Summary
Presentiamo dettagli sulle procedure di laboratorio per l'attivazione in vitro senza farmaci (IVA) dei follicoli ovarico per pazienti con grave disfunzione ovarica. Questo metodo potrebbe aumentare il numero di ovociti recuperabili per iperstimolazione ovarica e beneficiare della conservazione della fertilità per quei pazienti.
Abstract
La funzione ovarica diminuisce progressivamente durante l'invecchiamento e in alcune condizioni fisiopatologiche tra cui anomalie del cariotipo, malattie autoimmuni, terapie chemio- e radiazioni, nonché interventi chirurgici ovarici. Nelle donne non sposate con grave disfunzione ovarica, la conservazione della fertilità è importante per le gravidanze future. Sebbene la crioconservazione degli ovociti sia un metodo stabilito per la conservazione della fertilità, questi pazienti potrebbero preservare solo un numero limitato di ovociti anche dopo l'iperstimolazione ovarica, portando a stimolazioni ripetute per garantire ovociti sufficienti a garantire la gravidanza futura. Per risolvere questo problema, abbiamo recentemente sviluppato una procedura di attivazione in vitro (IVA) senza farmaci, che ci consente di stimolare le prime fasi dei follicoli ovarico a svilupparsi allo stadio del follicolo preantrale. Questi follicoli preantrali possono rispondere al protocollo unico della stimolazione della gonadotropina, con conseguente aumento del numero di ovociti recuperati per stimolazione ovarica per la crioconservazione. L'IVA senza farmaci comprendeva l'approccio chirurgico e la stimolazione ovarica. Abbiamo rimosso una parte della corteccia da una o entrambe le ovaie da pazienti in chirurgia laparoscopica. I tessuti corticali ovarico sono stati tagliati a cubetti per interrompere la via di segnalazione dell'Ippopotamo e stimolare lo sviluppo dei follicoli allo stadio iniziale. Questi cubi sono stati innestati ortotropicamente nelle ovaie rimanenti e sotto il serosa di entrambe le tube di Falloppio. Abbiamo già pubblicato la procedura chirurgica dell'IVA senza farmaci e il protocollo di successiva stimolazione ovarica, ma qui presentiamo i dettagli dei metodi di laboratorio richiesti per l'IVA senza farmaci.
Introduction
La funzione ovarica diminuisce progressivamente durante l'invecchiamento e alcune condizioni fisiopatologiche tra cui anomalie del cariotipo, malattie autoimmuni, terapie chemio- e radiazioni e interventi chirurgici ovarici. La conservazione della fertilità è una delle migliori opzioni per le donne non sposate con grave disfunzione ovarica per preservare il loro potenziale per la gravidanza futura. Per la conservazione della fertilità, attualmente sono disponibili due metodi principalmente nel campo dell'onco-fertilità. La crioconservazione degli ovocite è una procedura ben consolidata per la conservazione della fertilità e molti casi di successo sonostati segnalati 1,2. D'altra parte, la crioconservazione del tessuto ovarico è stata stabilita anche per la conservazione della fertilità nei pazienti oncologici,ma è ancora una strategia sperimentale 3,4. In entrambi i metodi, sono necessari più numeri di ovociti maturi per la gravidanza. Generalmente, i pazienti con insufficienza ovarica prematura (POI), che diventano amenorrea prima dei 40 anni di età, e le donne di mezza età con bassa riserva ovarica hanno mostrato una scarsa risposta ovarica (POR) alla stimolazione ovarica per la resa di ovociti maturi5,6,7. Inoltre, i giovani pazienti con un basso numero di follicoli astrali hanno anche mostrato POR alla stimolazione ovarica7. Questi pazienti hanno un numero molto limitato di ovociti recuperabili anche dopo una corretta iperstimolazione ovarica, richiedendo così più procedure costose per garantire un numero sufficiente di ovociti per la gravidanza.
