Summary
Baroreflex er en hjertefrekvensreguleringsmekanisme af det autonome nervesystem som reaktion på blodtryksændringer. Vi beskriver en kirurgisk teknik til implantering af telemetrisendere til kontinuerlig og samtidig måling af elektrokardiogram og blodtryk hos mus. Dette kan bestemme spontan baroreflexfølsomhed, en vigtig prognostisk markør for hjerte-kar-sygdomme.
Abstract
Blodtryk (BP) og puls (HR) styres begge af det autonome nervesystem (ANS) og er tæt sammenflettet på grund af refleksmekanismer. Baroreflex er en vigtig homeostatisk mekanisme til at modvirke akutte, kortsigtede ændringer i arteriel BP og til at opretholde BP i et relativt snævert fysiologisk område. BP registreres af baroreceptorer placeret i aortabuen og carotis sinus. Når BP ændres, overføres signaler til centralnervesystemet og kommunikeres derefter til de parasympatiske og sympatiske grene af det autonome nervesystem for at justere HR. En stigning i BP forårsager et refleksfald i HR, et fald i BP forårsager en refleksforøgelse i HR.
Baroreflex følsomhed (BRS) er det kvantitative forhold mellem ændringer i arteriel BP og tilsvarende ændringer i HR. Kardiovaskulære sygdomme er ofte forbundet med nedsat baroreflexfunktion. I forskellige undersøgelser er reduceret BRS blevet rapporteret i f.eks. hjertesvigt, myokardieinfarkt eller koronararteriesygdom.
Bestemmelse af BRS kræver information fra både BP og HR, som kan registreres samtidigt ved hjælp af telemetriske enheder. Den kirurgiske procedure beskrives begyndende med indsættelsen af tryksensoren i venstre halspulsåre og placeringen af dens spids i aortabuen for at overvåge arterielt tryk efterfulgt af den subkutane placering af transmitteren og EKG-elektroderne. Vi beskriver også postoperativ intensiv pleje og smertestillende behandling. Efter en to-ugers periode med bedring efter operationen udføres langsigtede EKG- og BP-optagelser i bevidste og uhæmmede mus. Endelig inkluderer vi eksempler på optagelser af høj kvalitet og analyse af spontan baroreceptorfølsomhed ved hjælp af sekvensmetoden.
Introduction
Den arterielle baroreceptorrefleks er det vigtigste feedback-kontrolsystem hos mennesker, som giver en kortvarig - og muligvis også længerevarende 1,2 - kontrol af arterielt blodtryk (ABP). Denne refleks buffer forstyrrelser i BP, der opstår som reaktion på fysiologiske eller miljømæssige udløsere. Det giver hurtige refleksændringer i hjertefrekvens, slagvolumen og total perifer arteriel modstand. Refleksen stammer fra sensoriske nerveender i aortabuen og carotis bihuler. Disse nerveterminaler udgør de arterielle baroreceptorer. Somata af nerveterminaler i aortabuen er placeret i nodoseganglionen, mens de af nerveterminaler i carotis sinus er placeret i petrosal ganglion. Refleksen udløses af en stigning i blodtrykket, som strækker og aktiverer baroreceptornerveterminalerne (figur 1A). Aktivering resulterer i aktionspotentielle volleys, som overføres centralt via den afferente aortadepressor og carotis sinusnerver til kardiovaskulære hjernestammekerner såsom nucleus tractus solitarii og vagusnervens dorsale kerne. Ændringer i afferente nerveaktivitet modulerer igen den autonome efferente aktivitet. Øget aktivitet af baroreceptornerver nedsætter sympatisk og øger parasympatisk nerveaktivitet. Konsekvenserne af aktivering af baroreceptorer er således en reduktion i hjertefrekvens, hjerteudgang og vaskulær resistens, som tilsammen modvirker og buffer stigningen i blodtrykket3. I modsætning hertil øger nedsat aktivitet af baroreceptornerver sympatisk og nedsætter parasympatisk nerveaktivitet, hvilket øger hjertefrekvens, hjerteudgang og vaskulær modstand og dermed modvirker faldet i blodtrykket.
Talrige undersøgelser hos mennesker og dyr har vist, at baroreceptorrefleksen kan justeres under fysiologiske forhold som motion4, søvn5, varmestress6 eller graviditet7. Derudover er der tegn på, at baroreflex er kronisk nedsat i hjerte-kar-sygdomme, såsom hypertension, hjertesvigt, myokardieinfarkt og slagtilfælde. Faktisk anvendes baroreflexdysfunktion også som en prognostisk markør i flere hjerte-kar-sygdomme 8,9,10. Desuden er dysfunktion af baroreflex også til stede i lidelser i ANS. I betragtning af baroreceptorrefleksens betydning for sundhed og sygdomstilstande er in vivo-estimering af denne refleks en vigtig komponent i autonom og kardiovaskulær forskning med visse alvorlige kliniske implikationer.
Genetiske muselinjer er vigtige værktøjer i kardiovaskulær forskning. In vivo-studier af sådanne muselinjer giver værdifuld indsigt i kardiovaskulær fysiologi og patofysiologi og fungerer i mange tilfælde som prækliniske modelsystemer for hjerte-kar-sygdomme. Her giver vi en protokol for telemetrisk in vivo EKG og BP optagelse i bevidste, uhæmmede, frit bevægelige mus og beskriver, hvordan baroreflexfølsomhed kan bestemmes ud fra disse optagelser ved hjælp af sekvensmetoden (figur 1B). Den anvendte metode kaldes sekvensmetoden, fordi beat-to-beat-serien af systoliske BP- (SBP) og RR-intervaller screenes for korte sekvenser på tre eller flere slag under spontan stigning eller fald i SBP med reflekstilpasning af HR. Denne metode er guldstandarden for bestemmelse af baroreflexfølsomhed, da kun spontane refleksmekanismer undersøges. Teknikken er bedre end ældre teknikker, der involverede invasive procedurer såsom injektion af vasoaktive lægemidler for at fremkalde BP-ændringer.
Figur 1: Skematisk gengivelse af følsomhedsvurderingen af baroreflex og baroreflex ved hjælp af sekvensmetoden . (A) Baroreflexens forløb under en akut stigning i blodtrykket. En kortvarig stigning i ABP registreres af baroreceptorer placeret i aortabuen og carotis sinus. Disse oplysninger overføres til centralnervesystemet og inducerer et fald i sympatisk nerveaktivitet parallelt med en stigning i parasympatisk aktivitet. Frigivelse af acetylcholin fra nerveender placeret i sinoatriale knude region inducerer et fald i den anden messenger cAMP i sinoatriale knude pacemaker celler og dermed en reduktion i hjertefrekvensen. Et kortvarigt fald i blodtrykket har den modsatte virkning. (B) Skematiske BP-spor under en op-sekvens (øverste venstre panel) og nedsekvens (øverste højre panel) af tre på hinanden følgende slag. En op-sekvens er forbundet med en parallel stigning i RR-intervaller (nederste venstre panel), hvilket svarer til et fald i HR. En nedsekvens er forbundet med et parallelt fald i RR-intervaller (nederste højre panel), hvilket svarer til en stigning i HR. Klik her for at se en større version af denne figur.
Protocol
Udfør alle dyreforsøg i overensstemmelse med lokale institutionelle retningslinjer og nationale love om dyreforsøg. Til dette forsøg blev undersøgelserne godkendt af Regierung von Oberbayern og var i overensstemmelse med tysk lovgivning om dyreforsøg. WT-dyr (C57BL/6J baggrund) og dyr med en syg sinussyndrom musemodel med øget BRS-følsomhed (Hcn4tm3(Y527F; R669E; T670A)Biel)11 (blandet C57BL/6N og 129/SvJ baggrund) blev anvendt til denne undersøgelse.
