Summary
Aqui, estabelecemos um novo modelo de rato Sprague-Dawley (SD) de trombose sagital superior (SSS) através de um método de embolização de roscas, e a estabilidade e confiabilidade do modelo foram verificadas.
Abstract
Os mecanismos que contribuem para o aparecimento natural da trombose venosa cerebral (CVST) são, em sua maioria, desconhecidos, e uma variedade de fatores incontroláveis estão envolvidos no curso da doença, resultando em grandes limitações na pesquisa clínica. Portanto, o estabelecimento de modelos animais CVST estáveis que possam padronizar uma variedade de fatores de confusão incontroláveis têm ajudado a contornar deficiências na pesquisa clínica. Nas últimas décadas, uma variedade de modelos animais CVST foram construídos, mas os resultados baseados nesses modelos têm sido inconsistentes e incompletos. Assim, para explorar melhor os mecanismos fisiociológicos do CVST, é necessário estabelecer um modelo animal novo e altamente compatível, que tenha importante valor prático e significância científica para o diagnóstico e tratamento do CVST. No presente estudo, foi estabelecido um novo modelo de rato Sprague-Dawley (SD) de trombose sagital superior (SSS) por meio de um método de embolização de roscas, e verificou-se a estabilidade e confiabilidade do modelo. Além disso, foram avaliadas alterações no fluxo sanguíneo venoso cerebral em ratos após a formação de CVST. Coletivamente, o modelo SD-rat SSS-thrombosis representa um novo modelo animal CVST que é facilmente estabelecido, minimiza o trauma, produz boa estabilidade e permite controlar com precisão o tempo isquêmico e a localização.
Introduction
A trombose súbia-síbia cerebral (CVST) é uma doença rara do sistema venoso cerebral que representa apenas 0,5-1,0% de todas as causas de AVC, mas tem uma taxa de ocorrência relativamente alta em crianças e adultos jovens1. Durante a autópsia, verificou-se que o CVST foi a causa de 10% dos óbitos cerebrovasculares2. A trombose pode ocorrer em qualquer parte do sistema venoso intracraniano. O seio sagital superior (SSS) é uma das áreas mais comumente afetadas no CVST e pode envolver múltiplos vasos sanguíneos. Devido à estenose ou à oclusão dos seios venosos, o retorno venoso intracraniano é bloqueado, que muitas vezes é acompanhado pelo aumento da pressão intracraniana3. As manifestações clínicas do CVST são complexas e variam ao longo do tempo; embora haja falta de especificidade dos sintomas, os sintomas mais comuns incluem dor de cabeça (77,2%), convulsões (42,7%) e déficits neurológicos (39,9%). Em casos graves, o coma e até mesmo a morte podem ocorrer4,5. Nos últimos anos, devido à melhoria geral das normas médicas e de saúde e à conscientização da saúde pública, a proporção de fatores de risco relacionados mudou, a proporção de trauma e infecção diminuiu, e a proporção de CVST causada pela gravidez, puerpério, contraceptivos orais e outros motivos aumentou gradualmente5.
Atualmente, a patogênese do CVST ainda não é bem compreendida. Para explorar o CVST em profundidade, é necessária uma pesquisa fisiopatológica adicional. No entanto, a maioria desses métodos de pesquisa são invasivos e, portanto, difíceis de implementar clinicamente. Devido a muitas limitações da pesquisa clínica, os modelos animais têm vantagens insubstituíveis em termos de pesquisa básica e translacional.
A causa do CVST é complexa, pois seu início inicial muitas vezes não é reconhecido e a localização da formação de trombos é altamente variável. Felizmente, os modelos animais podem alcançar um melhor controle desses fatores. Nas últimas décadas, uma variedade de modelos animais CVST foram estabelecidos, e cada modelo tem suas próprias desvantagens. De acordo com diferentes métodos de produção, eles podem ser aproximadamente divididos nas seguintes categorias: o modelo simples de ligadura SSS6,7; o modelo SSS de acelerador de injeção interna8; o modelo de trombose SSS induzida por cloreto férrico9; o modelo de trombose SSS induzido por fotoquímicosmodelo 10; e o auto-feito embolismo-oclusão ModeloSSS 11. No entanto, a maioria desses modelos são incapazes de contornar danos invasivos ao córtex cerebral do animal e não são capazes de controlar com precisão o tempo e a localização isquêmicas. Em alguns modelos, o trombo vai recanalizar espontaneamente; em outros modelos, o SSS torna-se permanentemente ocluído. Além disso, operações complicadas e/ou lesões graves podem afetar achados fisiopatológicos subsequentes nesses modelos.
