Summary
Presentamos los detalles de los procedimientos del laboratorio para la activación in vitro droga-libre (IVA) de los folículos ováricos para los pacientes con la disfunción ovárica severa. Este método podría aumentar el número de ovocitos recuperables por hiperestimulación ovárica y beneficiar la preservación de la fertilidad para esas pacientes.
Abstract
La función ovárica disminuye progresivamente durante el envejecimiento y en algunas condiciones fisiopatológicas, incluyendo anomalías del cariotipo, enfermedades autoinmunes, quimio y radioterapias, así como cirugías ováricas. En mujeres solteras con la disfunción ovárica severa, la preservación de la fertilidad es importante para los embarazos futuros. Aunque el cryopreservation del oocyte sea un método establecido para la preservación de la fertilidad, estos pacientes podrían preservar solamente un número limitado de oocytes incluso después de la hiperestimulación ovárica, llevando a los estímulos repetidos para asegurar suficientes ovocitos para garantizar embarazo futuro. Para solucionar este problema, hemos desarrollado recientemente un procedimiento de activación in vitro libre de drogas (IVA), que nos permite estimular las primeras etapas de los folículos ováricos para que se desarrollen a la etapa del folículo preantral. Estos folículos preantrales pueden responder al protocolo único del estímulo de la gonadotropina, dando por resultado el número creciente de ovocitos recuperados por el estímulo ovárico para el cryopreservation. El IVA libre de fármacos se compuso desde el abordaje quirúrgico y la estimulación ovárica. Se extrae una parte de la corteza de uno o ambos ovarios de pacientes sometidos a cirugía laparoscópica. Los tejidos corticales ováricos fueron cortados en pequeños cubos para interrumpir el camino de la señalización del hipopótamo y para estimular el desarrollo de los folículos de la etapa temprana. Estos cubos fueron injertado orthotropically en ovarios restantes así como debajo del serosa de ambos tubos de Falopio. Ya hemos publicado el procedimiento quirúrgico del IVA libre de drogas y el protocolo de estimulación ovárica posterior, pero aquí presentamos los detalles de los métodos de laboratorio requeridos para el IVA libre de drogas.
Introduction
La función ovárica disminuye progresivamente durante el envejecimiento y algunas condiciones patofisiológicas incluyendo anormalidad del karyotype, enfermedades autoinmunes, chemo- y radioterapias, y cirugías ováricas. La preservación de la fertilidad es una de las mejores opciones para que las mujeres solteras con disfunción ovárica grave preserven su potencial para el embarazo futuro. Para la preservación de la fertilidad, actualmente hay dos métodos disponibles principalmente en el campo de la oncofertilidad. La criopreservación de ovocitos es un procedimiento bien establecido para la preservación de la fertilidad y se han reportado muchos casos exitosos1,2. Por otro lado, la criopreservación del tejido ovárico también se estableció para la preservación de la fertilidad en pacientes con cáncer, pero sigue siendo una estrategia experimental3,4. En ambos métodos, se necesitan múltiples números de ovocitos maduros para que ocurra el embarazo. En general, las pacientes con insuficiencia ovárica prematura (POI), que se convierten en amenorrea antes de los 40 años de edad, y las mujeres de mediana edad con baja reserva ovárica mostraron una respuesta ovárica deficiente (POR) a la estimulación ovárica para la producción de ovocitos maduros5,6,7. Además, las pacientes jóvenes con un bajo número de folículos antrales también mostraron POR a la estimulación ovárica7. Estas pacientes tienen un número muy limitado de ovocitos recuperables incluso después de la hiperestimulación ovárica adecuada, lo que requiere múltiples procedimientos costosos para garantizar un número suficiente de ovocitos para el embarazo.
