Summary
Vi presenterer detaljer om laboratorieprosedyrer for legemiddelfri in vitro-aktivering (IVA) av eggstokksekkene for pasienter med alvorlig ovarial dysfunksjon. Denne metoden kan øke antall gjenvinnbare oocytter per ovarial hyperstimulering og dra nytte fruktbarhet bevaring for disse pasientene.
Abstract
Ovariefunksjonen avtar gradvis under aldring og i noen patofysiologiske tilstander, inkludert karyotype abnormitet, autoimmune sykdommer, kjemo- og strålebehandlinger, samt eggstokkoperasjoner. Hos ugifte kvinner med alvorlig ovarial dysfunksjon, fruktbarhet bevaring er viktig for fremtidige svangerskap. Selv om oocytt kryopreservering er en etablert metode for bevaring av fruktbarhet, disse pasientene kunne bare bevare et begrenset antall oocytter selv etter ovarial hyperstimulering, noe som fører til gjentatte stimuleringer for å sikre tilstrekkelig oocytter for å garantere fremtidig graviditet. For å løse dette problemet har vi nylig utviklet en legemiddelfri in vitro-aktiveringsprosedyre (IVA), som gjør det mulig for oss å stimulere tidlige stadier av eggstokksekkene til å utvikle seg til preantral follikkelstadiet. Disse preantrale folliklene kan reagere på den unike protokollen for gonadotropinstimulering, noe som resulterer i økt antall gjenvunne oocytter per ovarialstimulering for kryopreservering. Den legemiddelfrie IVA besto av kirurgisk tilnærming og eggstokkstimulering. Vi fjernet en del av cortex fra en eller begge eggstokkene fra pasienter under laparoskopisk kirurgi. Eggstokkens kortikale vev ble kuttet i små terninger for å forstyrre Hippo-signalveien og stimulere utviklingen av tidlige follikler. Disse kubene ble podet ortopedisk inn i gjenværende eggstokkene så vel som under serosa av begge fallopiske rør. Vi har allerede publisert den kirurgiske prosedyren for den legemiddelfrie IVA og protokollen for påfølgende eggstokkstimulering, men her presenterer vi detaljene i laboratoriemetoder som kreves for legemiddelfri IVA.
Introduction
Ovariefunksjonen avtar gradvis under aldring og noen patofysiologiske tilstander, inkludert karyotype abnormitet, autoimmune sykdommer, kjemo- og strålingsterapier og eggstokkoperasjoner. Ufrivillig bevaring er en av de beste alternativene for ugifte kvinner med alvorlig ovarial dysfunksjon for å bevare sitt potensial for fremtidig graviditet. For fruktbarhet bevaring, for tiden to metoder er tilgjengelig for det meste i onco-fruktbarhet feltet. Oocyte kryopreservering er en veletablert prosedyre for fertilitet bevaring og mange vellykkede tilfeller har blitt rapportert1,2. På den annen side ble ovarian vev kryopreservering også etablert for fruktbarhet bevaring hos kreftpasienter, men det er fortsatt en eksperimentell strategi3,4. I begge metoder er flere antall modne oocytter nødvendig for at graviditet skal oppstå. Generelt viste pasienter med for tidlig ovarialinsuffisiens (POI), som blir amenoré før 40 år, og middelaldrende kvinner med lav eggstokkreserve dårlig eggstokkrespons (POR) til eggstokkstimulering for å gi modne oocytter5,6,7. Videre viste unge pasienter med et lavt antall antralsekkene også POR til eggstokkstimulering7. Disse pasientene har svært begrenset antall gjenvinnbare oocytter selv etter riktig ovarial hyperstimulering, og krever dermed flere dyre prosedyrer for å sikre et tilstrekkelig antall oocytter for graviditet.
Oocyttdonasjon etterfulgt av in vitro befruktning (IVF) med mannens sæd- og embryooverføring (ET) er det eneste alternativet for disse POI- og POR-pasientene som har problemer med å skaffe sine egne oocytter8,9,10. Oocyttdonasjon er imidlertid komplisert av etiske problemer samt autoimmune og graviditetskomplikasjoner11,12,13,14. For å løse disse problemene, etableringen av ufruktbarhet behandling ved hjelp av pasientens egne oocytter er ønsket. For POI-pasienter har vi utviklet in vitro aktivering (IVA) tilnærming for å tillate vellykket follikkel vekst og generering av modne oocytter, fører en rekke svangerskap og leveranser15. I IVA fragmenterte vi ovariebarker etter fjerning av eggstokkene under laparoskopisk kirurgi og dyrket dem i to dager for å aktivere follikler av Akt-stimulerende stoffer og deretter utføre heterotoptransplantasjon tilbake i kunstige poser laget under serosa av fallopiske rør under andre laparoskopisk kirurgi15. Denne prosedyren fremmet vekst av primordiale, primære og sekundære follikler etter ovarial cortex fragmentering for å fremme Hippo signalforstyrrelser16, etterfulgt av to dagers kultur med Akt signalstimulatorer17.
