يصف هذا البروتوكول عملية خطوة بخطوة لبناء كل من المحفزات الكهربائية والمغناطيسية المستخدمة لتحفيز الأنسجة البيولوجية. ويتضمن البروتوكول مبدأ توجيهيا لمحاكاة المجالات الكهربائية والمغناطيسية حسابيا وتصنيع أجهزة التحفيز.
تستخدم هندسة الأنسجة الحقول الكهربائية (EFs) والمجالات المغناطيسية على نطاق واسع لتحسين ديناميكيات الخلايا مثل الانتشار والهجرة والتمايز والمورفولوجيا والتركيب الجزيئي. ومع ذلك، المتغيرات مثل قوة المحفزات وأوقات التحفيز تحتاج إلى النظر عند تحفيز الخلايا أو الأنسجة أو السقالات. وبالنظر إلى أن الصناديق الاستئمانية والصناديق الاستئمانية تختلف باختلاف الاستجابة الخلوية، لا يزال من غير الواضح كيفية بناء أجهزة تولد محفزات بيوفيزيائية كافية لتحفيز العينات البيولوجية. في الواقع، هناك نقص في الأدلة المتعلقة بالحساب والتوزيع عند تطبيق المحفزات الفيزيائية الحيوية. ويركز هذا البروتوكول على تصميم وتصنيع أجهزة لتوليد الصناديق الاستئمانية وصناديق الثروة السيادية وتنفيذ منهجية حسابية للتنبؤ بتوزيع المحفزات الفيزيائية الحيوية داخل العينات البيولوجية وخارجها. كان جهاز EF يتألف من قطبين متوازيين من الفولاذ المقاوم للصدأ يقعان في أعلى وأسفل الثقافات البيولوجية. تم توصيل الأقطاب الكهربائية بمذبذب لتوليد الفولتية (50 و 100 و 150 و 200 Vp-p) بسرعة 60 كيلوهرتز. كان جهاز MF يتكون من لفائف ، والتي تم تنشيطها بمحول لتوليد تيار (1 A) والجهد (6 V) عند 60 هرتز. تم بناء دعم الميثاكريل متعدد اليميثيل لتحديد الثقافات البيولوجية في منتصف الملف. وقد بينت المحاكاة الحسابية التوزيع المتجانس للصناديق الاستئمانية والصناديق الاستئمانية داخل الأنسجة البيولوجية وخارجها. هذا النموذج الحسابي هو أداة واعدة يمكن أن تعدل المعلمات مثل الفولتية والترددات ومورفولوجيا الأنسجة وأنواع لوحات الآبار والأقطاب الكهربائية وحجم الملف لتقدير EFs و MFs لتحقيق استجابة خلوية.
وقد ثبت أن صناديق الاستثمار الإلكترونية والصناديق متعددة الخلايا تعدل ديناميكيات الخلايا، مما يحفز الانتشار ويزيد من تركيب الجزيئات الرئيسية المرتبطة بالمصفوفة خارج الخلية للأنسجة1. يمكن تطبيق هذه المحفزات الفيزيائية الحيوية بطرق مختلفة باستخدام إعدادات وأجهزة محددة. وفيما يتعلق بالأجهزة لتوليد EFs، تستخدم المحفزات المباشرة اقتران الأقطاب الكهربائية التي هي في اتصال مع العينات البيولوجية في المختبر أو زرعها مباشرة في أنسجة المرضى والحيوانات في الجسم الحي2؛ ومع ذلك، لا تزال هناك قيود وأوجه القصور التي تشمل عدم كفاية التوافق البيولوجي من قبل الأقطاب الكهربائية في اتصال، والتغيرات في مستويات الحموضة والأوكسجين الجزيئي1. على العكس من ذلك ، تولد أجهزة الاقتران غير المباشرة EFs بين قطبين كهربائيين ، يتم وضعها بالتوازي مع العينات البيولوجية3، مما يسمح بتقنية بديلة غير غازية لتحفيز العينات البيولوجية وتجنب الاتصال المباشر بين الأنسجة والأقطاب الكهربائية. يمكن استقراء هذا النوع من الأجهزة للتطبيقات السريرية المستقبلية لإجراء إجراءات مع الحد الأدنى من الغزو للمريض. فيما يتعلق بالأجهزة التي تولد MFs ، تخلق محفزات الاقتران الاستقرائي تيارا كهربائيا متغيرا زمنيا ، يتدفق من خلال لفائف تقع حول ثقافات