Summary
이 지방으로 덮인 췌도 이식 방법은 복강 내 이식 된 섬의 검출에 적합합니다. 특히, 생체 결합제의 사용 또는 봉합이 필요하지 않습니다.
Abstract
췌도 이식은 중증 당뇨병에 대한 세포 대체 요법입니다. 복강 내강은 일반적으로이 절차의 이식 부위입니다. 그러나 복강 내 췌도 이식은 이식 효능이 좋지 않고 이식편 검출 능력이 어렵고 이식 후 분석을위한 이식 절제술 능력이 부족하다는 점에서 몇 가지 한계가 있습니다. 이 논문에서는 부고환 백색 지방 조직을 활용한 복강 내 췌도 이식 방법인 "지방으로 덮인 췌도 이식"을 사용하여 생체 공학 췌도의 치료 효과를 평가합니다. 이 방법의 단순성은 부고환 백색 지방 조직에 섬을 뿌리고 조직을 사용하여 섬을 덮는 데 있습니다. 이 방법은 복강 내 췌도 이식 기술로 분류 할 수 있지만 지방 내 조직 췌도 이식과 특성을 공유합니다. 그러나 지방으로 덮인 췌도 이식 방법은 혈당 및 혈장 인슐린 수치의 개선과 이식편 제거 가능성을 포함하여 지방 내 조직 췌도 이식보다 더 강력한 치료 효과를 보여줍니다. 백색 지방 조직으로의 췌도 생착 메커니즘과 생체 공학 섬의 치료 효과를 평가하기 위해이 방법을 채택하는 것이 좋습니다.
Introduction
췌도 이식은 중증 당뇨병 환자를위한 세포 대체 요법입니다. 최근 보고서에 따르면 이식 후 3년 후 인슐린 자립율은 최대 44%1까지 향상되며, 총 췌도 등가물 600,000건 이상을 투여받은 수혜자의 약 80%가 인슐린 자립성을 달성합니다2. 또한, 가장 최근의 협력 췌도 이식 등록 보고서에서 췌도 이식만 받은 환자의 70% 이상에서 공복 혈당 수치가 5년 동안 60-140mg/dL로 유지되는 것으로 나타났습니다. 이 연구는 또한 췌도 이식 단독 또는 신장 이식 후 췌도 이식을받은 환자의 약 90 %가 5 년 이상 심각한 저혈당 사건을 일으키지 않았다고 결정했습니다3.
이 치료의 임상 결과가 개선되고 있지만 최적의 이식 부위를 구축해야 할 필요성을 포함하여 몇 가지 제한 사항을 해결해야 합니다. 간은 많은 양의 췌도를 수용할 수 있는 가장 큰 기관이기 때문에 임상 췌도 이식을 위한 전형적인 이식 부위입니다. 그러나, 일부 환자에서는 간을 이용할 수 없고(예를 들어, 문맥 고혈압, 간염 및/또는 간경변4로 인해) 따라서 신장 피막하 공간5,6, 안주머니 7,8,9,10, 장간막(11), 위장관(12), 골격근(13), 피하 조직(13), 골수(14) 및 비장(15)을 포함하는 다른 부위 ,16,17은 대체 이식 부위로 간주되었습니다.
복강 내 췌도 이식은 국소 마취하에 쉽게 수행 할 수있어 복강 내 강이 임상 췌도 이식을위한 매력적인 부위가되지만, 이식시 췌도가 복강 전체에 분산되어 췌도 생착 검출 및 성공적인 생착 확인이 어렵습니다. 따라서, 복강 내 공동은 이상적인 임상 이식 부위로 널리 인식되지 않는다. 대신, 이식된 캡슐화된 섬(18 ) 및 생체공학적 섬(19)의 효과를 조사하기 위한 전임상 연구를 위한 대조 모델로서 자주 활용된다. 그러나 생체 공학과 대조 섬 간의 정확한 비교는 정확한 생착 평가를 수행하는 데 어려움이 있기 때문에 달성하기 어렵습니다.
대조적으로, omental pouch8, 장간막 및 기타 간외 위치에서 복강 내 백색 지방 조직의 사용은 잘 보고되었으며10,20,21,22,23 백색 지방 조직을 사용하여 이식된 생체 공학 섬의 기능을 조사하는 많은 연구에서 유망한 치료 결과를 보고할 수 있었습니다20,24,25, 26. 부고환 지방 조직의 사용이 이식 된 췌도의 검출을 용이하게함에 따라 복강 내 섬 이식의 한계를 극복하기 위해 부고환 지방 조직을 활용 한 "지방 피복 섬 이식 방법"이 개발되었습니다. 본 논문에서는 부고환 지방 조직을 이용한 지방으로 덮인 췌도 이식에 대해 설명한다.
