Summary
우리는 심각한 난소 기능 장애를 가진 환자를 위한 난소 여포의 약물 없는 체외 활성화 (IVA)를 위한 실험실 절차의 세부 사항을 제시합니다. 이 방법은 난소 과잉 자극 당 회수 가능한 난모세포의 수를 증가시키고 그 환자를 위한 불임 보존을 유익할 수 있었습니다.
Abstract
난소 기능은 노화 중 및 karyotype 이상, 자가 면역 질환, 화학 및 방사선 요법뿐만 아니라 난소 수술을 포함한 일부 병리학 적 조건에서 점진적으로 감소합니다. 심한 난소 기능 장애를 가진 미혼 여성의 경우, 불임 보존은 미래의 임신에 중요합니다. 난소 극저온 보존은 불임 보존을 위한 확립된 방법이지만, 이 환자들은 난소 과잉 자극 후에도 제한된 수의 난소세포만 보존할 수 있어 향후 임신을 보장하기에 충분한 난피세포를 보장하기 위해 반복된 자극으로 이어질 수 있습니다. 이 문제를 해결하기 위해, 우리는 최근에 우리가 preantral 여포 단계로 발전하기 위하여 난소 여포의 초기 단계를 자극하는 가능하게 하는 시험관 내 활성화 (IVA) 절차를 개발했습니다. 이 preantral 여포는 고나돌비틴 자극의 독특한 프로토콜에 반응할 수 있고, 그 결과 극저온 보존을 위한 난소 자극 당 회수된 난소 자극의 증가수의 결과로. 약물없는 IVA는 외과 적 접근법과 난소 자극으로 구성되었습니다. 우리는 복강경 수술하에 환자에게서 하나 또는 둘 다 난소에서 피질의 부분을 제거했습니다. 난소 피질 조직은 하마 신호 통로를 중단하고 초기 단계 여포의 발달을 자극하기 위하여 작은 큐브로 절단되었습니다. 이 큐브는 남은 난소뿐만 아니라 나팔관의 세로사 아래에 정형소로 이식되었습니다. 우리는 이미 약물없는 IVA의 수술 절차와 후속 난소 자극의 프로토콜을 발표했지만, 여기에서 우리는 약물없는 IVA에 필요한 실험실 방법의 세부 사항을 제시합니다.
Introduction
난소 기능은 노화 와 karyotype 이상, 자가 면역 질환, 화학 요법 및 방사선 요법 및 난소 수술을 포함한 일부 병리학 조건 동안 점진적으로 감소합니다. 불임 보존은 심각한 난소 기능 장애를 가진 미혼 여성이 미래의 임신에 대한 잠재력을 보존하는 가장 좋은 옵션 중 하나입니다. 불임 보존을 위해, 현재 두 가지 방법은 주로 온코 불임 분야에서 사용할 수 있습니다. 오낭 극저온 보존은 불임 보존을 위한 잘 확립된 절차이며 많은 성공적인 사례가1,2로보고되었다. 한편, 난소조직 냉동보존도 암 환자의 불임 보존을 위해 설립되었지만 여전히 실험전략3,4이다. 두 방법 모두에서 임신이 발생하기 위해서는 여러 가지 성숙한 난모세포가 필요합니다. 일반적으로, 40세 이전에 무생물이 되는 조기 난소 부족(POI)을 가진 환자, 그리고 난소 예비가 낮은 중년 여성은 성숙한 난소 자극에 대한 난소 반응(POR)을5,6,7로나타낸 것으로 나타났다. 더욱이, 적은 수의 개미 여포를 가진 젊은 환자는 또한 난소 자극7에POR를 보였다. 이 환자는 적당한 난소 hypers자극 후에조차 회수 가능한 난모세포의 아주 한정된 수를 가지고, 따라서 임신을 위한 난모세포의 충분한 수를 지키기 위하여 다중 비싼 절차가 요구됩니다.
