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Medicine

Transplantation d’îlots pancréatiques couverts de graisse à l’aide de tissu adipeux blanc épididymaire

Published: May 25, 2021 doi: 10.3791/62096
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2, 1,2
1Department of Regenerative Medicine and Transplantation, Faculty of Medicine, Fukuoka University, 2Center for Regenerative Medicine, Fukuoka University Hospital

Summary

Cette méthode de transplantation d’îlots couverts de graisse convient à la détection des îlots greffés dans la cavité intrapéritonéale. Notamment, il ne nécessite pas l’utilisation d’agents bioliants ou de suture.

Abstract

La transplantation d’îlots pancréatiques est une thérapie de remplacement cellulaire pour le diabète sucré sévère. La cavité intrapéritonéale est généralement le site de transplantation pour cette procédure. Cependant, la transplantation intrapéritonéale d’îlots pancréales présente certaines limites, notamment une faible efficacité de la transplantation, une capacité difficile de détection du greffon et un manque de capacité de greffectomie pour l’analyse post-transplantation. Dans cet article, la « transplantation d’îlots couverts de graisse », une méthode de transplantation d’îlots intrapéritonéaux qui utilise du tissu adipeux blanc épididymaire, est utilisée pour évaluer les effets thérapeutiques des îlots bio-modifiés. La simplicité de la méthode réside dans l’ensemencement des îlots sur le tissu adipeux blanc épididymaire et l’utilisation du tissu pour couvrir les îlots. Bien que cette méthode puisse être classée comme une technique de transplantation d’îlots intrapéritonéaux, elle partage des caractéristiques avec la transplantation intra-adipeuse d’îlots pancréteux. La méthode de transplantation d’îlots couverts de graisse démontre toutefois des effets thérapeutiques plus robustes que la transplantation intra-adipeuse d’îlots, y compris l’amélioration de la glycémie et des taux plasmatiques d’insuline et le potentiel d’élimination du greffon. Nous recommandons l’adoption de cette méthode pour évaluer les mécanismes de greffe d’îlots dans le tissu adipeux blanc et les effets thérapeutiques des îlots issus de la bioingénierie.

Introduction

La transplantation d’îlots pancréatiques est une thérapie de remplacement cellulaire pour les patients atteints de diabète sucré sévère. Des rapports récents ont montré que les taux d’insuline autonome trois ans après la transplantation s’améliorent jusqu’à 44 %1 et qu’environ 80 % des receveurs qui reçoivent plus de 600 000 équivalents îlots pancréatiques atteignent l’indépendance insulinique2. En outre, dans le plus récent rapport du registre collaboratif de transplantation d’îlots, il a été révélé que la glycémie à jeun était maintenue à 60-140 mg / dL pendant une période de 5 ans chez plus de 70% des patients qui ont subi une greffe d’îlots pancréatiques seuls. L’étude a également déterminé qu’environ 90% des patients ayant reçu une greffe d’îlots pancréatiques seuls ou une transplantation d’îlots après une greffe de rein n’ont pas développé d’événements hypoglycémiques graves pendant plus de 5 ans3.

Bien que les résultats cliniques de ce traitement se soient améliorés, certaines limites doivent encore être prises en compte, notamment la nécessité d’établir un site de transplantation optimal. Le foie est un site de transplantation typique pour la transplantation clinique d’îlots pancréatiques, car c’est le plus grand organe pouvant accueillir un volume élevé d’îlots. Cependant, chez certains patients, le foie n’est pas disponible (par exemple, en raison d’une hypertension portale, d’une hépatite et/ou d’une cirrhose4) et donc d’autres sites, y compris l’espace sous-capsulaire rénal5,6, la poche omentale 7,8,9,10, le mésentère 11, le tractus gastro-intestinal 12, le muscle squelettique 13, le tissu sous-cutané 13, la moelle osseuse 14 et la rate 15 ,16,17, ont été considérés comme des sites de transplantation alternatifs.