1. Opsætning af udstyr
- Fjern en telemetrisk sender fra dens sterile emballage, og forkort EKG-ledningerne til den længde, der passer til musens størrelse. For en 12 uger gammel sort seksmus-hanmus (C57BL/6J), der vejer ~30 g, skal du forkorte den positive bly (rød) til en længde på ~45 mm og den negative ledning (farveløs) til en længde på ~40 mm ved hjælp af en saks.
BEMÆRK: Disse værdier er angivet som orientering og skal tilpasses efter behov (figur 2). - Fjern ca. 6 mm af EKG-ledningens silikoneslange ved hjælp af en skalpel for at blotlægge ledningen. Dæk ledningens spidser med overdreven slange, og lad en ~ 2 mm del EKG-ledning være afdækket for at optage elektriske signaler. Fastgør silikoneslangen med ikke-absorberbart 5-0 silkesuturmateriale (figur 2A).
- Skriv senderens serienummer ned i betjeningsprotokollen (supplerende fil 1).
- Hydratér transmitteren i en varm, steril 0,9 % NaCl-opløsning.
- Vej musen og registrer dens vægt.
- Autoklave alle kirurgiske instrumenter før operationen. Steriliser dem under operationen og mellem drift af forskellige dyr ved tør varme ved hjælp af en varm glasperlesterilisator.
BEMÆRK: Kirurgiske instrumenter skal køle ned til stuetemperatur før brug for at forhindre hudforbrændinger. - Desinficer arbejdsbordet for at sikre aseptiske forhold.
2. Kirurgisk implantation af telemetriske transmittere til kombinerede EKG- og blodtryksmålinger
- Dissektion af venstre fælles halspulsåre.
- Anæstesificer en mus ved intraperitoneal injektion af anæstesiblanding (100 mg / kg ketamin; 15 mg / kg xylazin; 1 mg / kg acepromazin). Udfør en tåklemmetest for at sikre, at musen er fuldt bedøvet, inden operationen påbegyndes.
- Brug en trimmer til at barbere det kirurgiske område fra under hagen mod de tværgående brystmuskler.
- Placer musen i liggende stilling på en temperaturstyret operationsplade, der er indstillet til 37 °C. Fastgør lemmerne med kirurgisk tape og overvåg kontinuerligt kropstemperaturen med et rektalt termometer (figur 2C). Hvis kropstemperaturen falder til under 37 °C, skal dyrets krop dækkes med sterilt bomuldsgaze under operationen.
- Påfør øjensalve for at beskytte dyrets øjne under anæstesi.
- Påfør hårfjerningscreme på det tidligere barberede kirurgiske område. Fjern hår og hårfjerningscreme med en vatrondel og varmt vand efter 3-4 min. Sørg for, at huden er ren og fri for resterende hår og hårfjerningscreme, så såret ikke bliver forurenet under operationen.
- Desinficere huden med flere vekslende runder af povidon-jod eller chlorhexidinskrubbe efterfulgt af alkohol.
- Placer dyret under et dissekerende mikroskop og læg et sterilt drapering omkring det kirurgiske område.
- Lav et 1-1,5 cm midterliniesnit gennem halsens hud, der starter umiddelbart under hagen. Gør en indsats for at gøre snittet så lige som muligt. (Figur 2D).
BEMÆRK: Under de følgende trin skal det kirurgiske område holdes fugtigt ved regelmæssig påføring af steril, varm (37 °C) 0,9 % NaCl. - Opret et subkutant rum på begge sider af snittet ved at adskille huden fra underliggende bindevæv med stump dissektionssaks. Pas på ikke at klemme huden for stærkt med tangen, da dette kan forårsage nekrose og føre til nedsat sårheling efter operationen.
- Adskil parotid- og submandibulære kirtler ved hjælp af bomuldsspidsapplikatorer for at udsætte muskulaturen, der ligger over luftrøret.
- Træk venstre spytkirtel tilbage med buet dissektionspip for at identificere den venstre halspulsåre placeret sideværts til luftrøret (figur 2E).
- Disseker forsigtigt halspulsåren fra tilstødende væv ved hjælp af buede tang. Vær meget forsigtig med ikke at skade vagusnerven, der løber langs fartøjet. Fortsæt stump dissektion for at udsætte venstre halspulsåre til ca. 10 mm i længden og adskille den fuldstændigt fra vaskulær fascia og vagusnerven (figur 2F).
- Før en ikke-absorberbar, 5-0 silkesutur under den isolerede del af halspulsåren, mens blodkarret løftes let med buede tang for at reducere friktionen mellem suturen og halspulsåren, da dette let kan beskadige vaskulærvæggen.
- Placer suturen kranielt, bare tæt på bifurcationen af halspulsåren, form en knude og bind den for permanent at ligere karret (figur 2G). Fastgør begge ender af kranieokklusionssuturen til operationsbordet med kirurgisk tape.
- Før en anden okklusionssutur under halspulsåren og placer den kausalt i ~ 5 mm afstand til kraniesuten (figur 2H). Det er nødvendigt for midlertidig okklusion af blodgennemstrømningen under kanylering af arterien. Bind derfor en løs knude og fastgør begge suturender med kirurgisk tape.
- Placer en tredje sutur (sikker sutur) mellem den kraniale og kaudale okklusionssutur og lav en løs knude (figur 2I). Denne sutur er nødvendig for at holde kateteret på plads, mens arterien kanyleres. Tape den ene ende af suturen til operationsbordet.
- Kanylering af venstre fælles halspulsåre.
BEMÆRK: Blodtrykskateterets sensorområde er placeret 4 mm fra den distale ende og består af et rør indeholdende en ikke-komprimerbar væske og en biokompatibel gel (figur 2B). Da dette område er meget følsomt, skal du sørge for, at det er fri for luftbobler og ikke røre ved det på noget tidspunkt under proceduren.- Bøj spidsen af en 24 G nål i en vinkel på ~100° for at bruge den som kateterintroducer.
- Træk forsigtigt den kaudale okklusionssutur og fastgør den med spænding for midlertidigt at stoppe blodgennemstrømningen og for let at løfte arterien.
- Træng forsigtigt ind i arterien proksimal til kranieokklusionssuturen med den bøjede nål (figur 2J). Tag fat i kateteret med karkanyletang, indfør det i den lille punktering og lad det glide langsomt ind i beholderen. Træk forsigtigt den bøjede kanyle tilbage samtidigt (figur 2K).
- Når kateteret når den kaudale okklusionssutur, strammes den sikre sutur lidt for at holde kateteret på plads (figur 2L).
- Løsn den kaudale okklusionssutur, så kateteret kan flyttes yderligere, indtil spidsen er placeret i aortabuen.
BEMÆRK: Sørg for at bestemme kateterets korrekte indføringslængde, da dette afhænger af musens størrelse. For hanmus med en C57BL/6J-baggrund ved 12 ugers alderen og ~30 g kropsvægt anbefaler vi at indsætte kateteret, indtil det integrerede hak når kranieokklusionssuturen. Den korrekte indsættelsesdybde og placering af kateteret til den specifikke muselinje kan verificeres efter eutanasi af dyret. - Når kateteret er placeret korrekt, skal du fastgøre kateteret med alle tre suturer og skære enderne så korte som muligt. Træk ikke knuderne for stramt, da dette kan beskadige det skrøbelige blodtrykskateter.
