Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

Gebruik van het GAL4-UAS-systeem voor functionele genetica in Anopheles gambiae

Published: April 15, 2021 doi: 10.3791/62131
Automatic Translation
1, 1, 1,2,3, 1, 1, 1, 1
1Department of Vector Biology, Liverpool School of Tropical Medicine, 2IMBB FORTH, 3Department of Biology, University of Crete

Summary

Het bipartiete GAL4-UAS systeem is een veelzijdig instrument voor modificatie van genexpressie op een gecontroleerde spatiotemporale manier die functionele genetische analyse in Anopheles gambiae mogelijk maakt. De beschreven procedures voor het gebruik van dit systeem zijn een semi-gestandaardiseerde kloonstrategie, seksing en screening van poppen op fluorescerende eiwitmarkers en embryofixatie.

Abstract

Het bipartiete GAL4-UAS systeem is een veelzijdig en krachtig hulpmiddel voor functionele genetische analyse. De essentie van het systeem is het kruisen van transgene 'driver'-lijnen die de gisttranscriptiefactor GAL4 op een weefselspecifieke manier tot expressie brengen, met transgene 'responder'-lijnen die een kandidaat-gen / RNA-interferentieconstruct dragen waarvan de expressie wordt gecontroleerd door Upstream Activation Sequences (UAS) die GAL4 binden. In het daaropvolgende nageslacht wordt het gen of de uitschakelingsconstruct dus op een voorgeschreven spatiotemporale manier tot expressie gebracht, waardoor de resulterende fenotypen kunnen worden getest en de genfunctie kan worden afgeleid. Het binaire systeem maakt flexibiliteit mogelijk in experimentele benaderingen van schermfenotypen gegenereerd door transgene expressie in meerdere weefselspecifieke patronen, zelfs als ernstige fitnesskosten worden geïnduceerd. We hebben dit systeem aangepast voor Anopheles gambiae, de belangrijkste malariavector in Afrika.

In dit artikel geven we enkele van de meest voorkomende procedures die worden gebruikt tijdens GAL4-UAS-analyse. We beschrijven de An. gambiae GAL4-UAS-lijnen die al zijn gegenereerd, evenals het klonen van nieuwe responderconstructies voor upregulatie en RNAi knockdown. We specificeren een stapsgewijze handleiding voor het seksen van muggenpoppen om genetische kruisingen vast te stellen, die ook screening van nakomelingen omvat om overerving van fluorescerende genmarkers te volgen die de driver en responder inserties taggen. We presenteren ook een protocol voor het opruimen van An. gambiae embryo's om de embryonale ontwikkeling te bestuderen. Ten slotte introduceren we mogelijke aanpassingen van de methode om driverlijnen te genereren door CRISPR / Cas9-insertie van GAL4 stroomafwaarts van doelgenen.

Introduction

Het bipartiete GAL4-UAS-systeem is het werkpaard van functionele karakterisering van genen in het insectenmodelorganisme Drosophila melanogaster1,2,3. Om het GAL4-UAS-systeem te gebruiken, worden transgene driverlijnen, die de gisttranscriptiefactor GAL4 onder controle van een regulerende sequentie tot expressie brengen, gekruist met responderlijnen die een gen van belang of RNA-interferentie (RNAi) -construct dragen dat wordt bestuurd door een Upstream Activation Sequence (UAS) erkend door GAL4. Het nageslacht van dit kruis drukt het transgen van belang uit in een spatiotemporaal patroon gedicteerd door de promotor die gal4-expressie controleert (figuur 1). Fenotypen die worden weergegeven door nakomelingen van driver-responder-kruisingen kunnen worden beoordeeld om de functie van kandidaatgenen op te helderen. Hoewel D. melanogaster is gebruikt om genen van andere organismen te onderzoeken4,5,6,7, is het GAL4-UAS-systeem nu aangepast voor gebruik bij insecten van medisch en agrarisch belang om directe analyse te bieden in de soorten van belang 8,9,10,11,12,13,14.