Bien que la transplantation intrapéritonéale d’îlots puisse être effectuée facilement sous anesthésie locale, ce qui fait de la cavité intrapéritonéale un site attrayant pour la transplantation clinique d’îlots, lors de la transplantation, les îlots sont dispersés dans toute la cavité intrapéritonéale, ce qui rend difficile la détection de la greffe d’îlots et la confirmation réussie de la greffe. Par conséquent, la cavité intrapéritonéale n’est pas largement reconnue comme un site de transplantation clinique idéal. Au lieu de cela, il est fréquemment utilisé comme modèle de contrôle pour les études précliniques visant à étudier l’efficacité des îlots encapsuléstransplantés 18 et des îlots19 issus de la bioingénierie. Cependant, une comparaison exacte entre les îlots issus de la bioingénierie et les îlots témoins est difficile à réaliser en raison des défis liés à la réalisation d’une évaluation précise de la greffe.

En revanche, l’utilisation de tissu adipeux blanc intrapéritonéal dans la poche omentale8, le mésentère et d’autres emplacements extrahépatiques a été bien rapportée 10,20,21,22,23 et de nombreuses études portant sur la fonction des îlots issus de la bioingénierie transplantés à l’aide de tissu adipeux blanc ont pu rapporter des résultats thérapeutiques prometteurs20,24,25, 26. Comme l’utilisation de tissu adipeux épididymaire facilite la détection des îlots transplantés, la « méthode de transplantation d’îlots couverts de graisse », utilisant du tissu adipeux épididymaire, a été développée pour surmonter les limites de la transplantation intrapéritonéale d’îlots. Dans cet article, la transplantation d’îlots couverts de graisse à l’aide de tissu adipeux épididymaire est décrite.

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Protocol

La procédure suivante est effectuée en trois étapes. La première étape comprend l’induction du diabète chez les souris receveuses et l’isolement des îlots donneurs. La deuxième étape consiste à préparer les îlots avant la transplantation. Dans la troisième étape, la transplantation d’îlots sur le tissu adipeux épididymaire et le revêtement des îlots à l’aide du tissu adipeux est effectuée. Après cela, les effets thérapeutiques ont été évalués. La manipulation des souris et les procédures expérimentales effectuées dans cette étude sont conformes aux « Principes de soin des animaux de laboratoire » (Guide pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire, publication 8e édition des National Institutes of Health, 2011), et le protocole expérimental a été approuvé par le Comité de soin et d’utilisation des animaux de l’Université de Fukuoka (numéro d’approbation: 186018).

1. Préparation chirurgicale

  1. Induction du diabète : Induire le diabète chez des souris mâles receveuses âgées de 8 à 12 semaines pesant 20 à 25 g par injection intraveineuse de solution de streptozotocine de 18 mg/mL préparée dans un tampon de citrate 0,1 M (180 mg/kg de poids corporel). Les souris dont la glycémie dépasse 400 mg / dL sont considérées comme diabétiques. Utilisez des souris diabétiques dans la semaine 1 après l’induction du diabète avant une atrophie excessive du tissu adipeux blanc épididymaire pour couvrir les îlots.
  2. Isolement des îlots : Effectuer l’isolement des îlots murins un jour avant la transplantation en suivant la méthode27 de Gotoh pour l’isolement des îlots.
  3. En bref, digérer le tissu pancréatique en utilisant une solution de collagénase. Isoler les îlots par centrifugation à gradient de densité à l’aide d’une solution de séparation cellulaire appropriée. Ensuite, les îlots de culture passent la nuit dans un incubateur à 22 °C et 5% de CO2 (la culture à <37 °C a été signalée pour prévenir la mort des îlots 28,29,30,31).
    REMARQUE: Manipulez les cultures d’îlots purifiées dans une armoire de sécurité. Filtrer-stériliser toutes les solutions utilisées pour l’isolation et la culture des îlots à l’aide d’un filtre de 0,22 μm.

