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Medicine

गंभीर अंडाशय रोग के साथ रोगियों में प्रजनन संरक्षण

Published: March 25, 2021 doi: 10.3791/62098
Automatic Translation
1, 1
1Advanced Reproduction Medicine Research Center, Department of Obstetrics and Gynecology, International University of Health and Welfare School of Medicine

Summary

हम गंभीर अंडाशय रोग के रोगियों के लिए अंडाशय के रोम के दवा मुक्त इन विट्रो एक्टिवेशन (आईवीए) के लिए प्रयोगशाला प्रक्रियाओं का विवरण प्रस्तुत करते हैं। यह विधि अंडाशय हाइपरस्टिमुलेशन प्रति पुनः प्राप्त करने योग्य ओसाइट्स की संख्या में वृद्धि कर सकती है और उन रोगियों के लिए प्रजनन संरक्षण को लाभ पहुंचा सकती है।

Abstract

ओवेरियन फंक्शन में उम्र बढ़ने के दौरान और कुछ रोगविज्ञानी स्थितियों में उत्तरोत्तर गिरावट आती है जिसमें कारियोटाइप असामान्यता, ऑटोइम्यून रोग, कीमो और विकिरण-उपचार, साथ ही ओवेरियन सर्जरी शामिल हैं। गंभीर अंडाशय रोग के साथ अविवाहित महिलाओं में, प्रजनन संरक्षण भविष्य गर्भधारण के लिए महत्वपूर्ण है । यद्यपि ओसाइट क्रायोप्रिजर्वेशन प्रजनन संरक्षण के लिए एक स्थापित विधि है, लेकिन ये रोगी ओवेरियन हाइपरस्टिमुलेशन के बाद भी सीमित संख्या में ओसाइट्स को संरक्षित कर सकते हैं, जिससे भविष्य की गर्भावस्था की गारंटी के लिए पर्याप्त ओसाइट्स सुनिश्चित करने के लिए बार-बार उत्तेजनाएं होती हैं। इस मुद्दे को हल करने के लिए, हमने हाल ही में एक दवा मुक्त इन विट्रो एक्टिवेशन (आईवीए) प्रक्रिया विकसित की है, जो हमें अंडाशय के रोम के प्रारंभिक चरणों को पूर्वनिर्वास चरण में विकसित करने के लिए प्रोत्साहित करने में सक्षम बनाता है । ये प्रीएंट्राल रोम गोंडोट्रोपिन उत्तेजना के अद्वितीय प्रोटोकॉल का जवाब दे सकते हैं, जिसके परिणामस्वरूप क्रायोप्रिजर्वेशन के लिए प्रति ओवेरियन उत्तेजना प्राप्त ओसाइट्स की संख्या में वृद्धि हुई है। दवा मुक्त IVA शल्य चिकित्सा दृष्टिकोण और अंडाशय उत्तेजना से शामिल थे। हमने लेप्रोस्कोपिक सर्जरी के तहत रोगियों से एक या दोनों अंडाशय से कॉर्टेक्स का एक हिस्सा हटा दिया। हिप्पो सिग्नलिंग मार्ग को बाधित करने और प्रारंभिक चरण के रोम के विकास को प्रोत्साहित करने के लिए अंडाशय कॉर्टिकल ऊतकों को छोटे क्यूब्स में काटा गया था। इन क्यूब्स को ऑर्थोट्रॉपिक रूप से शेष अंडाशय के साथ-साथ दोनों फैलोपियन ट्यूबों के सेरोसा के नीचे कलम किया गया था। हम पहले से ही दवा मुक्त IVA की शल्य प्रक्रिया और बाद में अंडाशय उत्तेजना के प्रोटोकॉल प्रकाशित किया है, लेकिन इसके बाद हम दवा मुक्त IVA के लिए आवश्यक प्रयोगशाला तरीकों का विवरण प्रस्तुत करते हैं ।

