Elektriske og magnetiske feltenheder til stimulering af biologisk væv

Summary

Denne protokol beskriver den trinvise proces til opbygning af både elektriske og magnetiske stimulatorer, der bruges til at stimulere biologiske væv. Protokollen indeholder en retningslinje til at simulere beregningsmæssigt elektriske og magnetiske felter og fremstilling af stimulatorenheder.

Abstract

Elektriske felter (EF’er) og magnetfelter (MF’er) er i vid udstrækning blevet brugt af vævsteknik til at forbedre celledynamik såsom spredning, migration, differentiering, morfologi og molekylær syntese. Variabler sådanne stimuli styrke og stimuleringstider skal dog overvejes, når man stimulerer enten celler, væv eller stilladser. I betragtning af at EF’er og MF’er varierer afhængigt af cellulær respons, er det fortsat uklart, hvordan man opbygger enheder, der genererer tilstrækkelige biofysiske stimuli for at stimulere biologiske prøver. Faktisk er der mangel på dokumentation for beregning og distribution, når biofysiske stimuli anvendes. Denne protokol er fokuseret på design og fremstilling af enheder til at generere EF’er og MF’er og implementering af en beregningsmetode til at forudsige biofysisk stimulifordeling i og uden for biologiske prøver. EF-enheden bestod af to parallelle elektroder i rustfrit stål placeret øverst og nederst i biologiske kulturer. Elektroder blev forbundet til en oscillator for at generere spændinger (50, 100, 150 og 200 Vp-p) ved 60 kHz. MF-enheden bestod af en spole, som blev fyldt med energi med en transformer til at generere en strøm (1 A) og spænding (6 V) ved 60 Hz. En polymethyl methacrylat støtte blev bygget for at finde de biologiske kulturer i midten af spolen. Den beregningsmæssige simulering belyste den homogene fordeling af EF’er og MF’er i og uden for biologisk væv. Denne beregningsmæssige model er et lovende værktøj, der kan ændre parametre som spændinger, frekvenser, vævsmorfologier, godt pladetyper, elektroder og spolestørrelse for at estimere EF’erne og MF’erne for at opnå en cellulær respons.

Introduction

EF’er og MF’er har vist sig at ændre celledynamik, stimulere spredning og øge syntesen af de vigtigste molekyler forbundet med den ekstracellulære matrix af væv¹. Disse biofysiske stimuli kan anvendes på forskellige måder ved hjælp af specifikke indstillinger og enheder. For så vidt angår anordninger til ledningsproduktion, anvender direkte koblingsstimulatorer elektroder, der er i kontakt med biologiske prøver in vitro eller implanteret direkte i væv fra patienter og dyr in vivo^2; Der er dog stadig begrænsninger og mangler, der omfatter utilstrækkelig biokompatibilitet fra elektroderne i kontakt, ændringer i pH-niveauet og niveauet for molekylær ilt¹. Tværtimod genererer indirekte koblingsanordninger EF’er mellem to elektroder, som placeres parallelt med biologiske prøver³, hvilket giver en ikke-invasiv alternativ teknik til at stimulere biologiske prøver og undgå direkte kontakt mellem væv og elektroder. Denne type enhed kan ekstrapoleres til fremtidige kliniske applikationer til at udføre procedurer med minimal invasion til patienten. I forhold til enheder, der genererer MF’er, skaber induktive koblingsstimulatorer en tids varierende elektrisk strøm, der strømmer gennem en spole, der er placeret omkring^{cellekulturer 4,5}. Endelig er der kombinerede enheder, der bruger EF’er og statiske MF’er til at generere forbigående elektromagnetiske felter¹. I betragtning af at der er forskellige konfigurationer til at stimulere biologiske prøver, er det nødvendigt at overveje variabler som spænding og frekvens, når biofysiske stimuli anvendes. Spænding er en vigtig variabel, da den påvirker adfærden af biologiske væv; for eksempel har det vist sig, at cellemigration, orientering og genekspression afhænger af amplitudsen af anvendt spænding^3,6,^7,8,9,10. Frekvens spiller en vigtig rolle i biofysisk stimulation, da det har vist sig, at disse forekommer naturligt in vivo. Det er blevet påvist, at høje og lave frekvenser har gavnlige virkninger på cellerne. især i cellemembranspænding-gated calciumkanaler eller endoplasmisk reticulum, som udløser forskellige signalveje på intracellulært niveau^1,7,11.