2. Préparation des îlots pour la transplantation

  1. Rassemblez les instruments et le matériel appropriés, comme indiqué à la figure 1A.
  2. Étant donné que les enzymes digestives telles que l’amylase et la lipase peuvent endommager les îlots isolés et transplantés et qu’une perte d’îlots peut se produire après avoir été piégés dans des tissus fibreux contaminants dans la boîte de culture, avant la transplantation, utilisez des pinces pour choisir manuellement tous les composants extra-îlots du pancréas, y compris les tissus acineux et fibreux (Figure 1B), sous un microscope à dissection. Après la cueillette, utilisez une passoire cellulaire pour filtrer les cellules acineuses individuelles.
  3. Transférer les îlots filtrés dans une nouvelle boîte de culture contenant tout milieu de culture ou solution tampon approprié (p. ex. DMEM à faible teneur en glucose, RPMI1640, CMRL1066 ou HBSS) complété par du sérum ou de l’albumine bovine pour empêcher la fixation des îlots au plastique et agiter la capsule pour positionner les îlots au centre de la boîte (figure 1C). À l’aide d’une micropipette P200 et du microscope, prélever les îlots individuels dans un tube collecteur approprié (figure 1D).
  4. Placez une nouvelle crépine cellulaire de 40 μm sur un tube en plastique de 50 ml (figure 1E à gauche et au centre) et lavez le filtre avec un milieu frais (figure 1E à droite).
  5. Utilisez une pipette de 1000 μL pour ajouter les îlots à la crépine afin de séparer les îlots et les cellules acineuses simples (Figure 1 F1 et Figure 1F2).
    REMARQUE: Les îlots purifiés sur la passoire cellulaire seront purs à environ 100%.
  6. Utiliser une pince pour retourner la passoire sur une nouvelle boîte de culture non traitée de 60 ou 100 mm contenant un milieu de culture ou une solution tampon appropriée additionnée de sérum ou d’albumine bovine (figure 1 F3 et figure 1F4). Utilisez un milieu / tampon frais pour rincer les îlots dans un nouveau plat de culture. Ajoutez ensuite suffisamment de milieu/tampon à la capsule de culture pour atteindre un volume total d’environ 20 mL.
  7. Compter les îlots au microscope et diviser le nombre d’îlots également entre les tubes à centrifuger en plastique individuels de 1,5 mL en fonction du nombre d’animaux donneurs (figure 1G). Par exemple, deux cents équivalents d’îlots de 100 à 200 μm (IEQ) provenant de deux souris seraient ajoutés à chacun des deux tubes.
  8. Centrifuger les îlots à 2 100 x g en 1 minute à température ambiante et jeter le surnageant. Environ 20 à 30 μL de solution résiduelle restent généralement dans le tube (Figure 1H).