In de Afrikaanse malariamug Anopheles gambiae werd het GAL4-UAS-systeem voor het eerst getest door cellijn co-transfection9. Meerdere constructies werden getest op efficiëntie in verschillende paarsgewijze combinaties en ontdekten dat 14 gelijktijdig herhaalde UAS aangevuld met een kleine kunstmatige intron (UAS-14i) het breedste bereik van activeringspotentieel vertoonden bij gebruik met een paneel van GAL4-drivers. Om in vivo functionaliteit aan te tonen, werden deze constructies vervolgens gebruikt om twee afzonderlijke transgene An. gambiae-lijnen te creëren door PiggyBac transformation8: een driverlijn met GAL4 aangedreven door een midgut-specifieke promotor, en een responderlijn met zowel de luciferase- als de enhanced yellow fluorescent protein (eYFP) -genen onder regulatie van UAS-sequenties. Darmspecifieke luciferaseactiviteit en fluorescentie in het nageslacht gaven aan dat het systeem efficiënt was in Anopheles. Sindsdien zijn driverlijnen gemaakt die transgenen tot expressie brengen in andere weefsels die belangrijk zijn voor vectoriële capaciteit en insecticideresistentie, waaronder oenocyten15 en hemocyten16, en in een bijna alomtegenwoordig patroon10. Talrijke UAS-lijnen zijn ook gegenereerd om genen te testen waarvan wordt gedacht dat ze betrokken zijn bij metabolisme en sequestratie gemedieerde insecticideresistentie, cuticulaire koolwaterstofsynthese en om fluorescerend verschillende cel- en weefseltypen te taggen (tabel 1). Voor de responderlijnen wordt nu site-gerichte integratie van het transgen uitgevoerd door ΦC31 gekatalyseerde recombinatiecassette-uitwisseling17,18 om de genomische context van de UAS-gereguleerde genen te fixeren. Op deze manier wordt transgenexpressie genormaliseerd met betrekking tot de locatie van genomische insertie, waardoor een nauwkeurigere vergelijking van de fenotypische effecten van verschillende kandidaatgenen mogelijk is.

De responderlijnen die tot nu toe zijn gemaakt, zijn ontworpen om het transgen op verhoogde niveaus tot expressie te brengen of om genexpressie te verminderen door RNA-interferentie (RNAi). Gewoonlijk worden cDNA-klonen gefuseerd met de UAS-sequentie om geschikte expressieplasmiden te genereren, maar volledige genomische sequenties zijn ook haalbaar, ervan uitgaande dat ze niet te groot zijn om te klonen. Om dempingsconstructies te genereren, hebben we drie verschillende methoden gebruikt om geschikte tandem-omgekeerde sequenties te verkrijgen die haarspeld-dsRNA vormen dat RNAi stimuleert. Deze omvatten fusie-PCR, asymmetrische PCR en commerciële synthese van haarspeldconstructies. Gemeenschappelijk aan elke methode is de opname van een intronsequentie tussen de omgekeerde sequenties om kloonstabiliteit te bieden. Responderplasmiden waarin een gen van belang/RNAi-construct kan worden ingebracht, zijn ontwikkeld15. Deze plasmiden dragen ook de vereiste ΦC31 attB-locaties voor RMCE (beschreven in Adolfi bijgaand JoVE-artikel waarin de RCME-techniek in detail wordt beschreven). Protocollen met betrekking tot de belangrijke stappen die nodig zijn bij het selecteren van de volgorde voor inbrenging in een van deze plasmiden voor overexpressie zijn opgenomen in dit manuscript. Daarnaast worden twee protocollen voor het maken van RNAi-haarspeldconstructies beschreven en geïllustreerd.

