Encurtamento sarcomere de Cardiomiócitos Derivados de Células-Tronco Pluripotentes usando Proteínas Sarcomere marcadas por fluorescentes.
Summary
Este método pode ser usado para examinar o encurtamento do sarcomere usando cardiomiócitos pluripotentes derivados de células-tronco com proteínas de sarcomere marcadas por fluorescentes.
Abstract
Cardiomiócitos derivados de células-tronco pluripotentes (PSC-CMs) podem ser produzidos a partir de células pluripotentes embrionárias e induzidas (ES/iPS). Essas células fornecem fontes promissoras para a modelagem de doenças cardíacas. Para cardiomiopatias, o encurtamento de sarcomere é uma das avaliações fisiológicas padrão que são usadas com cardiomiócitos adultos para examinar seus fenótipos da doença. No entanto, os métodos disponíveis não são apropriados para avaliar a contratude dos PSC-CMs, uma vez que essas células têm sarcomeres subdesenvolvidos que são invisíveis sob microscopia de contraste de fase. Para abordar essa questão e realizar o encurtamento de sarcomere com PSC-CMs, foram utilizadas proteínas de sarcomere com marca fluorescente e imagens vivas fluorescentes. Linhas Z finas e uma linha M residem em ambas as extremidades e no centro de um sarcomere, respectivamente. As proteínas de linha Z — α-Actinin (ACTN2), Teletonina (TCAP) e proteína LIM associada à actina (PDLIM3) — e uma proteína de linha M — Myomesin-2 (Myom2) — foram marcadas com proteínas fluorescentes. Essas proteínas marcadas podem ser expressas a partir de alelos endógenos como knock-ins ou de vírus associados ao Adeno (AAVs). Aqui, introduzimos os métodos para diferenciar células-tronco pluripotentes de camundongos e humanos aos cardiomiócitos, produzir AAVs e realizar e analisar imagens ao vivo. Descrevemos também os métodos de produção de selos de polidimtilsiloxano (PDMS) para uma cultura padronizada de PSC-CMs, o que facilita a análise do encurtamento de sarcomere com proteínas fluorescentes marcadas. Para avaliar o encurtamento do sarcomere, as imagens de lapso de tempo das células batidas foram registradas em uma taxa de quadros alta (50-100 quadros por segundo) sob estimulação elétrica (0,5-1 Hz). Para analisar o comprimento do sarcomere ao longo da contração celular, as imagens gravadas de lapso de tempo foram submetidas ao SarcOptiM, um plug-in para ImageJ/Fiji. Nossa estratégia fornece uma plataforma simples para investigar fenótipos de doenças cardíacas em PSC-CMs.
Introduction
As doenças cardiovasculares são a principal causa de mortalidade em todo o mundo1 e a cardiomiopatia representa a terceira causa de mortes cardíacas2. Cardiomiopatia é um grupo coletivo de doenças que afetam os músculos cardíacos. Os recentes desenvolvimentos de células-tronco pluripotentes induzidas (iPS) e a diferenciação direcionada das células iPS em direção aos cardiomiócitos (PSC-CMs) abriram a porta para o estudo de cardiomiócitos com genoma do paciente como modelo in vitro de cardiomiopatia. Essas células podem ser utilizadas para entender a fisiopatologia de doenças cardíacas, para elucidar seus mecanismos moleculares e testar diferentes candidatos terapêuticos3. Há uma enorme quantidade de interesse, assim, células iPS derivadas do paciente têm sido geradas (por exemplo, cardiomiopatia hipertrófica [HCM]4,5, cardiomiopatia ventricular direita arrhythmogênica [ARVC]6, cardiomiopatia dilatada [DCM]7, e cardiomiopatias relacionadas à mitocondrial8,9). Como uma das características da cardiomiopatia é a disfunção e a interrupção dos sarcomeres, é necessária uma ferramenta válida que mede uniformemente a função sarcomere.
O encurtamento de Sarcomere é a técnica mais utilizada para avaliar a função de sarcomere e a contratilidade de cardiomiócitos adultos derivados de modelos animais e humanos. Para realizar o encurtamento de sarcomere, são necessários sarcomeres bem desenvolvidos que sejam visíveis sob contraste de fase. No entanto, os PSC-CMs cultivados in vitro exibem sarcomeres subdesenvolvidos e desorganizados e, portanto, não podem ser usados para medir adequadamente o encurtamento de sarcomere10. Essa dificuldade de avaliar adequadamente a contrateriedade dos PSC-CMs dificulta seu uso como plataforma para avaliar funções cardíacas in vitro. Para avaliar a contratilidade do PSC-CMs indiretamente, microscopia de força atômica, micro-matrizes pós-postes, microscopia de força de tração e medidas de impedância têm sido utilizadas para medir os efeitos do movimento exercido por essas células em seus arredores11,12,13. Gravações de vídeo-microscopia mais sofisticadas e menos invasivas do movimento celular real (por exemplo, SI8000 da SONY) podem ser usadas para avaliar alternativamente sua contratilidade, no entanto, este método não mede diretamente o movimento sarcomere ou força a geração cinética14.