3. Transplantation d’îlots sur du tissu adipeux épididymaire et recouvert de tissu adipeux blanc épididymaire

  1. Avant la chirurgie, prélevez un appareil d’anesthésie pour petits animaux, un stéréomicroscope, une source lumineuse, une micropipette de 50 à 200 μL avec des pointes de micropipette de 200 μL, des cotons-tiges, un ensemble de suture 4-0 et des instruments chirurgicaux désinfectés (figure 2A). Autoclave les ciseaux de tonnelier, les ciseaux ophtalmiques, les pinces à pois, les pinces à épiler et les porte-aiguilles. Après l’autoclavage, immerger l’équipement dans une solution de povidone iodée à 1 % (figure 2A). Utilisez des cotons-tiges pour la mobilisation du tissu adipeux blanc épididymaire et pour l’hémostase en cas de saignement. Utilisez une micropipette avec un embout de 50 à 200 μL pour la transplantation d’îlots.
  2. Administrer l’anesthésie à la souris receveuse diabétique à l’aide d’un agent anesthésique inhalé (2% d’isoflurane dans l’oxygène). Appliquez un lubrifiant ophtalmique sur les deux yeux pour éviter le dessèchement. Placez ensuite la souris en décubitus dorsal (Figure 2B à gauche) et retirez les poils de l’abdomen pour prévenir l’infection à l’aide d’une tondeuse à cheveux et/ou d’une crème dépilatoire. Désinfecter l’abdomen et la région inguinale en utilisant au moins trois cycles alternés d’une solution de povidone iodée suivie d’éthanol à 70 % (figure 2B droite). Avant la chirurgie, confirmez la profondeur de l’anesthésie par l’absence d’un réflexe de pincement des orteils. Fournir un soutien thermique peropératoire à l’aide d’un coussin chauffant et utiliser un champ chirurgical pour sécuriser la zone chirurgicale stérile.
  3. Inciser la peau au niveau de la zone médiane inférieure (Figure 2C à gauche). Une incision cutanée d’environ 2 cm de longueur est recommandée. Serrez la paroi abdominale gauche avec la pince de Pean (une pince atraumatique ou un rétracteur peut également être utilisé) et tirez le tissu vers le côté gauche de la souris pour sécuriser le champ chirurgical (Figure 2C droite). Après laparotomie, diminuer le pourcentage d’isoflurane à 1,0-1,5% pour l’entretien de l’anesthésie.
  4. Utilisez un coton-tige pour mobiliser l’intestin grêle et le gros intestin vers le côté droit de la souris (c.-à-d. le côté gauche de l’opérateur). Le tissu adipeux blanc épididymaire gauche dans la cavité abdominale est situé dans la région inguinale gauche. Mobiliser le tissu adipeux blanc épididymaire et le testicule gauche à l’extérieur de l’abdomen (Figure 2D gauche) et étirer le tissu (2D droite).
  5. Utilisez une micropipette P200 munie d’une pointe de pipette de 200 μL pour recueillir tout le volume des îlots d’un tube de 1,5 mL muni d’un pipetage doux (figure 2E à gauche), en veillant à ce qu’il ne reste aucun îlot dans le tube lors de la collecte. Laisser les îlots collectés se déposer à l’extrémité de la pipette par gravité (figure 2E droite).
  6. Placez légèrement l’embout de la micropipette sur le tissu adipeux distendu. En prenant soin d’éviter un rinçage excessif du milieu/tampon à l’extrémité, ensemencez soigneusement les îlots sur le tissu (figure 2F à gauche). Après l’ensemencement, confirmer le placement correct des îlots sous un microscope à dissection (figure 2F droite).
  7. Couvrir les îlots avec le tissu adipeux blanc épididymaire (Figure 2G). L’utilisation de sutures ou d’agents bioliants n’est pas nécessaire.
  8. Placez le testicule gauche sous le tissu adipeux blanc épididymaire et replacez les tissus dans la cavité intrapéritonéale (Figure 2H). Fermez la peau en deux couches (péritoine, puis muscle et peau) à l’aide d’une suture 4-0 (toutes les sutures telles que le nylon ou les sutures résorbables peuvent être utilisées) (Figure 2I). Injecter de l’acide acétylsalicylique (300 mg/kg; SQ) près de la plaie pour l’analgésie postopératoire. Placez ensuite la souris sous une lampe chauffante et surveillez jusqu’à récupération complète.

4. Surveillance après la transplantation d’îlots pancréatiques (résumé)

  1. Évaluer les effets thérapeutiques de la transplantation d’îlots pancréatiques en surveillant la glycémie, le test de tolérance au glucose et l’évaluation histologique au jour postopératoire (POD) 28.
    1. Surveiller la glycémie, y compris les mesures de la glycémie au test de tolérance au glucose, à l’aide d’un petit glucomètre.
    2. Prélevez les échantillons de sang (un peu de microlitres) dans la veine de la queue. En ce qui concerne l’évaluation histologique, l’insuline murine (pour détecter les îlots greffés) et le facteur von Willebrand (pour la détection des vaisseaux, ce qui est une preuve de la greffe d’îlots) ont été détectés dans les îlots transplantés dans le tissu adipeux épididymaire récupéré par immunohistochimie.