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Protocol
다음 절차는 세 단계로 수행됩니다. 첫 번째 단계는 수용자 마우스에서 당뇨병의 유도와 기증자 섬의 분리를 포함합니다. 두 번째 단계는 이식 전에 췌도를 준비하는 것입니다. 제 3 단계에서는 부고환 지방 조직에 췌도 이식을 실시하고 지방 조직을 이용하여 췌도를 덮는다. 그 후, 치료 효과를 평가하였다. 본 연구에서 실시한 마우스의 취급 및 실험 절차는 '실험동물 관리의 원리'(실험동물의 관리 및 이용 지침, 국립보건원 간행물 제8판, 2011)에 준거하며, 실험 프로토콜은 후쿠오카대학 동물관리이용위원회의 승인을 받았습니다(승인 번호: 186018).
1. 수술 준비
- 당뇨병 유도 : 0.1M 구연산염 완충액 (180mg / kg 체중)에서 제조 한 18mg / mL 스트렙토 조토신 용액 18mg / mL 정맥 주사를 통해 체중 20-25g, 8-12 주령 수컷 마우스에서 당뇨병을 유도합니다. 혈당 수치가 400mg/dL를 초과하는 마우스는 당뇨병으로 간주됩니다. 당뇨병 유발 후 1주일 이내에 당뇨병 마우스를 사용하여 섬을 덮기 위해 부고환 백색 지방 조직의 과도한 위축을 일으킨다.
- 췌도 분리: 췌도 분리를 위한 Gotoh의 방법27 에 따라 이식 하루 전에 쥐 췌도 분리를 수행합니다.
- 간단히 말해서, 콜라게나제 용액을 사용하여 췌장 조직을 소화하십시오. 적절한 세포 분리 용액을 사용하여 밀도 구배 원심분리에 의해 췌도를 분리합니다. 그 다음 22°C 및 5%CO2의 배양기에서 밤새 췌도 배양(<37°C에서 배양하면 28,29,30,31 섬이 사멸하는 것을 방지하는 것으로 보고되었다).
알림: 정제된 췌도 배양액을 안전 캐비닛에서 취급하십시오. 췌도 분리 및 배양에 사용되는 모든 용액을 0.22μm 필터를 사용하여 필터 멸균합니다.
2. 이식을위한 췌도의 준비
- 그림 1A에 표시된대로 적절한 도구와 재료를 수집하십시오.
- 아밀라아제 및 리파아제와 같은 소화 효소는 분리 및 이식된 섬에 손상을 줄 수 있고 배양 접시 내의 오염된 섬유 조직에 갇혀 섬의 손실이 발생할 수 있으므로 이식 전에 집게를 사용하여 acinar 및 섬유질 조직을 포함하여 췌장에서 추가 섬 구성 요소를 직접 선택합니다(그림 1B). 해부 현미경으로. 따기 후 세포 여과기를 사용하여 단일 acinar 세포를 걸러냅니다.
- 여과된 섬을 소 혈청 또는 알부민이 보충된 적절한 배양 배지 또는 완충 용액(예: 저혈당 DMEM, RPMI1640, CMRL1066 또는 HBSS)이 포함된 새 배양 접시로 옮겨 췌도가 플라스틱에 부착되는 것을 방지하고 접시를 소용돌이치게 하여 접시 중앙에 섬을 위치시킵니다(그림 1C). P200 마이크로피펫과 현미경을 사용하여 개별 섬을 적절한 수집 튜브에 넣습니다(그림 1D).
- 50mL 플라스틱 튜브(그림 1E 왼쪽 및 중앙) 위에 새 40μm 세포 여과기를 놓고 새 배지로 필터를 세척합니다(그림 1E 오른쪽).
- 1000μL 피펫을 사용하여 섬을 여과기에 추가하여 섬과 단일 acinar 세포를 분리합니다(그림 1 F1 및 그림 1F2).
알림: 세포 여과기의 정제된 섬은 약 100% 순수합니다. - 집게를 사용하여 배양 배지가 들어 있는 새로운 60mm 또는 100mm 크기의 비처리 배양 접시 또는 소 혈청 또는 알부민이 보충된 적절한 완충 용액에 여과기를 뒤집습니다(그림 1 F3 및 그림 1F4). 신선한 배지/완충액을 사용하여 섬을 새로운 배양 접시에 넣습니다. 그런 다음 배양 접시에 총 부피가 약 20mL에 도달하도록 충분한 배지/완충액을 추가합니다.
- 현미경으로 췌도를 세고 기증자 동물의 수에 따라 개별 1.5mL 플라스틱 원심분리기 튜브에 췌도 수를 균등하게 나눕니다(그림 1G). 예를 들어, 두 마우스의 100-200 μm 췌도 당량 (IEQ) 200 개를 두 개의 튜브 각각에 추가합니다.
