Denne metode kan bruges til at undersøge sarkomforkortelser ved hjælp af pluripotente stamcelleafledte kardiomyocytter med fluorescerende-mærkede sarkomproteiner.
Pluripotente stamcelleafledte kardiomyocytter (PSC-CMs) kan fremstilles af både embryonale og inducerede pluripotente stamceller (ES/iPS). Disse celler giver lovende kilder til hjertesygdom modellering. For kardiomyopatier er sarkomere afkortning en af de standard fysiologiske vurderinger, der bruges sammen med voksne kardiomyocytter til at undersøge deres sygdomsphoenotyper. De tilgængelige metoder er imidlertid ikke egnede til at vurdere PSC-CMs’ kontraktilitet, da disse celler har underudviklede sarkomenter, der er usynlige under fasekontrastmikroskopi. For at løse dette problem og udføre sarkomforkortelse med PSC-CMs blev der anvendt fluorescerende tagged sarkomproteiner og fluorescerende live-imaging. Tynde Z-linjer og en M-line opholde sig i begge ender og i midten af en sarkom, henholdsvis. Z-line proteiner — α-Actinin (ACTN2), Telethonin (TCAP) og actin-associeret LIM-protein (PDLIM3) — og et M-line protein — Myomesin-2 (Myom2) — blev mærket med fluorescerende proteiner. Disse mærkede proteiner kan udtrykkes fra endogene alleler som knock-ins eller fra adeno-associerede vira (AAV’er). Her introducerer vi metoderne til at differentiere mus og menneskelige pluripotente stamceller til kardiomyocytter, til at producere AAV’er og til at udføre og analysere live-imaging. Vi beskriver også metoderne til fremstilling af polydimethylsiloxan (PDMS) frimærker til en mønstret kultur af PSC-CMs, som letter analysen af sarkomere afkortning med fluorescerende-mærkede proteiner. For at vurdere sarkomforkortelse blev time-lapse-billeder af de bankende celler optaget med en høj framerate (50-100 billeder i sekundet) under elektrisk stimulering (0,5-1 Hz). For at analysere sarkomlængden i løbet af cellesammentrækning blev de optagede time-lapse-billeder udsat for SarcOptiM, en plug-in til ImageJ / Fiji. Vores strategi giver en enkel platform til undersøgelse af hjertesygdomme fænotyper i PSC-CMs.
Hjerte-kar-sygdomme er den hyppigste årsag til dødelighed på verdensplan1 og kardiomyopati udgør den tredje årsag til hjerte-relaterede dødsfald2. Kardiomyopati er en kollektiv gruppe af sygdomme, der påvirker hjertemusklerne. Den seneste udvikling af inducerede pluripotente stamceller (iPS) og den rettet differentiering af iPS-celler mod kardiomyocytter (PSC-CMs) har åbnet døren for at studere kardiomyocytter med patientgenom som en in vitro-model af kardiomyopati. Disse celler kan bruges til at forstå patofysiologien af hjertesygdomme, til at belyse deres molekylære mekanismer og til at teste forskellige terapeutiske kandidater3. Der er en enorm interesse, således patient-afledte iPS celler er blevet genereret (f.eks hypertrofisk kardiomyopati [HCM]4,5, arytmogenic højre ventrikulær kardiomyopati [ARVC]6, udvidede kardiomyopati [DCM]7, og mitokondrie-relaterede kardiomyopatier8,9). Fordi et af kendetegnene ved kardiomyopati er dysfunktion og forstyrrelse af sarkomenter, er der brug for et gyldigt værktøj, der ensartet måler sarkomfunktion.
Sarkomere afkortning er den mest anvendte teknik til at vurdere sarkomfunktion og kontraktiliteten af voksne kardiomyocytter afledt af dyremodeller og mennesker. For at udføre sarkomforkortende, er veludviklede sarkomere, der er synlige under fasekontrast, påkrævet. PSC-CMs dyrkede imidlertid in vitro-display underudviklede og uorganiserede sarkomenter og kan derfor ikke bruges til korrekt at måle sarkomforkortelser10. Denne vanskelighed ved at foretage en korrekt vurdering af PSC-CMs ‘ kontraktilitet hindrer deres brug som platform til vurdering af hjertefunktioner in vitro. For indirekte at vurdere PSC-CMs-kontraktilitet er der anvendt mikroskopi af atomkraft, mikro-post-arrays, mikroskopi og impedansmålinger til måling af virkningerne af den bevægelse, som disse celler udøver på deres omgivelser11,12,13. Mere sofistikerede og mindre invasive videomikroskopioptagelser af faktisk cellulær bevægelse (f.eks. SI8000 fra SONY) kan bruges til alternativt at vurdere deres kontraktilitet, men denne metode måler ikke direkte sarkomere bevægelse eller kraftgenerering kinetik14.