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Representative Results

Pour comparer l’efficacité de la transplantation d’îlots couverts de graisse à celle après la transplantation intrapéritonéale d’îlots, le même nombre d’îlots a été implanté sur le péritoine à l’espace paracolique gauche des animaux diabétiques receveurs témoins. On a observé que la glycémie des souris ayant subi une transplantation d’îlots couverts de graisse diminuait graduellement et significativement par rapport aux souris transplantées d’îlots intrapéritonéaux (p = 0,0023; Figure 3A). Un mois après la transplantation, la glycémie chez les souris ayant subi une greffe d’îlots couverts de graisse a été maintenue à des niveaux inférieurs à ceux observés chez les souris transplantées d’îlots intrapéritonéaux, évaluée par un test de tolérance au glucose intrapéritonéale (p = 0,0046; Figure 3B). En outre, comme nous l’avons déjà fait, les niveaux plasmatiques d’insuline se sont également améliorés après la transplantation d’îlots couverts de graisse. Une réélévation de la glycémie a également été confirmée. Ces données démontrent que la transplantation intrapéritonéale d’îlots couverts de graisse à l’aide de 200 QEI peut améliorer considérablement les conditions diabétiques des souris receveuses.

Un examen histologique a également été effectué pour évaluer la greffe d’îlots dans le tissu adipeux blanc épididymaire. Chez les animaux receveurs d’îlots pancréatiques couverts de graisse, la coloration à l’hématoxyline-éosine révèle la présence d’îlots dans le tissu adipeux blanc épididymaire (Figure 3C, image du haut). De plus, la coloration par anticorps conjugués à la fluorescence des îlots insulino-positifs a facilité la détection de microvaisseaux à facteur von Willebrand positif dans le tissu adipeux blanc épididymaire de toutes les souris receveuses (n = 6 ; Figure 3C). En revanche, chez les souris transplantées d’îlots intrapéritonéaux, aucun îlot greffé n’a été observé dans le tissu adipeux blanc épididymaire ou dans la paroi abdominale (données non présentées).