Figur 2: Implantation af et kombineret EKG og blodtrykstransmitter - kanylering af venstre halspulsåre . (A) Telemetritransmitteren består af et trykkateter, to biopotentielle elektroder og enhedens krop. B) Skematisk gengivelse af trykkateteret. Sensorområdet består af en ikke-komprimerbar væske og en biokompatibel gel. Kateteret skal indsættes i halspulsåren, indtil hakket er på niveau med kranieokklusionssuturen for at sikre korrekt position i blodkarret. (C) Bedøvet C57BL/6J-mus forberedt til implantation af kirurgisk sender. (D-L) Billedsekvens, der viser kirurgisk procedure for kanylering af venstre halspulsåre. D) Indsnit i livmoderhalsens hud. (E) Eksponeret luftrør for at identificere venstre halspulsåre placeret sideværts til luftrøret. (F) Stump dissektion for at isolere arterien fra tilstødende væv og vagusnerven. (G) Permanent ligering af venstre halspulsåre med kranial okklusionssutur. (H) Spænding anvendt på kaudal okklusionssutur for midlertidigt at stoppe blodgennemstrømningen. (I) Sikker sutur for at holde kateteret på plads under kanylering. J) Kanyle med buet spids til indsættelse af kateteret i blodkarret. (K) Trykkateter indsættes i halspulsåren. (L) Kateterspidsen er placeret i aortabuen, og kateteret er fastgjort med den midterste sutur. Skalabjælke i D - L viser 4 mm. Genoptrykt fra16. Klik her for at se en større version af denne figur.
- Placering af telemetrienhedens krop i en subkutan lomme på musens venstre flanke (figur 3).
- Dann en subkutan tunnel fra halsen rettet mod dyrets venstre flanke og dann en lille pose ved hjælp af en lille, stump dissekerende saks (figur 3B).
- Skyl tunnelen med en 1 ml sprøjte fyldt med varm, steril 0,9% NaCl-opløsning, og før ~300 μL af opløsningen ind i posen (figur 3C).
- Løft forsigtigt huden med stump pincet, og før senderenhedens krop ind i posen (figur 3D). I løbet af dette trin skal du være meget forsigtig med ikke at trække blodtrykskateteret ud af halspulsåren.
- Placering af EKG-ledningerne i Einthoven II-konfiguration.
- Dann en tynd tunnel til højre brystmuskel med stump dissekerende saks og placer den negative (farveløse) bly i tunnelen ved hjælp af stump tang. Fastgør den terminale ende af ledningen med en søm til brystmusklen ved hjælp af 6-0 absorberbart suturmateriale (figur 3E).
- Dann en løkke i den positive (røde) ledning, placer spidsen ved venstre kaudale ribbenregion og fastgør dens position med en sutur ved hjælp af 6-0 absorberbart suturmateriale.
BEMÆRK: Det er vigtigt, at begge ledninger ligger fladt mod kroppen i hele deres længde for at undgå vævsirritation (figur 3F). - Luk huden med enkelte knuder ved hjælp af 5-0 ikke-absorberbart suturmateriale (figur 3H). Derudover påføres en lille mængde vævslim på hver knude for at forhindre dyret i at bide suturen og forhindre dehiscens.
- Påfør povidon-jodhydrogel 10% på såret for at forhindre sårinfektion i genopretningsfasen.
- Til forebyggende smertelindring injiceres 5 mg/kg carprofen i 0,9 % NaCl subkutant, mens musen stadig er under bedøvelse.
- Indstil en varmeplatform til 39 ± 1 °C, og anbring musen i et separat husbur. Placer halvdelen af buret på platformen i 12 timer efter operationen og overfør musen i det varme område. Når dyret vågner fra anæstesi, har det mulighed for at blive i det varme område eller flytte til den køligere del af buret.
Figur 3: Implantation af et kombineret EKG og blodtrykstransmitter - subkutan placering af EKG-elektroderne og enhedens krop . (A) Mus efter indsættelse af blodtrykskateteret. Kateterposition sikres af okklusionssuturerne. (B) Danner en subkutan lomme på dyrets venstre flanke med en stump saks. (C) Posen vandes med ~300 μL varmt sterilt saltvand. (D) Enhedens krop placeres i den subkutane lomme. (E) Den terminale ende af den negative elektrode (farveløs) er fastgjort til højre brystmuskel med absorberbart suturmateriale. (F) Fastgørelse af den positive elektrode (rød) til venstre interkostale muskler. (G) Placering af en permanent sutur på brystmusklen for at sikre EKG-elektrodernes position. (H) Mus efter lukning af huden. De subkutane positioner af EKG-elektrodespidserne er angivet med røde cirkler. Til demonstrationsformål blev et dødt dyr brugt til at tage disse billeder. Følg steril praksis, mens du bruger et levende dyr. Genoptrykt fra16. Klik her for at se en større version af denne figur.
- Postoperativ pleje
- Til postoperativ smertelindring injiceres 5 mg/kg carprofen i 0,9% NaCl subkutant hver 12. time i 3-5 dage, indtil såret er helet.
- Der injiceres 10 μL/g varm ringer-lactatopløsning intraperitonealt for at beskytte dyret mod dehydrering.
- Lad musen komme sig i 2-3 uger, før du kører de første telemetriske målinger. Overvåg omhyggeligt generelle sundhedsmæssige forhold, sårheling, kropsvægt og mad- og vandindtag i genopretningsperioden.
- Ved afslutningen af eksperimentet aflives musen ved indånding af kuldioxid (CO2).
BEMÆRK: Cervikal dislokation eller halshugning anbefales ikke som eutanasimetode, da dette kan beskadige dele af EKG og BP-senderenheden.
- Dataindsamling.
- Træffe foranstaltninger for at undgå akustisk og elektronisk støj under dataoptagelse. Desuden skal personalets adgang under dataregistreringen begrænses, og alle opdrætsprocedurer skal afsluttes forud for forsøget.
- Placer dyrets bur på telemetrimodtagerpladen, og tænd den telemetriske sender ved at bringe en magnet tæt på dyret.
- Få kontinuerlige EKG-, blodtryks- og aktivitetsregistreringer over 72 timer (12-timers mørk/lys cyklus) med dataindsamlingssoftware (figur 4).
- Analyse af døgnrytmen af puls, blodtryk og aktivitet.
- Kontroller tilstedeværelsen af en regelmæssig døgnrytme af HR, BP og aktivitet ved hjælp af dataindsamlingssoftware12 (figur 5).
- Dataanalyse, herunder bestemmelse af baroreceptorfølsomhed ved hjælp af sekvensmetoden med EKG- og BP-analysesoftware.
- Eksportér BP- og HR-data fra dataindsamlingssoftware til EKG- og BP-analysesoftware (supplerende fil 2). Brug følgende rækkefølge af kommandoer: Åbn EKG- og BP-analysesoftware > Fil > Rådata fra konverter > Konverter ikke-IOX rådata. I det nye vindue skal du klikke på Filer > Indlæs Dataquest ART4-data. Igen åbnes et nyt vindue, vælg datafil til eksport > Nyt vindue åbnes, vælg dyr fra listen "emner" og vælg EKG og BP fra "bølgeformliste" og tryk på OK. Vælg dyr, hvorfra data skal konverteres ved at klikke på Konverter data > Opret IOX binær webstedsfil.
- Åbn IOX binær webstedsfil i EKG- og BP-analysesoftware ved hjælp af følgende kommandorækkefølge: Fil > Indlæs IOX-data > Vælg BP- og EKG-sporing, > tryk på det grønne flueben.