La donazione di ovociti seguita da fecondazione in vitro (FIV) con trasferimento di sperma ed embrioni del marito (ET) è l'unica opzione per questi pazienti con POI e POR che hanno difficoltà ad ottenere i propri ovociti8,9,10. Tuttavia, la donazione di ovociti è complicata da questioni etiche, nonché complicazioni autoimmuni e di gravidanza11,12,13,14. Per risolvere questi problemi, si desidera l'istituzione di un trattamento di infertilità utilizzando gli ovociti dei pazienti. Per i pazienti con POI, abbiamo sviluppato l'approccio di attivazione in vitro (IVA) per consentire una crescita follicolare di successo e la generazione di ovociti maturi, guidando una serie digravidanze e consegne 15. Nell'IVA, abbiamo frammentato le corteccia ovarico dopo la rimozione delle ovaie in chirurgia laparoscopica e le abbiamo coltivate per due giorni per attivare follicoli da farmaci stimolanti Akt e quindi eseguire l'innesto eterotopico in sacchetti artificiali realizzati sotto la serosa delle tube di Falloppio sotto la seconda chirurgia laparoscopica15. Questa procedura ha promosso la crescita dei follicoli primordiali, primari e secondari dopo la frammentazione della corteccia ovarica per promuovere l'interruzione della segnalazione di Ippopotamo16, seguitada una cultura di due giorni con stimolatori di segnalazione Akt17.
A differenza dei casi gravi di POI, i pazienti con POR con diminuzione della riserva ovarica hanno più follicoli secondari. Poiché Hippo segnala l'interruzione da solo è efficace nel promuovere la crescita del follicolosecondario 16, abbiamo recentemente dimostrato gravidanze e consegne di successo per i pazienti POR utilizzando la procedura IVA senza farmaci che comporta frammentazione corticale e innesto ortotopico senza trattamento dei farmaci stimolanti Akt. L'IVA senza farmaci stimola la fase iniziale dei follicoli ovarici a svilupparsi allo stadio del follicolo preantrale dopo un solo intervento chirurgico e aumenta il numero di ovociti recuperati per il trasferimento di fecondazione invitro-embrione 15,18. L'approccio IVA senza farmaci ha diversi vantaggi rispetto alla nostra IVA originale di 1) evitando potenziali perdite follicolari durante la coltura, 2) riducendo al minimo l'invasività e i costi del secondo intervento chirurgico, 3) coinvolgendo solo il riposo a letto post-chirurgico a breve termine e 4) il potenziale di gravidanza spontanea a causa dell'innesto ortotopico. Recentemente abbiamo pubblicato un video articolo che mostra le procedure chirurgiche dell'IVA19 senza farmaci e protocolli dettagliati di stimolazione ovarica dopo l'interventochirurgico 20. Qui, presentiamo i dettagli dei metodi di laboratorio richiesti per l'IVA senza farmaci.
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Protocol
Il consenso informato scritto è stato ottenuto da ogni paziente POR con riserva ovarica decrescimento che si è iscritto al trattamento IVA senza farmaci. Questo studio è stato approvato dal comitato etico dell'Università Internazionale di Salute e Benessere (n. 17-S-21). Lo studio clinico è stato registrato con il numero UMIN000034464 ed eseguito in conformità con il Codice Etico della World Medical Association (Dichiarazione di Helsinki).
1. Estrazione della corteccia ovarica
- Rimuovere parte della corteccia ovarica (10 x 10 mm, spessore 2-3 mm) da una o entrambe le ovaie in anestesia generale attraverso la chirurgia laparoscopica comeprecedentemente descritto 19,20.
- Posizionare le corteccia ovarica raccolte in un contenitore sterile contenente 10 mL di HTF modificato (mHTF) a 37 °C.
2. Frammentazione della corteccia ovarica
NOTA: Prima della dissezione della corteccia ovarica, riscaldare mHTF a 37 °C. Mantenere condizioni sterili durante tutta la procedura. Tutti gli strumenti per questa procedura sono elencati in Table of Materials.
- Mettere le corteccia ovarica raccolte in un piatto di plastica contenente 5-10 mL di mHTF a 37 °C e posizionarle sulla piastra termica per mantenere il tessuto a 37 °C(Figura 2A).
- Scatta una foto di ogni corteccia usando una fotocamera digitale con il nome del paziente prima di iniziare la procedura successiva per collegare i dati in background del paziente.
- Posizionare una corteccia individuale su una garza sterile inumidita con mHTF (Figura 2B).
NOTA: Applicare mHTF aggiuntivo con una pipetta monouso sulla garza per evitare che la superficie della corteccia venga asciugata durante questa procedura. - Rimuovere il tessuto midollare residuo in cui appare rosa utilizzando una micro-forbice in modo che lo spessore del tessuto raggiunga 1-2 mm(Figura 2C e D).
