Dispositivi elettrici e a campo magnetico per la stimolazione dei tessuti biologici

Summary

Questo protocollo descrive il processo passo-passo per costruire stimolatori elettrici e magnetici utilizzati per stimolare i tessuti biologici. Il protocollo include una linea guida per simulare computazalmente campi elettrici e magnetici e la produzione di dispositivi di stimolazione.

Abstract

I campi elettrici (EFs) e i campi magnetici (IF) sono stati ampiamente utilizzati dall’ingegneria tissutale per migliorare la dinamica cellulare come la proliferazione, la migrazione, la differenziazione, la morfologia e la sintesi molecolare. Tuttavia, variabili come la forza degli stimoli e i tempi di stimolazione devono essere considerati quando si stimolano cellule, tessuti o impalcature. Dato che EFs e IF variano a seconda della risposta cellulare, non è chiaro come costruire dispositivi che generino adeguati stimoli biofisici per stimolare campioni biologici. In effetti, mancano prove relative al calcolo e alla distribuzione quando vengono applicati stimoli biofisici. Questo protocollo è focalizzato sulla progettazione e produzione di dispositivi per generare EFs e IF e sull’implementazione di una metodologia computazionale per prevedere la distribuzione di stimoli biofisici all’interno e all’esterno dei campioni biologici. Il dispositivo EF era composto da due elettrodi paralleli in acciaio inossidabile situati nella parte superiore e inferiore delle colture biologiche. Gli elettrodi erano collegati ad un oscillatore per generare tensioni (50, 100, 150 e 200 Vp-p) a 60 kHz. Il dispositivo MF era composto da una bobina, che era eccitata con un trasformatore per generare una corrente (1 A) e una tensione (6 V) a 60 Hz. Fu costruito un supporto di metacrilato polimetile per localizzare le colture biologiche al centro della bobina. La simulazione computazionale ha chiarito la distribuzione omogenea di EF e IF all’interno e all’esterno dei tessuti biologici. Questo modello computazionale è uno strumento promettente in grado di modificare parametri come tensioni, frequenze, morfologie tissutali, tipi di piastre di pozzo, elettrodi e dimensioni della bobina per stimare gli EF e gli IF per ottenere una risposta cellulare.

Introduction

EFs e IF hanno dimostrato di modificare la dinamica cellulare, stimolando la proliferazione e aumentando la sintesi delle principali molecole associate alla matrice extracellulare dei tessuti¹. Questi stimoli biofisici possono essere applicati in diversi modi utilizzando impostazioni e dispositivi specifici. Per quanto riguarda i dispositivi per generare EF, gli stimolatori di accoppiamento diretto utilizzano elettrodi che sono a contatto con campioni biologici in vitro o impiantati direttamente nei tessuti di pazienti e animali in vivo^2; tuttavia, vi sono ancora limitazioni e carenze che includono l’insufficiente biocompatibilità da parte degli elettrodi a contatto, cambiamenti nei livelli di pH e ossigeno molecolare¹. Al contrario, i dispositivi di accoppiamento indiretto generano EF tra due elettrodi, che sono collocati in parallelo ai^{campioni biologici 3}, consentendo una tecnica alternativa non invasiva per stimolare campioni biologici ed evitare il contatto diretto tra tessuti ed elettrodi. Questo tipo di dispositivo può essere estrapolato a future applicazioni cliniche per eseguire procedure con un’invasione minima al paziente. In relazione ai dispositivi che generano MFs, gli stimolatori di accoppiamento induttivi creano una corrente elettrica variabile nel tempo, che scorre attraverso una bobina che si trova intorno alle^{colture cellulari 4,5}. Infine, esistono dispositivi combinati, che utilizzano EFs e IF statici per generare campi elettromagnetici transitori¹. Dato che ci sono diverse configurazioni per stimolare campioni biologici, è necessario considerare variabili come tensione e frequenza quando vengono applicati stimoli biofisici. La tensione è una variabile importante, poiché influenza il comportamento dei tessuti biologici; ad esempio, è stato dimostrato che la migrazione cellulare, l’orientamento e l’espressione genica dipendono dall’ampiezza della tensione^{applicata 3,6,7,8,9,10}. La frequenza gioca un ruolo importante nella stimolazione biofisica, poiché è stato dimostrato che queste si verificano naturalmente in vivo. È stato dimostrato che le alte e basse frequenze hanno effetti benefici sulle cellule; in particolare, nei canali di calcio gated di tensione della membrana cellulare o reticolo endoplasmatico, che innescano diverse vie di segnalazione a^{livello intracellulare 1,7,11}.