Introduction

उम्र बढ़ने और कुछ रोगविज्ञानी स्थितियों के दौरान ओवेरियन फंक्शन में उत्तरोत्तर गिरावट आती है जिसमें कारियोटाइप असामान्यता, ऑटोइम्यून रोग, कीमो-और विकिरण-उपचार, और ओवेरियन सर्जरी शामिल हैं। प्रजनन संरक्षण गंभीर अंडाशय रोग के साथ अविवाहित महिलाओं के लिए सबसे अच्छा विकल्प में से एक है भविष्य गर्भावस्था के लिए अपनी क्षमता को बनाए रखने के लिए । प्रजनन संरक्षण के लिए, वर्तमान में दो तरीके ज्यादातर ऑन्को-फर्टिलिटी क्षेत्र में उपलब्ध हैं। ओसाइट क्रायोप्रिजर्वेशन प्रजनन संरक्षण के लिए एक अच्छी तरह से स्थापित प्रक्रिया है और कई सफल मामलों की सूचना दी गई है1,2. दूसरी ओर, कैंसर रोगियों में प्रजनन संरक्षण के लिए ओवेरियन ऊतक क्रायोप्रिजर्वेशन भी स्थापित किया गया था लेकिन यह अभी भी एक प्रयोगात्मक रणनीति3,4है। दोनों तरीकों में, गर्भावस्था होने के लिए परिपक्व ओसाइट्स की कई संख्याओं की आवश्यकता होती है। आम तौर पर, समय से पहले अंडाशय अपर्याप्तता (पीओआई) वाले रोगियों, जो 40 वर्ष की आयु से पहले एमेनोरिया बन जाते हैं, और कम ओवेरियन रिजर्व वाली मध्यम आयु वर्ग की महिलाओं ने परिपक्वओसाइट्स5,6,7उपज के लिए अंडाशय उत्तेजना के लिए खराब अंडाशय प्रतिक्रिया (पीओआर) दिखाया। इसके अलावा, एंट्रल रोम की कम संख्या वाले युवा रोगियों ने ओवेरियन उत्तेजना7को पीओआर भी दिखाया। इन रोगियों को उचित अंडाशय अतिउत्सुलेशन के बाद भी पुनः प्राप्त करने योग्य ओसाइट्स की बहुत सीमित संख्या है, इस प्रकार गर्भावस्था के लिए पर्याप्त संख्या में ओसाइट्स सुनिश्चित करने के लिए कई महंगी प्रक्रियाओं की आवश्यकता होती है।

Oocyte दान पति के शुक्राणु और भ्रूण हस्तांतरण (ईटी) के साथ इन विट्रो निषेचन (आईवीएफ) के बाद इन POI और POR रोगियों के लिए एकमात्र विकल्प है जो अपने स्वयं के oocytes8,9,10प्राप्त करने में कठिनाइयों है । हालांकि , ओसाइट दान नैतिक मुद्दों के साथ - साथ ऑटोइम्यून और गर्भावस्था की जटिलताओं11 , 12,13,14से जटिल है । इन मुद्दों को हल करने के लिए, रोगियों के अपने oocytes का उपयोग कर बांझपन उपचार की स्थापना वांछित है । पीओआई रोगियों के लिए, हमने सफल कूप विकास और परिपक्व ओसाइट्स की पीढ़ी की अनुमति देने के लिए इन विट्रो एक्टिवेशन (आईवीए) दृष्टिकोण विकसित किया है, जिससे कई गर्भधारण और प्रसव15हैं। IVA में, हमने लेप्रोस्कोपिक सर्जरी के तहत अंडाशय को हटाने के बाद अंडाशय के कॉर्टेक्स को खंडित किया और उन्हें दो दिनों तक सुसंस्कृत किया ताकि अकेट-उत्तेजक दवाओं द्वारा रोम को सक्रिय किया जा सके और फिर दूसरी लेप्रोस्कोपिक सर्जरी15के तहत फैलोपियन ट्यूबों के सेरोसा के नीचे बने कृत्रिम पाउच में हेट्रोटोपिक ग्राफ्टिंग वापस करें। इस प्रक्रिया ने हिप्पो सिग्नलिंग व्यवधान16को बढ़ावा देने के लिए ओवेरियन कॉर्टेक्स विखंडन के बाद मौलिक, प्राथमिक और माध्यमिक रोम के विकास को बढ़ावा दिया, इसके बाद दो दिनों की संस्कृति के साथ एकेटी सिग्नलिंग उत्तेजक17।