- 실온에서 1분 이내에 2,100 x g에서 섬을 원심분리하고 상층액을 버립니다. 약 20-30 μL의 잔류 용액이 일반적으로 튜브에 남아 있습니다 (그림 1H).
3. 부고환 지방 조직에 췌도 이식 및 부고환 백색 지방 조직으로 덮음
- 수술 전에 작은 동물용 마취기, 실체 현미경, 광원, 200μL 마이크로피펫 팁이 있는 50-200μL 마이크로피펫, 면봉, 4-0 봉합 세트 및 소독된 수술 기구를 수집합니다(그림 2A). 쿠퍼 가위, 안과 용 가위, Pean 집게, 핀셋 및 바늘 홀더를 오토 클레이브하십시오. 오토클레이빙 후 장비를 1% 포비돈-요오드 용액에 담그십시오(그림 2A). 면봉을 사용하여 부고환 백색 지방 조직을 동원하고 출혈의 경우 지혈을 수행하십시오. 췌도 이식을 위해 50-200 μL 팁이있는 마이크로 피펫을 사용하십시오.
- 흡입 마취제 (산소 중 2 % 이소 플루 란)를 사용하여 당뇨병 수용자 마우스에 마취를 전달하십시오. 건조를 방지하기 위해 양쪽 눈에 안과 윤활제를 바르십시오. 그런 다음 마우스를 앙와위 자세(그림 2B 왼쪽)에 놓고 복부에서 털을 제거하여 이발기 및/또는 제모 크림을 사용하여 감염을 예방합니다. 포비돈-요오드 용액과 70 % 에탄올을 세 번 교대로 사용하여 복부와 사타구니 부위를 소독합니다 (그림 2B 오른쪽). 수술 전에 발가락 핀치 반사가 없어 마취 깊이를 확인하십시오. 가열 패드를 사용하여 수술 중 열 지원을 제공하고 수술용 드레이프를 사용하여 멸균 수술 부위를 고정합니다.
- 낮은 중앙 영역에서 피부를 절개합니다 (그림 2C 왼쪽). 길이 약 2cm의 피부 절개를 권장합니다. Pean 집게로 왼쪽 복벽을 고정하고(무외상성 집게 또는 견인기도 사용할 수 있음) 조직을 마우스의 왼쪽으로 당겨 수술 부위를 고정합니다(그림 2C 오른쪽). 개복술 후 마취 유지를 위해 이소 플루 란의 비율을 1.0-1.5 %로 줄입니다.
- 면봉을 사용하여 소장과 대장을 마우스의 오른쪽(즉, 작업자의 왼쪽)으로 움직입니다. 복강의 왼쪽 부고환 백색 지방 조직은 왼쪽 사타구니 부위에 위치합니다. 부고환 백색 지방 조직과 왼쪽 고환을 복부 바깥쪽으로 동원하고(그림 2D 왼쪽) 조직을 펴십시오(오른쪽 2D).
- 200μL 피펫 팁이 장착된 P200 마이크로피펫을 사용하여 부드러운 피펫팅(그림 2E 왼쪽)으로 하나의 1.5mL 튜브에서 전체 췌도 부피를 수집하고, 수집 시 튜브에 췌도가 남지 않도록 주의합니다. 수집된 섬이 중력에 의해 피펫 끝에 가라앉도록 합니다(그림 2E 오른쪽).
- 마이크로피펫 팁을 팽창된 지방 조직에 가볍게 놓습니다. 팁의 배지/완충액이 과도하게 플러싱되지 않도록 주의하면서 췌도를 조직에 조심스럽게 씨를 뿌립니다(그림 2F 왼쪽). 파종 후 해부 현미경으로 췌도의 올바른 위치를 확인하십시오 (그림 2F 오른쪽).
- 부고환 백색 지방 조직으로 섬을 덮으십시오 (그림 2G). 봉합사 또는 생체 결합제의 사용은 필요하지 않습니다.
- 왼쪽 고환을 부고환 백색 지방 조직 아래에 놓고 조직을 복강 내로 되돌립니다 (그림 2H). 4-0 봉합사를 사용하여 피부를 두 층(복막, 근육 및 피부)으로 닫습니다(나일론 또는 흡수성 봉합사와 같은 모든 봉합사를 사용할 수 있음)(그림 2I). 아세틸 살리실산 주입 (300 mg / kg; SQ) 수술 후 진통제를 위해 상처 근처. 그런 다음 마우스를 열 램프 아래에 놓고 완전히 회복 될 때까지 모니터링하십시오.