الخلايا4و5. وأخيرا، هناك أجهزة مجتمعة، والتي تستخدم صناديق الاستثمار الإلكترونية وFS ثابت لتوليد المجالات الكهرومغناطيسيةعابرة 1. وبالنظر إلى وجود تكوينات مختلفة لتحفيز العينات البيولوجية، فمن الضروري النظر في متغيرات مثل التوتر والتردد عند تطبيق المحفزات الفيزيائية الحيوية. الجهد هو متغير مهم ، لأنه يؤثر على سلوك الأنسجة البيولوجية . على سبيل المثال، فقد تبين أن هجرة الخلايا والتوجه والتعبير الجيني تعتمد على اتساع الجهد التطبيقي3،6،7،8،9،10. يلعب التردد دورا مهما في التحفيز البيوفيزيائي ، حيث ثبت أن هذه تحدث بشكل طبيعي في الجسم الحي. وقد ثبت أن الترددات العالية والمنخفضة لها آثار مفيدة على الخلايا؛ خاصة، في قنوات الكالسيوم ذات البوابات الجهد الخلية غشاء أو reticulum endoplasmic، والتي تؤدي مختلف الإشارات المسارات في مستوى داخل الخلية1،7،11.
وفقا لما ذكر أعلاه ، يتكون جهاز لتوليد EFs من مولد جهد متصل بمكثفين متوازيين12. تم تنفيذ هذا الجهاز من قبل ارمسترونغ وآخرون لتحفيز كل من معدل التكاثر والتوليف الجزيئي للشوندروسيتيس13. تم إجراء تكييف لهذا الجهاز من قبل برايتون وآخرون الذين عدلوا صفائح آبار زراعة الخلايا عن طريق حفر أغطية العلوي والسفلي. تم ملء الثقوب بشرائح الغطاء ، حيث تم استخدام النظارات السفلية زراعة الأنسجة البيولوجية. وضعت أقطاب كهربائية على كل شريحة غطاء لتوليد EFs14. تم استخدام هذا الجهاز لتحفيز كهربائيا chondrocytes، والعظام والغضاريف explants، مما يدل على زيادة في انتشار الخلايا14،15،16 والتوليف الجزيئي3،17. ويتكون الجهاز الذي صممه Hartig وآخرون من مولد موجة ومكبر للصوت الجهد، والتي كانت متصلة المكثفات المتوازية. تم صنع أقطاب كهربائية من الفولاذ المقاوم للصدأ عالي الجودة الموجود في علبة عازلة. تم استخدام الجهاز لتحفيز الخلايا العظمية، مما يدل على زيادة كبيرة في الانتشار وإفراز البروتين18. ويتكون الجهاز الذي يستخدمه كيم وآخرون من رقاقة محفز تيار ثنائي الطور، تم بناؤها باستخدام عملية تصنيع أشباه الموصلات التكميلية لأكسيد المعادن عالي الجهد. تم تصميم لوحة بئر الثقافة زراعة الخلايا على سطح موصل مع التحفيز الكهربائي. كانت مغلفة الأقطاب الكهربائية في الذهب على لوحات السيليكون19. تم استخدام هذا الجهاز لتحفيز الخلايا العظمية ، مما يدل على زيادة في انتشار وتوليف عامل النمو البطاني الوعائي19، وتحفيز إنتاج نشاط الفوسفاتاز القلوية وترسب الكالسيوم والبروتينات المورفوجينية العظمية20. وبالمثل، تم استخدام هذا الجهاز لتحفيز معدل التكاثر والتعبير عن عامل النمو البطانية الوعائية من نخاع العظم البشري الخلايا الجذعيةالمتوسطة 21. وكان الجهاز الذي صممه ناكاسوجي وآخرون يتألف من مولد جهد متصل بلوحات البلاتين. تم بناء أقطاب كهربائية لقياس الإمكانات الكهربائية في 24 نقطة مختلفة. تم استخدام هذا الجهاز لتحفيز chondrocytes، مما يدل على أن EFs لم يغير مورفولوجيا الخلايا وزيادة الانتشار والتوليف الجزيئي22. ويتكون الجهاز الذي يستخدمه الاتحاد الافريقي وآخرون من غرفة زجاجية مجهزة بقضيبين كربونيين متصلين بمحفز للقلب بأسلاك بلاتينية. تم استخدام هذا المحفز لتحفيز خلايا القلب والخلايا الليفية ، وتحسين استطالة الخلايا ومحاذاة الخلايا الليفية23.