Figure 1
Figure 1-ABC. Préparation des îlots pour la transplantation sur le tissu adipeux épididymaire et recouvert de tissu adipeux blanc épididymaire. (A) Préparation des instruments : a. aide à pipette, b. embouts de pipettes de 10 mL, tubes en plastique d’environ 50 mL, d. tubes en plastique de 15 mL, e. micropipettes de 50 à 200 μL (à gauche) et 200 à 1000 μL (à droite), f. tubes à centrifuger en plastique de 1,5 mL, g. embouts de micropipettes de 200 et 1000 μL, h. milieu ou tampon contenant de l’albumine ou du sérum fœtal bovin (c.-à-d. DMEM à faible teneur en glucose contenant 10 % de sérum fœtal de bovin et 100 U/mL de pénicilline + 100 U/mL de solution de streptomycine), et i. crépine cellulaire de 40 μm. (B) Îlots isolés avec tissus acineux (à gauche: indiqués par une flèche) et fibreux (à droite). Barre d’échelle = 200 μm. (C) Îlots collectés dans le tube en plastique. À gauche, îlots dispersés dans le plat de culture. Au centre, les îlots sont collectés au centre du plat de culture par tourbillon. À droite, îlots collectés au centre du plat. Barre d’échelle = 200 μm.  Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 1
Figure 1-DEF. Préparation des îlots pour la transplantation sur le tissu adipeux épididymaire et recouvert de tissu adipeux blanc épididymaire. (D) Les îlots collectés (à gauche) sont transférés dans des tubes en plastique de 15 mL (à droite). (E) La crépine cellulaire de 40 μm est placée sur le tube en plastique de 50 mL (gauche et centre). Milieu préparé / tampon ajouté à un autre tube en plastique de 50 ml pour rincer les îlots sur la passoire cellulaire dans une nouvelle boîte de culture (à droite). f) 1. Îlots collectés à l’aide d’une micropipette de 200 à 1000 μL. 2. Les îlots se sont déversés dans la passoire cellulaire. 3 et 4. Milieu/tampon utilisé pour rincer les îlots sur la passoire dans un nouveau plat de culture. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 1
Figure 1-GH. Préparation des îlots pour la transplantation sur le tissu adipeux épididymaire et recouvert de tissu adipeux blanc épididymaire. (G) Îlots divisés en tube centrifuge en plastique de 1,5 mL selon le nombre de souris receveuses. Ici, deux cents équivalents îlots de 100 à 200 μm (IEQ) ont été divisés également dans chaque tube. (H) Îlots divisés également dans des tubes de 1,5 mL avant centrifugation (à gauche). Îlots centrifugés pour se recueillir au fond du tube (centre). 20-30 μL de surnageant restent dans le tube après élimination de l’excès de solution (à droite). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2-ABC. La procédure de transplantation d’îlots sur le tissu adipeux épididymaire et le revêtement à l’aide de tissu adipeux blanc épididymaire. (A) Préparation des instruments: a. machine d’anesthésie pour petits animaux, b. stéréomicroscope, c. source lumineuse, d. instruments chirurgicaux désinfectés, e. îlots divisés dans des tubes en plastique de 1,5 mL, f. micropipettes de 50-200 μL, g. 200 μL de pointes de micropipettes et h. 4-0 sutures. (B) Souris receveuse diabétique en décubitus dorsal sous anesthésie générale d’isoflurane à 2 % (à gauche). L’abdomen et la région inguinelle sont désinfectés à l’aide d’éthanol à 70 % et recouverts d’une lingette de laboratoire en papier (à droite). (C) La peau est incisée à la position médiane inférieure (à gauche). La paroi abdominale gauche est serrée par une pince de Pean et tirée vers le côté gauche de la souris pour sécuriser le champ chirurgical (à droite). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2-DEF. La procédure de transplantation d’îlots sur le tissu adipeux épididymaire et le revêtement à l’aide de tissu adipeux blanc épididymaire. (D) Le tissu adipeux blanc épididymaire gauche et le testicule gauche sont mobilisés à l’extérieur de l’abdomen (gauche) et distendus (à droite). Barre d’échelle = 1 cm. (E) Les îlots dans des tubes en plastique de 1,5 mL sont complètement collectés à l’aide d’une micropipette munie d’une pointe de pipette de 200 μL (à gauche). Les îlots collectés (indiqués par une flèche) ont été laissés couler complètement par gravité jusqu’à la pointe de la pipette (à droite). (F) Pointe de micropipette légèrement placée sur le tissu adipeux distendu (à gauche). Ensemencement des îlots (cercle pointillé) sur le tissu confirmé par dissection au microscope (à droite). Barre d’échelle = 1 cm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2-GHI. La procédure de transplantation d’îlots sur le tissu adipeux épididymaire et le revêtement à l’aide de tissu adipeux blanc épididymaire. (G) Les îlots sont recouverts de tissu adipeux blanc épididymaire. (H) Testicule gauche et tissu adipeux blanc épididymaire retournés dans la cavité intrapéritonéale. (I) Image après fermeture de l’abdomen. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Graphique 3. L’effet thérapeutique de la transplantation d’îlots couverts de graisse. (A) Taux de glucose dans le sang. Ligne bleue : transplantation d’îlots couverts de graisse (n = 6); Ligne orange : transplantation intrapéritonéale d’îlots pancrétinaux (n = 6) Une analyse statistique a été effectuée à l’aide de mesures répétées et une analyse de variance a été définie comme p < 0,05. (B) Glycémie provenant du test de tolérance au glucose un mois après la transplantation. Ligne bleue : transplantation d’îlots couverts de graisse (n = 6); Ligne orange : transplantation intrapéritonéale d’îlots pancréales (n = 6). L’analyse statistique a été effectuée à l’aide d’une analyse de variance à mesures répétées et une différence significative a été définie comme p < 0,05. (C) Image histologique des îlots greffés un mois après la transplantation. Image du haut : coloration à l’hématoxyline-éosine; Image du bas : immunohistocoloration pour l’insuline murine (vert) et le facteur von Willebrand (vWF : rouge, indiqué par une flèche blanche). Barre d’échelle = 100 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Discussion