गंभीर पीओआई मामलों के विपरीत, कम अंडाशय रिजर्व वाले पीओआर रोगियों में कई माध्यमिक रोम होते हैं। क्योंकि हिप्पो सिग्नलिंग व्यवधान अकेले माध्यमिक कूप विकास16को बढ़ावा देने में प्रभावी है, हमने हाल ही में एकेटी उत्तेजक दवाओं के उपचार के बिना कॉर्टिकल विखंडन और ऑर्थोटोपिक ग्राफ्टिंग शामिल दवा-मुक्त IVA प्रक्रिया का उपयोग करके पीओआर रोगियों के लिए सफल गर्भधारण और प्रसव का प्रदर्शन किया। दवा मुक्त आईवीए केवल एक सर्जरी के बाद प्रीएंट्राल कूप चरण में विकसित करने के लिए अंडाशय के रोम के प्रारंभिक चरण को उत्तेजित करता है और आईवीएफ-भ्रूण हस्तांतरण15,18के लिए प्राप्त ओसाइट्स की संख्या में वृद्धि करता है। दवा मुक्त IVA दृष्टिकोण के रूप में 1 द्वारा हमारे मूल IVA के साथ तुलना में कई फायदे हैं) संस्कृति के दौरान संभावित कूप हानि से परहेज, 2) आक्रामकता और दूसरी सर्जरी की लागत को कम करने, 3) केवल अल्पकालिक पोस्ट सर्जरी बिस्तर आराम और 4) आर्थोटोपिक ग्राफास के कारण सहज गर्भावस्था की क्षमता शामिल है । हमने हाल ही में एक वीडियो लेख प्रकाशित किया जिसमें सर्जरी20के बाद दवा मुक्त आईवीए19 की सर्जिकल प्रक्रियाएं और अंडाशय उत्तेजना के विस्तृत प्रोटोकॉल दिखाए गए हैं। यहां, हम दवा मुक्त IVA के लिए आवश्यक प्रयोगशाला विधियों का विवरण प्रस्तुत करते हैं ।

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Protocol

लिखित सूचित सहमति प्रत्येक पीओआर रोगी से अंडाशय रिजर्व कम होने के साथ प्राप्त की गई थी, जिसने दवा मुक्त आईवीए उपचार में नामांकित किया था । इस अध्ययन को इंटरनेशनल यूनिवर्सिटी ऑफ हेल्थ एंड वेलफेयर (नंबर 17-एस-21) की एथिकल कमेटी ने मंजूरी दी थी। नैदानिक परीक्षण संख्या UMIN000034464 के तहत पंजीकृत किया गया था और विश्व चिकित्सा संघ (हेलसिंकी की घोषणा) की आचार संहिता के अनुसार किया जाता है ।

1. ओवेरियन कॉर्टेक्स निष्कर्षण

  1. लेप्रोस्कोपिक सर्जरी के माध्यम से सामान्य संज्ञाहरण के तहत एक या दोनों अंडाशय से ओवेरियन कॉर्टेक्स (10 x 10 मिमी,2-3मिमी मोटाई) का हिस्सा हटाएं जैसा कि पिछले वर्णित19,20।
  2. एकत्र अंडाशय प्रांतस्थाओं को एक बाँझ कंटेनर में रखें जिसमें संशोधित एचटीएफ (एमएचटीएफ) की 10 एमएल 37 डिग्री सेल्सियस पर हो।

2. ओवेरियन कॉर्टेक्स विखंडन

नोट: ओवेरियन कॉर्टेक्स के विच्छेदन से पहले, एमएचटीएफ को 37 डिग्री सेल्सियस तक गर्म करें। प्रक्रिया के दौरान बाँझ स्थितियों को बनाए रखें। इस प्रक्रिया के लिए सभी उपकरण सामग्री की तालिकामें सूचीबद्ध हैं।