4. 췌도 이식 후 모니터링 (요약)
- 수술 후 (POD) 28에서 혈당, 포도당 내성 검사 및 조직 학적 평가를 모니터링하여 췌도 이식의 치료 효과를 평가합니다.
- 작은 포도당 측정기를 사용하여 내당능 시험에서 혈당의 측정을 포함하여 혈당을 모니터링한다.
- 꼬리 정맥에서 혈액 샘플 (약간의 마이크로 리터)을 수집하십시오. 조직 학적 평가와 관련하여, 뮤린 인슐린 (이식 된 섬 검출 용) 및 폰 빌레 브란트 인자 (혈관 검출 용, 췌도 생착의 증거)는 면역 조직 화학에 의해 회수 된 부고환 지방 조직의 이식 된 섬에서 검출되었다.
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Representative Results
지방으로 덮인 췌도 이식의 이식 효능을 복강 내 췌도 이식 후의 이식 효능과 비교하기 위해, 대조군 수용자 당뇨병 동물의 왼쪽 paracolic 공간에서 동일한 수의 췌도를 복막에 이식하였다. 지방으로 덮인 췌도 이식 마우스의 혈당 수치는 복강 내 췌도 이식 마우스에 비해 점진적으로 유의하게 감소하는 것으로 관찰되었다 (p = 0.0023; 그림 3A). 이식 1개월 후, 지방으로 덮인 췌도 이식을 받은 마우스의 혈당은 복강내 포도당 내성 시험에 의해 평가된 바와 같이 복강내 췌도 이식 마우스에서 관찰된 것보다 낮은 수준으로 유지되었다(p=0.0046; 그림 3B). 또한, 이전에 우리가 이전에 보고한 바와 같이, 혈장 인슐린 수치도 지방으로 덮인 섬 이식 후에 개선되었다고 보고했습니다. 혈당 수치의 재 상승도 확인되었습니다. 이러한 데이터는 200 IEQ를 사용한 복강 내 지방으로 덮인 췌도 이식이 수용자 마우스의 당뇨병 상태를 크게 개선 할 수 있음을 보여줍니다.
부고환 백색 지방 조직으로의 췌도 생착을 평가하기 위해 조직 학적 검사도 수행되었습니다. 지방으로 덮인 췌도 이식 수혜자 동물에서 헤마톡실린-에오신 염색은 부고환 백색 지방 조직 내에 췌도의 존재를 나타냅니다(그림 3C, 상단 이미지). 또한, 인슐린 양성 섬도의 형광-접합 항체 염색은 모든 수용자 마우스의 부고환 백색 지방 조직 내에서 폰 빌레브란트 인자 양성 미세혈관의 검출을 용이하게 하였다 (n=6; 그림 3C). 대조적으로, 복강 내 췌도 이식 마우스에서, 부고환 백색 지방 조직 또는 복벽에서 이식 된 섬은 관찰되지 않았다 (데이터는 나타내지 않음).
그림 1-ABC. 부고환 지방 조직에 이식하고 부고환 백색 지방 조직으로 덮기위한 췌도의 준비. (A) 기기 준비: a. 피펫 보조제, b. 10mL 피펫 팁, c. 50mL 플라스틱 튜브, d. 15mL 플라스틱 튜브, e. 50-200μL(왼쪽) 및 200-1000μL(오른쪽) 마이크로피펫, f. 1.5mL 플라스틱 원심분리기 튜브, g. 200 및 1000μL 마이크로피펫 팁, h. 알부민 또는 소 태아 혈청을 포함하는 배지 또는 완충액(즉, 10% 소 태아 혈청 및 100U/mL 페니실린 + 100U/mL 스트렙토마이신 용액을 포함하는 저혈당의 DMEM), 및 i. 40 μm 세포 스트레이너. (B) acinar (왼쪽 : 화살표로 표시)와 섬유 조직 (오른쪽)이있는 고립 된 섬. 스케일 바 = 200 μm. (C) 플라스틱 튜브에 수집 된 섬. 왼쪽, 문화 접시에 흩어져있는 섬. 중앙, 섬은 소용돌이에 의해 배양 접시의 중앙에 수집됩니다. 오른쪽, 접시 중앙에 모인 섬. 스케일 바 = 200 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 1-DEF. 부고환 지방 조직에 이식하고 부고환 백색 지방 조직으로 덮기위한 췌도의 준비. (D) 수집 된 섬 (왼쪽)을 15mL 플라스틱 튜브 (오른쪽)로 옮깁니다. (E) 40μm 세포 여과기는 50mL 플라스틱 튜브(왼쪽 및 중앙) 위에 설정됩니다. 세포 여과기의 섬을 새 배양 접시로 플러싱하기 위해 준비된 배지/버퍼를 다른 50mL 플라스틱 튜브에 추가했습니다(오른쪽). (F) 1. 200-1000 μL 마이크로피펫을 사용하여 췌도를 수집하였다. 2. 췌도가 세포 여과기에 쏟아졌습니다. 3 및 4. 새로운 배양 접시에 스트레이너에 섬을 플러시하는 데 사용되는 매체/완충액. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 1-GH. 부고환 지방 조직에 이식하고 부고환 백색 지방 조직으로 덮기위한 췌도의 준비. (g) 수용자 마우스의 수에 따라 1.5mL 플라스틱 원심분리 튜브로 분할된 섬. 