La donación de ovocitos seguida de la fecundación in vitro (FIV) con espermatozoides del marido y la transferencia de embriones (TE) es la única opción para estas pacientes de POI y POR que tienen dificultades para obtener sus propiosovocitos 8,9,10. Sin embargo, la donación de ovocitos se complica por cuestiones éticas, así como por complicaciones autoinmunes y del embarazo11,12,13,14. Para resolver estos problemas, se desea el establecimiento de un tratamiento de infertilidad utilizando los propios ovocitos de los pacientes. Para las pacientes con POI, hemos desarrollado el enfoque de activación in vitro (IVA) para permitir el crecimiento exitoso del folículo y la generación de ovocitos maduros, liderando una serie de embarazos y partos15. En IVA, fragmentamos las cortezas ováricas después de la extracción de ovarios bajo cirugía laparoscópica y los cultivamos durante dos días para activar folículos mediante fármacos estimulantes de Akt y luego realizar injertos heterotópicos de nuevo en bolsas artificiales hechas debajo de la serosa de las trompas de Falopio bajo segunda cirugía laparoscópica15. Este procedimiento promovió el crecimiento de folículos primordiales, primarios y secundarios después de la fragmentación de la corteza ovárica para promover la interrupción de la señalización de hipopótamo16,seguido de dos días de cultivo con estimuladores de señalización Akt17.
En contraste con casos severos del POI, los pacientes del POR con la reserva ovárica disminuida tienen folículos secundarios múltiples. Debido a que la interrupción de la señalización de hipopótamos por sí sola es eficaz en la promoción del crecimiento del folículo secundario16,recientemente demostramos embarazos y partos exitosos para pacientes con POR utilizando el procedimiento IVA libre de drogas que implica fragmentación cortical e injerto ortotópico sin tratamiento de los fármacos estimulantes Akt. El IVA libre de drogas estimula la etapa temprana de los folículos ováricos para que se desarrollen a la etapa del folículo preantral después de una sola cirugía y aumenta el número de ovocitos recuperados para la transferencia de embriones deFIV 15,18. El acercamiento droga-libre del IVA tiene varias ventajas con respecto a nuestro IVA original por 1) evitando pérdida potencial del folículo durante cultura, 2) minimizando invasividad y costes de la segunda cirugía, 3) implicando solamente resto de cama a corto plazo de la poste-cirugía y 4) potencial del embarazo espontáneo debido al injerto orthotopic. Recientemente publicamos un video artículo que muestra los procedimientos quirúrgicos del IVA libre de drogas19 y los protocolos detallados de estimulación ovárica después de la cirugía20. Aquí, presentamos los detalles de los métodos de laboratorio requeridos para el IVA libre de drogas.
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Protocol
El consentimiento informado escrito fue obtenido de cada paciente del POR con la reserva ovárica decreciente que alistó en el tratamiento droga-libre del IVA. Este estudio fue aprobado por el comité ético de la Universidad Internacional de Salud y Bienestar (No. 17-S-21). El ensayo clínico se registró con el número UMIN000034464 y se llevó a cabo de acuerdo con el Código de Ética de la Asociación Médica Mundial (Declaración de Helsinki).
1. Extracción de la corteza ovárica
- Extirpar parte de la corteza ovárica (10 x 10 mm, 2-3 mm de espesor) de uno o ambos ovarios bajo anestesia general mediante cirugía laparoscópica como se describió anteriormente19,20.
- Coloque las cortezas ováricas recogidas en un recipiente estéril que contenga 10 mL de HTF modificado (mHTF) a 37 °C.
2. Fragmentación de la corteza ovárica
NOTA: Antes de la disección de la corteza ovárica, caliente mHTF a 37 °C. Mantenga condiciones estériles durante todo el procedimiento. Todas las herramientas para este procedimiento se enumeran en tabla de materiales.
- Colocar las cortezas ováricas recogidas en un plato de plástico que contenga 5-10 mL de mHTF a 37 °C y colocarlas sobre la placa de calor para mantener el tejido a 37 °C (Figura 2A).
- Tome una foto de cada corteza usando una cámara digital con el nombre del paciente antes de comenzar el siguiente procedimiento para vincular los datos de fondo del paciente.
- Colocar una corteza individual sobre una gasa estéril humedecida con mHTF(Figura 2B).
NOTA: Aplique mHTF adicional con una pipeta desechable en la gasa para evitar que la superficie de la corteza se seque durante este procedimiento. - Retirar el tejido de la médula residual donde se ve rosado utilizando una micro-tijera para que el espesor del tejido alcance los 1-2 mm(Figura 2C y D).