  1. एकत्र किए गए ओवेरियन कॉर्टेक्स को 37 डिग्री सेल्सियस पर एमएचटीएफ के 5-10 एमएल वाले प्लास्टिक डिश में रखें और टिश्यू को 37 डिग्री सेल्सियस(चित्रा 2 ए)पर बनाए रखने के लिए उन्हें हीट प्लेट पर रखें।
  2. रोगी पृष्ठभूमि डेटा को लिंक करने के लिए अगली प्रक्रिया शुरू करने से पहले रोगी के नाम के साथ एक डिजिटल कैमरे का उपयोग करके प्रत्येक कॉर्टेक्स की तस्वीर लें।
  3. एमएचटीएफ(चित्रा 2B)के साथ नम एक बाँझ धुंध पर एक व्यक्तिगत प्रांतस्था रखें।
    नोट: इस प्रक्रिया के दौरान कॉर्टेक्स की सतह को सूखने से रोकने के लिए धुंध पर एक डिस्पोजेबल पिपेट के साथ अतिरिक्त एमएचटीएफ लागू करें।
  4. अवशिष्ट मेडुला ऊतक को हटा दें जहां माइक्रो-कैंची का उपयोग करके गुलाबी दिखता है ताकि ऊतक की मोटाई 1-2 मिमी(चित्रा 2 सी और डी)तक पहुंच जाए।
    नोट: प्रारंभिक चरण में रोम के नुकसान से बचने के लिए, मोटाई में 1 मिमी से कम कॉर्टिकल स्ट्रिप्स तैयार न करें, क्योंकि प्रारंभिक चरण के रोम ओवेरियन कॉर्टेक्स 21 की सतह से1-2 मिमीके भीतर स्थित हैं।
  5. एक ठीक स्केलपेल का उपयोग करके प्रत्येक अंडाशय कॉर्टिकल स्ट्रिप से 1 मिमी x 1 मिमी x 5 मिमी ऊतक टुकड़ा विच्छेदन करें और अवशिष्ट रोम की उपस्थिति निर्धारित करने के लिए इसे हिस्टोलॉजिकल विश्लेषण के अधीन करें जैसा कि पिछले वर्णित18 (चित्रा 2E)।
    नोट: हिस्टोलॉजी के लिए विच्छेदित ऊतक एमएचटीएफ में डूबे हुए हैं और फिक्सिंग तक 4 डिग्री सेल्सियस पर रखें(चित्रा 2F,चरण 4 देखें)।
  6. कॉर्टेक्स को फाइन स्केलपेल(चित्रा 2G)का उपयोग करके 1 मिमी x 1 मिमी x 10 मिमी स्ट्रिप्स में काट लें।
    नोट: उस पर खींचने की तुलना में स्केलपेल पर नीचे दबाकर कटौती करना आसान है।
  7. इन टिश्यू स्ट्रिप्स को 1 एमएम एक्स 1 एमएम एक्स 1 एमएम छोटे क्यूब्स(चित्रा 2H)में काटें ।
    नोट: माध्यम में ऑस्मोटिक दबाव के परिवर्तन से बचने के लिए, ऊतक ऑटोबेड़ा से पहले मॉडरेशन में एमएचटीएफ जोड़ें।

3. ओवेरियन कॉर्टिकल टुकड़ों की ऑटो ग्राफ्टिंग

  1. आईवी कैनुला के पैकेज को खोलें और इसे बाँझ कपड़े पर रखें।
  2. कई बार एमएचटीएफ को एस्पिरेशन और डिस्चार्ज करके एमएचटीएफ के साथ आईवीए कैनुला के अंदर कुल्ला करें।
  3. लोडिंग(चित्रा 3 ए)के दौरान कॉर्टिकल क्यूब्स को सूखने से बचने के लिए आईवीए कैनुला की नोक को भरने के लिए एमएचटीएफ के 100-200 माइक्रोन को एस्पिरेट करें।
  4. एक ठीक चिमटी(चित्रा 3B-ई)का उपयोग कर IVA cannula की नोक में कॉर्टिकल क्यूब्स लोड करें ।
    नोट: लोडिंग के लिए कॉर्टिकल क्यूब्स की संख्या ग्राफ्टिंग साइट पर निर्भर करती है। आम तौर पर, 20-30 क्यूब्स को ऑर्थोपॉपिक शेष अंडाशय में प्रत्यारोपित किया जा सकता है, जबकि 10-15 क्यूब्स को फैलोपियन ट्यूब के सेरोसा के नीचे एक थैली में प्रत्यारोपित किया जा सकता है।
  5. कॉर्टिकल क्यूब्स लोड करने के बाद, IVA कैनुला को सर्जन को स्थानांतरित करने तक उंगलियों द्वारा कॉर्टिकल क्यूब्स युक्त कैनुला की नोक पकड़ें। इससे क्यूब का तापमान घटने से बच जाएगा।
    नोट: लेप्रोस्कोपिक सर्जरी के तहत ऑटोबेड़ा प्रक्रिया का विवरण पहले19रिपोर्ट किया गया है । अंडाशय कॉर्टिकल क्यूब्स ग्राफ्टिंग के लिए, एक कैनुला के आकार का उपकरण (IVA कैनुला) हमारे सहयोगी, किटाजाटो कॉर्पोरेशन द्वारा विकसित किया गया था।