여기서, 200개의 100-200 μm 췌도 당량(IEQ)을 각 튜브로 균등하게 분할하였다. (H) 원심분리 전에 1.5mL 튜브에 균등하게 분할된 섬(왼쪽). 원심분리하여 튜브 바닥(중앙)에서 수집한다. 20-30 μL의 상청액은 과량의 용액을 버린 후 튜브에 남아 있습니다 (오른쪽). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2-ABC. 부고환 지방 조직에 췌도를 이식하고 부고환 백색 지방 조직을 사용하여 덮는 절차. (A) 기구 준비: a. 작은 동물용 마취기, B. 실체 현미경, c. 광원, D. 소독된 수술 기구, e. 1.5mL 플라스틱 튜브에 분할된 섬, f. 50-200μL 마이크로피펫, g. 200μL 마이크로피펫 팁 및 h. 4-0 봉합사. (b) 당뇨 수용자 마우스가 2% 이소플루란의 전신마취하에 앙와위 자세를 취하고 있다(왼쪽). 복부와 사타구니 부위는 70 % 에탄올을 사용하여 소독하고 종이 실험실 물티슈 (오른쪽)로 덮습니다. (C) 피부가 낮은 중간 위치 (왼쪽)에서 절개됩니다. 왼쪽 복벽은 Pean 집게로 고정되고 마우스 왼쪽으로 당겨져 수술 부위 (오른쪽)를 고정합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2-DEF. 부고환 지방 조직에 췌도를 이식하고 부고환 백색 지방 조직을 사용하여 덮는 절차. (D) 왼쪽 부고환 백색 지방 조직과 왼쪽 고환은 복부 외부 (왼쪽)와 팽창 (오른쪽)으로 동원됩니다. 스케일 바 = 1cm. (E) 1.5mL 플라스틱 튜브의 췌도는 200μL 피펫 팁(왼쪽)이 있는 마이크로피펫을 사용하여 완전히 수집됩니다. 수집 된 섬 (화살표로 표시)은 중력에 의해 피펫 팁 (오른쪽)으로 완전히 가라 앉도록 허용되었습니다. (F) 팽창된 지방 조직에 가볍게 놓인 마이크로피펫 팁(왼쪽). 조직 상에 췌도 파종(점선 원)을 현미경으로 해부하여 확인하였다(오른쪽). 스케일 바 = 1cm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2-GHI. 부고환 지방 조직에 췌도를 이식하고 부고환 백색 지방 조직을 사용하여 덮는 절차. (G) 섬은 부고환 백색 지방 조직으로 덮여 있습니다. (H) 왼쪽 고환과 부고환 백색 지방 조직이 복강 내로 돌아왔다. (I) 복부 폐쇄 후 이미지. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3. 지방으로 덮인 섬 이식의 치료 효과. (A) 혈당 수치. 파란색 선 : 지방으로 덮인 섬 이식 (n = 6); 주황색 선: 복강내 췌도 이식(n=6) 통계분석은 분산의 반복 측정 분석을 이용하여 수행하였으며 유의한 차이는 p<0.05로 정의하였다. (B) 이식 후 한 달 후의 내당능 검사로부터의 혈당 수준. 파란색 선 : 지방으로 덮인 섬 이식 (n = 6); 주황색 선 : 복강 내 섬 이식 (n = 6). 통계분석은 분산의 반복 측정 분석을 사용하여 수행되었으며 유의한 차이는 p < 0.05로 정의되었습니다. (C) 이식 1개월 후 이식된 섬의 조직학적 이미지. 상단 이미지: 헤마톡실린-에오신 염색; 하단 이미지 : 쥐 인슐린 (녹색) 및 폰 빌레 브란트 인자 (vWF : 빨간색, 흰색 화살표로 표시)에 대한 면역 조직 염색. 스케일 바 = 100 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
지방으로 덮인 췌도 이식 방법은 복강 내 췌도 이식과 지방 조직 내 췌도 이식의 두 가지 이식 기술의 기술을 통합합니다. 부고환 백색 지방 조직의 표면막은 복막에 의해 덮여 있고 부고환에 부착되어있는 백색 지방 조직으로 간주되기 때문에 지방으로 덮인 췌도 이식 방법은 해부학 적으로 복강 내 섬 이식의 일종으로 분류 할 수 있습니다. 그러나 췌도가 수용자에게 전달되는 기술은 지방 조직 내 췌도 이식에 사용되는 기술과 더 유사합니다. 우리의 데이터는 지방으로 덮인 췌도 이식 방법의 치료 효과가 복강 내 췌도 이식의 치료 효과보다 우수하다는 것을 보여줍니다. 우리의 이전 연구는 또한이 방법의 이식 효능이 최고의 이식 효능을 가진 췌도 이식 방법 인 신장 피막 하 섬 이식의 이식 효능과 거의 동일하다는 것을 보여주었습니다23. 이 방법의 유용성은 백색 지방 조직 및 지방 사이토 카인 내에 존재하고 섬 생착에 기여하는 것으로 생각되는 접착 분자 때문일 수 있다고 추측됩니다10,23.