For direkte at måle sarkom bevægelse i PSC-CMs, nye tilgange, såsom fluorescerende-tagging til sarkomere protein, er ved at opstå. For eksempel bruges Lifeact til at mærke filamentous actin (F-actin) til at måle sarkom bevægelse15,16. Genetisk modificerede iPS-celler er en anden mulighed for tagging af sarkomproteiner (f.eks. α-actinin [ACTN2] og Myomesin-2 [MYOM2]) med fluorescerende protein17,18,19.
I dette papir beskriver vi, hvordan man udfører time-lapse imaging til måling af sarkomforkortelser ved hjælp af Myom2-TagRFP (musefosterstamceller [ES] og ACTN2-mCherry (humane iPS-celler). Vi viser også, at en mønstret kultur letter sarkomere tilpasning. Derudover beskriver vi en alternativ metode til sarkommærkning ved hjælp af adeno-associerede vira (AAV’er), som i vid udstrækning kan anvendes på patientafledte iPS-celler.
PSC-CMs har et stort potentiale til at blive brugt som en in vitro platform til model hjertesygdom og til at teste virkningerne af narkotika. Ikke desto mindre skal der først etableres en nøjagtig og ensartet metode til vurdering af PSC-CMs-funktioner. De fleste af funktionelle tests arbejder med PSC-CMs, f.eks elektrofysiologi, calcium forbigående, og stofskifte26, og en af de første patient-afledte PSC-CM undersøgelser handlede om lang-QT syndrom27. Men kont…
The authors have nothing to disclose.
Vi vil gerne anerkende alle laboratoriemedlemmer i Afdelingen for Regenerativ Medicin ved Jichi Medical University for den nyttige diskussion og teknisk bistand. Denne undersøgelse blev støttet af tilskud fra Japan Agency for Medical Research and Development (AMED; JP18bm0704012 og JP20bm0804018), Japan Society for the Promotion of Science (JSPS; JP19KK0219), og den japanske Circulation Society (Grant for Basic Research) til H.U.
1-Thioglycerol | Sigma-Aldrich | M6145-25 | |
2-Mercaptoethanol (55mM) | Thermo Fisher Scientific | 21985-023 | |
2-methacryloyloxyethyl phosphorylcholine (MPC) polymer, | NOF Corp. | LIPIDURE-CM5206 | |
2-Propanol | Fujifilm wako | 166-04836 | |
35-mm imaging dish with a polymer coverslip (µ-Dish 35 mm, high) | ibidi | 81156 | |
AAVproR Helper Free System (AAV6) (vectors; pHelper, pRC6, pAAV-CMV-Vector) |
Takara | 6651 | |
ACTN2-mCherry (AR12, AR21) hiPSCs | N.A. | We inserted IRES-puromycin resistant casette to 3' UTR of TNNT2 locus and mCherry around the stop codon of ACTN2 in 610B1 hiPSC line, following a method describe elsewhere (Anzai, Methods Mol Biol, in press) | |
B-27 Supplement (50X), serum free | Thermo Fisher Scientific | 17504-044 | |
B-27 Supplement, minus insulin | Thermo Fisher Scientific | A18956-01 | |
B27 supplement (50X), minus Vitamin A | Thermo Fisher Scientific | 12587-010 | |
Benzonase (25 U/µL) | Merck Millipore | 70746 | |
Blasticidin S Hydrochloride | Fujifilm wako | 029-18701 | |
BMP-4, Human, Recombinant, | R&D Systems, Inc. | 314-BP-010 | |
Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A4503-100g | |
C59, Wnt Antagonist (WntC59) | abcam | ab142216 | |
CAD drawing software, | Robert McNeel and Associates, WA, USA | Rhinoceros 6.0 | |
Centrifugal ultrafiltration unit (100k MWCO), Vivaspin-20 | Sartorius | VS2042 | |
CHIR99021 | Cayman | 13122 | |
Chromium etchant | Nihon Kagaku Sangyo Co., Ltd., Japan | N14B | |