4. ओवेरियन कॉर्टेक्स का हिस्टोलॉजिकल विश्लेषण

नोट: अवशिष्ट रोम की संख्या गिनती करने के लिए, पिछले वर्णित15के रूप में हिस्टोलॉजिकल विश्लेषण करते हैं ।

  1. नमूना निर्धारण से पहले एक ऊतक अंकन डाई के साथ कॉर्टिकल स्ट्रिप सतह को चिह्नित करें। इससे हिस्ता विज्ञान के लिए स्ट्रिप में कॉर्टेक्स का पक्ष पता चल जाएगा।
  2. बोइन के समाधान का उपयोग करके ऊतक स्ट्रिप्स को रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर ठीक करें।
    नोट: अतीक रोम का पता लगाने के लिए, हम ओसाइट साइटोप्लाज्म के सिकुड़न से बचने के लिए फिक्सिंग के लिए पैराफॉर्मेल्डिहाइड का उपयोग करने की सलाह नहीं देते हैं।
  3. पैराफिन में टिश्यू स्ट्रिप्स को डिहाइड्रेट और एंजॉय करें।
  4. ऊतक नमूने वाले पैराफिन ब्लॉक को क्रमबद्ध रूप से अनुभाग करें।
  5. रोम की कल्पना करने के लिए हेमेटॉक्सीलिन और ईओसिन का उपयोग करके प्रत्येक अनुभाग को दाग दें।
  6. पहले बताए गए रोमों की गणनाकरें 17.

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Representative Results

आईवीए दृष्टिकोण15के पहले प्रकाशन में, हमने लेप्रोस्कोपिक सर्जरी(चित्रा 1 ए)के तहत ओवेरियन कॉर्टिकल क्यूब्स को एक-एक करके ग्राफ्टिंग साइटों में प्रत्यारोपित किया। क्योंकि 100-150 अंडाशय क्यूब्स का इस्तेमाल किया गया था, इसलिए लेप्रोस्कोपिक सर्जरी के तहत टिश्यू ग्राफ्टिंग के लिए 3-4 घंटे लग गए । इसके अलावा, ग्राफ्टिंग से पहले कुछ अंडाशय के क्यूब्स खो गए थे। क्योंकि IVA cannula एक समय(चित्रा 1B)में एक ग्राफ्टिंग साइट के लिए 20-30 क्यूब्स स्थानांतरित कर सकता है, हम 1-2 घंटे के लिए आपरेशन समय छोटा कर सकता है । इसके अलावा, IVA कैनुला सर्जरी के दौरान अंडाशय कॉर्टिकल क्यूब्स के नुकसान को खत्म कर सकता है।