부고환 백색 지방 조직의 크기는 많은 양의 섬을 수용 할 수있게합니다. 대조적으로, 설치류 더 큰 omentum은 너무 작아서 많은 섬을 쉽게 포함하고 접근 할 수 없습니다. 잠재적인 실험적 췌도 이식 부위로서 부고환 백색 지방 조직의 유일한 물리적 한계는 인슐린10의 문맥 순환을 제공하지 않는다는 것이다.
이 방법은 섬이 조직에 직접 주입되는 대신 지방 조직으로 덮여 있기 때문에 독특합니다. 지방 내 조직 이식 된 섬은 당뇨병 동물에서 손상된 인슐린 기능이 과량의 유리 지방산32로 이어질 수 있기 때문에 지방 독성의 영향을 겪을 수 있습니다. 이 방법은 또한 이식 된 췌도 손실을 방지하기 위해 생체 접합제 또는 봉합을 필요로하지 않습니다. 도 3C에서 관찰되는 바와 같이, 췌도는 이식 후 1개월까지 지방 조직 내에 성공적으로 생착된 상태로 유지되며,23 절제술 후 혈당 수준 유지가 확인되었다. 이 현상은 지방 조직이 섬을 포획하는 능력 때문일 수 있으며, 이는 껍질을 벗기기 어려워집니다.
이 방법의 장점은 기술적으로 수행하기 쉽고, 섬의 치료 효과에 대한 대사 및 조직 학적 평가를 허용하며, 낙관 절제술 후 췌도 유전자 및 / 또는 단백질 발현의 평가를 용이하게한다는 것입니다. 이전 연구와 비교하여이 방법의 효능은 부고환 백색 지방 조직 10,33,34,35,36으로의 췌도 이식의 효능보다 열등하지 않습니다. 성공적인 생착을 위해서는 췌도 손실없이 부고환 백색 지방 조직에 섬을 정확하게 파종하는 것이 필요하다는 점에 유의하는 것이 중요합니다. 거칠고 빠른 피펫팅으로 인해 플라스틱 튜브의 벽에 췌도가 부착되어 분주가 어려울 수 있으므로 성공을 보장하려면 1.5mL 플라스틱 튜브에서 췌도의 전체 부피를 마이크로피펫 팁으로 부드럽게 흡입해야 합니다. 췌도 접착은 부적절한 췌도 파종의 주요 원인입니다. 췌도가 마이크로 피펫 팁의 끝에 정착하도록 허용 한 후, 섬은 플러싱없이 부고환 지방 조직에 이식되어야합니다. 지방 조직의 과도한 매체/완충액 플러싱을 방지하기 위해 섬을 흡입 및 분배할 때 플런저 버튼의 함몰을 최소화하는 것이 중요합니다. 따라서 이식을 위해 마이크로 피펫의 플런저 버튼을 누르기 전에 섬이 마이크로 피펫 팁의 끝에서 완전히 응집 될 때까지 기다리는 것이 필수적입니다. 팁을 지방 조직에 가볍게 놓고 광학 현미경으로 조직에 췌도의 파종을 확인하는 것으로 충분합니다.
결론적으로이 방법은 성공을 위해 몇 가지 중요한 단계가 필요함에도 불구하고 매우 간단합니다. 우리는 백색 지방 조직에 대한 췌도 생착을 촉진하고 생체 공학 섬의 치료 효과에 대한 추가 평가를 돕기 위해이 방법의 광범위한 채택을 희망합니다.
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Disclosures
우리는 이해 상충이 없습니다.