Secondo quanto sopra, un dispositivo per la generazione di EF è costituito da un generatore di tensione collegato a due condensatori paralleli¹². Questo dispositivo è stato implementato da Armstrong et al. Un adattamento di questo dispositivo è stato eseguito da Brighton et al. I fori venivano riempiti da vetri di copertura, dove gli occhiali inferiori venivano utilizzati per coltura di tessuti biologici. Gli elettrodi sono stati posizionati su ogni vetrino di copertura per generare^{EFs 14}. Questo dispositivo è stato utilizzato per stimolare elettricamente condrociti, osteoblasti ed espianto cartilagine, mostrando un aumento della proliferazione^{cellulare 14,15,16} e sintesi^{molecolare 3,17}. Il dispositivo progettato da Hartig et al. Gli elettrodi erano realizzati in acciaio inossidabile di alta qualità situato in una custodia isolante. Il dispositivo è stato utilizzato per stimolare gli osteoblasti, mostrando un significativo aumento della proliferazione e della secrezione^{proteica 18}. Il dispositivo utilizzato da Kim et al. Una piastra di coltura è stata progettata per coltura di cellule su una superficie conduttiva con stimolazione elettrica. Gli elettrodi erano rivestiti in oro su piastre di^{silicio 19}. Questo dispositivo è stato utilizzato per stimolare gli osteoblasti, mostrando un aumento della proliferazione e della sintesi del fattore di crescita endoteliale vascolare¹⁹e stimolando la produzione di attività fosfatasi alcalina, deposizione di calcio e proteine morfogeniche ossee²⁰. Allo stesso modo, questo dispositivo è stato utilizzato per stimolare il tasso proliferativo e l’espressione del fattore di crescita endoteliale vascolare delle cellule staminali mesenchimali del midollo osseo^{umano 21}. Il dispositivo progettato da Nakasuji et al. Gli elettrodi sono stati costruiti per misurare il potenziale elettrico in 24 punti diversi. Questo dispositivo è stato utilizzato per stimolare i condrociti, dimostrando che le EF non alterano la morfologia cellulare e aumentano la proliferazione e la sintesi molecolare²². Il dispositivo utilizzato da Au et al. Questo stimolatore è stato utilizzato per stimolare cardiomiociti e fibroblasti, migliorando l’allungamento cellulare e l’allineamento dei^{fibroblasti 23}.

Diversi dispositivi MF sono stati fabbricati sulla base di bobine Helmholtz per stimolare diversi tipi di campioni biologici. Ad esempio, le bobine di Helmholtz sono state utilizzate per stimolare la proliferazione e la sintesi molecolare dei condrociti^24,25, migliorare la sintesi proteoglicana degli espianto cartilaginei articolari^26,migliorare l’upregolazione genica correlata alla formazione ossea delle cellule osteoblase²⁷e aumentare la proliferazione e l’espressione molecolare delle cellule endoteliali²⁸. Le bobine Helmholtz generano MF attraverso due bobine situate una di fronte all’altra. Le bobine devono essere posizionate con una distanza pari al raggio delle bobine per garantire un MF omogeneo. Lo svantaggio dell’uso delle bobine Helmholtz risiede nelle dimensioni della bobina, perché devono essere abbastanza grandi da generare l’intensità MF richiesta. Inoltre, la distanza tra le bobine deve essere sufficiente a garantire una distribuzione omogenea delle IF attorno ai tessuti biologici. Per evitare problemi causati dalle bobine Helmholtz, diversi studi sono stati focalizzati sulla produzione di bobine solenoidi. Le bobine solenoidi sono basate su un tubo, che viene avvolto con filo di rame per generare MFs. Gli ingressi del filo di rame possono essere collegati direttamente alla presa o a un alimentatore per energizzare la bobina e creare MFs al centro del solenoide. Più giri ha la bobina, maggiore è l’MF generato. La magnitudine MF dipende anche dalla tensione e dalla corrente applicate per energizzare la bobina²⁹. Bobine solenoidi sono state utilizzate per stimolare magneticamente diversi tipi di cellule come HeLa, HEK293 e MCF7³⁰ o cellule staminali mesenchimali³¹.

I dispositivi utilizzati da autori diversi non hanno considerato né la dimensione adeguata degli elettrodi né la lunghezza corretta della bobina per distribuire in modo omogeneo sia i FE che i IF. Inoltre, i dispositivi generano tensioni e frequenze fisse, limitandone l’uso per stimolare specifici tessuti biologici. Per questo motivo, in questo protocollo viene eseguita una linea guida di simulazione computazionale per simulare sia sistemi capacitivi che bobine per garantire una distribuzione omogenea di EFs e MF su campioni biologici, evitando l’effetto bordo. Inoltre, viene dimostrato che la progettazione di circuiti elettronici genera tensioni e frequenza tra gli elettrodi e la bobina, creando EFs e IF che supereranno i limiti causati dall’impedenza delle piastre e dell’aria della coltura cellulare. Queste modifiche consentiranno la creazione di bioreattori non invasivi e adattivi per stimolare qualsiasi tessuto biologico.