Figure 1
चित्रा 1:आईवीए कैनुला की प्रभावशीलता। (ए)ओवेरियन कॉर्टिकल क्यूब्स को एक-एक करके संदंश का उपयोग करके प्रत्यारोपण करने के साथ पिछली विधि। (ख)आईवीए कैनुला का उपयोग करके एक समय में 20-30 क्यूब्स प्रत्यारोपण के साथ वर्तमान विधि। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2:दवा मुक्त IVA के लिए ओवेरियन ऊतक विच्छेदन। (ए)ओवेरियन कॉर्टेक्स का एक टुकड़ा 37 डिग्री सेल्सियस पर एमएचटीएफ युक्त प्लास्टिक डिश में रखा जाता है ।(B)अवशिष्ट मेडुला ऊतकों को हटाने के लिए ओवेरियन कॉर्टेक्स को एक नम धुंध पर रखा जाता है । (ग)मेडुला टिश्यू को बारीक माइक्रो-कैंची का इस्तेमाल करते हुए हटा दिया जाता है । (घ)तैयार किए जाने वाले कॉर्टेक्स की मोटाई 1 से 2 मिमी के बीच होती है।(ई)मेडुला टिश्यू को हटाने के बाद हर ओवेरियन कॉर्टिकल स्ट्रिप से 1 एमएम एक्स 1 एमएम एक्स 5 एमएम टिश्यू पीस को हिस्टोलॉजिकल एनालिसिस के लिए विच्छेदित किया जाता है। (च)विच्छेदित ऊतक को 1.5 एमएल ट्यूब में संग्रहित किया जाता है जिसमें 1.5 एमएल ट्यूब में 4 डिग्री सेल्सियस पर एमएचटीएफ होता है जब तक कि हिस्टोलॉजी के लिए फिक्सिंग नहीं होती है। (जी और एच)ओवेरियन कॉर्टेक्स को 1 एमएम एक्स 1 एमएम एक्स 10 एमएम स्ट्रिप्स में काटा जाता है और फिर फाइन स्केलपेल का इस्तेमाल करते हुए 1 एमएम एक्स 1 एमएम एक्स 1 एमएम छोटे क्यूब्स में काट दिया जाता है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्र 3:अंडाशय कॉर्टिकल टुकड़ों की ऑटो ग्राफ्टिंग। (क)क्यूब्स लोड करने से पहले, 100-200 μL एमएचटीएफ को आईवीए कैनुला की नोक को भरने के लिए एस्पिरेटेड किया जाता है ताकि कॉर्टिकल क्यूब्स को लोडिंग के दौरान सूखने से बचाया जा सके(बी-ई)लोडिंग ओवेरियन कॉर्टिकल क्यूब्स को आईवीए कैनुला की नोक में । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

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Discussion

इस पांडुलिपि में, हमने दवा मुक्त IVA के लिए एक विस्तृत प्रयोगशाला प्रोटोकॉल दिखाया। दवा मुक्त IVA माध्यमिक रोम विकास को बढ़ावा देने के लिए अंडाशय रिजर्व कम करने के साथ POR रोगी के लिए बांझपन उपचार का एक नया दृष्टिकोण है, जिसके परिणामस्वरूप अंडाशय उत्तेजना के बाद अधिक परिपक्व oocytes उपज और सफल गर्भावस्था में वृद्धि20। अंडाशय रिजर्व कम करने के साथ 15 POR रोगियों में, इस दृष्टिकोण ने एक सहज गर्भावस्था हासिल की, इन विट्रो निषेचन-भ्रूण हस्तांतरण ने चार जीवित जन्मों की अनुमति दी, एक साथ चल रही गर्भावस्था19के साथ।

ओवेरियन कॉर्टेक्स ग्राफ्टिंग की तैयारी के लिए, मेडुला ऊतक को 1-2 मिमी मोटाई के साथ माइक्रो-कैंची का उपयोग करके हटा दिया गया था। पहले, हमने दिखा दिया कि मौलिक, प्राथमिक और अधिकांश माध्यमिक रोम सामान्य अंडाशय रिजर्व21वाले रोगियों में अंडाशय प्रांतस्था की सतह से 1 मिमी मोटाई के भीतर स्थित थे। पीओआई रोगियों में, हमने पाया कि माध्यमिक रोम 1 मिमी से अधिक गहरे स्थित थे, लेकिन ओवेरियन कॉर्टेक्स 21 की सतह से2 मिमीके भीतर। 21 को मेडुला के ऊतकों में एंट्रल रोम छिद्रोंका पता लगाने के लिए जाना जाताहै, लेकिन पीओआई रोगियों में मेडुला ऊतकों में कोई कूप नहीं पाया गया । यद्यपि ओवेरियन रिजर्व कम होने वाले पोर रोगियों में मेडुला ऊतक में एंट्रल रोम हो सकते हैं, लेकिन रक्त वाहिका संचारकीकमी के कारण ग्राफ्टिंग के बाद एंट्रल रोम जीवित रहना मुश्किल है। इसलिए, हमने ओवेरियन कॉर्टेक्स की मोटाई 1-2 मिमी होने का निर्धारण किया और प्रोटोकॉल के भीतर महत्वपूर्ण कदम कीमती अवशिष्ट रोम के नुकसान से बचने के लिए कॉर्टिकल स्ट्रिप्स को 1-2 मिमी < नहीं बना रहा है। कॉर्टिकल स्ट्रिप्स और क्यूब्स की तैयारी के दौरान, हमने एमएचटीएफ का उपयोग किया, लेकिन कोई भी समान माध्यम का उपयोग कर सकता है जिसमें 4-(2-हाइड्रोक्सीथिल) -1-piperazineethanesulfonic एसिड (HEPES) बफर शामिल हैं।