Acknowledgments
이 연구는 일본 문부 과학성의 과학 연구 보조금 (C) (19K09839, NS)의 지원을 받았습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4-0 Nylon | Alfresa | ER2004NA45-KF2 | Closing abdomen |
| Alexa 488-conjugated donkey anti-guinea pig | Jackson Immunoresearch | 706-546-148 | Secondary antibody for insulin antibody |
| Alexa 647-conjugated donkey anti-rabbit | Jackson Immunoresearch | 711-606-152 | Secondary antibody for von Willebrand factor antibody |
| DMEM, low glucose, pyruvate | ThermoFisher Scientific | 11885084 | Culturing islets, transplanting islets |
| Eosin | Fujifilm Wako Chemicals | 051-06515 | Using for staining tissue by eosin |
| Eppendorf Safe-Lock Tubes, 1.5 mL | Eppendorf | 30120086 | Collecting islets |
| Falcon 15 mL Conical Centrifuge Tubes | Corning | 352095 | Collecting islets |
| Falcon 40 µm Cell Strainer | Falcon | 352340 | Using for separating islets from other pancreatic tissue |
| Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tubes | Corning | 352070 | Discarding excessive medium/buffer |
| Guinea pig anti-insulin | Agilent Technologies Japan, Ltd. (Dako) | IR002 | Primary antibody for murine insulin |
| Hematoxylin | Muto Pure Chemicals Co., Ltd. | 30002 | Using for staining tissue by hematoxylin |
| Isodine solution 10% | Shionogi&Co., Ltd. | no catalog number | Using for disinfection |
| Isoflurane | Fujifilm Wako Chemicals | 095-06573 | Using for anesthesia |
| Labcon 1000 µL ZapSilk Low Retention Pipette Tips | Labcon | 1177-965-008 | Using for separating islets from other pancreatic tissue |
| Labcon 200 µL ZapSilk Low Retention Pipette Tips | Labcon | 1179-965-008 | Using for seeding islets onto epididymal white adipose tissue |
| Mintsensor | Sanwa Kagaku Kenkyusho Co. Ltd., | 8AEB02E | Using for monitoring blood glucose |
| Pipetteman P-1000 | Gilson | F123602 | Using for separating islets from other pancreatic tissue |
| Pipetteman P-200 | Gilson | F123601 | Using for seeding islets onto epididymal white adipose tissue |
| Rabbit anti-vWF | Abcam | ab6994 | Primary antibody for murine von Willebrand factor |
References
- Barton, F. B., et al. Improvement in outcomes of clinical islet transplantation: 1999-2010. Diabetes Care. 35 (7), 1436-1445 (2012).
- Balamurugan, A. N., et al. Islet product characteristics and factors related to successful human islet transplantation from the Collaborative Islet Transplant Registry (CITR) 1999-2010. American Journal of Transplantation. 14 (11), 2595-2606 (2014).
- Collaborative Islet Transplant Registry. Collaborative Islet Transplant Registry. Annual Report. , (2017).
- Rajab, A., et al. Total Pancreatectomy and Islet Autotransplantation Following Treated Hepatitis C Infection. Cell Transplantation. 27 (10), 1569-1573 (2018).
- Mellgren, A., Schnell Landstrom, A. H., Petersson, B., Andersson, A. The renal subcapsular site offers better growth conditions for transplanted mouse pancreatic islet cells than the liver or spleen. Diabetologia. 29 (9), 670-672 (1986).
- Hiller, W. F., Klempnauer, J., Luck, R., Steiniger, B. Progressive deterioration of endocrine function after intraportal but not kidney subcapsular rat islet transplantation. Diabetes. 40 (1), 134-140 (1991).
- Yasunami, Y., Lacy, P. E., Finke, E. H. A new site for islet transplantation--a peritoneal-omental pouch. Transplantation. 36 (2), 181-182 (1983).
- Kin, T., Korbutt, G. S., Rajotte, R. V. Survival and metabolic function of syngeneic rat islet grafts transplanted in the omental pouch. American Journal of Transplantation. 3 (3), 281-285 (2003).
- Kasoju, N., et al. Bioengineering a pre-vascularized pouch for subsequent islet transplantation using VEGF-loaded polylactide capsules. Biomaterials Science. 8 (2), 631-647 (2020).
- Sakata, N., Yoshimatsu, G., Kodama, S. White Adipose Tissue as a Site for Islet Transplantation. Transplantology. 1 (2), 55-70 (2020).
- Osama Gaber, A., Chamsuddin, A., Fraga, D., Fisher, J., Lo, A. Insulin independence achieved using the transmesenteric approach to the portal vein for islet transplantation. Transplantation. 77 (2), 309-311 (2004).
- Fujita, M., et al. Technique of endoscopic biopsy of islet allografts transplanted into the gastric submucosal space in pigs. Cell Transplantation. 22 (12), 2335-2344 (2013).
- Sakata, N., et al. Strategy for clinical setting in intramuscular and subcutaneous islet transplantation. Diabetes/Metabolism Research and Reviews. 30 (1), 1-10 (2014).