NOTA: Para evitar la pérdida de folículos en la etapa temprana, no prepare las tiras corticales de menos de 1 mm de espesor, porque los folículos en etapa temprana se encuentran dentro de 1-2 mm de la superficie de la corteza ovárica21. - Diseccionar una pieza de tejido de 1 mm x 1 mm x 5 mm de cada tira cortical ovárica utilizando un bisturí fino y someterlo a análisis histológico para determinar la presencia de folículos residuales como se describió anteriormente18 (Figura 2E).
NOTA: Los tejidos disecados para histología se sumergen en mHTF y se mantienen a 4 °C hasta su fijación(Figura 2F,ver Paso 4). - Corte la corteza en tiras de 1 mm x 1 mm x 10 mm usando un bisturí fino (Figura 2G).
NOTA: Es más fácil de cortar presionando hacia abajo sobre el bisturí que tirando de él. - Corte estas tiras de tejido en cubos pequeños de 1 mm x 1 mm x 1 mm (Figura 2H).
NOTA: Para evitar cambios de presión osmótica en el medio, agregue mHTF con moderación antes de autoinjerto tisular.
3. Autoinjerto de fragmentos corticales ováricos
- Abra el paquete de la cánula IVA y colócalo en una cortina estéril.
- Enjuague el interior de la cánula IVA con mHTF aspirando y descargando mHTF varias veces.
- Aspirar 100-200 μL de mHTF para llenar la punta de la cánula IVA para evitar que los cubos corticales se sequen durante la carga (Figura 3A).
- Cargue los cubos corticales en la punta de la cánula IVA usando una pinza fina (Figura 3B-E).
NOTA: El número de cubos corticales para la carga depende del sitio de injerto. Generalmente, 20-30 cubos se pueden trasplantar en un ovario restante ortotrópico, mientras que 10-15 cubos se pueden trasplantar en una bolsa debajo del serosa del tubo de Falopio. - Después de cargar los cubos corticales, sostenga la punta de la cánula que contiene los cubos corticales por los dedos hasta transferir la cánula IVA a un cirujano. Esto evitará que la temperatura del cubo disminuya.
NOTA: Los detalles del procedimiento de autoinjerto bajo cirugía laparoscópica han sido reportadospreviamente 19. Para el injerto de cubos corticales ováricos, un dispositivo en forma de cánula (cánula IVA) fue desarrollado por nuestro colaborador, la Corporación Kitazato.
4. Análisis histológico de la corteza ovárica
NOTA: Para contar el número de folículos residuales, realice análisis histológicos como se describió anteriormente15.
- Marque la superficie de la tira cortical con un tinte de marcado de tejido antes de la fijación de la muestra. Esto indicará el lado de la corteza en la tira para la histología.
- Fije las tiras de tejido durante la noche a 4 °C usando la solución de Bouin.
NOTA: Para detectar folículos atretic, no recomendamos usar el paraformaaldehído para la fijación para evitar la contracción del citoplasma del oocyte. - Deshidratar e incrustar las tiras de tejido en la parafina.
- Seccione en serie el bloque de parafina que contiene la muestra de tejido.
- Manche cada sección usando hematoxilina y eosina para visualizar los folículos.
- Contar los folículos como se describió anteriormente17.
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Representative Results
En la primera publicación del enfoque IVA15,trasplantamos los cubos corticales ováricos uno por uno en los sitios de injerto bajo cirugía laparoscópica(Figura 1A). Porque 100-150 cubos ováricos fueron utilizados, tomó 3-4 horas para el injerto del tejido bajo cirugía laparoscopic. También, algunos cubos ováricos fueron perdidos antes de injertar. Debido a que la cánula IVA podría transferir 20-30 cubos a un sitio de injerto a la vez (Figura 1B), podríamos acortar el tiempo de operación a 1-2 horas. Además, la cánula IVA podría eliminar la pérdida de cubos corticales ováricos durante la cirugía.
Figura 1:La efectividad de la cánula IVA. (A) Método previo con trasplante de cubos corticales ováricos uno por uno utilizando un fórceps. (B)El método actual con el trasplante de 20-30 cubos a la vez utilizando la cánula IVA. Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.