تم تصنيع أجهزة MF مختلفة على أساس لفائف هيلمهولتز لتحفيز عدة أنواع من العينات البيولوجية. على سبيل المثال، وقد استخدمت لفائف هيلمهولتز لتحفيز الانتشار والتوليف الجزيئي للشوندروسيتيس24،25، وتعزيز تخليق البروتيوغليكان من explants الغضاريف المفصلية26، وتحسين التنظيم الجيني المتعلقة بتكوين العظام من الخلايا الشبيهة بالعظم27، وزيادة الانتشار والتعبير الجزيئي للخلايا البطانية28. لفائف هيلمهولتز تولد MFs في جميع أنحاء اثنين من لفائف تقع واحدة أمام الأخرى. يجب وضع اللفائف بمسافة مساوية لنصف قطر اللفائف لضمان MF متجانسة. ويكمن عيب استخدام لفائف هيلمهولتز في أبعاد الملف ، لأنها تحتاج إلى أن تكون كبيرة بما يكفي لتوليد كثافة MF المطلوبة. بالإضافة إلى ذلك، يجب أن تكون المسافة بين اللفائف كافية لضمان توزيع متجانس للصناديق متعددة العضلات حول الأنسجة البيولوجية. لتجنب المشاكل الناجمة عن لفائف هيلمهولتز، ركزت دراسات مختلفة على تصنيع لفائف السولينويد. وتستند لفائف سولينويد على أنبوب، وهو الجرح مع الأسلاك النحاسية لتوليد MFs. يمكن توصيل مدخلات الأسلاك النحاسية مباشرة إلى منفذ أو إمدادات الطاقة لتنشيط لفائف وخلق MFs في وسط سولينويد. كلما زاد تحول الملف ، كلما زاد توليد MF. حجم MF يعتمد أيضا على الجهد والتيارات المطبقة لتنشيطلفائف 29. وقد استخدمت لفائف سولينويد لتحفيز نوع مختلف مغناطيسيا من الخلايا مثل هيلا، HEK293 وMCF730 أو الخلايا الجذعية mesenchymal31.
الأجهزة المستخدمة من قبل مختلف المؤلفين لم تنظر في الحجم الكافي للأقطاب الكهربائية أو الطول الصحيح لللفائف لتوزيع متجانسة كل من صناديق الاستثمار المتداولة وFs. وعلاوة على ذلك، تولد الأجهزة الفولتية الثابتة والترددات، والحد من استخدامها لتحفيز الأنسجة البيولوجية محددة. ولهذا السبب، يتم في هذا البروتوكول تنفيذ مبدأ توجيهي للمحاكاة الحاسوبية لمحاكاة كل من النظم السعائية واللفائف لضمان التوزيع المتجانس للصناديق الاستئمانية والصناديق متعددة المؤشرات على العينات البيولوجية، وتجنب تأثير الحافة. بالإضافة إلى ذلك ، يظهر أن تصميم الدوائر الإلكترونية يولد الفولتية والتردد بين الأقطاب الكهربائية واللفائف ، مما يخلق EFs و MFs التي ستتغلب على القيود الناجمة عن مقاومة لوحات الآبار والهواء لثقافة الخلية. وستسمح هذه التعديلات بإنشاء مفاعلات بيولوجية غير غازية ومتكيفة لتحفيز أي أنسجة بيولوجية.
العلاجات المستخدمة لعلاج الأمراض المختلفة التي تؤثر على الأنسجة البشرية هي العلاجات الدوائية32 أو التدخلات الجراحية33، والتي تسعى إلى تخفيف الألم محليا أو استبدال الأنسجة المصابة بالنباتات أو عمليات الزرع. في الآونة الأخيرة ، تم اقتراح العلاج الذاتي بالخلايا كع…
The authors have nothing to disclose.
ويشكر أصحاب البلاغ الدعم المالي الذي قدمته مؤسسة فينانسيامينتو بارا لا سينسيا، لا تكنولوجيا، إي لا إنوفاسيون – فوندو فرانسيسكو خوسيه دي كالداس – مينسينوسياس” وجامعة كولومبيا الوطنية من خلال المنحة رقم 80740-290-2020 والدعم الذي تلقته شركة فالتيام للتكنولوجيا – البحث والابتكار لتوفير المعدات والدعم التقني في طبعة الفيديو.