Bij het creëren van nieuwe lijnen is de identificatie van zeldzame transgene individuen cruciaal om uit te fokken om transgene kolonies te vestigen en te onderhouden. Het belangrijkste voor het GAL4-UAS-systeem is dat het noodzakelijk is om de responder- en driverlijnen te onderscheiden om kruisen vast te stellen en individuele nakomelingen te identificeren die beide transgenen dragen. Dit wordt bereikt door gebruik te maken van verschillende dominante selecteerbare markergenen die zijn gekoppeld aan de driver- en respondercassettes. Meestal zijn dit fluorescerende markergenen die duidelijk te onderscheiden zijn met behulp van optische filters (bijv. eYFP, eCFP, dsRed). Het is belangrijk dat markers worden uitgedrukt in een bekend en betrouwbaar spatiotemporaal patroon, omdat dit de identificatie van afwijkingen en besmetting gemakkelijker maakt. Fluorescerende markergenexpressie wordt routinematig gereguleerd door de synthetische 3xP3-promotor , die oog- en ventrale gangliaspecifieke expressie veroorzaakt in alle stadia van an. gambiae ontwikkeling19. Fluorescerende markers gecontroleerd door 3xP3 zijn opgenomen in alle transformatieplasmiden die in dit artikel worden beschreven. Een protocol met de gebruikelijke methoden die worden gebruikt om fluorescerende An. gambiae poppen GAL4-UAS-lijnen te screenen, is hier opgenomen.

Een van de belangrijkste elementen van het GAL4-UAS-systeem is de noodzaak om de differentieel gemarkeerde driver- en responderlijnen te overschrijden. Om dit te doen, moeten mannetje en vrouwtjes van elke lijn worden gescheiden voorafgaand aan de paring. Volwassenen zijn gemakkelijk te onderscheiden door zicht, maar voor het vaststellen van genetische kruisingen is het verstandig om de geslachten te scheiden vóór de opkomst van de volwassene om ervoor te zorgen dat de paring niet heeft plaatsgevonden. Het algemene grootteverschil tussen mannelijke en vrouwelijke An. gambiae poppen is te variabel om een efficiënte en betrouwbare methode voor geslachtsbepaling te zijn20. In plaats daarvan bieden duidelijke morfologische verschillen in de uitwendige genitaliën een betrouwbare basis voor seks bij An. gambiae. In dit artikel beschrijven we een betrouwbare methode voor het seksen van An. gambiae poppen om geschikte kruisingen op te zetten.

Figure 1
Figuur 1 - Schematische weergave van het proces voor het gebruik van het bipartiete GAL4-UAS-systeem in Anopheles gambiae. (A) De belangrijkste componenten van een voorbeeldvector (pSL-attB-UAS14-gyp[3xp3-eYFP]) worden afgebeeld, met details over de beschikbare beperkingslocaties (EcoRI, NheI, XhoI en NcoI) binnen de meerdere kloonlocaties die geschikt zijn voor gebruik om de haarspeldconstructie of coderende sequentie voor het betreffende gen in te voegen. Ook de structuur van de doklijn is afgebeeld. (B) De kruisingsstap is geïllustreerd met vermelding van het gebruik van mannetjes van de bestuurderslijn (met GAL4-driver door een promotor van belang en eCFP bestuurd door de 3xP3-promotor) en vrouwtjes van de responderlijn (met het gen van belang of haarspeldconstructie gecontroleerd door een UAS-promotor en een eYFP-marker gecontroleerd door de 3xP3-promotor). (C) Een schematische weergave van GAL4-drijvende expressie van het gen dat van belang is voor het nageslacht van de kruising in B en een lijst van enkele van de typische fenotypen die worden beoordeeld. Afkortingen: Multiple Cloning Site (MCS), Recombinase mediated cassette exchange (RMCE), Upstream Activator Sequence (UAS), enhanced yellow fluorescent protein (eYFP), enhanced cyan fluorescent protein (eCFP). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Het is het gebruik van kruisen dat de bipartiete aard van het GAL4-UAS-systeem biedt, dat duidelijke voordelen heeft ten opzichte van meer lineaire benaderingen. Zo kunnen er veel meer combinaties van driver- en responderlijnen worden beoordeeld dan haalbaar zou zijn als voor elke promotor/gencombinatie een nieuwe transgene lijn zou moeten worden gegenereerd en onderhouden. Wat nog belangrijker is, het maakt de analyse mogelijk van genen die dodelijke of steriele fenotypes produceren wanneer hun expressie wordt verstoord en die moeilijk te creëren / onderhouden zijn in een lineair systeem. Dergelijke dodelijke fenotypen kunnen zich in alle ontwikkelingsstadia manifesteren, afhankelijk van de genfunctie en spatiotemporale expressie, maar worden meestal waargenomen tijdens de embryonale ontwikkeling. Het visualiseren van de ontwikkeling van muggenembryo's vereist het opruimen van het ondoorzichtige chorion dat de eieren bedekt. Volgens methoden beschreven in Trpiš (1970) 21 en Kaiser et al. (2014) 22, beschrijven we de protocollen die we gebruiken om embryo's te fixeren, met behoud van structurele integriteit, en bleken om het endochorion te verwijderen dat microscopische visualisatie en beeldvorming mogelijk maakt.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Ontwerp en bouw van UAS-constructies