NOTA: Per evitare la perdita di follicoli nella fase iniziale, non preparare le strisce corticali di spessore inferiore a 1 mm, perché i follicoli in fase iniziale si trovano entro 1-2 mm dalla superficie della corteccia ovarica21. - Sezionare un pezzo di tessuto di 1 mm x 1 mm x 5 mm da ogni striscia corticale ovarica utilizzando un bisturi fine e sottoposerlo ad analisi istologiche per determinare la presenza di follicoli residui comedescritto in precedenza 18 (Figura 2E).
NOTA: I tessuti sezionati per l'istologia sono immersi in mHTF e si mantengono a 4 °C fino al fissaggio(Figura 2F, vedere fase 4). - Tagliare la corteccia in strisce da 1 mm x 1 mm x 10 mm utilizzando un bisturi fine (Figura 2G).
NOTA: È più facile da tagliare premendo sul bisturi che tirandolo su di esso. - Tagliare queste strisce di tessuto in cubi piccoli da 1 mm x 1 mm x 1 mm(Figura 2H).
NOTA: Per evitare cambiamenti di pressione osmotica nel mezzo, aggiungere mHTF con moderazione prima dell'autoinnesto dei tessuti.
3. Auto-innesto di frammenti corticali ovarico
- Aprire la confezione della cannula IVA e metterla su un drappo sterile.
- Risciacquare all'interno della cannula IVA con mHTF aspirando e scaricando mHTF più volte.
- Aspirare 100-200 μL di mHTF per riempire la punta della cannula IVA per evitare che i cubi corticali si asciughino durante il caricamento(Figura 3A).
- Caricare i cubi corticali nella punta della cannula IVA utilizzando una pinzetta fine (Figura 3B-E).
NOTA: Il numero di cubi corticali per il caricamento dipende dal sito di innesto. Generalmente, 20-30 cubi possono essere trapiantati in un'ovaia rimanente ortotropica, mentre 10-15 cubi possono essere trapiantati in una busta sotto la serosa della tube di Falloppio. - Dopo aver caricato i cubi corticali, tenere la punta della cannula contenente i cubi corticali dalle dita fino a trasferire la cannula IVA a un chirurgo. Ciò eviterà che la temperatura del cubo diminuisca.
NOTA: I dettagli della procedura di autoinnesto in chirurgia laparoscopica sono stati riportati in precedenza19. Per l'innesto di cubi corticali ovarico, il nostro collaboratore, la Kitazato Corporation, ha sviluppato un dispositivo a forma di cannula (IVA cannula).
4. Analisi istologica della corteccia ovarica
NOTA: Per contare il numero di follicoli residui, eseguire analisi istologiche come descritto in precedenza15.
- Contrassegnare la superficie della striscia corticale con un colorante di marcatura tissutale prima della fissazione del campione. Questo indicherà il lato della corteccia in striscia per l'istologia.
- Fissare le strisce tissutali durante la notte a 4 °C utilizzando la soluzione di Bouin.
NOTA: Per rilevare i follicoli atretici, si s consiglia di utilizzare la paraformaldeide per il fissaggio per evitare il restringimento del citoplasma degli ovocite. - Disidratare e incorporare le strisce tissutali in paraffina.
- Sessò in serie il blocco di paraffina contenente il campione di tessuto.
- Macchiare ogni sezione usando ematossilina ed eosina per visualizzare i follicoli.
- Contare i follicoli come descritto in precedenza17.
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Representative Results
Nella prima pubblicazione dell'approccio IVA15,abbiamo trapiantato i cubi corticali ovarici uno per uno nei siti di innesto in chirurgia laparoscopica(Figura 1A). Poiché sono stati usati 100-150 cubi ovarici, ci sono volle 3-4 ore per l'innesto tissutale sotto chirurgia laparoscopica. Inoltre, alcuni cubi ovarico sono stati persi prima dell'innesto. Poiché la cannula IVA potrebbe trasferire 20-30 cubi in un sito di innesto contemporaneamente (Figura 1B), potremmo ridurre il tempo di funzionamento a 1-2 ore. Inoltre, la cannula IVA potrebbe eliminare la perdita di cubi corticali ovarico durante l'intervento chirurgico.