I motsetning til alvorlige POI-tilfeller har POR-pasienter med redusert eggstokkreserve flere sekundære follikler. Fordi Hippo signalisering forstyrrelser alene er effektiv i å fremme sekundær follikkel vekst16, vi nylig demonstrert vellykket svangerskap og leveranser for POR pasienter ved hjelp av den legemiddelfrie IVA prosedyren involverer kortikale fragmentering og ortopedisk podning uten behandling av Akt stimulerende legemidler. Legemiddelfri IVA stimulerer tidlig stadium av eggstokksekkene til å utvikle seg til preantral follikkelstadium etter bare en operasjon og økte antall gjenvunne oocytter for IVF-embryooverføring15,18. Den legemiddelfrie IVA-tilnærmingen har flere fordeler sammenlignet med vår opprinnelige IVA med 1) å unngå potensielt follikkeltap under kultur, 2) minimere invasivitet og kostnader ved den andre operasjonen, 3) som bare involverer kortsiktig sengestøtte etter operasjonen og 4) potensial for spontan graviditet på grunn av ortotopisk podning. Vi publiserte nylig en videoartikkel som viser kirurgiske prosedyrer for legemiddelfri IVA19 og detaljerte protokoller for eggstokkstimulering etter operasjonen20. Her presenterer vi detaljer om laboratoriemetoder som kreves for legemiddelfri IVA.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Skriftlig informert samtykke ble innhentet fra hver POR-pasient med avtagende ovariereservat som meldte seg på den legemiddelfrie IVA-behandlingen. Denne studien ble godkjent av etisk komité ved International University of Health and Welfare (nr. 17-S-21). Klinisk studie ble registrert under nummer UMIN000034464 og utført i samsvar med Code of Ethics of the World Medical Association (Helsinkideklarasjonen).
1. Ovarian cortex ekstraksjon
- Fjern en del av ovarial cortex (10 x 10 mm, 2-3 mm tykkelse) fra en eller begge eggstokkene under generell anestesi gjennom laparoskopisk kirurgi som tidligere beskrevet19,20.
- Plasser de oppsamlede ovariebarkene i en steril beholder som inneholder 10 ml modifisert HTF (mHTF) ved 37 °C.
2. Ovarian cortex fragmentering
MERK: Før disseksjon av ovarial cortex, varme opp mHTF til 37 °C. Oppretthold sterile forhold gjennom hele prosedyren. Alle verktøy for denne prosedyren er oppført i Materialliste.
- Plasser de oppsamlede ovariebarkene i en plastfat som inneholder 5-10 ml mHTF ved 37 °C og legg dem på varmeplaten for å opprettholde vevet ved 37 °C (Figur 2A).
- Ta et bilde av hver cortex ved hjelp av et digitalt kamera med pasientens navn før du starter neste prosedyre for å koble pasientens bakgrunnsdata.
- Plasser en individuell cortex på en steril gasbind fuktet med mHTF (Figur 2B).
MERK: Påfør ekstra mHTF med en engangspipette på gasbindet for å forhindre at overflaten av cortex tørkes ut under denne prosedyren. - Fjern gjenværende medullavev der ser rosa ut ved hjelp av en mikrosaks, slik at vevstykkelsen når 1-2 mm (Figur 2C og D).
MERK: For å unngå tap av follikler på tidlig stadium, ikke forbered kortikale strimler mindre enn 1 mm i tykkelse, fordi de tidlige folliklene ligger innen 1-2 mm fra overflaten av ovarial cortex21. - Disseker en 1 mm x 1 mm x 5 mm vevsstykke fra hver ovarial kortikale stripe ved hjelp av en fin skalpell og underkast den for histologisk analyse for å bestemme tilstedeværelsen av gjenværende follikler som tidligere beskrevet18 (Figur 2E).
MERK: Dissekert vev for histologi er nedsenket i mHTF og holder seg ved 4 °C til festing (Figur 2F, se trinn 4). - Skjær cortexen i 1 mm x 1 mm x 10 mm strimler med en fin skalpell (Figur 2G).