남편의 정자와 배아 전이(ET)를 가진 체외 수정(IVF)에 이어 온구체 기증은 자신의 난소를 얻는 데 어려움을 겪는 POI 및 POR 환자에게 유일한 옵션이다8,9,10. 그러나, 난소세포 기증은 윤리적인 문제뿐만 아니라 자기면역 및 임신 합병증11,12,13,14에의해 복잡하다. 이러한 문제를 해결하기 위해 환자 고유의 난모를 사용하여 불임 치료의 설립이 필요합니다. POI 환자를 위해, 우리는 성공적인 여포 성장 및 성숙한 난모세포의 생성을 허용하기 위하여 체외 활성화 (IVA) 접근을 개발했습니다, 많은 임신 및 납품을 지도하는15. IVA에서, 우리는 복강경 수술에서 난소 피질을 단편화하고 Akt 자극 약물에 의해 여포를 활성화하고 두 번째 복강경 수술15에서나팔관의 세로사 아래에 만든 인공 파우치로 다시 이식이 수행하기 위해 이틀 동안 배양. 이 절차는 난소 피질 단편화 후 원시, 기본 및 이차 여포의 성장을 촉진 하 여 하마 신호 중단을 촉진16,Akt 신호 자극기와 2 일 문화다음 17.
가혹한 POI 케이스와는 대조적으로, 감소된 난소 예비를 가진 POR 환자는 다중 이차 여포가 있습니다. 하마 신호 중단만으로는 이차 여포 성장 촉진에 효과적이기 때문에16,우리는 최근에 Akt 자극 약물의 처리 없이 피질 단편화 및 직교 이식을 포함하는 약 없는 IVA 절차를 사용하여 POR 환자를 위한 성공적인 임신 및 납품을 보여주었습니다. 약물 없는 IVA는 난소 여포의 초기 단계를 자극하여 단 하나의 수술 후 전형 여포 단계로 발전시키고 IVF-배아 전달을 위한 회수된 난귀세포의 수를증가15,18. 약물 없는 IVA 접근법은 원래 IVA와 비교하여 1) 문화 중 잠재적 인 여포 손실을 피하고, 2) 두 번째 수술의 침습성과 비용을 최소화하고, 3) 단기 수술 후 침대 휴식과 4) 직교 성 이식으로 인한 자발적 임신의 잠재력을 포함합니다. 우리는 최근에 약물없는 IVA19의 외과 적 절차와 수술 후 난소 자극의 상세한 프로토콜을 보여주는 비디오 기사를 발표했다20. 여기서, 우리는 약물없는 IVA에 필요한 실험실 방법의 세부 사항을 제시한다.
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Protocol
약물 없는 IVA 치료에 등록한 난소 예비군이 감소하는 각 POR 환자로부터 서면 통보 동의를 얻었습니다. 이 연구는 국제 보건 복지 대학의 윤리위원회에 의해 승인되었다 (제 17-S-21). 임상시험은 UMIN000034464에 따라 등록되었으며 세계의학협회 윤리강령(헬싱키 선언)에 따라 시행되었습니다.
1. 난소 피질 추출
- 전설명19,20과 같이 복강경 수술을 통해 전신 마취하에 하나 또는 두 난소에서 난소 피질(10 x 10mm, 2-3mm 두께)의 일부를제거한다.
- 수집된 난소 피질을 37°C에서 10mL의 수정된 HTF(mHTF)를 함유한 멸균 용기에 놓습니다.
2. 난소 피질 조각화
참고: 난소 피질의 해부 전에 mHTF를 37°C로 예열하십시오. 절차 전반에 걸쳐 멸균 상태를 유지합니다. 이 절차에 대한 모든 도구는 재료 표에나열됩니다.
- 수집된 난소 피질을 mHTF 5-10mL를 포함하는 플라스틱 접시에 37°C에서 배치하고 37°C(도2A)에서조직을 유지하기 위해 열판에 놓습니다.
- 환자 배경 데이터를 연결하는 다음 절차를 시작하기 전에 환자의 이름이 있는 디지털 카메라를 사용하여 각 피질의 사진을 찍습니다.
- mHTF(도2B)로적신 멸균 거즈에 개별 피질을 놓습니다.
참고: 거즈에 일회용 파이펫을 추가로 적용하여 이 절차 중에 피질의 표면이 건조되는 것을 방지합니다. - 조직의 두께가 1-2mm(도 2C 및 D)에도달되도록 마이크로 가위를 사용하여 분홍색으로 보이는 잔류 수질 조직을 제거하십시오.
참고: 초기 단계에서 여포의 손실을 피하기 위해, 초기 단계 여포가 난소피질(21)의표면에서 1-2mm 이내의 위치에 있기 때문에 두께가 1mm 미만인 피질 스트립을 준비하지 마십시오. - 1mm x 1mm x 5mm의 조직 조각을 각 난소 피질 스트립으로부터 미세메스를 사용하여 해부하고, 이전 설명된18(도 2E)와같은 잔류 여포의 존재를 결정하기 위해 조직학적 분석을 거칩니다.