Figura 1: L'efficacia della cannula IVA . (A) Metodo precedente con trapianto di cubi corticali ovarico uno per uno usando una flession. (B) Il metodo attuale con il trapianto di 20-30 cubi contemporaneamente utilizzando la cannula IVA. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Dissezione dei tessuti ovariani per IVA senza farmaci. (A) Un pezzo di corteccia ovarica è posto in un piatto di plastica contenente mHTF a 37 °C.(B)Per rimuovere i tessuti residui del midollo, la corteccia ovarica viene posta su una garza inumidita. (C) Il tessuto midollare viene rimosso utilizzando una micro-forbice fine. (D) Lo spessore della corteccia da preparare è compreso tra 1 e 2 mm . (E) Dopo la rimozione del tessuto midollare, viene sezionato un pezzo di tessuto di 1 mm x 1 mm x 5 mm da ogni striscia corticale ovarica per l'analisi istologica. (F) Il tessuto sezionato viene conservato in un tubo da 1,5 ml contenente mHTF a 4 °C fino al fissaggio per l'istologia. (G e H) La corteccia ovarica viene tagliata in strisce da 1 mm x 1 mm x 10 mm, quindi ulteriormente tagliata in cubetti di piccole dimensioni da 1 mm x 1 mm x 1 mm utilizzando un bisturi fine. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Auto-innesto di frammenti corticali ovariani. (A) Prima di caricare i cubi, si aspirano 100-200 μL di mHTF a riempire la punta della cannula IVA per evitare che i cubi corticali si asciughino durante il caricamento(B-E)Caricando cubi corticali ovarico nella punta della cannula IVA. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
In questo manoscritto, abbiamo mostrato un protocollo di laboratorio dettagliato per l'IVA senza farmaci. L'IVA senza farmaci è un nuovo approccio di trattamento dell'infertilità per il paziente POR con riserva ovarica in diminuzione per promuovere la crescita dei follicoli secondari, con conseguente rendimento di ovociti più maturi dopo la stimolazione ovarica e aumento della gravidanza disuccesso 20. In 15 pazienti por con riserva ovarica in diminuzione, questo approccio ha raggiunto una gravidanza spontanea, il trasferimento in vitro di fecondazione-embrione ha permesso quattro nascite vive, insieme a una gravidanza in corso19.
Per la preparazione dell'innesto della corteccia ovarica, il tessuto midollare è stato rimosso utilizzando una micro-forbice con 1-2 mm di spessore. In precedenza, abbiamo dimostrato che primordiali, primari e la maggior parte dei follicoli secondari si trovavano entro 1 mm di spessore dalla superficie della corteccia ovarica nei pazienti con normale riserva ovarica21. Nei pazienti con POI, abbiamo scoperto che i follicoli secondari si trovavano più in profondità di 1 mm ma entro 2 mm dalla superficie della corteccia ovarica21. I follicoli astrali sono noti per localizzare nei tessuti midollari21, ma nessun follicolo è stato trovato nei tessuti midollari nei pazienti con POI21. Sebbene i pazienti por con riserva ovarica in diminuzione possano avere follicoli astrali nel tessuto midollare, i follicoli antrali sono difficili da sopravvivere dopo l'innesto a causa della mancanza di comunicazione dei vasisanguigni 22. Pertanto, abbiamo determinato che lo spessore della corteccia ovarica è di 1-2 mm e il passo critico all'interno del protocollo non è fare le strisce corticali < 1-2 mm per evitare la perdita di preziosi follicoli residui. Durante la preparazione di strisce corticali e cubi, abbiamo usato mHTF, ma si può usare un mezzo simile che include tampone di acido 4-(2-idrossietile)-1-piperazinaetanosolfonico (HEPES).
In questa procedura, abbiamo trapiantato la corteccia ovarica dopo averla tagliare in 1 mm3 cubi 15,20. A causa della difficoltà di maneggiare frammenti così piccoli per l'innesto, i precedenti cubi ovarici di innesto uno per uno sotto l'intervento laparoscopico hanno impiegato 3-4 ore con alcuni cubi occasionalmente persi durante l'intervento chirurgico. Dopo lo sviluppo della cannula IVA, potremmo ridurre il tempo di funzionamento a 1-2 ore, con conseguente minimizzazione dell'invasività dell'intervento chirurgico per consentire all'IVA senza farmaci di diventare un solo giorno di intervento chirurgico. Inoltre, potremmo eliminare la perdita di cubi corticali ovarico durante l'intervento chirurgico. A causa del numero limitato di follicoli nella corteccia ovarica nei pazienti con POR con riserva ovarica in diminuzione, è importante evitare la perdita di cubi corticali ovarico. Se la cannula IVA non è disponibile, potresti provare a trovare una cannula simile da poter utilizzare in chirurgia laparoscopica.