MERK: Det er lettere å kutte ved å trykke ned på skalpellen enn ved å trekke i den. - Skjær disse vevsstrimlene i 1 mm x 1 mm x 1 mm små terninger (Figur 2H).
MERK: For å unngå endringer av osmotisk trykk i mediet, tilsett mHTF i moderasjon før vevsautomatisk.
3. Automatisk podning av eggstokkkortikale fragmenter
- Åpne pakken med IVA-kanylen og legg den på en steril gardin.
- Skyll innsiden av IVA-kanylen med mHTF ved å aspirere og utlade mHTF flere ganger.
- Aspirat 100-200 μL mHTF for å fylle spissen av IVA-kanyle for å unngå at kortikale terninger tørker ut under lasting (Figur 3A).
- Legg de kortikale kubene i spissen av IVA-kanylen med en fin pinsett (Figur 3B-E).
MERK: Antall kortikale kuber for lasting avhenger av podningsstedet. Vanligvis kan 20-30 kuber transplanteres til en ortopedisk gjenværende eggstokk, mens 10-15 kuber kan transplanteres i en pose under serosa av fallopianrøret. - Etter å ha lastet kortikale kuber, hold spissen av kanylen som inneholder kortikale terninger med fingrene til du overfører IVA-kanylen til en kirurg. Dette vil unngå at kubetemperaturen reduseres.
MERK: Detaljene om autograferingsprosedyre under laparoskopisk kirurgi har blitt rapportert tidligere19. For podning av eggstokkkortikale kuber ble en kanyleformet enhet (IVA-kanyle) utviklet av vår samarbeidspartner, Kitazato Corporation.
4. Histologisk analyse av ovarial cortex
MERK: For å telle antall gjenværende follikler, utfør histologisk analyse som tidligere beskrevet15.
- Merk den kortikale stripeoverflaten med et vevsmarkeringsfarge før prøvefiksering. Dette vil indikere siden av cortex i stripe for histologi.
- Fest vevsstrimlene over natten ved 4 °C ved hjelp av Bouins oppløsning.
MERK: For å oppdage atretiske follikler, anbefaler vi ikke å bruke paraformaldehyd for å fikse for å unngå krymping av oocyttcytoplasma. - Dehydrer og legg inn vevsstrimlene i paraffin.
- Del parafinblokken som inneholder vevsprøven serielt.
- Flekk hver seksjon ved hjelp av hematoksylin og eosin for å visualisere folliklene.
- Tell folliklene som tidligere beskrevet17.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I den første utgivelsen av IVA-tilnærmingen15transplanterte vi eggstokkkortikale kuber en etter en inn i podningsstedene under laparoskopisk kirurgi (Figur 1A). Fordi 100-150 eggstokkkuber ble brukt, tok det 3-4 timer for vevtransplantasjon under laparoskopisk kirurgi. Også noen eggstokk kuber gikk tapt før podning. Fordi IVA-kanylen kan overføre 20-30 kuber til et podningssted på en gang (figur 1B), kan vi forkorte operasjonstiden til 1-2 timer. Videre kan IVA-kanylen eliminere tapet av eggstokkkortikale kuber under operasjonen.
Figur 1: Effektiviteten av IVA-kanylen. (A) Tidligere metode med transplantasjon av eggstokkkortikale kuber en etter en ved hjelp av tang. (B) Den nåværende metoden med transplantasjon av 20-30 kuber samtidig ved hjelp av IVA-kanylen. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Ovarievevs disseksjon for legemiddelfri IVA. (A) Et stykke ovariebark er plassert i en plastfat som inneholder mHTF ved 37 °C. (B) For å fjerne gjenværende medullavev, plasseres eggstokkbarken på en fuktet gasbind. (C) Medulla vev fjernes ved hjelp av en fin mikrosaks. (D) Tykkelsen på cortex som skal tilberedes er mellom 1 til 2 mm. (E) Etter fjerning av medulla vev, er en 1 mm x 1 mm x 5 mm vev stykke fra hver ovarial kortikale stripe dissekert for histologisk analyse. (F) Det dissekerte vevet lagres i 1,5 ml rør som inneholder mHTF ved 4 °C til det festes for histologi. (G og H) Ovariebarken er kuttet i 1 mm x 1 mm x 10 mm strimler, og deretter videre kuttet i 1 mm x 1 mm x 1 mm små terninger ved hjelp av en fin skalpell. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Automatisk podning av eggstokkkortikale fragmenter. (A) Før du laster kuber, aspireres 100-200 μL mHTF for å fylle spissen av IVA-kanylen for å unngå at kortikale kuber tørker ut under lasting (B-E) Lasting av eggstokkkortikale kuber i spissen av IVA-kanyle. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I dette manuskriptet viste vi en detaljert laboratorieprotokoll for legemiddelfri IVA. Den legemiddelfrie IVA er en ny tilnærming til ufruktbarhet behandling for POR pasient med avtagende ovarie reserve for å fremme sekundære follikler vekst, noe som resulterer i å gi mer modne oocytter etter ovarial stimulering og økende i vellykket graviditet20. I 15 POR-pasienter med avtagende ovariereservat oppnådde denne tilnærmingen en spontan graviditet, in vitro befruktning-embryooverføring tillot fire levende fødsler, sammen med en pågående graviditet19.