BEMÆRK: Følgende databehandlingsparametre er optimeret til data indsamlet fra vildtypemus og bør i princippet passe til alle musemodeller, der anvendes inden for præklinisk felt. Det kan dog være nødvendigt at tilpasse disse parametre, når der arbejdes med specifikke eksperimentelle modeller, f.eks. mus med ekstremt høje eller lave HR- og/eller BP-værdier eller forskellige gnaverarter. Under alle omstændigheder skal databehandlingsparametre gennemgås nøje for at sikre, at de passer til den specifikke model, der undersøges. - For indstillinger for EKG-, BP- og BRS-analyse se supplerende fil 3.4. For BRS-analyse i mus skal BRS-parametrene justeres til kun at detektere sekvenser af tre (eller flere) slag, der udviser en forsinkelse mellem SBP og RR på et slag, og indstil tærsklen for SBP- og RR-ændring til 0,5 mmHg og 2 ms. Sørg for, at korrelationskoefficienten for hældningen af regressionslinjen fra RR / SBP-plots er større end 0,75, og analyser kun sektioner, der udviser stabil sinusrytme. Indstil parametre for EKG-, BP- og BRS-analyse i overensstemmelse hermed ved hjælp af følgende kommandorækkefølge: Indstil > analyseindstillinger > nyt vindue åbnes
- EKG-indstillinger (højreklik i vinduet "EKG-tilstand og signalfiltrering" (supplerende fil 3)). Indstil parametrene som beskrevet her. Tilstand: EKG, kun RR, Filtertilstand: auto, i henhold til indstillet HR, Forventet puls: bpm > 300, Baseline fjernelse filterbredde (ms): 100,00, Filterbredde til fjernelse af støj: 1,00 ms, Notch filter: 50,0 Hz, Spike fjernelse filter: fra, Drop-out detection mode: off, Max RR længder (ms): 900,00, RR fra justerede R peaks: off, RR_only indstillingstilstand: Xsmall: mus, R-spidsbredde (ms): 10,00, PR-bredde (ms): 20,00, RT-bredde (ms): 50,00, maks. interbeatartefakt (%): 50,00, R til andet amplitudeforhold: 3,00, R-toptegn: positiv og Beregn ekstra parameter: fra
- For blodtryksindstillingerne (BP, trykindstillinger) skal du højreklikke på vinduet "BP-analysator" (supplerende fil 4). Indstil parametrene som beskrevet her. Filterbredde for fjernelse af støj (ms): 10,00, Afledt filterbredde (ms): 6,00, Notch-filter: 50,0 Hz, Filter til fjernelse af spids: fra, Valideringstærskel (cal. enhed): 12,00, Afvisningstærskel (cal. enhed): 8,00, Derivat ved start af opslag (cal U/s): 10,00, Afvisningsgrænser: fra, Forsinkelse fra reference-ekg: brugerdefineret vindue, Min. forsinkelse fra ekg Rpeak (ms): 10,00, Maks. forsinkelse fra ekg Rpeak (ms): 250,00, Conduct_time_1 fra mærke: ikke beregnet, Conduct_time_2 fra mærke: ikke beregnet, BR (vejrtrækningshastighed): slukket, BRS (Baroreflex-følsomhed): tændt, Minimum fortløbende slagtal: 3, Latensslagtal: 1, Trykværdi: SBP, Mærke til beregning af pulsinterval: R, Mindste trykvariation (caIU): 0,50, Mindste intervalvariation (ms): 2,00, Mindste korrelation: 0,75
- Skærm aktivitetssignalet for en 3-timers sekvens med lav aktivitet. Udfør BRS-analysen i dette tidsvindue, da dyrenes høje aktivitet forstyrrer BP- og RR-korrelationen.
- Udfør en BP- og RR-analyse i løbet af dette 3-timers tidsvindue, mens du underinddeler 3-timers analysen i trin på 10 minutter.
- Udfør BRS-analyse ved hjælp af følgende kommandorækkefølge: Åbn BRS-analysevinduet > Vis > BRS-analyse. Dette åbner BRS-analysepanelet. Undersøg manuelt hver sekvens, der vises i BRS-analysepanelet, og ekskluder ektopiske beats, sinuspauser, arytmiske hændelser eller støjende data. Sørg for at ugyldiggøre hvert eneste slag i sådanne sekvenser for at udelukke dem fra analysen.
- Eksporter resultaterne af BRS-analysen til en regnearksfil (resultatfil). Rediger de parametre, der eksporteres til regnearksfilen, ved hjælp af følgende kommandorækkefølge (supplerende filer 5-7):
- Indstil > parametre på listen / til fil > sektioner > txt (supplerende fil 5). Vælg sektionen "beats" og enhver anden sektion, der indeholder oplysninger af interesse, undtagen den ugyldige beats-sektion.
- Indstil > parametre på listen / til fil > trin > txt (supplerende fil 6). Vælg trinværdier, der skal eksporteres.
- Indstil > parametre på listen / til fil > beats -> txt (supplerende fil 7).
- Sørg for, at beats-sektionen i filen mindst indeholder følgende data for hvert enkelt beat. ECG_RR, ECG_HR, BP_SBP, BP_BRS_deltaP, BP_BRS_# (= sekvensens fortløbende slagintervaller), BP_BRS_slope, BP_BRS_correl BP_BRS_shiftl (=RR for det efterfølgende slag)
- Klik derefter på filet > Gem resultatfil.
- Sorter de eksporterede data for op- og nedsekvenser ved hjælp af filterfunktionen i Excel (supplerende fil 8). Beregn antallet af sekvenser, gennemsnitlig BRS-hældning, standardafvigelse og standardfejl for BRS-hældning for op og ned sekvenser separat. Beregn også det samlede antal sekvenser pr. 1000 slag.
BEMÆRK: En regnearksskabelon (TemplateBRS) til automatiseret sortering og analyse af op- og nedsekvenser findes i tillægget (supplerende fil 8) og letter analysen. Ved at justere filterfunktionen kan du sortere sekvenser efter forskellige takttal (f.eks. tre- eller firetaktssekvenser). For yderligere oplysninger henvises til supplerende filer 9-13.- Åbn resultatfilen og Excel-filen TemplateBRS (supplerende fil 8). Kopiér dataene fra følgende kolonner fra resultatfilen: (Tryk)_BRS_deltaP, (Tryk)_BRS_# og (Tryk)_BRS_slope (Supplerende fil 9). Indsæt dataene i de respektive kolonner i regnearkene "Op sekvenser" og "Ned sekvenser" i TemplateBRS-filen (supplerende fil 10). Derudover skal du kopiere dataene i kolonnen (Tryk)_BRS_SBP fra resultatfilen (supplerende fil 11) og indsætte dem i regnearket "Alle sekvenser" i filen TemplateBRS (supplerende fil 12).
BEMÆRK: Tallet i kolonnen (Tryk)_BRS_# vises kun i det sidste slag i en sekvens og viser sekvenslængden. Op og ned sekvenser kan skelnes ved tegnet på (Tryk)_deltaP værdien. Negative værdier for det andet og tredje slag i en tre-taktssekvens angiver en nedsekvens. Positive værdier angiver henholdsvis en op-sekvens. - Filtrer de kopierede data med standardfilterindstillingerne. Klik på filterikonet i kolonnen (Tryk)_BRS_#, og tryk på "ok" (Supplerende fil 13). Anvend dette trin på regnearkene "Op sekvenser" og "Ned sekvenser".
BEMÆRK: Regnearket filtrerer for sekvenser med tre takter. Hvis der anmodes om andre sekvenslængder, skal indstillingen af denne kolonne ændres i rullemenuen. Beregninger for antal sekvenser, gennemsnitlig BRS-hældning, standardafvigelse og standardfejl i BRS-hældning vises i de grønne felter i regnearkene "Op-sekvenser" og "Nedsekvenser". Beregninger for det samlede antal sekvenser pr. 1000 slag vises i den grønne boks i regnearket "Alle sekvenser".