Ifølge ovennævnte består en anordning til produktion af EF’er af en spændingsgenerator, der er forbundet med to parallelle kondensatorer¹². Denne enhed blev implementeret af Armstrong et al. for at stimulere både den proliferative hastighed og den molekylære syntese af chondrocytter¹³. En tilpasning af denne enhed blev udført af Brighton et al., der modificerede cellekulturens brøndplader ved at bore deres top- og bundlåg. Huller blev fyldt med dæksløtninger, hvor de nederste briller blev brugt til at dyrke biologiske væv. Elektroder blev placeret på hvert dækslør for at generere^{EF’er 14}. Denne enhed blev brugt til elektrisk at stimulere chondrocytter, osteoblaster og brusk explants, viser en stigning i cellespredning^14,15,16 og molekylær syntese^3,17. Enheden designet af Hartig et al. bestod af en bølgegenerator og en spændingsforstærker, som var forbundet til parallelle kondensatorer. Elektroder blev lavet af rustfrit stål af høj kvalitet placeret i en isolerende sag. Enheden blev brugt til at stimulere osteoblaster, der viser en betydelig stigning i spredning og protein sekretion¹⁸. Den anordning, der anvendes af Kim et al. bestod af en bifasisk strøm stimulator chip, som blev bygget ved hjælp af en fremstillingsproces af komplementære halvledere af højspændingsmetaloxid. En kulturbrøndplade blev designet til at kulturceller over en ledende overflade med elektrisk stimulation. Elektroder var belagt med guld over siliciumplader¹⁹. Denne anordning blev brugt til at stimulere osteoblaster, der viser en stigning i spredning og syntese af den vaskulære endotel vækstfaktor¹⁹, og stimulere produktionen af alkalisk fosfatase aktivitet, calcium deposition og knogle morfogene proteiner²⁰. På samme måde blev denne anordning brugt til at stimulere den proliferative hastighed og ekspression af vaskulær endotelvækstfaktor for humane knoglemarvs mesenchymale stamceller²¹. Enheden designet af Nakasuji et al. bestod af en spændingsgenerator forbundet til platinplader. Elektroder blev bygget til at måle det elektriske potentiale på 24 forskellige punkter. Denne enhed blev brugt til at stimulere chondrocytter, der viser, at EF’er ikke ændrede cellemorfologi og øget spredning og molekylær syntese²². Den anordning, der anvendes af Au et al. bestod af et glaskammer udstyret med to kulstofstænger forbundet til en hjertestimulator med platintråde. Denne stimulator blev brugt til at stimulere kardiomyocytter og fibroblaster, forbedre celleforlængelse og fibroblastjustering²³.

Forskellige MF-enheder er fremstillet på basis af Helmholtz-spoler for at stimulere flere typer biologiske prøver. For eksempel har Helmholtz spoler blevet brugt til at stimulere spredning og molekylær syntese af chondrocytter^24,25, forbedre proteoglycan syntese af ledbrusk explants²⁶, forbedre genopregulering relateret til knogledannelse af osteoblast-lignende celler²⁷, og øge spredning og molekylære udtryk for endotelceller²⁸. Helmholtz spoler generereR MF’er i to spoler placeret foran den anden. Spolerne skal placeres med en afstand svarende til spolernes radius for at sikre en homogen MF. Ulempen ved at bruge Helmholtz spoler ligger i spoledimensionerne, fordi de skal være store nok til at generere den krævede MF-intensitet. Desuden skal afstanden mellem spolerne være tilstrækkelig til at sikre en ensartet fordeling af MF’er omkring biologisk væv. For at undgå problemer forårsaget af Helmholtz spoler, forskellige undersøgelser har været fokuseret på solenoid spoler fremstilling. Solenoid spoler er baseret på et rør, som er sår med kobbertråd til at generere MF’er. Kobbertråd indgange kan tilsluttes direkte til stikkontakten eller en strømforsyning til energi til spolen og skabe MF’er i midten af solenoid. Jo flere sving spolen har, jo større MF genereret. MF-størrelsen afhænger også af den spænding og strøm, der påføres for at give spolen²⁹energi. Solenoid spoler er blevet brugt til at stimulere magnetisk forskellige slags celler som HeLa, HEK293 og MCF7³⁰ eller mesenchymale stamceller³¹.

Anordninger, der anvendes af forskellige forfattere, har hverken taget hensyn til elektrodernes tilstrækkelige størrelse eller den korrekte længde af spolen til homogent at distribuere både EF’er og MF’er. Desuden genererer enheder faste spændinger og frekvenser, hvilket begrænser deres anvendelse til at stimulere specifikke biologiske væv. Derfor udføres der i denne protokol en beregningssimuleringsretningslinje for at simulere både kapacitive systemer og spoler for at sikre homogen fordeling af EF’er og MF’er over biologiske prøver, så kanteffekten undgås. Derudover er det vist, at udformningen af elektroniske kredsløb generere spændinger og frekvens mellem elektroderne og spolen, skabe EF’er og MF’er, der vil overvinde begrænsninger forårsaget af impedans af cellekulturen godt plader og luft. Disse modifikationer vil gøre det muligt at skabe ikke-invasive og adaptive bioreaktorer for at stimulere ethvert biologisk væv.