Il declino della funzione ovarica è progressivamente causato dall'invecchiamento e da alcune condizioni fisiopatiche 23,24,25. Pertanto, nelle donne non sposate con grave disfunzione ovarica, la conservazione della fertilità è importante per consentire la gravidanza futura. Per questi pazienti sono stati riportati i metodi di crioconservazione degli ovociti o dei tessuti ovarici26,27,28,29. Sebbene la crioconservazione degli ovociti sia un metodo stabilito per la conservazione dellafertilità 1,2, questi pazienti potrebbero avere un numero molto limitato di ovociti recuperabili anche dopo l'iperstimolazione ovarica a causa della bassa riserva ovarica. Inoltre, nei pazienti anziani con disfunzione ovarica, è stata segnalata un'elevata incidenza di anomalie cromosomiche negli ovociti ovulati26,30. Ciò porta all'esigenza di più procedure costose per garantire un numero sufficiente di ovociti per garantire la gravidanza. Per risolvere questi problemi, abbiamo sviluppato l'approccio IVA senza farmaci per aumentare il numero di ovociti maturi per il recupero degli ovociti. Poiché la crioconservazione degli ovocite non è più un metodosperimentale 31,32, l'IVA senza farmaci seguita dalla crioconservazione degli ovocite dovrebbe essere un metodo promettente per la conservazione della fertilità nelle donne non sposate con grave disfunzione ovarica. Tuttavia, saranno necessari futuri studi clinici utilizzando gli ovociti congelati ottenuti dall'IVA senza farmaci per determinare l'efficacia di questo approccio per la conservazione della fertilità nelle donne non sposate con grave disfunzione ovarica.
In conclusione, abbiamo sviluppato l'IVA senza farmaci come nuovo approccio di trattamento dell'infertilità per il paziente POR con riserva ovarica in diminuzione e abbiamo mostrato il protocollo di laboratorio dettagliato per poter ripetere le nostre procedure. I limiti metodologici dell'IVA senza farmaci sono difficoltà nella previsione del numero di follicoli residui prima dell'intervento chirurgico e anche incapacità di valutare la sopravvivenza dell'innesto. La tecnica di laboratorio dell'IVA senza farmaci potrebbe diventare la base della futura applicazione della coltura del tessuto ovarico per ottenere ovociti maturi senza innesto.
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Disclosures
Gli autori confermano di non avere alcun conflitto di interessi.
Acknowledgments
Ringraziamo Tatsuji Ihana, Sachiyo Kurimoto, Kazuko Takahasih, Yuki Yoshizawa, Maho Arashi, Kentaro Fujita, Erina Kudo, Yuka Kurimoto e Mayuko Wakatsuki per aver supportato la procedura IVA senza farmaci e il Prof. Ringraziamo anche Rebecca Truman e Gregory Truman per aver inserito la narrazione inglese. Questo studio è stato supportato dalla Japan Society for the Promotion of Science (JSPS), Scientific Research B (19H03801) e Challenging Exploratory Research (18K19624).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4.5 onz specimen container | FALCON | 354013 | Other products may also be suitable |
| 60mm dish | FALCON | 351007 | Other products may also be suitable |
| 50 x 50 cm sterile drape | HOGY Medical | SR-823 | Any type of sterile produsts may also be suitable |
| Disposable pippete | FALCON | 357575 | Other products may also be suitable |
| Fine scissors, Curved | WPI | #14224-G | Although other products may also be suitable, we strongly recommend use this products |
| Hot plate | TOKAI HIT | TPiE-SP | Use at operation room to maintain the temperature of dishes containing ovarian tissue before transplantation |
| Human Serum Albumin Solution | Irvine Scientific | 9988 | Medium for handling ovarian tissue |
| IVA cannule | KITAZATO | 446030 IVA-6030E | Specific cannula for tissue autografting |
| KAI medical Disposable scalpel | WPI | #5 10-A | Although other products may also be suitable, we strongly recommend use this products |
| Micro scissors, Curved | WPI | #503364 | Although other products may also be suitable, we strongly recommend use this products |
| Modified HTF Medium-HEPES | Irvine Scientific | 90126 | Medium for handling ovarian tissue |
| Sterile gauze | Osaki Medical | 15004 | Any type of sterile produsts may also be suitable |
| Swiss Tweezers, Curved Tips | KAI | #504505 | Although other products may also be suitable, we strongly recommend use this products |
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