- Åbn resultatfilen og Excel-filen TemplateBRS (supplerende fil 8). Kopiér dataene fra følgende kolonner fra resultatfilen: (Tryk)_BRS_deltaP, (Tryk)_BRS_# og (Tryk)_BRS_slope (Supplerende fil 9). Indsæt dataene i de respektive kolonner i regnearkene "Op sekvenser" og "Ned sekvenser" i TemplateBRS-filen (supplerende fil 10). Derudover skal du kopiere dataene i kolonnen (Tryk)_BRS_SBP fra resultatfilen (supplerende fil 11) og indsætte dem i regnearket "Alle sekvenser" i filen TemplateBRS (supplerende fil 12).
Representative Results
Positive resultater for EKG- og BP-rådata
Ved hjælp af denne protokol kan EKG- og BP-data af høj kvalitet erhverves (figur 4 og supplerende fil 14), hvilket ikke kun giver mulighed for præcis BRS-analyse, men også for analyse af en bred vifte af EKG- eller BP-afledte parametre, f.eks. EKG-intervaller (figur 4B, øverste panel), blodtryksparametre (figur 4B, nederste panel), puls og blodtryksvariation, arytmi detektion osv12,13,14,15.
Figur 4: Telemetriske EKG - og BP-optagelser. (A) Repræsentativt EKG-spor af høj kvalitet (øverste panel) og tilsvarende rå BP-optagelser af høj kvalitet (nederste panel). (B) Forstørrelse af EKG-spor (øverste panel). P-bølge, QRS-kompleks, T-bølge og RR-interval er angivet. Forstørrelse af tilsvarende BP-data (nederste panel). Diastolisk BP (DBP) og systolisk BP (SBP) er angivet. Klik her for at se en større version af denne figur.
Positive resultater for døgnrytmen
En sund mus, der er kommet sig tilstrækkeligt efter operationen, viser en fysiologisk stigning i aktivitet, HR og BP i aktivitetsfasen (mørk) (figur 5). Mange forskellige faktorer kan forstyrre denne regelmæssige døgnrytme. Disse omfatter psykologisk stress, akustisk eller elektrisk støj og smerte. For eksempel vil en akut smertetilstand umiddelbart efter operationen resultere i en stigning i hjertefrekvensen med et samtidigt fald i aktiviteten. Derfor er døgnrytmen en vigtig indikator for dyrs sundhed og trivsel og bør rutinemæssigt kontrolleres før BRS-analyse.
Figur 5: Analyse af langsigtede telemetrimålinger for at bestemme døgnrytmevariationer. Døgnrytme af hjertefrekvens (A), aktivitet (B), systolisk blodtryk (C) og diastolisk blodtryk (D) i gennemsnit fra 9 vilde C57BL/6J-hanmus i løbet af 12 timers lyse og mørke cyklusser. Grå områder skildrer aktiviteten (mørke) fase og hvide områder skildrer dyrenes hvilefase (lys). Alle parametre er fysiologisk forhøjet under dyrets aktivitet (mørke) fase. Data er repræsenteret som middelværdi +/- SEM. Klik her for at se en større version af denne figur.
Positive resultater for BRS-analyse
Efter at have udført analysen som beskrevet i protokollens afsnit 2.8, registrerer softwaren henholdsvis op- og nedsekvenser. Den anvendte metode kaldes sekvensmetode, da ændringer i SBP- og RR-intervaller undersøges på beat-to-beat-basis under korte sekvenser på tre eller flere slag med en spontan stigning eller fald i SBP (figur 6). En kontinuerlig stigning i SBP over tre hjerteslag forårsager en refleksforøgelse i parasympatisk aktivitet og bremser følgelig HR, hvilket svarer til længere RR-intervaller. Ventetiden for refleks HR-tilpasningen er et slag. En sådan sekvens er vist i figur 6A og defineres som en op-sekvens. I modsætning hertil defineres et kontinuerligt fald i SBP over tre slag med parallel stigning i HR (fald i RR-interval) som en nedsekvens (figur 6B). For at evaluere korrelationen mellem RR og SBP plottes begge parametre mod hinanden, og hældningen (ms/mmHg) af den lineære regressionslinje beregnes for hver sekvens (figur 6A,B, nedre paneler). Efter sortering efter op- og nedsekvenser kan det gennemsnitlige antal sekvenser pr. 1000 slag (figur 6C) og den gennemsnitlige forstærkning af spontan BRS beregnes for henholdsvis op- og nedsekvenser (figur 6D, E). Forstærkningen af spontan BRS afspejles af hældningen af den lineære regressionslinje beregnet ud fra RR / SBP-relationen. Afvigelsen fra normale BRS-værdier kan have forskellige årsager. Disse omfatter ændringer i ANS-input eller ændringer i sinoatriale knudes responsivitet over for input fra det autonome nervesystem. I figur 6 er øget BRS i en musemodel for sygt sinussyndrom (SSS) med overdreven respons af sinoatriale knude til vagal inputvist 11.
Figur 6: Estimering af BRS ved hjælp af sekvensmetoden. (A) Repræsentativt BP-spor af en vildtype C57BL/6J-mus under en opsekvens på tre på hinanden følgende slag (øverste panel) forbundet med en parallel stigning i RR-intervallet (midterste panel), hvilket svarer til et fald i HR. RR-intervallerne blev plottet mod SBP (nederste panel). Hældningen af regressionslinjen (rød linje) for op-sekvensen afbildet i det øverste og midterste panel (WT, sorte cirkler) var 4,10 ms/mmHg. Et repræsentativt RR/SBP-forhold mellem musemodellen med syge sinussyndromer gav en øget hældning på 6,49 ms/mmHg, hvilket indikerer forhøjet BRS (SSS, grå cirkler). (B) Repræsentativ nedsekvens af en vildtypemus med et fald i SBP (øverste panel) og et efterfølgende fald i RR-intervallet (midterste panel), hvilket resulterer i en BRS-hældning på 4,51 ms/mmHg (nederste panel; WT, sorte cirkler). Et repræsentativt RR/SBP-forhold mellem musemodellen med sygt sinussyndrom (SSS, grå cirkler) med en hældning på 7,10 ms/mmHg. Retningen af de røde pilespidser angiver sekvensernes retning (op eller ned sekvens). (C) Samlet antal sekvenser pr. 1000 slag for WT- og SSS-mus. D) Gennemsnitlig hældning af RR/SBP-forholdet for UP-sekvenser for WT- og SSS-mus. E) Gennemsnitlig hældning af RR/SBP-forholdet for nedsekvenser for WT- og SSS-mus. Statistik i (C-E) blev udført fra resultater af seks mandlige WT-dyr og otte handyr af den syge sinussyndrom musemodel. Boxplots viser medianlinjen, perc 25/75 og min/max-værdien; Åbne symboler repræsenterer middelværdien. Klik her for at se en større version af denne figur.
Negativt resultat for rådatakvaliteten
Især i faser med højere aktivitet kan signalkvaliteten falde (figur 7 og supplerende filer 15,16). Dette kan skyldes midlertidig forskydning eller forkert placering af enten BP-kateteret eller EKG-ledningerne eller begge dele på grund af dyrets bevægelse. Skeletmuskelaktivitet kan også detekteres fra EKG-ledningerne og fremkalde støj (figur 7B, øverste panel). Med de softwareindstillinger, der er beskrevet ovenfor, registreres disse slag af lav kvalitet ikke og er derfor udelukket fra analyse. Ikke desto mindre er manuel inspektion af de analyserede rådata obligatorisk.