Protocol

1. Simulering af EF’er og MF’er BEMÆRK: Simulering af EF’er og MF’er blev udført i COMSOL Multiphysics. Vælg en aksemetrisk 2D-konfiguration, der repræsenterer både domæner elektrisk og magnetisk. I den fysiske konfiguration skal du vælge enten den elektriske strømgrænseflade til beregning af EF’er i parallelle elektroder eller magnetfeltgrænsefladen til beregning af MF’er omkring spoler. I undersøgelseskonfigurationen …

Representative Results

BeregningssimuleringFordelingen af EF’er og MF’er fremgår af figur 3. På den ene side var det muligt at observere den homogene fordeling af EF’er i kapacitive systemet (figur 3A). Ef blev plottet til at observere feltets størrelse i den biologiske prøve (Figur 3B). Denne simulering var nyttig til at parametrisere elektrodernes størrelse og fremstille dem for at undgå kanteffekten. På den anden side var de…

Discussion

Behandlinger, der anvendes til at helbrede forskellige patologier, der påvirker humane væv er farmakologiske behandlinger³² eller kirurgiske indgreb³³, som søger at lindre smerter lokalt eller erstatte berørte væv med explants eller transplantationer. For nylig er autolog celleterapi blevet foreslået som en alternativ behandling til behandling af skadet væv, hvor celler isoleres fra patienten og udvides gennem in vitro-teknikker, der skal implanteres på skadesstedet…

Materials

Electrical stimulator
Operational amplifier	Motorola	LF-353N	—- Quantity: 1
Resistors	—-	—-	22 kΩ Quantity: 1
Resistors	—-	—-	10 kΩ Quantity: 3
Resistors	—-	—-	2.6 kΩ Quantity: 2
Resistors	—-	—-	2.2 kΩ Quantity: 1
Resistors	—-	—-	1 kΩ Quantity: 1
Resistors	—-	—-	220 Ω Quantity: 2
Resistors	—-	—-	22 Ω Quantity: 5
Resistors	—-	—-	10 Ω Quantity: 1
Resistors	—-	—-	6.8 Ω Quantity: 1
Resistors	—-	—-	3.3 Ω Quantity: 2
Polyester capacitors	—-	—-	1 nF Quantity: 2
Polyester capacitors	—-	—-	100 nF Quantity: 1
VHF Band Amplifier Transistor JFET	Toshiba	2SK161	—- Quantity: 1
Power transistor BJT NPN	Mospec	TIP 31C	—- Quantity: 1
Zener diode	Microsemi	1N4148	—- Quantity: 1
Switch	Toogle Switch	SPDT – T13	—- Quantity: 3
Toroidal ferrite core	Caracol	—-	T*22*14*8 Quantity: 1
Cooper wire	Greenshine	—-	AWG – 24 Quantity: 1
Relimate header with female housing	ADAFRUIT	—-	8 pin connectors Quantity: 1
Relimate header with female housing	ADAFRUIT	—-	2 pin connectors Quantity: 1
Female plug terminal connector	JIALUN	—-	4mm Lantern Plugs (Plug + Socket) 15 A Quantity: 1
Aluminum Heat Sink	AWIND	—-	For TIP 31C transistor Quantity: 1
Led	CHANZON	—-	5 mm red Quantity: 1
Integrated circuit socket connector	Te Electronics Co., Ltd.	—-	Double row 8-pin DIP Quantity: 1
3 pin connectors set	STAR	—-	JST PH 2.0 Quantity: 3
2 pin screw connectors	STAR	—-	For PCB Quantity: 1
3 pin screw connectors	STAR	—-	For PCB Quantity: 1
Banana connector test lead	JIALUN	—-	P1041 – 4 mm – 15 A Quantity: 7
Bullet connectors to banana plug charge lead	JIALUN	—-	4 mm male-male/female-female adapters – 15 A Quantity: 1
Case	—-	—-	ABS Quantity: 1
Electrodes	—-	—-	Stainless – steel Quantity: 2
Electrode support	—-	—-	Teflon Quantity: 2
Printed circuit board			Quantity: 1
Magnetic stimulator
Cooper wire	Greenshine	—-	AWG – 18 Quantity: 1
AC power plugs	—-	—-	120 V AC – 60 Hz Quantity: 1
Banana female connector test lead	JIALUN	—-	1Set Dual Injection – 4 mm – 15 A Quantity: 2
Banana male connector test lead	JIALUN	—-	1Set Dual Injection – 4 mm 15 A Quantity: 1
Cell culture well plate support	—-	—-	PMMA Quantity: 1
Fuse	Bussmann	2A	—- Quantity: 1
Transformer	—-	—-	1A – 6 V AC Quantity: 1
Tube	—-	—-	PVC Quantity: 1
Variable rheostat	MCP	BXS150	10 Ω Quantity: 1
General equipment
Digital dual source	PeakTech	DG 1022Z	2 x 0 – 30 V / 0 – 5 A CC / 5 V / 3 A fijo Quantity: 1
Digital Oscilloscope	Rigol	DS1104Z Plus	100 MHz, bandwidth, 4 channels Quantity: 1
Digital multimeter	Fluke	F179	Voltage CC – CA (1000 V). Current CC – CA 10 A. Frequency 100 kHz Quantity: 1