- Cantarelli, E., et al. Transplant Site Influences the Immune Response After Islet Transplantation: Bone Marrow Versus Liver. Transplantation. 101 (5), 1046-1055 (2017).
- White, S. A., et al. The risks of total pancreatectomy and splenic islet autotransplantation. Cell Transplantation. 9 (1), 19-24 (2000).
- Itoh, T., Nishinakamura, H., Kumano, K., Takahashi, H., Kodama, S. The Spleen Is an Ideal Site for Inducing Transplanted Islet Graft Expansion in Mice. PLoS One. 12 (1), 0170899 (2017).
- Sakata, N., Yoshimatsu, G., Kodama, S. The Spleen as an Optimal Site for Islet Transplantation and a Source of Mesenchymal Stem Cells. International Journal of Molecular Sciences. 19 (5), (2018).
- Sakata, N., et al. Effect of rat-to-mouse bioartificial pancreas xenotransplantation on diabetic renal damage and survival. Pancreas. 32 (3), 249-257 (2006).
- Nagaya, M., et al. Effectiveness of bioengineered islet cell sheets for the treatment of diabetes mellitus. Journal of Surgical Research. 227, 119-129 (2018).
- Weaver, J. D., et al. Vasculogenic hydrogel enhances islet survival, engraftment, and function in leading extrahepatic sites. Science Advances. 3 (6), 1700184 (2017).
- Dufour, J. M., et al. Development of an ectopic site for islet transplantation, using biodegradable scaffolds. Tissue Engineering. 11 (9-10), 1323-1331 (2005).
- Chen, X., et al. The epididymal fat pad as a transplant site for minimal islet mass. Transplantation. 84 (1), 122-125 (2007).
- Sakata, N., et al. Mechanism of Transplanted Islet Engraftment in Visceral White Adipose Tissue. Transplantation. 104 (12), 2516-2527 (2020).
- Navarro-Requena, C., et al. PEG hydrogel containing calcium-releasing particles and mesenchymal stromal cells promote vessel maturation. Acta Biomaterialia. 67, 53-65 (2018).
- Phelps, E. A., Headen, D. M., Taylor, W. R., Thule, P. M., Garcia, A. J. Vasculogenic bio-synthetic hydrogel for enhancement of pancreatic islet engraftment and function in type 1 diabetes. Biomaterials. 34 (19), 4602-4611 (2013).
- Manzoli, V., et al. Immunoisolation of murine islet allografts in vascularized sites through conformal coating with polyethylene glycol. American Journal of Transplantation. 18 (3), 590-603 (2018).
- Gotoh, M., Maki, T., Kiyoizumi, T., Satomi, S., Monaco, A. P. An improved method for isolation of mouse pancreatic islets. Transplantation. 40 (4), 437-438 (1985).
- Brandhorst, D., Brandhorst, H., Hering, B. J., Bretzel, R. G. Long-term survival, morphology and in vitro function of isolated pig islets under different culture conditions. Transplantation. 67 (12), 1533-1541 (1999).
- Noguchi, H., et al. Low-temperature preservation of isolated islets is superior to conventional islet culture before islet transplantation. Transplantation. 89 (1), 47-54 (2010).
- Itoh, T., et al. Low temperature condition prevents hypoxia-induced islet cell damage and HMGB1 release in a mouse model. Cell Transplantation. 21 (7), 1361-1370 (2012).
- Komatsu, H., et al. Optimizing Temperature and Oxygen Supports Long-term Culture of Human Islets. Transplantation. 103 (2), 299-306 (2019).
- Unger, R. H. Lipid overload and overflow: metabolic trauma and the metabolic syndrome. Trends in Endocrinology, Metabolism. 14 (9), 398-403 (2003).
- Mao, D., et al. A macroporous heparin-releasing silk fibroin scaffold improves islet transplantation outcome by promoting islet revascularisation and survival. Acta Biomaterialia. 59, 210-220 (2017).
- Wang, K., Wang, X., Han, C. S., Chen, L. Y., Luo, Y. Scaffold-supported Transplantation of Islets in the Epididymal Fat Pad of Diabetic Mice. Journal of Visualized Experiments. (125), e54995 (2017).
- Wang, X., Wang, K., Zhang, W., Qiang, M., Luo, Y. A bilaminated decellularized scaffold for islet transplantation: Structure, properties and functions in diabetic mice. Biomaterials. 138, 80-90 (2017).
- Rios, P. D., Zhang, X., Luo, X., Shea, L. D. Mold-casted non-degradable, islet macro-encapsulating hydrogel devices for restoration of normoglycemia in diabetic mice. Biotechnology and Bioengineering. 113 (11), 2485-2495 (2016).