Figur 7: Eksempler på rå signaler af lav kvalitet. (A) EKG-signal (øverste panel) detekteres med god kvalitet, men BP-signalkvaliteten (nederste panel) er lav. (B) Kvaliteten af EKG (øverste panel) og BP (nederste panel) signal er ikke tilstrækkelig. Klik her for at se en større version af denne figur.
Negative resultater for BRS-analyse
BRS-analyseindstillingerne, der er anført i protokolafsnit 2.8.3, er generelt afgørende for hurtig og korrekt registrering af op- og nedsekvenser. Den mindste korrelationskoefficient for regressionslinjen er indstillet til 0,75. Indstilling af for lave værdier for minimumskorrelationskoefficienten resulterer i falske detektioner af sekvenser, der ikke afspejler baroreflexaktivitet, men snarere skyldes arytmiske slag (figur 8). Til BRS-analyse skal kun episoder med stabil sinusrytme analyseres. Ektopiske slag eller andre arytmiske hændelser, f.eks. sinuspauser, kan findes med HRV-muligheden for EKG- og BP-analysesoftware og skal ugyldiggøres.
Figur 8: Sekvenser, der ikke afspejler baroreflexaktivitet . (A) EKG-spor af en mus med mild sinusdysrytmi. (B) BP-optagelse, der viser en spontan stigning i SBP. (C) Tilsvarende RR-intervaller indikerer et fald i HR ved stigningen i BP. (D) Plot af SBP og tilsvarende RR-intervaller. Den lave korrelationskoefficient for regressionslinjen indikerer, at HR-reduktion ikke var forårsaget af baroreflexens aktivitet, men snarere af sinusdysrytmi. (E) Rå EKG-spor, der viser en sinuspause. (F) Tilsvarende rå BP-signal. Sinuspausen forårsager et fald i diastolisk blodtryk. Systolisk blodtryk i det efterfølgende slag er næsten upåvirket. Klik her for at se en større version af denne figur.
Supplerende fil 1: Kirurgi protokol. Skabelon til dokumentation af det kirurgiske indgreb og postoperativ pleje. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende fil 2: Konvertering af Dataquest A.R.T-data til IOX-data til analyse i ecgAUTO-software. Vælg dyr i emnelisten (venstre) og Tryk og EKG på bølgeformlisten (højre). Tryk på OK for at konvertere data. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende fil 3: EKG-indstillinger til BRS-analyse. Indstil parametre som angivet, tryk på ok, og anvend konfigurationen. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende fil 4: BP-indstillinger til BRS-analyse. Indstil parametre som angivet, tryk på ok, og anvend konfigurationen. Gem konfigurationen som en konfigurationsfil for nemt at kunne indlæse indstillingerne. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende fil 5: Parametre i liste/til-fil-vinduet for "sektioner". Vælg sektioner, der skal eksporteres, under sektionerne > txt-overskrift (valgt), og tryk på Anvend!. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende fil 6: Parametre i liste/til-fil-vinduet for "trin". Vælg trindata, der skal eksporteres, under trinnene > txt-header (valgt), og tryk på Anvend!. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende fil 7: Parametre i liste/til-fil-vinduet for "beats". Vælg værdier, der skal eksporteres, under overskriften beats > txt (valgt), og tryk på Anvend!. Til BRS-analyse er de krydsede parametre nødvendige. Bemærk rækkefølgen af valg angivet med tallene. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende fil 8: TemplateBRS-regnearksfil. Regnearksskabelon til automatiseret sortering og analyse af op- og nedsekvenser. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende fil 9: Kopiering af relevante data fra resultatfilen I. Kopiér kolonnerne (Tryk)_BRS_deltaP, (Tryk)_BRS_# og (Tryk)_BRS_slope fra resultatfilen. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende fil 10: Regnearksskabelonfil (TemplateBRS) til datasortering og analyse I. Indsæt de kopierede data i de respektive kolonner i regnearket "Op sekvenser" og "Ned sekvenser" i TemplateBRS-regnearkfilen. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende fil 11: Kopiering af relevante data fra resultatfil II. Kopiér kolonnen (Tryk)_BRS_SBP fra resultatfilen. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende fil 12: En regnearksskabelonfil (TemplateBRS) til datasortering og analyse II. Indsæt de kopierede SBP-data i regnearket "Alle sekvenser" i TemplateBRS-regnearksfilen for at beregne det samlede antal sekvenser. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende fil 13: Filtrering og analyse af sekvenserne. I regnearket "Op sekvenser" i TemplateBRS-regnearksfilen skal du åbne rullemenuen i kolonnefilteret (Tryk)_BRS_# og trykke på OK uden at ændre nogen parametre. Dette sorterer automatisk dataene og opdaterer beregningerne for sekvenser med 3 slag. Gentag dette for regnearket "Nedsekvenser". Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende fil 14: Skærmbillede af en optagelse i høj kvalitet, der er registreret med EKG- og BP-analysesoftware. Det øverste spor (EKG) viser detektion af hver R-top, og det nedre spor (BP) viser detektion af hvert diastolisk tryk (DP) og systolisk tryk (SP). Områder under succesfuldt registrerede toppe er markeret med rødt. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende fil 15: Skærmbillede af en BP-optagelse af lav kvalitet, hvor BP-parametre kun registreres delvist. Det øverste spor (EKG) viser detektion af hver R-top, men det nederste spor (BP) viser mellemrum mellem detekterede BP-toppe. Detekterede toppe af diastolisk tryk (DP) og systolisk tryk (SP) er markeret med røde områder. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende fil 16: Skærmbillede af en EKG- og BP-optagelse af lav kvalitet, hvor EKG- og BP-parametre ikke kunne registreres. Det øverste spor (EKG) viser et område (lilla baggrund), hvor EKG-parametre ikke kunne detekteres. BP-detektion (lavere sporing) mislykkedes også på grund af lav signalkvalitet. Klik her for at downloade denne fil.