Para medir diretamente o movimento do sarcomere em PSC-CMs, novas abordagens, como a marcação fluorescente à proteína sarcomere, estão surgindo. Por exemplo, lifeact é usado para rotular fisomotos actin (F-actin) para medir o movimento sarcomere15,16. Células iPS geneticamente modificadas são outra opção para a marcação de proteínas sarcomere (por exemplo, α-actinin [ACTN2] e Myomesin-2 [MYOM2]) por proteína fluorescente17,18,19.
Neste artigo, descrevemos como realizar imagens de lapso de tempo para medir o encurtamento de sarcomere usando myom2-TagRFP (células embrionárias de tronco de camundongo [ES] e ACTN2-mCherry (células iPS humanas). Também mostramos que uma cultura padronizada facilita o alinhamento do sarcomere. Além disso, descrevemos um método alternativo de rotulagem de sarcomere, usando vírus associados ao adeno (AAVs), que pode ser amplamente aplicado às células iPS derivadas do paciente.
Protocol
Representative Results
Discussion
Os PSC-CMs têm grande potencial para serem utilizados como uma plataforma in vitro para modelar doenças cardíacas e testar os efeitos das drogas. No entanto, um método preciso e unificado para avaliar as funções do PSC-CMs deve ser primeiro estabelecido. A maioria dos testes funcionais funciona com PSC-CMs, por exemplo, eletrofisiologia, transitório de cálcio e metabolismo26, e um dos primeiros estudos de PSC-CM derivados do paciente foi sobre a síndrome de QT longo<sup class="xr…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gostaríamos de reconhecer todos os membros do laboratório da Divisão de Medicina Regenerativa da Universidade Médica de Jichi pela discussão e assistência técnica úteis. Este estudo foi apoiado pelas bolsas da Agência japonesa de Pesquisa e Desenvolvimento Médico (AMED; JP18bm0704012 e JP20bm0804018), a Sociedade Japonesa para a Promoção da Ciência (JSPS; JP19KK0219), e a Sociedade de Circulação Japonesa (a Bolsa para Pesquisa Básica) para a H.U.
Materials
| 1-Thioglycerol | Sigma-Aldrich | M6145-25 | |
| 2-Mercaptoethanol (55mM) | Thermo Fisher Scientific | 21985-023 | |
| 2-methacryloyloxyethyl phosphorylcholine (MPC) polymer, | NOF Corp. | LIPIDURE-CM5206 | |
| 2-Propanol | Fujifilm wako | 166-04836 | |
| 35-mm imaging dish with a polymer coverslip (µ-Dish 35 mm, high) | ibidi | 81156 | |
| AAVproR Helper Free System (AAV6) (vectors; pHelper, pRC6, pAAV-CMV-Vector) |
Takara | 6651 | |
| ACTN2-mCherry (AR12, AR21) hiPSCs | N.A. | We inserted IRES-puromycin resistant casette to 3' UTR of TNNT2 locus and mCherry around the stop codon of ACTN2 in 610B1 hiPSC line, following a method describe elsewhere (Anzai, Methods Mol Biol, in press) | |
| B-27 Supplement (50X), serum free | Thermo Fisher Scientific | 17504-044 | |
| B-27 Supplement, minus insulin | Thermo Fisher Scientific | A18956-01 | |
| B27 supplement (50X), minus Vitamin A | Thermo Fisher Scientific | 12587-010 | |
| Benzonase (25 U/µL) | Merck Millipore | 70746 | |
| Blasticidin S Hydrochloride | Fujifilm wako | 029-18701 | |
| BMP-4, Human, Recombinant, | R&D Systems, Inc. | 314-BP-010 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A4503-100g | |
| C59, Wnt Antagonist (WntC59) | abcam | ab142216 | |
| CAD drawing software, | Robert McNeel and Associates, WA, USA | Rhinoceros 6.0 | |
| Centrifugal ultrafiltration unit (100k MWCO), Vivaspin-20 | Sartorius | VS2042 | |
| CHIR99021 | Cayman | 13122 | |
| Chromium etchant | Nihon Kagaku Sangyo Co., Ltd., Japan | N14B | |