For fremstilling av podning av eggstokkbark ble medullavev fjernet ved hjelp av en mikrosaks med 1-2 mm tykkelse. Tidligere viste vi at primordial, primær og flertall av sekundære follikler var plassert innenfor 1 mm tykkelse fra overflaten av ovarial cortex hos pasienter med normal ovarialreserve21. Hos POI-pasienter fant vi ut at sekundære follikler lå dypere enn 1 mm, men innen 2 mm fra overflaten av ovarial cortex21. Antral follikler er kjent for å finne i medulla vev21, men ingen follikkel ble funnet i medulla vev hos POI pasienter21. Selv om POR-pasienter med avtagende ovariereservat kan ha antralsekkene i medullavev, er antralsekkene vanskelige å overleve etter podning på grunn av mangel på blodkarkommunikasjon22. Derfor bestemte vi tykkelsen på ovarial cortex å være 1-2 mm og det kritiske trinnet i protokollen gjør ikke kortikale strimler < 1-2 mm for å unngå tap av dyrebare gjenværende follikler. Under tilberedning av kortikale strimler og terninger brukte vi mHTF, men man kan bruke lignende medium som inkluderer 4-(2-hydroksyetyl)-1-piperazineethanesulfonsyre (HEPES) buffer.
I denne prosedyren transplanterte vi ovarial cortex etter å ha kuttet den i 1 mm3 terninger15,20. På grunn av vanskeligheten med å håndtere slike små fragmenter for podning, tok tidligere podning av eggstokkkuber en etter en under laparoskopisk kirurgi 3-4 timer med noen kuber som av og til gikk tapt under operasjonen. Etter utviklingen av IVA-kanylen kan vi forkorte operasjonstiden til 1-2 timer, noe som resulterer i å minimere operasjonens invasivitet slik at den stofffrie IVA blir en enkelt dagkirurgi. Videre kan vi eliminere tapet av eggstokkkortikale kuber under operasjonen. På grunn av begrenset antall follikler i ovarial cortex hos POR-pasienter med redusert eggstokkreserve, er det viktig å unngå tap av eggstokkkortikale kuber. Hvis IVA-kanylen ikke er tilgjengelig, kan du prøve å finne en lignende kanyle for å kunne bruke under laparoskopisk kirurgi.
Nedgangen i eggstokkfunksjonen er gradvis forårsaket av aldring og noen patofysiologiske forhold 23,24,25. Således, i ugifte kvinner med alvorlig ovarial dysfunksjon, fruktbarhet bevaring er viktig for å tillate fremtidig graviditet. For disse pasientene ble metodene for oocytter eller eggstokkvev kryopreservering rapportert26,27,28,29. Selv om oocytt kryopreservering er en etablert metode for fruktbarhet bevaring1,2, disse pasientene kan ha svært begrenset antall gjenvinnbare oocytter selv etter ovarial hyperstimulering på grunn av lav ovarial reserve. Videre, hos aldrende pasienter med ovarial dysfunksjon, ble høy forekomst av kromosomavvik rapportert hos ovulated oocytter26,30. Dette fører til kravet om flere dyre prosedyrer for å sikre tilstrekkelig antall oocytter for å garantere graviditet. For å løse disse problemene har vi utviklet den legemiddelfrie IVA-tilnærmingen for å øke antall modne oocytter for oocyttuthenting. Fordi oocytt kryopreservering ikke lenger er en eksperimentell metode31,32, forventes den stofffrie IVA etterfulgt av oocytt kryopreservering å være en lovende metode for fruktbarhet bevaring hos ugifte kvinner med alvorlig ovarial dysfunksjon. Imidlertid, fremtidige kliniske studier ved hjelp av fryse-tint oocytter hentet fra den legemiddelfrie IVA vil være nødvendig for å bestemme effektiviteten av denne tilnærmingen for fruktbarhet bevaring i ugifte kvinner med alvorlig ovarial dysfunksjon.