Discussion
Metodens betydning i forhold til alternative metoder
I dette arbejde præsenterer vi en detaljeret protokol til kvantificering af spontan BRS ved hjælp af sekvensmetoden. Denne tilgang anvender spontane BP- og refleks-HR-ændringer målt ved EKG og BP-telemetri. Fordelen ved denne metode er, at begge parametre kan registreres i bevidste, frit bevægelige, uhæmmede dyr uden at forstyrre dyr ved at gå ind i det rum, hvor målingerne udføres eller endda ved fysisk interaktion, der kræves til injektion af lægemidler. Dette punkt er meget vigtigt, da det klart er blevet påvist, at sådanne forstyrrelser alvorligt forstyrrer HR- og BP-optagelser. For eksempel kræver injektion af lægemidler fiksering af musene, hvilket medfører et maksimalt stressrespons, der øger HR op til 650-700 bpm. For at omgå disse stressresponser er BRS tidligere blevet bestemt i bedøvede mus. Imidlertid inducerer standardanæstetika, der anvendes i veterinærmedicin, såsom ketamin/xylazin eller isofluran, bradykardi og påvirker autonome refleksresponser, hvilket begrænser gyldigheden af disse tilgange og fortolkningen af resultaterne. For delvist at overvinde disse begrænsninger blev implanterbare lægemiddelafgivelsesanordninger, dvs. osmotiske pumper, som kan frigive lægemidler i bughulen, brugt. Med osmotiske pumper er det imidlertid ikke muligt at anvende en bolus af en defineret dosis lægemiddel, der begrænser anvendelsen af sådanne anordninger. Alternativt komplekse infusionskatetre17 kan implanteres i mus for at administrere lægemidler. Disse katetre er imidlertid vanskelige at håndtere og kræver kirurgiske færdigheder, der kan sammenlignes med dem, der kræves til implantation af telemetriske enheder, samtidig med at de giver mindre videnskabeligt resultat sammenlignet med målinger af spontan BRS. Ud over de tekniske problemer forbundet med måling af BRS ved hjælp af injektion af lægemidler er der nogle begrænsninger relateret til lægemiddelvirkningen i sig selv. Traditionelle tilgange til bestemmelse af BRS omfatter bolusinjektioner af vasoaktive lægemidler. Imidlertid er bolusinjektion af vasokonstriktorer (f.eks. phenylephrin) eller vasodilatorer (f.eks. natriumnitroprussid) blevet betragtet som en overdreven og ikke-fysiologisk stimulus til refleks HR-tilpasning til ændringer i BP18. Spontan aktivitet af baroreceptorrefleksen kan også kvantificeres ved hjælp af spektrale metoder. En af disse metoder vurderer BRS i frekvensdomænet ved beregning af forholdet mellem ændringer i HR og ændringer i blodtryk i et specifikt frekvensbånd18,19. Andre spektrale metoder involverer bestemmelse af BP's og HR's overførselsfunktion eller kvantificering af sammenhængen mellem BP og HR20,21. Disse metoder kræver også telemetrisk erhvervelse af spontane BP- og HR-parametre, og selvom de er egnede til bestemmelse af spontan BRS, kræver de intensive beregningsværktøjer og er udfordrende at anvende. Desuden lider alle spektrale metoder under den begrænsning, at ikke-stationære signaler udelukker anvendelsen af spektrale metoder. Især spektraltoppe induceret af respirationsrytmer kan reduceres hos menneskelige patienter ved at bede patienten om at stoppe med at trække vejret, mens dette naturligvis ikke er muligt hos mus. Derfor er signal-støj-forholdet ofte ret lavt hos mus. I betragtning af begrænsningerne i de ovenfor beskrevne metoder favoriserer vi sekvensmetoden til bestemmelse af BRS hos mus. En betydelig fordel ved denne metode er, at det er en ikke-invasiv teknik, der giver data om spontan BRS under virkelige forhold22. Et yderligere vigtigt punkt er, at varigheden af sekvenser analyseret ved hjælp af sekvensmetoden er ret kort, der involverer 3-5 slag. Refleksregulering af HR ved vagusnerven er meget hurtig og godt inden for tidsrammen for disse sekvenser. Derfor er sekvensmetoden velegnet til at evaluere vagusnervens bidrag til BRS. I modsætning hertil er reguleringen af det sympatiske nervesystem meget langsommere. Faktisk kan aktiviteten i det sympatiske nervesystem under disse korte sekvenser antages at være næsten konstant. Derfor er metoden tilpasset til selektivt at detektere refleksændringer i HR drevet af vagusnerveaktivitet.
Fortolkning af BRS-data
Til fortolkning af BRS-dysfunktion eller BRS-data i sig selv er det vigtigt at overveje de individuelle funktionelle niveauer, der er involveret i baroreceptorrefleksen. På neuronalt niveau kan afferente, centrale eller efferente komponenter i refleksen blive påvirket23. På det kardiovaskulære niveau kan nedsat eller overdreven respons af sinoatriale knude til ANS-input være til stede11,24. En ændring på hvert niveau kan føre til ændringer i BRS. For at dissekere, om neuronale og / eller hjertemekanismer er ansvarlige for observerede ændringer i BRS, hjerte- eller neuronspecifik gensletning, knock down eller genredigeringsmetoder kunne anvendes.
Kritiske trin i protokollen
Det mest sofistikerede og kritiske trin i denne protokol er forberedelsen og kanyleringen af venstre halspulsåre (trin 2.3). Spændingen af den kaudale okklusionssutur skal være tilstrækkelig høj til helt at stoppe blodgennemstrømningen før kanylering. Ellers kan selv en lille lækage af blod under kanylering alvorligt begrænse synligheden eller endda få musen til at bløde ihjel. Kanylering skal lykkes ved første forsøg. Men ved manglende første forsøg er det stadig muligt at omhyggeligt prøve kanylering igen.
Midterlinjesnittet og den subkutane tunnel fra halsen til venstre flanke (trin 2.3) skal være stor nok til let at indføre senderen uden kraft, men skal også være så lille som muligt for at holde senderen på plads. Ellers bliver man nødt til at låse den på plads med suturmateriale eller vævslim. Da mus har en meget delikat hud, kan nekrose af huden forekomme, hvis tunnelen til senderen er for lille.
Hvis EKG-elektroderne er for lange til at passe ind i den subkutane tunnel (trin 2.4), er det nødvendigt at danne en ny spids ved at forkorte elektroden til en passende længde. Elektroden skal ligge fladt mod kroppen over hele blyets længde. For lange elektroder vil forstyrre dyrene, og de vil forsøge at åbne såret for at fjerne senderen, hvilket resulterer i risiko for vævsirritation og sårdehiscens. Ledninger, der er for korte, kan naturligvis ikke forlænges, og det kan være, at elektroderne i dette tilfælde ikke kan placeres på en sådan måde, at de svarer til Einthoven II-konfiguration. Vi anbefaler derfor at bestemme den optimale længde af EKG-ledningerne på en død mus af samme køn, vægt og genetiske baggrund.
Mus bør have en længere restitutionstid efter implantation af senderen, hvis de ikke har en normal døgnrytme, og dette ikke er fænotypen for den undersøgte muselinje (trin 2.7). En anden årsag til forstyrret døgnrytme kan være utilstrækkelig akustisk isolering af dyreanlægget eller personale, der kommer ind i rummet under målingen.
EKG-, BP- og BRS-dataanalyse er ligetil (trin 2.8). Det mest kritiske trin er at udelukke ektopiske beats, sinuspauser, arytmiske episoder eller sektioner med signaler af lav kvalitet fra dataanalyse.