  1. Ontwerp en assemblage van vectoren voor kandidaat-genexpressie
    1. Bepaal de sequentie die moet worden gebruikt voor de upregulatie van kandidaat-genen.
      1. Sequentieer het cDNA/gDNA uit de stam van belang en vergelijk het met de gepubliceerde sequentie om de identiteit te verifiëren en potentiële SNP's en beperkingsplaatsen voor diagnostische digest te identificeren.
      2. Zorg ervoor dat de voorwaartse primer die wordt gebruikt voor genversterking de oorspronkelijke Kozak-sequentie bedekt en begin codon, indien van toepassing. Een primer met ~10 bp binding stroomopwaarts van het startcodon zal de Kozak-sequentie omvatten.
      3. Neem in de meeste omstandigheden het stopcodon op in het fragment dat is versterkt door de omgekeerde primer. Gebruik 3'-beëindigingssequenties in de beschreven plasmidevectoren of versterk van kandidaat-gengen genomische sequenties.
      4. Bestel desgewenst commerciële sequenties met specifieke codon bias.
    2. Gebruik standaard subcloning-procedures om gencassettes in te brengen in UAS-plasmidevectoren, bijvoorbeeld pSL-attB-UAS14-gyp[3xP3-eYFP]15 (figuur 1) voor zowel upregulatie- als RNAi-constructies.
    3. Produceer transgene muggen gemaakt met behulp van ΦC31 recombinatie gemedieerde cassette-uitwisseling10,17,18,23.
  2. Creatie van RNAi haarspeldconstructies: single step amplification met behulp van asymmetrische PCR15,24
    1. Extract genomisch DNA (gDNA) van volwassen vrouwtje An. gambiae die het gewenste kandidaat-gen draagt met behulp van de Livak-methode25.
      1. Ontwerp de voorwaartse primer om te binden om exon te richten op de 5 ' van het gewenste fragment gericht op het naburige intron. Ontwerp het 3'-uiteinde van een brugprimer om te binden aan het einde van het voorgaande exon om het intron te versterken. Het 5'-uiteinde is complementair aan een klein fragment van het doelexon direct na het intron.
    2. Voer een asymmetrische PCR-reactie uit zoals beschreven in Xiao (2006)24 (figuur 2).
    3. Kloon het gezuiverde PCR-product tot een geschikte vector die de UAS-promotor draagt (bijv. pSL-attB-UAS14-gyp[3xP3-eYFP]15).
      OPMERKING: Enzymen binnen de meervoudige kloonplaats die geschikt zijn voor het klonen van pSL-attB-UAS14-gyp[3xP3-eYFP]15 en de volgende vereiste stappen zijn aangegeven in figuur 1. Enkelvoudige enzymvertering is essentieel omdat er slechts één restrictieplaats wordt toegevoegd. Defosforylering van het plasmide zal de kloonefficiëntie verbeteren.
  3. Bouw van RNAi haarspeldconstructies: Fusion PCR van cDNA en gDNA15
    1. Extract genomisch DNA (gDNA) van volwassen vrouwtje An. gambiae die het gewenste kandidaat-gen draagt met behulp van de Livak-methode25.
      1. Neem gDNA op in een PCR-reactie om het doelgebied van de exon- en intronsequenties samen te versterken (figuur 2).
      2. Ontwerp het 3'-uiteinde van de voorwaartse primer om te binden aan de omgekeerde doelexonsequentie om te versterken naar de doelintronsequentie en het 5'-uiteinde om een restrictieplaats te dragen om het klonen te vergemakkelijken.
      3. Ontwerp omgekeerde primer (1) om te binden aan het 5'-uiteinde van het intron en de 5'-eindoverhang draagt de eerste bases van de voorwaartse reeks van het naburige exon. Deze overhang wordt gebruikt in de fusie PCR.
      4. Zuiver het gewenste reactieproduct.
    2. Extract RNA, verwijder DNA met behulp van DNase's en bereid cDNA voor van volwassen vrouwelijke An. gambiae die het gewenste kandidaat-gen draagt volgens de protocollen van de fabrikant.
    3. Gebruik cDNA in een PCR-reactie om alleen het doelgebied van het exon te versterken (figuur 2).
      1. Ontwerp voorwaartse primer (2) zodat het 3'-uiteinde bindt aan het 3'-uiteinde van de complementaire doelexonsequentie en het 5'-uiteinde van de primer een restrictieplaats heeft voor gebruik bij het klonen.
        OPMERKING: De voorwaartse primer van 1.3.1.2 kan opnieuw worden gebruikt in deze tweede reactie. Dit betekent echter dat een enkele enzymvertering essentieel is. Het gebruik van een tweede voorwaartse primer met een andere restrictieplaats maakt dubbele vertering mogelijk, wat de kloonefficiëntie kan verhogen.
      2. Ontwerp omgekeerde primer (2) - het 3'-uiteinde bindt aan het 5'-uiteinde van het naburige exon dat het doelexon versterkt. Het 5'-uiteinde bindt aan het 3'-uiteinde van de intronsvoorste streng. Deze overhang wordt gebruikt in de fusie PCR.
      3. Zuiver het gewenste reactieproduct.
    4. Neem de producten van stap 1.3.1 en 1.3.2 op als sjablonen voor een fusie-PCR-reactie met standaardconcentraties met Forward primers 1 en 2. Zuiver het gewenste product.
    5. Verteer het gezuiverde product om de overstekken voor klonen te genereren. Kloon in een geschikte vector stroomafwaarts van UAS-promotor. Geschikte enzymen voor het klonen van pSL-attB-UAS14-gyp[3xP3-eYFP] en de volgende vereiste stappen zijn aangegeven in figuur 1.