No presente estudo, um plugue de rosca foi inserido no SSS dos ratos Sprague-Dawley (SD) para estabelecer com sucesso um modelo CVST que minimizasse danos, permitia uma controlabilidade precisa e gerava boa estabilidade. Além disso, imagens de ressonância magnética de animais de pequeno porte (RM) e imagens de fluxo sanguíneo com manchas a laser foram combinadas para verificar a eficácia do modelo. Avaliamos alterações no fluxo sanguíneo cerebral antes e depois do estabelecimento do nosso modelo, bem como avaliamos a estabilidade do nosso modelo, estabelecendo base para estudos mais aprofundados explorando a ocorrência, o desenvolvimento e mecanismos fisiofológicos relacionados da CVST.
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Protocol
Os procedimentos envolvendo matérias animais foram aprovados pelo Comitê de Normas Médicas e Ética da Universidade Médica de Wenzhou e estão de acordo com a legislação chinesa sobre o uso e o cuidado de animais de laboratório.
1. Preparação do plugue de rosca, ratos SD e equipamento experimental
- Use uma rosca de nylon com diâmetro de 0,28 mm como o corpo principal do plugue da rosca.
NOTA: A maciez e dureza da linha de nylon devem ser moderadas. - Cubra uma extremidade da linha de nylon com material de silicone. O comprimento da parte de silicone do plugue da rosca é de aproximadamente 1,2 cm, e o diâmetro é de aproximadamente 1,2 mm. A extremidade da cabeça está afilada, e a parte de silicone é cilíndrica. Reserve mais 5-7 cm. A linha de nylon é fácil de fixar e pode ser cortada de acordo com necessidades específicas após a operação.
- Use 75% de etanol para absorver o plugue por 3 minutos antes da operação e enxaguar qualquer etanol residual com soro fisiológico normal antes de conectar.
- Selecione 12 ratos SD machos pesando entre 280 e 320 g, e divida-os aleatoriamente em um grupo falso e grupo experimental (n = 6 por grupo). Após uma semana de adaptação ambiental, acelere os ratos por 12h e prive-os por 4h antes da operação.
- Prepare os seguintes equipamentos experimentais necessários para o experimento: uma pequena máquina de anestesia animal, um instrumento estereotaxista cerebral, um microscópio dissecando, uma broca de crânio de alta velocidade, tesoura, pinças, fórceps vasculares, um suporte de agulha, uma linha de agulha, uma seringa de 2 mL, um sistema de imagem de fluxo sanguíneo com manchas a laser e um scanner de ressonância magnética de animais pequenos.
2. Construção do Modelo de Embolização SD-Rat SSS via Embolização de Roscas
- Coloque o rato SD em uma caixa de indução de anestesia e use uma máquina anestéstica de pequenos animais para entregar 4% de isoflurane para induzir anestesia. Depois disso, use fórceps para confirmar que os membros traseiros e os dedos dos dedos traseiros do rato SD não respondem a beliscões moderadas.
- Conserte rapidamente o rato SD com cabelos de topo raspados na posição propensa em um dispositivo estereotaxic cerebral. Mantenha a anestesia com isoflurane de 1,5-2,0% (a uma velocidade de 0,5 L/min), e estabilize a taxa respiratória em 40-60 respirações/min. Estabilize a temperatura corporal do rato através de uma almofada de aquecimento a 37±0,2 °C.
- Aplique lubrificante ocular oftálmico estéril depois que o rato for colocado na estrutura estereotaxica para proteger as córneas da secagem durante a anestesia.