참고: 조직학을 위한 해부된 조직은 mHTF에 침지되고 고정될 때까지 4°C에서 유지합니다(그림2F,4단계 참조). - 미세 한 메스(그림 2G)를사용하여 피질을 1mm x 1 mm x 10mm 스트립으로 자른다.
참고 : 메스를 당기는 것보다 메스를 누르는 것이 더 쉽습니다. - 이 티슈 스트립을 1mm x 1mm x 1mm 작은큐브(그림 2H)로자른다.
참고: 매체에서 삼투압의 변화를 피하려면 조직 자가 이식 전에 절제에 mHTF를 추가하십시오.
3. 난소 피질 조각의 자동 접목
- IVA 캐뉼라 패키지를 열고 멸균 커튼에 놓습니다.
- MHTF를 여러 번 흡입하고 방출하여 MHTF로 IVA 캐뉼라 내부를 헹구세요.
- 흡인 100-200 μL의 mHTF는 로딩 중에 피질 큐브가 건조되는 것을 피하기 위해 IVA 캐뉼라의 끝을 채웁니다(그림3A).
- 미세 트위저(그림3B-E)를사용하여 IVA 캐뉼라 의끝에 피질 큐브를 적재합니다.
참고: 로딩용 피질 큐브 의 수는 접목 부위에 따라 다릅니다. 일반적으로, 20-30 큐브는 난소 남아 있는 직교로로 이식될 수 있고, 반면 10-15 큐브는 나팔관의 세로사 아래에 있는 파우치로 이식될 수 있다. - 피질 큐브를 로드한 후 IVA 캐뉼라를 외과 의사에게 옮길 때까지 손가락으로 피질 큐브가 들어 있는 캐뉼라 끝을 잡습니다. 이렇게 하면 큐브 온도가 감소하는 것을 방지할 수 있습니다.
참고 : 복강경 수술에서 자가 이식 절차의 세부 사항은 이전에보고되었습니다19. 난소 피질 큐브를 접목하기 위해, 캐뉼라 모양의 장치 (IVA 캐뉼라)는 우리의 협력자인 기타자토 코퍼레이션에 의해 개발되었습니다.
4. 난소 피질의 조직학적 분석
참고: 잔여 여포 수를 계산하려면 앞에서 설명한15와같이 조직학적 분석을 수행한다.
- 샘플 고정 전에 염색을 표시하는 조직으로 피질 스트립 표면을 표시합니다. 이것은 장학적 학을 위한 스트립에 있는 피질의 측을 표시합니다.
- 부인의 용액을 사용하여 4 °C에서 하룻밤 동안 티슈 스트립을 수정합니다.
참고: 폐색 여포를 감지하려면 난낭 세포질의 수축을 피하기 위해 파라포름알데히드를 사용하지 않는 것이 좋습니다. - 탈수하고 파라핀에 티슈 스트립을 포함.
- 조직 샘플을 포함하는 파라핀 블록을 직렬로 절제한다.
- 헤마톡시린과 에신을 사용하여 각 섹션을 얼룩지게 하여 여포를 시각화합니다.
- 앞서 설명한17번과같이 여포를 계산한다.
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Representative Results
IVA접근법(15)의첫 번째 간행물에서, 우리는 복강경수술(그림 1A)의밑에 이식 부위로 하나씩 난소 피질 큐브를 이식했습니다. 100-150 난소 큐브가 사용되었기 때문에 복강경 수술에서 조직 이식에 3-4 시간이 걸렸습니다. 또한, 일부 난소 큐브는 접목 하기 전에 손실 되었다. IVA 캐뉼라는 20-30큐브를 한 번에 접목 부위로 옮길 수 있기때문에(그림 1B)을1-2시간으로 단축할 수 있습니다. 또한, IVA 캐뉼라는 수술 중 난소 피질 큐브의 손실을 제거 할 수 있습니다.