| Chromium mask coated with AZP1350 | Clean Surface Technology Co., Japan | CBL2506Bu-AZP | |
| Dr. GenTLE Precipitation Carrier (20mg/mL Glycogen, 3 M Sodium Acetate (pH 5.2)) | Takara | 9094 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) – high glucose | Sigma-Aldrich | D6429-500 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) – high glucose, without sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | D5796 | |
| Ethanol (99.5) | Fujifilm wako | 057-00456 | |
| Fetal Bovine Serum | Moregate | 59301104 | |
| FGF-10, Human, Recombinant, | R&D Systems, Inc. | 345-FG-025 | |
| Fibroblast Growth Factor(basic), human, recombinant | Fujifilm wako | 060-04543 | |
| Gelatin from porcine skin powder | Sigma-Aldrich | G1890-100g | |
| Glasgow Minimum Essential Medium (GMEM) | Sigma-Aldrich | G5154-500 | |
| GLASS BOTTOM culture plates | MatTek | P24G-1.5-13-F/H | |
| Ham’s F-12 | Thermo Fisher Scientific | 11765-062 | |
| Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) | Thermo Fisher Scientific | 12440-061 | |
| L-alanine-L-glutamine (GlutaMAX Supplement, 200mM) | Thermo Fisher Scientific | 35050-061 | |
| L(+)-Ascorbic Acid Sodium Salt | Fujifilm wako | 196-01252 | |
| Laminin-511 E8 fragment (LN511-E8, iMatrix-511) | Nippi | 892012 | |
| Mask aligner | Union Optical Co., Ltd., Japan | PEM-800 | |
| Maskless lithography tool | NanoSystem Solutions, Inc., Japan | D-Light DL-1000 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) | Thermo Fisher Scientific | 11140-050 | |
| Millex-HV Syringe Filter Unit, 0.45 µm, PVDF (0.45-µm filter) | Merck Millipore | SLHVR33RS | |
| Myom2-RFP (SMM18) | N.A. | Developed in our previous paper (Chanthra, Sci Rep, 2020) | |
| N-2 Supplement (100X) | Thermo Fisher Scientific | 17502-048 | |
| ORCA-Flash4.0 V3 digital CMOS camera | Hamamatsu | C13440-20CU | |
| PD0325901 | Stemgent | 04-0006-10 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | |
| Petri dish | Sansei medical co. Ltd | 01-004 | |
| Phenol/Chloroform/Isoamyl alcohol (25:24:1) | Nippon Gene | 311-90151 | |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) elastomer | Dow Corning Corp., MI, USA | SILPOT 184 | |
| polyethylenimine MAX (MW. 40,000) | Polyscience | 24765-1 | |
| Positive photoresist developer | Tokyo Ohka Kogyo Co., Ltd., Japan | NMD-3 | |
| PowerUp SYBR Green Master Mix | Thermo Fisher Scientific | A25742 | |
| Proteinase K | Takara | 9034 | |
| Puromycin Dihydrochloride | Fujifilm wako | 166-23153 | |
| Recombinant Human/Mouse/Rat Activin A Protein | R&D Systems, Inc. | 338-AC-050 | |
| Recombinant trypsin-like protease (rTrypsin; TrypLE express) | Thermo Fisher Scientific | 12604-039 | |
| RPMI1640 Medium | Thermo Fisher Scientific | 11875-119 | |
| Silicon wafer | Matsuzaki Seisakusyo Co., Ltd., Japan | N.A. | |
| Sodium Pyruvate (100 mM) | Thermo Fisher Scientific | 11360-070 | |
| Spin-coater | Mikasa Co., Ltd., Japan | MS-A100 | |
| Spininng confocal microscopy | Oxford Instruments | Andor Dragonfly Spinning Disk System | |
| StemSure LIF, Mouse, recombinant, Solution (10^6U) | Fujifilm wako | 195-16053 | |
| SU-8 3010 | Kayaku Advanced Materials, Inc., MA, USA | SU-8 3010 | |
| SU-8 developer | Kayaku Advanced Materials, Inc., MA, USA | SU-8 developer | |
| Tris-EDTA | Nippon Gene | 314-90021 | |
| Vascular Endothelial Growth Factor-A165(VEGF), Human, recombinant | Fujifilm wako | 226-01781 |
References
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