Chromium mask coated with AZP1350 | Clean Surface Technology Co., Japan | CBL2506Bu-AZP | |
Dr. GenTLE Precipitation Carrier (20mg/mL Glycogen, 3 M Sodium Acetate (pH 5.2)) | Takara | 9094 | |
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) – high glucose | Sigma-Aldrich | D6429-500 | |
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) – high glucose, without sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | D5796 | |
Ethanol (99.5) | Fujifilm wako | 057-00456 | |
Fetal Bovine Serum | Moregate | 59301104 | |
FGF-10, Human, Recombinant, | R&D Systems, Inc. | 345-FG-025 | |
Fibroblast Growth Factor(basic), human, recombinant | Fujifilm wako | 060-04543 | |
Gelatin from porcine skin powder | Sigma-Aldrich | G1890-100g | |
Glasgow Minimum Essential Medium (GMEM) | Sigma-Aldrich | G5154-500 | |
GLASS BOTTOM culture plates | MatTek | P24G-1.5-13-F/H | |
Ham’s F-12 | Thermo Fisher Scientific | 11765-062 | |
Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) | Thermo Fisher Scientific | 12440-061 | |
L-alanine-L-glutamine (GlutaMAX Supplement, 200mM) | Thermo Fisher Scientific | 35050-061 | |
L(+)-Ascorbic Acid Sodium Salt | Fujifilm wako | 196-01252 | |
Laminin-511 E8 fragment (LN511-E8, iMatrix-511) | Nippi | 892012 | |
Mask aligner | Union Optical Co., Ltd., Japan | PEM-800 | |
Maskless lithography tool | NanoSystem Solutions, Inc., Japan | D-Light DL-1000 | |
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) | Thermo Fisher Scientific | 11140-050 | |
Millex-HV Syringe Filter Unit, 0.45 µm, PVDF (0.45-µm filter) | Merck Millipore | SLHVR33RS | |
Myom2-RFP (SMM18) | N.A. | Developed in our previous paper (Chanthra, Sci Rep, 2020) | |
N-2 Supplement (100X) | Thermo Fisher Scientific | 17502-048 | |
ORCA-Flash4.0 V3 digital CMOS camera | Hamamatsu | C13440-20CU | |
PD0325901 | Stemgent | 04-0006-10 | |
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | |
Petri dish | Sansei medical co. Ltd | 01-004 | |
Phenol/Chloroform/Isoamyl alcohol (25:24:1) | Nippon Gene | 311-90151 | |
Polydimethylsiloxane (PDMS) elastomer | Dow Corning Corp., MI, USA | SILPOT 184 | |
polyethylenimine MAX (MW. 40,000) | Polyscience | 24765-1 | |
Positive photoresist developer | Tokyo Ohka Kogyo Co., Ltd., Japan | NMD-3 | |
PowerUp SYBR Green Master Mix | Thermo Fisher Scientific | A25742 | |
Proteinase K | Takara | 9034 | |
Puromycin Dihydrochloride | Fujifilm wako | 166-23153 | |
Recombinant Human/Mouse/Rat Activin A Protein | R&D Systems, Inc. | 338-AC-050 | |
Recombinant trypsin-like protease (rTrypsin; TrypLE express) | Thermo Fisher Scientific | 12604-039 | |
RPMI1640 Medium | Thermo Fisher Scientific | 11875-119 | |
Silicon wafer | Matsuzaki Seisakusyo Co., Ltd., Japan | N.A. | |
Sodium Pyruvate (100 mM) | Thermo Fisher Scientific | 11360-070 | |
Spin-coater | Mikasa Co., Ltd., Japan | MS-A100 | |
Spininng confocal microscopy | Oxford Instruments | Andor Dragonfly Spinning Disk System | |
StemSure LIF, Mouse, recombinant, Solution (10^6U) | Fujifilm wako | 195-16053 | |
SU-8 3010 | Kayaku Advanced Materials, Inc., MA, USA | SU-8 3010 | |
SU-8 developer | Kayaku Advanced Materials, Inc., MA, USA | SU-8 developer | |
Tris-EDTA | Nippon Gene | 314-90021 | |
Vascular Endothelial Growth Factor-A165(VEGF), Human, recombinant | Fujifilm wako | 226-01781 |