- Esterilize a superfície na parte superior da cabeça do rato com 5% de iodo povidone alternando três vezes com 75% de etanol. Faça uma incisão de pele (2,0 cm de comprimento) no meio da cabeça e, em seguida, retire cuidadosamente a fáscia superior e o periósteo para expor totalmente o crânio.
- Confirme as posições da fontanelle anterior, fontanelle posterior, sutura coronal, sutura sagital e sutura herringbone.
- Use a área entre a sutura coronal e a sutura herringbone como área observacional de fluxo sanguíneo. Para evitar que o crânio afete a observação durante a imagem do fluxo sanguíneo, diluir o crânio na área de observação até que os vasos sanguíneos sejam claramente visíveis. O tamanho do crânio diluído deve ser de aproximadamente 1,0 cm × 1,0 cm. Esta etapa e o seguinte são todas realizadas sob um microscópio dissecando.
- Durante a moagem do crânio, use soro fisiológico de temperatura normal para enxaguar a broca repetidamente para evitar queimaduras de alta temperatura no córtex cerebral.
- Use uma broca de alta velocidade para moer o crânio dentro de uma janela óssea de 6,0 mm x 4,0 mm centrada na bregma para expor a SSS da área de bregma.
- Use soro fisiológico normal para esfriar o crânio durante a moagem. Quando o crânio ficar fino, use pinças para remover cuidadosamente os pedaços de osso restantes para evitar rasgar a SSS.
- Escolha um plugue de rosca adequado, use o ponto de bregma SSS como ponto de plugue, perfure-o cuidadosamente com uma agulha de seringa de 2 mL e insira rapidamente a cabeça do plugue do fio no ponto de plugue.
- Neste momento, o ângulo entre a extremidade da cabeça do plugue e o SSS deve ser de aproximadamente 30-45°; em seguida, ajuste o ângulo entre a extremidade do plugue da rosca e o SSS para 0-10 graus, e insira lentamente o SSS no centro até que a cabeça atinja a borda posterior da confluência do seio. Depois disso, corte a parte excedente da cauda.
NOTA: Pode ocorrer hemorragia rápida quando o SSS é perfurado. Se a extremidade do plugue não puder ser rapidamente inserida no ponto de plugue de uma só vez, use uma pequena gaze ou uma bola de algodão para pressionar suavemente o ponto de tomada enquanto desliza lentamente para baixo para expor o ponto de tomada cuidadosamente e, em seguida, insira rapidamente a extremidade do parafuso de fio no SSS. Depois que o plugue da rosca é inserido, se houver sangramento no ponto de tomada, materiais hemostáticos como uma esponja de gelatina podem ser usados para parar o sangramento.
- Neste momento, o ângulo entre a extremidade da cabeça do plugue e o SSS deve ser de aproximadamente 30-45°; em seguida, ajuste o ângulo entre a extremidade do plugue da rosca e o SSS para 0-10 graus, e insira lentamente o SSS no centro até que a cabeça atinja a borda posterior da confluência do seio. Depois disso, corte a parte excedente da cauda.
3. Detecção de fluxo sanguíneo na superfície cerebral de ratos SD
- Use uma fonte de luz laser para iluminar uniformemente a área observacional do fluxo sanguíneo. A luz refletida é coletada por uma câmera e é transmitida a um computador para análise. Use as seguintes configurações de parâmetro para o sistema de imagem de fluxo sanguíneo com manchas a laser: comprimento de onda: λ = 785 nm; e tempo de exposição da imagem: T = 10 ms.
- Centralize a área observacional de fluxo sanguíneo de SD-rato para o campo de visão do sistema de imagem de fluxo sanguíneo de manchas a laser e realize o monitoramento contínuo do fluxo sanguíneo na superfície cerebral por 2 minutos. Colete e processe os dados de fluxo sanguíneo antes e depois da embolização de cada rato SD, e obtenha o mapa de fluxo sanguíneo com manchas a laser da área observada.
- Enxágue repetidamente a área operada com soro fisiológico normal para lavar detritos ósseos e resíduos. Sutura a pele (fio 0) e desinfete com iodophor.