Til slutt utviklet vi den legemiddelfrie IVA som en ny tilnærming til ufruktbarhet behandling for POR pasient med avtagende ovariereservat og viste detaljene laboratorieprotokollen for å kunne gjenta våre prosedyrer. De metodologiske begrensningene ved legemiddelfri IVA er vanskeligheter med prediksjon av gjenværende follikkelnummer før operasjonen og også manglende evne til å evaluere graftoverlevelsen. Laboratorieteknikken til legemiddelfri IVA kan bli grunnlaget for fremtidig anvendelse av eggstokkvevskultur for å oppnå modne oocytter uten podning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne bekrefter at de ikke har noen interessekonflikt.
Acknowledgments
Vi takker Tatsuji Ihana, Sachiyo Kurimoto, Kazuko Takahasih, Yuki Yoshizawa, Maho Arashi, Kentaro Fujita, Erina Kudo, Yuka Kurimoto og Mayuko Wakatsuki for å støtte den narkotikafrie IVA-prosedyren og prof. Aaron J.W. Hsueh (Stanford University School of Medicine, Stanford, CA) for kritisk lesing og redigering av manuskriptet. Vi takker også Rebecca Truman og Gregory Truman for å ha satt inn engelsk fortelling. Denne studien ble støttet av The Japan Society for the Promotion of Science (JSPS), Scientific Research B (19H03801) og Challenging Exploratory Research (18K19624).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4.5 onz specimen container | FALCON | 354013 | Other products may also be suitable |
| 60mm dish | FALCON | 351007 | Other products may also be suitable |
| 50 x 50 cm sterile drape | HOGY Medical | SR-823 | Any type of sterile produsts may also be suitable |
| Disposable pippete | FALCON | 357575 | Other products may also be suitable |
| Fine scissors, Curved | WPI | #14224-G | Although other products may also be suitable, we strongly recommend use this products |
| Hot plate | TOKAI HIT | TPiE-SP | Use at operation room to maintain the temperature of dishes containing ovarian tissue before transplantation |
| Human Serum Albumin Solution | Irvine Scientific | 9988 | Medium for handling ovarian tissue |
| IVA cannule | KITAZATO | 446030 IVA-6030E | Specific cannula for tissue autografting |
| KAI medical Disposable scalpel | WPI | #5 10-A | Although other products may also be suitable, we strongly recommend use this products |
| Micro scissors, Curved | WPI | #503364 | Although other products may also be suitable, we strongly recommend use this products |
| Modified HTF Medium-HEPES | Irvine Scientific | 90126 | Medium for handling ovarian tissue |
| Sterile gauze | Osaki Medical | 15004 | Any type of sterile produsts may also be suitable |
| Swiss Tweezers, Curved Tips | KAI | #504505 | Although other products may also be suitable, we strongly recommend use this products |
References
- Liang, T., Motan, T. Mature Oocyte Cryopreservation for Fertility Preservation. Advances in Experimental Medicine and Biology. 951, 155-161 (2016).
- Yoon, T. K., et al. Live births after vitrification of oocytes in a stimulated in vitro fertilization-embryo transfer program. Fertility and Sterility. 79 (6), 1323-1326 (2003).
- Donnez, J., et al. Livebirth after orthotopic transplantation of cryopreserved ovarian tissue. Lancet. 364 (9443), 1405-1410 (2004).
- Meirow, D., et al. Pregnancy after transplantation of cryopreserved ovarian tissue in a patient with ovarian failure after chemotherapy. New England Journal of Medicine. 353 (3), 318-321 (2005).
- De Vos, M., Devroey, P., Fauser, B. C.
- Scott, R. T., et al. Follicle-stimulating hormone levels on cycle day 3 are predictive of in vitro fertilization outcome. Fertility and Sterility. 51 (4), 651-654 (1989).
- Ferraretti, A. P., et al. ESHRE consensus on the definition of 'poor response' to ovarian stimulation for in vitro fertilization: the Bologna criteria. Human Reproduction. 26 (7), 1616-1624 (2011).
- Huhtaniemi, I., et al. Advances in the Molecular Pathophysiology, Genetics, and Treatment of Primary Ovarian Insufficiency. Trends in Endocrinology and Metabolism. 29 (6), 400-419 (2018).