그림 1: IVA 캐뉼라의 효과. (A)난소 피질 큐브를 집게를 사용하여 하나씩 이식하는 이전 방법. (B)IVA 캐뉼라를 이용하여 한 번에 20-30개의 큐브를 이식하는 현재의 방법. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 약물없는 IVA용 난소 조직 해부. (A)난소 피질의 조각은 37 °C에서 mHTF를 포함하는 플라스틱 접시에 배치됩니다.(B)잔류 수질 조직을 제거하기 위해, 난소 피질은 촉촉한 거즈에 배치된다. (C)메둘라 조직은 미세미세 가위를 사용하여 제거된다. (D)준비되는 피질의 두께는 1~2mm(E) 수질조직의 제거 후 각 난소 피질 스트립으로부터 1mm x 1mm x 5mm의 조직 조각이 조직학적 분석을 위해 해부된다. (F)해부된 조직은 조직학을 위해 고정될 때까지 4°C에서 mHTF를 함유하는 1.5mL 튜브에 저장됩니다. (G와 H)난소 피질은 1mm x 1mm x 10mm 스트립으로 절단된 다음 미세한 메스를 사용하여 1mm x 1mm x 1mm x 1mm 작은 큐브로 추가로 절단됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 난소 피질 조각의 자동 접목. (A)큐브를 적재하기 전에, 100-200 μL의 mHTF는 IVA 캐뉼라의 끝을 채우기 위해 흡인되어 로딩(B-E) 난소 피질 큐브를 IVA 캐뉼라의 끝에 적재하는 동안 피질 큐브를 건조시키는 것을 피하도록 한다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
이 원고에서, 우리는 약물없는 IVA에 대한 상세한 실험실 프로토콜을 보여 주었다. 약물 없는 IVA는 난소 의 성장을 촉진하기 위해 난소 예비를 감소시키는 POR 환자를위한 불임 치료의 새로운 접근법으로, 난소 자극 후 더 성숙한 난모를 산출하고 성공적인 임신20에서증가합니다. 감소하는 난소 예비를 가진 15명의 POR 환자에서, 이 접근법은 1개의 자발적인 임신을 달성했습니다, 체외 수정-태아 전송은 1개의 지속적인 임신19와더불어 4개의 살아있는 출생을 허용했습니다.
난소 피질을 접목하기 위해, 수질 조직은 두께의 1-2 mm와 마이크로 가위를 사용하여 제거되었다. 이전에는 원시, 1차 및 이차 여포의 대부분이 정상 난소예비(21)를가진 환자에서 난소 피질의 표면으로부터 1mm 두께 내에 위치했다는 것을 입증했습니다. POI 환자에서, 우리는 이차 여포가 난소 피질 21의 표면에서 1 mm 보다는 더 깊은 그러나 2 mm 안에 있었다는 것을 것을을발견했습니다. 개미 여포는 수질조직(21)에서발견되는 것으로 알려져 있지만, POI환자(21)의수질조직에서여포가 발견되지 않았다. 감소 난소 예비를 가진 POR 환자는 수질 조직에 있는 개소 여포가 있을 수 있더라도, antral 여포는 혈관 통신의 부족 때문에 이식 후에 살아남기 어렵습니다(22). 따라서, 우리는 난소 피질의 두께가 1-2mm로 결정되었고 프로토콜 내의 중요한 단계는 귀중한 잔류 여포의 손실을 피하기 위해 피질 스트립을 1-2 mm < 만들지 않습니다. 피질 스트립과 큐브를 준비하는 동안 mHTF를 사용했지만 4-(2-하이드록세틸)-1-piperazinethanesulfonic 산 (HEPES) 버퍼를 포함하는 유사한 매체를 사용할 수 있습니다.
이 절차에서는 1mm3 큐브15,20으로절단 한 후 난소 피질을 이식했습니다. 이식에 대 한 이러한 작은 조각을 처리 하는 어려움으로 인해, 복 강경 수술에서 하나 하나 씩 이식 난소 큐브 3-4 시간 동안 일부 큐브 는 때때로 수술 중 손실 있어. IVA 캐뉼라의 개발 후, 우리는 수술 시간을 1-2 시간으로 단축할 수 있으며, 그 결과 약물없는 IVA가 하루 수술이 될 수 있도록 수술의 침습성을 최소화 할 수 있습니다. 또한 수술 중 난소 피질 큐브의 손실을 제거할 수 있습니다. 난소 보호구역이 감소하는 POR 환자의 난소 피질에 있는 여포의 제한된 수 때문에, 난소 피질 큐브의 손실을 피하는 것이 중요합니다. IVA 캐뉼라를 사용할 수 없는 경우 복강경 수술에서 사용할 수 있는 유사한 캐뉼라를 찾으려고 할 수 있습니다.