Figura 2:Disección de tejido ovárico para IVA libre de fármacos. (A) Se coloca un trozo de corteza ovárica en un plato de plástico que contiene mHTF a 37 °C.(B)Para eliminar los tejidos residuales de la médula, la corteza ovárica se coloca sobre una gasa humedante. (C) El tejido de la médula se extrae utilizando una microes tijera fina. (D) El espesor de la corteza a preparar es de entre 1 a 2 mm. (E) Después de la extracción del tejido de la médula, se disecciona una pieza de tejido de 1 mm x 1 mm x 5 mm de cada tira cortical ovárica para su análisis histológico. (F) El tejido diseccionado se almacena en un tubo de 1,5 mL que contiene mHTF a 4 °C hasta su fijación para la histología. (G y H) La corteza ovárica se corta en tiras de 1 mm x 1 mm x 10 mm, y luego se corta aún más en cubos pequeños de 1 mm x 1 mm x 1 mm usando un bisturí fino. Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.
Figura 3: Autoinjerto de fragmentos corticales ováricos. (A) Antes de cargar los cubos, se aspiran 100-200 μL de mHTF para llenar la punta de la cánula IVA para evitar que los cubos corticales se sequen durante la carga (B-E) Cargando cubos corticales ováricos en la punta de la cánula IVA. Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.
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Discussion
En este manuscrito, mostramos un protocolo detallado del laboratorio para el IVA droga-libre. El IVA libre de fármacos es un nuevo enfoque de tratamiento de la infertilidad para pacientes con POR con reserva ovárica decreciente para promover el crecimiento de los folículos secundarios, lo que resulta en el rendimiento de ovocitos más maduros después de la estimulación ovárica y el aumento en el embarazo exitoso20. En 15 pacientes del POR con la reserva ovárica decreciente, este acercamiento alcanzó un embarazo espontáneo, la transferencia in vitro de la fertilización-embrión permitió cuatro nacimientos vivos, junto con un embarazo en curso19.
Para la preparación de la corteza ovárica del injerto, el tejido de la médula fue quitado usando una micro-tijera con 1-2 milímetros de grueso. Previamente, demostramos que primordial, primario y la mayoría de los folículos secundarios estaban localizados dentro de 1 mm de espesor de la superficie de la corteza ovárica en las pacientes con reserva ovárica normal21. En pacientes del POI, encontramos que los folículos secundarios fueron situados más profundos de 1 milímetro pero dentro de 2 milímetros de la superficie de la corteza ovárica21. Se sabe que los folículos antrales se localizan en los tejidos de la médula21,pero no se encontró folículo en los tejidos de la médula en pacientes con POI21. A pesar de que las pacientes con por ovárica decreciente podrían tener folículos antrales en el tejido de la médula, los folículos antrales son difíciles de sobrevivir después del injerto debido a la falta de comunicación de los vasos sanguíneos22. Por lo tanto, determinamos el grueso de la corteza ovárica para ser 1-2 milímetros y el paso crítico dentro del protocolo no está haciendo las tiras corticales < 1-2 milímetros para evitar la pérdida de folículos residuales preciosos. Durante la preparación de tiras corticales y cubos, utilizamos mHTF, pero uno puede utilizar medio similar que incluyen 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic ácido (HEPES) almacenador intermediario.
En este procedimiento, trasplantamos la corteza ovárica después de cortarla en 1 mm3 cubos15,20. Debido a la dificultad en la manipulación de fragmentos tan pequeños para el injerto, el injerto anterior de cubos ováricos uno por uno bajo cirugía laparoscópica tomó de 3 a 4 horas con algunos cubos que ocasionalmente se perdieron durante la cirugía. Después del desarrollo de la cánula IVA, podríamos acortar el tiempo de operación a 1-2 horas, lo que resulta en minimizar la invasividad de la cirugía para permitir que el IVA libre de drogas se convierta en un solo día de cirugía. Por otra parte, podríamos eliminar la pérdida de cubos corticales ováricos durante cirugía. Debido a el número limitado de folículos en corteza ovárica en pacientes del POR con la disminución de la reserva ovárica, es importante evitar la pérdida de cubos corticales ováricos. Si la cánula IVA no está disponible, usted puede tratar de encontrar una cánula similar para poder usar bajo cirugía laparoscópica.