- Mantenha a temperatura corporal até que o rato acorde após a cirurgia e, em seguida, abriga em uma única gaiola com comida e água fornecida ad libitum. O grupo falso não pode ser ligado.
- Após a conclusão da coleta de dados, realize o pós-processamento.
- Seleção completa da região de interesse (ROI) através das ferramentas fornecidas pelo software do sistema de imagem de fluxo sanguíneo com manchas a laser. Os valores obtidos são o valor médio do fluxo sanguíneo no ROI, e os valores locais de fluxo sanguíneo cerebral antes e depois da embolização. Use o valor do fluxo sanguíneo antes da embolização como o valor da linha de base.
- Selecione quatro ROIs e meça a alteração relativa do fluxo sanguíneo cerebral em cada ROI, expressa como a variação percentual do valor da linha de base.
4. Detecção da posição da rosca em animais pequenos RM
- Use os seguintes parâmetros de imagem t2 -ponderados (T2WI) para o sistema de ressonância magnética: tempo de eco (TE) = 33 ms, tempo de repetição (TR) = 3000 ms, número de excitação (NEX) = 4, Fatias = 28, espessura da fatia = 0,8 mm, tamanho da matriz = 256 * 256 mm2, ângulo de lançamento = 80°, campo de visão (FOV) = 30 * 30 mm2, tempo de varredura = 6 min 24 s; os parâmetros de angiografia de ressonância magnética (MRA) foram definidos da seguinte forma: TE = 4,4 ms, TR = 12 ms, NEX = 4, fatias = 80, espessura da fatia = 0,4 mm, tamanho da matriz = 256 * 256 mm2, ângulo de lançamento = 80°, FOV = 30 * 30 mm2, tempo de varredura = 16 min 23 seg 40 ms.
- Corrija o animal na tabela de ressonância magnética, calibrar a posição cerebral por meio do posicionamento e realize a varredura da sequência T2WI e MRA após confirmar a posição.
- Use anestesia contínua através da máquina de anestesia animal durante a detecção. Em seguida, eutanize os ratos SD por injeção intraperitoneal de pentobarbital excessivo.
- Aquisição de imagem e pós-processamento: após a coleta dos dados da imagem, a fim de observar o estado do plugue de rosca no SSS com mais clareza, use o método de aprimoramento de pseudo cor para exibir a imagem T2WI do cérebro de rato.
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Representative Results
Para estabelecer o modelo SSS-thrombosis SD-rat através do método de sutura, a sutura deve ser preparada com antecedência(Figura 1A), e os equipamentos necessários para o experimento(Figura 1B) devem ser preparados. Devido à natureza delicada da operação, a preparação do modelo precisa ser concluída sob um microscópio dissecando. Os principais passos são mostrados na Figura 2. Para facilitar a descrição dos detalhes específicos da observação do fluxo sanguíneo do modelo, a Figura 3B marca a área observacional de fluxo sanguíneo, a janela óssea e o ponto de partida, e também mostra o estado do plugue inserido na SSS(Figura 3C). Após a conclusão da preparação do modelo, a imagem de fluxo sanguíneo com manchas a laser é usada para detectar o fluxo sanguíneo na superfície cerebral dos ratos SD(Figura 4A, B). A Figura 4C mostra que o fluxo sanguíneo nas veias SSS e ponte (BVs) foi diminuído significativamente em comparação com os da artéria cerebral média (MCA) e capilares (CAPs). Em seguida, a ressonância magnética de animais pequenos é usada para detectar o estado do plugue de rosca no SSS a partir da posição horizontal(Figura 5A),posição sagital(Figura 5B)e posição coronal(Figura 5C). As imagens mostram que o plugue de rosca está no lugar, o que confirma a embolização do SSS.