La méthode de transplantation d’îlots couverts de graisse intègre des techniques de deux techniques de transplantation différentes: la transplantation intrapéritonéale d’îlots et la transplantation intra-adipeuse d’îlots adipeux. Comme la membrane superficielle du tissu adipeux blanc épididymaire est considérée comme le tissu adipeux blanc qui est recouvert par le péritoine et qui est attaché à l’épididyme, la méthode de transplantation d’îlots couverts de graisse peut être anatomiquement classée comme un type de transplantation d’îlots intrapéritonéaux. La technique par laquelle les îlots sont livrés à l’animal receveur, cependant, est plus similaire à celle utilisée dans la transplantation intra-adipeuse d’îlots pancréteurs. Nos données montrent que l’effet thérapeutique de la méthode de transplantation d’îlots couverts de graisse est supérieur à celui de la transplantation intrapéritonéale d’îlots. Notre étude précédente a également montré que l’efficacité de transplantation de cette méthode est presque égale à celle de la transplantation d’îlots sous-capsulaires rénaux, une méthode de transplantation d’îlots avec une efficacité de transplantation suprême23. On suppose que l’utilité de cette méthode peut être due aux molécules d’adhésion présentes dans les tissus adipeux blancs et les adipocytokines et dont on pense qu’elles contribuent à la greffe d’îlots10,23.

La taille du tissu adipeux blanc épididymaire permet d’accueillir un grand volume d’îlots. En revanche, le grand épiploon du rongeur est trop petit pour contenir et accéder facilement à de nombreux îlots. La seule limitation physique du tissu adipeux blanc épididymaire en tant que site expérimental potentiel de transplantation d’îlots est qu’il ne fournit pas de circulation portale de l’insuline10.

La méthode est unique parce que les îlots sont recouverts de tissus adipeux, au lieu d’être directement infusés dans le tissu. Les îlots transplantés de tissu intra-adipeux peuvent souffrir de l’influence de la lipotoxicité, car la fonction altérée de l’insuline chez les animaux diabétiques peut entraîner un excès d’acides gras libres32. Cette méthode ne nécessite pas non plus d’agents de bioliaison ou de suture pour éviter la perte d’îlots implantés. Comme l’observe la figure 3C, les îlots restent greffés avec succès dans le tissu adipeux jusqu’à 1 mois après la greffe et le maintien de la glycémie a été confirmé après la greffectomie23. Ce phénomène peut être dû à la capacité du tissu adipeux à piéger les îlots, qui deviennent difficiles à décoller.

Les avantages de cette méthode sont qu’elle est techniquement facile à réaliser, permet une évaluation métabolique et histologique des effets thérapeutiques des îlots et facilite l’évaluation de l’expression du gène et/ou de la protéine des îlots pancréatiques après grefftectomie. Par rapport aux études précédentes, l’efficacité de cette méthode n’est pas inférieure à celle de la transplantation d’îlots dans le tissu adipeux blanc épididymaire 10,33,34,35,36. Il est important de noter qu’un ensemencement précis des îlots sur le tissu adipeux blanc épididymaire sans perte d’îlots est nécessaire pour une greffe réussie. Pour assurer le succès, tout le volume des îlots doit être aspiré doucement dans l’extrémité de la micropipette à partir du tube en plastique de 1,5 mL, car un pipetage rugueux et rapide peut entraîner une adhérence de l’îlot aux parois du tube en plastique, ce qui rend la distribution difficile. L’adhérence des îlots est l’une des principales raisons de l’ensemencement inadéquat des îlots. Après avoir laissé les îlots se déposer à l’extrémité de l’extrémité de la micropipette, les îlots doivent être implantés sur le tissu adipeux épididymaire sans rinçage. Il est important de minimiser la dépression du bouton du piston lors de l’aspiration et de la distribution des îlots afin d’éviter un rinçage excessif du tissu adipeux. Par conséquent, il est essentiel d’attendre que les îlots se soient complètement agrégés à l’extrémité de la pointe de la micropipette avant d’appuyer sur le bouton du piston de la micropipette pour l’implantation. Il suffit de placer légèrement l’extrémité sur le tissu adipeux et de confirmer l’ensemencement des îlots sur le tissu par microscopie optique.