Protocol

1. Simulazione di FEI e IF NOTA: la simulazione di EFs e IF è stata eseguita in multifisica COMSOL. Selezionare una configurazione 2D assimmetrica per rappresentare entrambi i domini elettrico e magnetico. Nella configurazione fisica, selezionate l’interfaccia Corrente elettrica per calcolare ef in elettrodi paralleli o l’interfaccia campo magnetico per calcolare le MF attorno alle bobine. Nella configurazione di studio, selezion…

Representative Results

Simulazione computazionaleLe distribuzioni di FE e MF sono riportate nella figura 3. Da un lato, è stato possibile osservare la distribuzione omogenea dei FE nel sistema capacitivo(figura 3A). L’EF è stato tracciato per osservare in dettaglio l’entità del campo all’interno del campione biologico (figura 3B). Questa simulazione è stata utile per parametrizzare le dimensioni degli elettrodi e produrli per evit…

Discussion

I trattamenti utilizzati per guarire diverse patologie che colpiscono i tessuti umani sono terapie farmacologiche^{32 o} interventi chirurgici³³, che cercano di alleviare il dolore localmente o sostituire i tessuti colpiti con espianto o trapianti. Recentemente, la terapia cellulare autologa è stata proposta come terapia alternativa per il trattamento dei tessuti feriti, in cui le cellule sono isolate dal paziente e ampliate, attraverso tecniche in vitro, da impiantare nel si…

Materials

Electrical stimulator
Operational amplifier	Motorola	LF-353N	—- Quantity: 1
Resistors	—-	—-	22 kΩ Quantity: 1
Resistors	—-	—-	10 kΩ Quantity: 3
Resistors	—-	—-	2.6 kΩ Quantity: 2
Resistors	—-	—-	2.2 kΩ Quantity: 1
Resistors	—-	—-	1 kΩ Quantity: 1
Resistors	—-	—-	220 Ω Quantity: 2
Resistors	—-	—-	22 Ω Quantity: 5
Resistors	—-	—-	10 Ω Quantity: 1
Resistors	—-	—-	6.8 Ω Quantity: 1
Resistors	—-	—-	3.3 Ω Quantity: 2
Polyester capacitors	—-	—-	1 nF Quantity: 2
Polyester capacitors	—-	—-	100 nF Quantity: 1
VHF Band Amplifier Transistor JFET	Toshiba	2SK161	—- Quantity: 1
Power transistor BJT NPN	Mospec	TIP 31C	—- Quantity: 1
Zener diode	Microsemi	1N4148	—- Quantity: 1
Switch	Toogle Switch	SPDT – T13	—- Quantity: 3
Toroidal ferrite core	Caracol	—-	T*22*14*8 Quantity: 1
Cooper wire	Greenshine	—-	AWG – 24 Quantity: 1
Relimate header with female housing	ADAFRUIT	—-	8 pin connectors Quantity: 1
Relimate header with female housing	ADAFRUIT	—-	2 pin connectors Quantity: 1
Female plug terminal connector	JIALUN	—-	4mm Lantern Plugs (Plug + Socket) 15 A Quantity: 1
Aluminum Heat Sink	AWIND	—-	For TIP 31C transistor Quantity: 1
Led	CHANZON	—-	5 mm red Quantity: 1
Integrated circuit socket connector	Te Electronics Co., Ltd.	—-	Double row 8-pin DIP Quantity: 1
3 pin connectors set	STAR	—-	JST PH 2.0 Quantity: 3
2 pin screw connectors	STAR	—-	For PCB Quantity: 1
3 pin screw connectors	STAR	—-	For PCB Quantity: 1
Banana connector test lead	JIALUN	—-	P1041 – 4 mm – 15 A Quantity: 7
Bullet connectors to banana plug charge lead	JIALUN	—-	4 mm male-male/female-female adapters – 15 A Quantity: 1
Case	—-	—-	ABS Quantity: 1
Electrodes	—-	—-	Stainless – steel Quantity: 2
Electrode support	—-	—-	Teflon Quantity: 2
Printed circuit board			Quantity: 1
Magnetic stimulator
Cooper wire	Greenshine	—-	AWG – 18 Quantity: 1
AC power plugs	—-	—-	120 V AC – 60 Hz Quantity: 1
Banana female connector test lead	JIALUN	—-	1Set Dual Injection – 4 mm – 15 A Quantity: 2
Banana male connector test lead	JIALUN	—-	1Set Dual Injection – 4 mm 15 A Quantity: 1
Cell culture well plate support	—-	—-	PMMA Quantity: 1
Fuse	Bussmann	2A	—- Quantity: 1
Transformer	—-	—-	1A – 6 V AC Quantity: 1
Tube	—-	—-	PVC Quantity: 1
Variable rheostat	MCP	BXS150	10 Ω Quantity: 1
General equipment
Digital dual source	PeakTech	DG 1022Z	2 x 0 – 30 V / 0 – 5 A CC / 5 V / 3 A fijo Quantity: 1
Digital Oscilloscope	Rigol	DS1104Z Plus	100 MHz, bandwidth, 4 channels Quantity: 1
Digital multimeter	Fluke	F179	Voltage CC – CA (1000 V). Current CC – CA 10 A. Frequency 100 kHz Quantity: 1