Disclosures
Ingen
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af den tyske forskningsfond [FE 1929/1-1 og WA 2597/3-1]. Vi takker Sandra Dirschl for fremragende teknisk assistance og Julia Rilling for veterinærrådgivning.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acepromazine maleate (Tranquisol KH) Solution Injectable 0.5 mg/mL | CP-Pharma, Germany | 1229 | anesthesia |
| B.Braun Injekt-F 1 mL syringe | Wolfram Droh GmbH, Germany | 9166017V | |
| Bepanthen eye and nose ointment | Bayer AG, Germany | ||
| Blunt dissecting scissors | Fine Science Tools GmbH, Germany | 14078-10 | |
| Carprofen (Carprosol) 50 mg/mL | CP-Pharma, Germany | 115 | preemptive and post-operative pain relief |
| Cutasept F skin desinfectant | BODE Chemie GmbH, Germany | 9803650 | |
| Cotton Tipped Applicator sterile | Paul Boettger GmbH & Co. KG, Germany | 09-119-9100 | |
| Forceps - Micro-Blunted Tips | Fine Science Tools GmbH, Germany | 11253-25 | |
| Forceps - straight | Fine Science Tools GmbH, Germany | 11008-13 | |
| Gauze swabs with cut edges, 7.5x7.5 cm, cotton | Paul Hartmann AG. Germany | 401723 | |
| HD?X11, Combined telemetric ECG and BP transmitters | Data Sciences International, United States | ||
| Homothermic blanket system with flexible probe | Harvard Apparatus, United States | ||
| Hot bead sterilizer | Fine Science Tools GmbH, Germany | 18000-45 | |
| Ketamine 10% | Ecuphar GmbH, Germany | 799-760 | anesthesia |
| Magnet | Data Sciences International, United States | transmitter turn on/off | |
| Needle holder, Olsen-Hegar with suture cutter | Fine Science Tools GmbH, Germany | 12502-12 | |
| Needle single use No. 17, 0.55 x 25 mm | Henke-Sass Wolf GmbH, Germany | 4710005525 | 24 G needle |
| Needle single use No. 20, 0.40 x 20 mm | Henke-Sass Wolf GmbH, Germany | 4710004020 | 27 G needle |
| Needle-suture combination, sterile, absorbable (6-0 USP, metric 0.7, braided) | Resorba Medical, Germany | PA10273 | lead fixation |
| Needle-suture combination, sterile, silk (5-0 USP, metric 1.5, braided) | Resorba Medical, Germany | 4023 | skin closure |
| OPMI 1FR pro, Dissecting microscope | Zeiss, Germany | ||
| Pilca depilatory mousse | Werner Schmidt Pharma GmbH, Germany | 6943151 | |
| PVP-Iodine hydrogel 10% | Ratiopharm, Germany | ||
| Ringer's lactate solution | B. Braun Melsungen AG, Germany | 401-951 | |
| Sensitive plasters, Leukosilk | BSN medical GmbH, Germany | 102100 | surgical tape |
| Sodium chloride solution 0.9% sterile Miniplasco Connect 5 ml | B. Braun Melsungen AG, Germany | ||
| Surgibond tissue adhesive | SMI, Belgium | ZG2 | |
| Suture, sterile, silk, non-needled (5-0 USP, metric 1 braided) | Resorba Medical, Germany | G2105 | lead preparation, ligation sutures |
| Trimmer, Wella Contura type 3HSG1 | Procter & Gamble | ||
| Vessel Cannulation Forceps | Fine Science Tools GmbH, Germany | 18403-11 | |
| Xylazine (Xylariem) 2% | Ecuphar GmbH, Germany | 797469 | anesthesia |
| Data acquisition and analysis | Source | ||
| DSI Data Exchange Matrix | Data Sciences International, United States | ||
| DSI Dataquest ART 4.33 | Data Sciences International, United States | data aquisition software | |
| DSI Ponemah | Data Sciences International, United States | data aquisition software | |
| DSI PhysioTel HDX-11 for mice | Data Sciences International, United States | ||
| DSI PhysioTel receivers RPC1 | Data Sciences International, United States | ||
| ecgAUTO v3.3.5.11 | EMKA Technologies | ECG and BP analysis software | |
| Microsoft Excel | Microsoft Corporation, United States |
References
- Landgren, S. On the excitation mechanism of the carotid baroceptors. Acta Physiologica Scandinavica. 26 (1), 1-34 (1952).
- Heyman, C., Neil, E.
- Lu, Y., et al. The ion channel ASIC2 is required for baroreceptor and autonomic control of the circulation. Neuron. 64 (6), 885-897 (2009).
- Fadel, P. J., Raven, P. B. Human investigations into the arterial and cardiopulmonary baroreflexes during exercise. Experimental Physiology. 97 (1), 39-50 (2012).
- Nagura, S., Sakagami, T., Kakiichi, A., Yoshimoto, M., Miki, K. Acute shifts in baroreflex control of renal sympathetic nerve activity induced by REM sleep and grooming in rats. The Journal of Physiology. 558, Pt 3 975-983 (2004).
- Crandall, C. G., Cui, J., Wilson, T. E. Effects of heat stress on baroreflex function in humans. Acta Physiologica Scandinavica. 177 (3), 321-328 (2003).
- Crandall, M. E., Heesch, C. M. Baroreflex control of sympathetic outflow in pregnant rats: effects of captopril. The American Journal of Physiology. 258 (6), Pt 2 1417-1423 (1990).
- Mortara, A., et al. Arterial baroreflex modulation of heart rate in chronic heart failure: clinical and hemodynamic correlates and prognostic implications. Circulation. 96 (10), 3450-3458 (1997).
- La Rovere, M. T., Bigger, J. T., Marcus, F. I., Mortara, A., Schwartz, P. J. Baroreflex sensitivity and heart-rate variability in prediction of total cardiac mortality after myocardial infarction. ATRAMI (Autonomic Tone and Reflexes After Myocardial Infarction) Investigators. Lancet. 351 (9101), 478-484 (1998).
- Robinson, T. G., Dawson, S. L., Eames, P. J., Panerai, R. B., Potter, J. F. Cardiac baroreceptor sensitivity predicts long-term outcome after acute ischemic stroke. Stroke. 34 (3), 705-712 (2003).
- Fenske, S., et al. cAMP-dependent regulation of HCN4 controls the tonic entrainment process in sinoatrial node pacemaker cells. Nature Communications. 11 (1), 5555 (2020).
- Fenske, S., et al. Comprehensive multilevel in vivo and in vitro analysis of heart rate fluctuations in mice by ECG telemetry and electrophysiology. Nature Protocols. 11 (1), 61-86 (2016).
- Thireau, J., Zhang, B. L., Poisson, D., Babuty, D. Heart rate variability in mice: a theoretical and practical guide. Experimental Physiology. 93 (1), 83-94 (2008).
- Cesarovic, N., Jirkof, P., Rettich, A., Arras, M. Implantation of radiotelemetry transmitters yielding data on ECG, heart rate, core body temperature and activity in free-moving laboratory Mice. Journal of Visualized Experiments. (57), e3260 (2011).
- Alam, M. A., Parks, C., Mancarella, S. long-term blood pressure measurement in freely moving mice using telemetry. Journal of Visualized Experiments. (111), e53991 (2016).
- Brox, V. Optical and electrophysiological approaches to examine the role of cAMP-dependent regulation of the sinoatrial pacemaker channel HCN4. Dissertation, LMU Munich. , Available from: https://edoc.ub.uni-muenchen.de/24431/1/Brox_Verena.pdf (2019).
- Just, A., Faulhaber, J., Ehmke, H. Autonomic cardiovascular control in conscious mice. American Journal of Physiology-Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 279 (6), 2214-2221 (2000).
- Parati, G., Di Rienzo, M., Mancia, G. How to measure baroreflex sensitivity: from the cardiovascular laboratory to daily life. Journal of Hypertension. 18 (1), 7-19 (2000).
- Robbe, H. W., et al. Assessment of baroreceptor reflex sensitivity by means of spectral analysis. Hypertension. 10 (5), 538-543 (1987).
- Pinna, G. D., Maestri, R., Raczak, G., La Rovere, M. T. Measuring baroreflex sensitivity from the gain function between arterial pressure and heart period. Clinical Science. 103 (1), 81-88 (2002).
- Pinna, G. D., Maestri, R. New criteria for estimating baroreflex sensitivity using the transfer function method. Medical and Biological Engineering and Computing. 40 (1), 79-84 (2002).
- Laude, D., Baudrie, V., Elghozi, J. L. Applicability of recent methods used to estimate spontaneous baroreflex sensitivity to resting mice. American Journal of Physiology-Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 294 (1), 142-150 (2008).
- Ma, X., Abboud, F. M., Chapleau, M. W. Analysis of afferent, central, and efferent components of the baroreceptor reflex in mice. American Journal of Physiology-Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 283 (5), 1033-1040 (2002).
- Fleming, S., et al. Impaired Baroreflex Function in Mice Overexpressing Alpha-Synuclein. Frontiers in Neurology. 4 (103), (2013).