इस प्रक्रिया में, हमने इसे 1 मिमी 3 क्यूब्स15,20में काटने के बाद ओवेरियन कॉर्टेक्स को प्रत्यारोपित किया। ग्राफ्टिंग के लिए ऐसे छोटे टुकड़ों को संभालने में कठिनाई के कारण, लेप्रोस्कोपिक सर्जरी के तहत एक-एक करके पिछले ग्राफ्टिंग ओवेरियन क्यूब्स को 3-4 घंटे लग गए, जिसमें कुछ क्यूब्स कभी-कभी सर्जरी के दौरान खो जाते हैं। IVA cannula के विकास के बाद, हम ऑपरेशन के समय को 1-2 घंटे तक छोटा कर सकते हैं, जिसके परिणामस्वरूप सर्जरी की आक्रामकता को कम करने के लिए दवा मुक्त IVA एक ही दिन की सर्जरी बनने की अनुमति है । इसके अलावा, हम सर्जरी के दौरान अंडाशय कॉर्टिकल क्यूब्स के नुकसान को खत्म कर सकते हैं। ओवेरियन रिजर्व कम होने के साथ पीओआर रोगियों में ओवेरियन कॉर्टेक्स में रोम की सीमित संख्या के कारण, अंडाशय कॉर्टिकल क्यूब्स के नुकसान से बचना महत्वपूर्ण है। यदि IVA कैनुला उपलब्ध नहीं है, तो आप लेप्रोस्कोपिक सर्जरी के तहत उपयोग करने में सक्षम होने के लिए एक समान कैनुला खोजने की कोशिश कर सकते हैं।

ओवेरियन फंक्शन का पतन उत्तरोत्तर उम्र बढ़ने और कुछ रोगविज्ञानी स्थितियों के कारण होता है 23,24,25. इस प्रकार, गंभीर अंडाशय की शिथिलता वाली अविवाहित महिलाओं में, भविष्य की गर्भावस्था की अनुमति देने के लिए प्रजनन संरक्षण महत्वपूर्ण है। इन रोगियों के लिए, ओसाइट्स या ओवेरियन ऊतक क्रायोप्रिजर्वेशन के तरीकों की रिपोर्ट की गई थी26,27,28,29। यद्यपि ओसाइट क्रायोप्रिजर्वेशन प्रजनन संरक्षण1,2के लिए एक स्थापित विधि है, लेकिन इन रोगियों को कम अंडाशय रिजर्व के कारण अंडाशय हाइपरस्टिमुलेशन के बाद भी बहुत सीमित संख्या में पुनः प्राप्त करने योग्य ओसाइट्स हो सकते हैं। इसके अलावा, अंडाशय की शिथिलता वाले वृद्धावस्था रोगियों में, ओवुलेटेड ओसाइट्स26,30में गुणसूत्र असामान्यताओं की उच्च घटनाओं की सूचना दी गई थी। यह गर्भावस्था की गारंटी के लिए पर्याप्त संख्या में ओसाइट्स सुनिश्चित करने के लिए कई महंगी प्रक्रियाओं की आवश्यकता की ओर जाता है। इन समस्याओं को हल करने के लिए, हमने ओसाइट पुनर्प्राप्ति के लिए परिपक्व ओसाइट्स की संख्या बढ़ाने के लिए दवा मुक्त आईवीए दृष्टिकोण विकसित किया है । क्योंकि ओसाइट क्रायोप्रिजर्वेशन अब एक प्रयोगात्मक विधि नहीं है31,32,दवा मुक्त आईवी जिसके बाद ओसाइट क्रायोप्रिजर्वेशन गंभीर अंडाशय की शिथिलता वाली अविवाहित महिलाओं में प्रजनन संरक्षण के लिए एक आशाजनक तरीका होने की उम्मीद है। हालांकि, दवा मुक्त IVA से प्राप्त फ्रीज-गल oocytes का उपयोग कर भविष्य नैदानिक अध्ययन गंभीर अंडाशय रोग के साथ अविवाहित महिलाओं में प्रजनन संरक्षण के लिए इस दृष्टिकोण की प्रभावशीलता का निर्धारण करने के लिए आवश्यक हो जाएगा ।