난소 기능의 감소는 노화및 일부 병리학 적 조건에 의해 점진적으로 발생 (23,24,25). 따라서, 심각한 난소 장애를 가진 미혼 여자에서, 불임 보존은 미래 임신을 허용하는 것이 중요합니다. 이들 환자를 위해, 난소 세포 또는 난소 조직 냉동 보존의 방법은26,27,28,29를보고되었다. 난소 보존을 위한 확립된 방법이기더라도1,2,이 환자는 낮은 난소 예비로 인한 난소 과잉 자극 후에도 매우 제한된 수의 회수 가능한 난모세포가 있을 수 있다. 더욱이, 난소 기능 장애를 가진 노화 환자에서, 염색체 이상의 높은 부각은 배란 난모세포26에서보고되었다26,30. 이것은 임신을 보장하기 위하여 난모세포의 충분한 수를 지키기 위하여 다중 비싼 절차의 요구 사항으로 이끌어 냅니다. 이러한 문제를 해결하기 위해, 우리는 난모세포 검색을위한 성숙한 난모세포의 수를 증가시키기위한 약물없는 IVA 접근 방식을 개발했습니다. 난소 극빙은 더 이상실험방법(31,32)이아니므로, 약물없는 IVA가 이어지며 난소 기능 장애가 심한 미혼 여성의 불임 보존을 위한 유망한 방법이 될 것으로 기대된다. 그러나, 약물 없는 IVA에서 얻은 동결 해동 된 난모세포를 사용 하 여 미래 임상 연구는 심각한 난소 기능 장애를 가진 미혼 여성에 불 임 보존에 대 한이 접근의 효과 결정 하는 데 필요한 것입니다.
결론적으로, 우리는 난소 예비를 감소시키는 POR 환자를 위한 불모 처리의 새로운 접근으로 약 자유로운 IVA를 개발하고 우리의 절차를 반복할 수 있는 세부 실험실 프로토콜을 보여주었습니다. 약물없는 IVA의 방법론적 한계는 수술 전에 잔여 여포 수를 예측하는 데 어려움을 가지며 이식 생존을 평가할 수 없습니다. 약물없는 IVA의 실험실 기술은 이식없이 성숙한 난모세포를 얻기 위해 난소 조직 문화의 미래 응용 프로그램의 기초가 될 수 있습니다.
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Disclosures
저자는 이해 상충이 없음을 확인합니다.
Acknowledgments
이하나 다츠지, 쿠리모토 사치요, 다카하시 가즈코, 요시자와 유키, 아라시 마호, 후지타 켄타로, 에리나 쿠도, 쿠리모토 유카, 와카츠키 마유코 교수에게 약물 없는 IVA 시술과 아론 J.W. 교수(스탠포드 대학 편집대학, 캘리포니아 대학교 편집학 교수) 우리는 또한 영어 내레이션을 삽입 레베카 트루먼과 그레고리 트루먼 감사합니다. 이 연구는 일본 과학 진흥 협회 (JSPS), 과학 연구 B (19H03801), 도전 탐사 연구 (18K19624)에 의해 지원되었습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4.5 onz specimen container | FALCON | 354013 | Other products may also be suitable |
| 60mm dish | FALCON | 351007 | Other products may also be suitable |
| 50 x 50 cm sterile drape | HOGY Medical | SR-823 | Any type of sterile produsts may also be suitable |
| Disposable pippete | FALCON | 357575 | Other products may also be suitable |
| Fine scissors, Curved | WPI | #14224-G | Although other products may also be suitable, we strongly recommend use this products |
| Hot plate | TOKAI HIT | TPiE-SP | Use at operation room to maintain the temperature of dishes containing ovarian tissue before transplantation |
| Human Serum Albumin Solution | Irvine Scientific | 9988 | Medium for handling ovarian tissue |
| IVA cannule | KITAZATO | 446030 IVA-6030E | Specific cannula for tissue autografting |
| KAI medical Disposable scalpel | WPI | #5 10-A | Although other products may also be suitable, we strongly recommend use this products |
| Micro scissors, Curved | WPI | #503364 | Although other products may also be suitable, we strongly recommend use this products |
| Modified HTF Medium-HEPES | Irvine Scientific | 90126 | Medium for handling ovarian tissue |
| Sterile gauze | Osaki Medical | 15004 | Any type of sterile produsts may also be suitable |
| Swiss Tweezers, Curved Tips | KAI | #504505 | Although other products may also be suitable, we strongly recommend use this products |
References
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