Figura 1. Imagem de embolia de rosca e condições experimentais. (A) Imagem da embolia de rosca auto-feita (a: cabeça de embolia de rosca, b: corpo de embolia de rosca). Barra de escala = 5 mm. (B) Equipamento principal necessário para este experimento. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. Os principais passos do modelo SSS-thrombosis SD-rat. (A) Fixar os dedos dos membros traseiros do rato SD com fórceps para verificar anestesia bem sucedida. (B) Fixar o rato SD em um dispositivo estereotaxic e esterilizar a superfície na parte superior da cabeça. (C)Corte a pele. (D) Retire a fáscia superior e o periósteo, e exponha totalmente o crânio. (E) Perfurar e polir a área de observação e o crânio da janela óssea até que os vasos sanguíneos estejam claramente visíveis. (F) Remova cuidadosamente os fragmentos ósseos na janela óssea com fórceps para evitar rasgar a SSS. (G) Selecione um plugue de rosca adequado. (H) Use uma agulha de seringa para perfurar o ponto de tomada e inserir o plugue da rosca rapidamente. (I) Ajuste o ângulo entre o plugue da rosca e o SSS. (J) Insira a sutura lentamente. (K) até que a ponta atinja a borda posterior da confluência sinusa. (L) Suturar o couro cabeludo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3. Observação e operação de ratos SD. (A) Marcos anatômicos do crânio superior de ratos SD foram exibidos para facilitar a localização da SSS (a: bregma, b: bregma posterior). (B) A área vermelha arredondada-retangular é a área de observação do fluxo sanguíneo, e a área azul arredondada-retangular é a janela óssea. A área circular vermelha é o ponto de partida, e a seta aponta para o seio sagital superior. (C) Estado do plugue inserido no SSS a partir do ponto de tomada (seta azul). A seta branca aponta para o corpo do plugue, enquanto a seta vermelha aponta para a cabeça do fio. Barra de escala = 2 mm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4. Comparação do fluxo sanguíneo antes e depois da inserção da embolia da rosca. Imagem de fluxo sanguíneo com manchas a laser do fluxo sanguíneo cerebral de ratos SD(A)antes e (B) após embolização. A coluna azul-a-vermelha à direita representa a gama de valores de fluxo sanguíneo de pequeno para grande. Em (A),o ROI selecionado está marcado (a: SSS, b: BV, c: MCA, d: CAP). (C) É mostrado um gráfico de barras de fluxo sanguíneo relativo cerebral (CBF). A análise unidirecional da variância revelou diminuição significativa do fluxo sanguíneo no SSS e no BV (# P <0.001 vs. MCA e CAP; * P <0.001 vs. MCA e CAP). Barra de escala = 1 mm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5. Resultados de verificação da ressonância magnética. A ressonância magnética de animais pequenos mostra o estado do plugue de rosca (mostrado pela seta preta) nas posições SSS da horizontal (A),sagital (B)e coronal(C). Barra de escala = 2 mm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Modelo animal CVST | Limitações |
| modelo simples de ligadura SSS | dano córtex cerebral, permanentemente ocluído |
| Modelo de acelerador de injeção interna SSS | dano do córtex cerebral, recanalizar espontaneamente, tempo isquêmico e localização imprecisos |
| modelo de trombose SSS induzida por cloreto férrico | dano córtex cerebral, recanalizar espontaneamente |
| modelo de trombose SSS induzido por fotoquímico | dano córtex cerebral, recanalizar espontaneamente |
| modelo de embolia auto-feita | dano córtex cerebral, permanentemente ocluído, operações complicadas |
Tabela 1: Desvantagens dos modelos animais CVST.
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Discussion
Neste estudo, um novo tipo de modelo CVST foi estabelecido com sucesso inserindo um plugue de rosca auto-fabricado no SSS de ratos SD. Além disso, imagens de fluxo sanguíneo com manchas a laser e ressonância magnética de pequenos animais foram combinadas para monitorar alterações no fluxo sanguíneo na superfície cerebral de ratos SD antes e depois da embolização, a fim de padronizar o tempo isquêmico e a localização.