En conclusion, cette méthode est très simple, bien qu’elle nécessite plusieurs étapes critiques pour son succès. Nous espérons que cette méthode sera largement adoptée pour faciliter la greffe d’îlots sur le tissu adipeux blanc et pour une évaluation plus approfondie des effets thérapeutiques des îlots issus de la bioingénierie.

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Disclosures

Nous n’avons aucun conflit d’intérêts.

Acknowledgments

Cette étude a été financée par une subvention pour la recherche scientifique (C) (19K09839, NS) du ministère de l’Éducation, de la Culture, des Sports, de la Science et de la Technologie du Japon.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
4-0 Nylon Alfresa ER2004NA45-KF2 Closing abdomen
Alexa 488-conjugated donkey anti-guinea pig Jackson Immunoresearch 706-546-148 Secondary antibody for insulin antibody
Alexa 647-conjugated donkey anti-rabbit Jackson Immunoresearch 711-606-152 Secondary antibody for von Willebrand factor antibody
DMEM, low glucose, pyruvate ThermoFisher Scientific 11885084 Culturing islets, transplanting islets
Eosin Fujifilm Wako Chemicals 051-06515 Using for staining tissue by eosin
Eppendorf Safe-Lock Tubes, 1.5 mL Eppendorf 30120086 Collecting islets 
Falcon 15 mL Conical Centrifuge Tubes Corning 352095 Collecting islets
Falcon 40 µm Cell Strainer Falcon 352340 Using for separating islets from other pancreatic tissue
Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tubes Corning 352070 Discarding excessive medium/buffer
Guinea pig anti-insulin Agilent Technologies Japan, Ltd. (Dako) IR002 Primary antibody for murine insulin
Hematoxylin Muto Pure Chemicals Co., Ltd. 30002 Using for staining tissue by hematoxylin
Isodine solution 10% Shionogi&Co., Ltd. no catalog number Using for disinfection
Isoflurane Fujifilm Wako Chemicals 095-06573 Using for anesthesia
Labcon 1000 µL ZapSilk Low Retention Pipette Tips Labcon 1177-965-008 Using for separating islets from other pancreatic tissue
Labcon 200 µL ZapSilk Low Retention Pipette Tips Labcon 1179-965-008 Using for seeding islets onto epididymal white adipose tissue
Mintsensor Sanwa Kagaku Kenkyusho Co. Ltd., 8AEB02E Using for monitoring blood glucose
Pipetteman P-1000 Gilson F123602 Using for separating islets from other pancreatic tissue
Pipetteman P-200 Gilson F123601 Using for seeding islets onto epididymal white adipose tissue
Rabbit anti-vWF Abcam ab6994 Primary antibody for murine von Willebrand factor

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Médecine numéro 171 transplantation d’îlots tissu adipeux blanc coussinet adipeux épididymaire intrapéritonéal souris modèle expérimental
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Sakata, N., Yoshimatsu, G., Kawakami, R., Kodama, S. Fat-Covered Islet Transplantation Using Epididymal White Adipose Tissue. J. Vis. Exp. (171), e62096, doi:10.3791/62096 (2021).

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