Electrical stimulator | |||
Operational amplifier | Motorola | LF-353N | —- Quantity: 1 |
Resistors | —- | —- | 22 kΩ Quantity: 1 |
Resistors | —- | —- | 10 kΩ Quantity: 3 |
Resistors | —- | —- | 2.6 kΩ Quantity: 2 |
Resistors | —- | —- | 2.2 kΩ Quantity: 1 |
Resistors | —- | —- | 1 kΩ Quantity: 1 |
Resistors | —- | —- | 220 Ω Quantity: 2 |
Resistors | —- | —- | 22 Ω Quantity: 5 |
Resistors | —- | —- | 10 Ω Quantity: 1 |
Resistors | —- | —- | 6.8 Ω Quantity: 1 |
Resistors | —- | —- | 3.3 Ω Quantity: 2 |
Polyester capacitors | —- | —- | 1 nF Quantity: 2 |
Polyester capacitors | —- | —- | 100 nF Quantity: 1 |
VHF Band Amplifier Transistor JFET | Toshiba | 2SK161 | —- Quantity: 1 |
Power transistor BJT NPN | Mospec | TIP 31C | —- Quantity: 1 |
Zener diode | Microsemi | 1N4148 | —- Quantity: 1 |
Switch | Toogle Switch | SPDT – T13 | —- Quantity: 3 |
Toroidal ferrite core | Caracol | —- | T*22*14*8 Quantity: 1 |
Cooper wire | Greenshine | —- | AWG – 24 Quantity: 1 |
Relimate header with female housing | ADAFRUIT | —- | 8 pin connectors Quantity: 1 |
Relimate header with female housing | ADAFRUIT | —- | 2 pin connectors Quantity: 1 |
Female plug terminal connector | JIALUN | —- | 4mm Lantern Plugs (Plug + Socket) 15 A Quantity: 1 |
Aluminum Heat Sink | AWIND | —- | For TIP 31C transistor Quantity: 1 |
Led | CHANZON | —- | 5 mm red Quantity: 1 |
Integrated circuit socket connector | Te Electronics Co., Ltd. | —- | Double row 8-pin DIP Quantity: 1 |
3 pin connectors set | STAR | —- | JST PH 2.0 Quantity: 3 |
2 pin screw connectors | STAR | —- | For PCB Quantity: 1 |
3 pin screw connectors | STAR | —- | For PCB Quantity: 1 |
Banana connector test lead | JIALUN | —- | P1041 – 4 mm – 15 A Quantity: 7 |
Bullet connectors to banana plug charge lead | JIALUN | —- | 4 mm male-male/female-female adapters – 15 A Quantity: 1 |
Case | —- | —- | ABS Quantity: 1 |
Electrodes | —- | —- | Stainless – steel Quantity: 2 |
Electrode support | —- | —- | Teflon Quantity: 2 |
Printed circuit board | Quantity: 1 | ||
Magnetic stimulator | |||
Cooper wire | Greenshine | —- | AWG – 18 Quantity: 1 |
AC power plugs | —- | —- | 120 V AC – 60 Hz Quantity: 1 |
Banana female connector test lead | JIALUN | —- | 1Set Dual Injection – 4 mm – 15 A Quantity: 2 |
Banana male connector test lead | JIALUN | —- | 1Set Dual Injection – 4 mm 15 A Quantity: 1 |
Cell culture well plate support | —- | —- | PMMA Quantity: 1 |
Fuse | Bussmann | 2A | —- Quantity: 1 |
Transformer | —- | —- | 1A – 6 V AC Quantity: 1 |
Tube | —- | —- | PVC Quantity: 1 |
Variable rheostat | MCP | BXS150 | 10 Ω Quantity: 1 |
General equipment | |||
Digital dual source | PeakTech | DG 1022Z | 2 x 0 – 30 V / 0 – 5 A CC / 5 V / 3 A fijo Quantity: 1 |
Digital Oscilloscope | Rigol | DS1104Z Plus | 100 MHz, bandwidth, 4 channels Quantity: 1 |
Digital multimeter | Fluke | F179 | Voltage CC – CA (1000 V). Current CC – CA 10 A. Frequency 100 kHz Quantity: 1 |