अंत में, हमने ओवेरियन रिजर्व को कम करने के साथ पीओआर रोगी के लिए बांझपन उपचार के एक नए दृष्टिकोण के रूप में दवा मुक्त IVA विकसित किया और हमारी प्रक्रियाओं को दोहराने में सक्षम होने के लिए विस्तार प्रयोगशाला प्रोटोकॉल दिखाया। दवा मुक्त IVA की पद्धतिगत सीमाएं सर्जरी से पहले अवशिष्ट कूप संख्या की भविष्यवाणी में कठिनाई होती है और भ्रष्टाचार के अस्तित्व का मूल्यांकन करने में भी असमर्थता होती है। दवा मुक्त IVA की प्रयोगशाला तकनीक ग्राफ्टिंग के बिना परिपक्व oocytes प्राप्त करने के लिए अंडाशय ऊतक संस्कृति के भविष्य के आवेदन का आधार बन सकता है।

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Disclosures

लेखक इस बात की पुष्टि करते हैं कि उनके हितों का कोई टकराव नहीं है ।

Acknowledgments

हम तात्सुजी इहाना, साचियो कुरिमोटो, काजुको ताकासासिह, युकी योशिजावा, महो अर्शी, केंतारो फुजिता, एरीना कूडो, युका कुरिमोटो और मायुको वाकात्सुकी को दवा मुक्त इववा प्रक्रिया का समर्थन करने और प्रो हारून जेडब्ल्यू हसुए (स्टैनफोर्ड यूनिवर्सिटी स्कूल ऑफ मेडिसिन, स्टैनफोर्ड, सीए) को महत्वपूर्ण पठन और संपादन के लिए धन्यवाद देते हैं । हम अंग्रेजी कथन डालने के लिए रेबेका ट्रूपर और ग्रेगरी ट्रूपर को भी धन्यवाद देते हैं । इस अध्ययन को जापान सोसायटी फॉर द प्रमोशन ऑफ साइंस (जेएसपीएस), साइंटिफिक रिसर्च बी (19H03801) और चैलेंजिंग एक्सप्लोरेटरी रिसर्च (18K19624) द्वारा समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
4.5 onz specimen container FALCON 354013 Other products may also be suitable
60mm dish FALCON 351007 Other products may also be suitable
50 x 50 cm sterile drape HOGY Medical SR-823 Any type of sterile produsts may also be suitable
Disposable pippete FALCON 357575 Other products may also be suitable
Fine scissors, Curved WPI #14224-G Although other products may also be suitable, we strongly recommend use this products
Hot plate TOKAI HIT TPiE-SP Use at operation room to maintain the temperature of dishes containing ovarian tissue before transplantation
Human Serum Albumin Solution Irvine Scientific 9988 Medium for handling ovarian tissue
IVA cannule KITAZATO 446030 IVA-6030E Specific cannula for tissue autografting
KAI medical Disposable scalpel WPI #5 10-A Although other products may also be suitable, we strongly recommend use this products
Micro scissors, Curved WPI #503364 Although other products may also be suitable, we strongly recommend use this products
Modified HTF Medium-HEPES Irvine Scientific 90126 Medium for handling ovarian tissue
Sterile gauze Osaki Medical 15004 Any type of sterile produsts may also be suitable
Swiss Tweezers, Curved Tips KAI #504505 Although other products may also be suitable, we strongly recommend use this products

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References

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Kawagoe, Y., Kawamura, K. Fertility Preservation in Patients with Severe Ovarian Dysfunction. J. Vis. Exp. (169), e62098, doi:10.3791/62098 (2021).

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