Em 1989, Longa et al. fizeram um modelo de oclusão mca reversível inserindo retrógradamente uma sutura de nylon auto-feita na artéria carótida externa dos ratos12. Para melhorar a estabilidade deste modelo, vários métodos aprimorados foram introduzidos13. Este modelo de oclusão MCA permite o tempo isquêmico preciso e a localização, é fácil de recanalizar, e tem sido amplamente utilizado em pesquisas básicas que investigam o derrame arterial cerebral14,15. No presente estudo, baseado no desenho do modelo MCAO, foi estabelecido um novo modelo CVST inserindo um plugue de rosca auto-fabricado no centro da posição inicial do SSS.
Para elucidar os mecanismos patogênicos do CVST, uma variedade de modelos animais foram estabelecidos e implementados(Tabela 1). O modelo simples de ligadura SSS não pode evitar danos ao córtex cerebral do animal6,7. O modelo de SSS-thrombosis induzido por cloreto férrico também inevitavelmente causa danos ao córtex cerebral do animal devido à toxicidade do cloreto férrico9. Como modelo alternativo, um plugue de rosca pode ser inserido no SSS, a fim de evitar completamente o contato com o córtex cerebral, o que pode ajudar a mitigar qualquer dano cortical. O modelo SSS internal-injection-accelerator utiliza um método fotoquímico para induzir trombose com a possibilidade de recanalização8; este modelo usa um plugue de linha de nylon auto-fabricado para induzir embolização confiável em um local fixo. A embolia usada no modelo de embolia-oclusão auto-fabricada é difícil de estabelecer, o que aumenta o dano às células endoteliais vasculares e não pode ser recanalizado11. O plugue de rosca auto-fabricado usado neste modelo é feito de fio de nylon e gel de sílica. Esses materiais possuem uma textura flexível e uma superfície relativamente lisa, que minimizam os danos causados pelo próprio material ao córtex cerebral e às células endoteliais SSS durante o processo de modelagem. Existem diferenças individuais no diâmetro do SSS em ratos SD. Para excluir a influência deste parâmetro, a especificação do plugue de rosca é determinada com base nos dados obtidos a partir de múltiplas medições do SSS e da experiência operacional. Além disso, tal lesão se recupera facilmente após a retirada do plugue, o que proporciona a possibilidade de recanalização subsequente do SSS.
Este presente estudo estabeleceu com sucesso um novo modelo CVST que minimizava os danos, possibilitava uma controlabilidade precisa e dava boa estabilidade. Além disso, a ressonância magnética de animais pequenos e imagens de fluxo sanguíneo com manchas a laser foram combinadas para verificar a estabilidade do modelo e avaliar o sangue cerebral antes e depois da embolização. Juntos, os presentes achados e protocolos fornecem uma base para estudos mais aprofundados que exploram a ocorrência, o desenvolvimento e os mecanismos fisiodológicos relacionados do CVST.
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Disclosures
Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.
Acknowledgments
Este estudo foi apoiado pela Grant Scientific Research Foundation for the High-Level Talents, Fujian University of Traditional Chinese Medicine (X2019002-talents).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2 mL syringe | Becton,Dickinson and Company | 301940 | |
| brain stereotaxic instrument | Shenzhen RWD Life Technology Co., Ltd | 68025 | |
| dissecting microscope | Wuhan SIM Opto-technology Co. | SIM BFI-HR PRO | |
| high-speed skull drill | Shenzhen RWD Life Technology Co., Ltd | 78046 | |
| laser-speckle blood-flow imaging system | Wuhan SIM Opto-technology Co. | SIM BFI-HR PRO | |
| needle holder | Shenzhen RWD Life Technology Co., Ltd | F31022-12 | |
| needle thread | Shenzhen RWD Life Technology Co., Ltd | F33303-08 | |
| scissors | Shenzhen RWD Life Technology Co., Ltd | S13029-14 | |
| silica gel | Heraeus Kulzer | 302785 | |
| small animal anesthesia machine | Shenzhen RWD Life Technology Co., Ltd | R540 | |
| small-animal MRI | Bruker Medical GmbH | Biospec 94/30 USR | |
| tweezers | Shenzhen RWD Life Technology Co., Ltd | F11029-11 | |
| vascular forceps | Shenzhen RWD Life Technology Co., Ltd | F22003-09 |
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