El declive de la función ovárica es causado progresivamente por el envejecimiento y algunas condiciones fisiopatológicas 23,24,25. Así, en mujeres solteras con la disfunción ovárica severa, la preservación de la fertilidad es importante permitir embarazo futuro. Para estas pacientes, los métodos de criopreservación de ovocitos o tejido ovárico fueron reportados26,27,28,29. Aunque la criopreservación de ovocitos es un método establecido para la preservación de la fertilidad1,2,estas pacientes podrían tener un número muy limitado de ovocitos recuperables incluso después de la hiperestimulación ovárica debido a la baja reserva ovárica. Además, en pacientes del envejecimiento con la disfunción ovárica, la alta incidencia de anormalidades del cromosoma fue divulgada en ovocitos ovulados26,30. Esto lleva al requisito de múltiples procedimientos costosos para asegurar un número suficiente de ovocitos para garantizar el embarazo. Para resolver estos problemas, hemos desarrollado el acercamiento libre de la droga del IVA para aumentar el número de ovocitos maduros para la recuperación del oocyte. Debido a que la criopreservación de ovocitos ya no es un método experimental31,32,se espera que el IVA libre de drogas seguido de criopreservación de ovocitos sea un método prometedor para la preservación de la fertilidad en mujeres solteras con disfunción ovárica grave. Sin embargo, los estudios clínicos futuros usando los ovocitos congelado-descongelados obtenidos del IVA droga-libre serán requeridos determinar la eficacia de este acercamiento para la preservación de la fertilidad en mujeres solteras con la disfunción ovárica severa.
En conclusión, desarrollamos el IVA libre de fármacos como un nuevo enfoque de tratamiento de infertilidad para pacientes por POR con disminución de la reserva ovárica y mostramos el protocolo de laboratorio detallado para poder repetir nuestros procedimientos. Las limitaciones metodológicas del IVA libre de fármacos son la dificultad en la predicción del número de folículos residuales antes de la cirugía y también la incapacidad para evaluar la supervivencia del injerto. La técnica de laboratorio del IVA libre de fármacos podría convertirse en la base de la futura aplicación del cultivo de tejido ovárico para obtener ovocitos maduros sin injerto.
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Disclosures
Los autores confirman que no tienen ningún conflicto de intereses.
Acknowledgments
Agradecemos a Tatsuji Ihana, Sachiyo Kurimoto, Kazuko Takahasih, Yuki Yoshizawa, Maho Arashi, Kentaro Fujita, Erina Kudo, Yuka Kurimoto y Mayuko Wakatsuki por apoyar el procedimiento de IVA libre de drogas y al Prof. Aaron J.W. Hsueh (Stanford University School of Medicine, Stanford, CA) por la lectura crítica y edición del manuscrito. También agradecemos a Rebecca Truman y Gregory Truman por insertar la narración en inglés. Este estudio fue apoyado por la Sociedad Japonesa para la Promoción de la Ciencia (JSPS), la Investigación Científica B (19H03801) y la Investigación Exploratoria Desafiante (18K19624).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4.5 onz specimen container | FALCON | 354013 | Other products may also be suitable |
| 60mm dish | FALCON | 351007 | Other products may also be suitable |
| 50 x 50 cm sterile drape | HOGY Medical | SR-823 | Any type of sterile produsts may also be suitable |
| Disposable pippete | FALCON | 357575 | Other products may also be suitable |
| Fine scissors, Curved | WPI | #14224-G | Although other products may also be suitable, we strongly recommend use this products |
| Hot plate | TOKAI HIT | TPiE-SP | Use at operation room to maintain the temperature of dishes containing ovarian tissue before transplantation |
| Human Serum Albumin Solution | Irvine Scientific | 9988 | Medium for handling ovarian tissue |
| IVA cannule | KITAZATO | 446030 IVA-6030E | Specific cannula for tissue autografting |
| KAI medical Disposable scalpel | WPI | #5 10-A | Although other products may also be suitable, we strongly recommend use this products |
| Micro scissors, Curved | WPI | #503364 | Although other products may also be suitable, we strongly recommend use this products |
| Modified HTF Medium-HEPES | Irvine Scientific | 90126 | Medium for handling ovarian tissue |
| Sterile gauze | Osaki Medical | 15004 | Any type of sterile produsts may also be suitable |
| Swiss Tweezers, Curved Tips | KAI | #504505 | Although other products may also be suitable, we strongly recommend use this products |
References
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