- Męczekalski, B., Maciejewska-Jeske, M., Podfigurna, A. Reproduction in premature ovarian insufficiency patients - from latest studies to therapeutic approach. Prz Menopauzalny. 17 (3), 117-119 (2018).
- Baker, V. Life plans and family-building options for women with primary ovarian insufficiency. Seminars in Reproductive Medicine. 29 (4), 362-372 (2011).
- Englert, Y., Govaerts, I. Oocyte donation: particular technical and ethical aspects. Human Reproduction. 13, Suppl 2 90-97 (1998).
- Englert, Y., Rodesch, C., Laruelle, C., Govoerts, I. Oocyte donation: ethical aspects related to the donor. Contraception, Fertilite, Sexualite. 25 (3), 251-257 (1997).
- Storgaard, M., et al. Obstetric and neonatal complications in pregnancies conceived after oocyte donation: a systematic review and meta-analysis. BJOG: An International Journal of Obstetrics and Gynaecology. 124 (4), 561-572 (2017).
- Storgaard, M., Malchau, S., Loft, A., Larsen, E., Pinborg, A. Oocyte donation is associated with an increased risk of complications in the pregnant woman and the fetus. Ugeskrift for Laeger. 179 (11), (2017).
- Kawamura, K., et al. Hippo signaling disruption and Akt stimulation of ovarian follicles for infertility treatment. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (43), 17474-17479 (2013).
- Hsueh, A. J., Kawamura, K., Cheng, Y., Fauser, B. C.
- Li, J., et al. Activation of dormant ovarian follicles to generate mature eggs. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (22), 10280-10284 (2010).
- Suzuki, N., et al. Successful fertility preservation following ovarian tissue vitrification in patients with primary ovarian insufficiency. Human Reproduction. 30 (3), 608-615 (2015).
- Tanaka, Y., Hsueh, A. J., Kawamura, K. Surgical approaches of drug-free in activation and laparoscopic ovarian incision to treat patients with ovarian infertility. Fertility and Sterility. , (2020).
- Kawamura, K., Ishizuka, B., Hsueh, A. J. W. Drug-free in-vitro activation of follicles for infertility treatment in poor ovarian response patients with decreased ovarian reserve. Reproductive Biomedicine Online. 40 (2), 245-253 (2020).
- Haino, T., et al. Determination of Follicular Localization in Human Ovarian Cortex for Vitrification. Journal of Adolescent and Young Adult Oncology. 7 (1), 46-53 (2018).
- Baird, D. T., Webb, R., Campbell, B. K., Harkness, L. M., Gosden, R. G. Long-term ovarian function in sheep after ovariectomy and transplantation of autografts stored at -196 C. Endocrinology. 140 (1), 462-471 (1999).
- Qin, Y., Jiao, X., Simpson, J. L., Chen, Z. J. Genetics of primary ovarian insufficiency: new developments and opportunities. Human Reproduction Update. 21 (6), 787-808 (2015).
- Domniz, N., Meirow, D. Premature ovarian insufficiency and autoimmune diseases. Best Practice & Research: Clinical Obstetrics & Gynaecology. 60, 42-55 (2019).
- Laven, J. S.
- Grynberg, M., et al.
- Tomao, F., Spinelli, G. P., Panici, P. B., Frati, L., Tomao, S. Ovarian function, reproduction and strategies for fertility preservation after breast cancer. Critical Reviews in Oncology/Hematology. 76 (1), 1-12 (2010).
- Kim, S., Lee, Y., Lee, S., Kim, T. Ovarian tissue cryopreservation and transplantation in patients with cancer. Obstetrics & Gynecology Science. 61 (4), 431-442 (2018).
- Donnez, J., Dolmans, M. M. Ovarian tissue freezing: current status. Current Opinion in Obstetrics and Gynecology. 27 (3), 222-230 (2015).
- Wu, R. C., Kuo, P. L., Lin, S. J., Liu, C. H., Tzeng, C. C. X chromosome mosaicism in patients with recurrent abortion or premature ovarian failure. Journal of the Formosan Medical Association. 92 (11), 953-956 (1993).
- De Munck, N., Vajta, G. Safety and efficiency of oocyte vitrification. Cryobiology. 78, 119-127 (2017).
- Argyle, C. E., Harper, J. C., Davies, M. C. Oocyte cryopreservation: where are we now. Human Reproduction Update. 22 (4), 440-449 (2016).