Figure 2
Figuur 2 - Schematische weergave van de creatie van RNAi-constructies voor insertie in pSL-attB-UAS14-gyp[3xP3-eYFP] met twee methoden: (A) Eenstaps asymmetrische PCR (aangepast van Xiao. Y H et al (2006) en (B) meerstaps fusie PCR. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. 

2. Een screening van gambiae poppen

  1. Verzameling poppen voor microscopische karakterisering
    OPMERKING: In deze protocollen verwijst water naar gedestilleerd water aangevuld met 0,01% vijverzout.
    1. Achterste An. gambiae muggen met behulp van standaardprotocollen (bijv. MR426) tot popstadium.
      LET OP: Zorg ervoor dat u poppen tijdens dit proces niet verwondt.
    2. Verzamel poppen op een heldere platte schaal die geschikt is voor gebruik met een stereomicroscoop (bijvoorbeeld een plastic petrischaaltje van 100 x 15 mm, waarbij de randen worden vermeden).
      OPMERKING: Om poppen te verzamelen, gebruiken we een plastic Pasteur-pipet van 3 ml met ongeveer 10 mm gesneden uit het uiteinde om het uiteinde te verbreden en letsel aan de muggen te voorkomen. Screening en seksing kan worden voltooid op individuen, maar dit is erg traag. Het wordt aanbevolen om screening en seks uit te voeren op groepen van 50-200 poppen (de grootte van de mogelijke groep wordt beperkt door de grootte van het gebruikte gerecht en is afhankelijk van persoonlijke voorkeur). Als een groot aantal wordt gescreend, kan de efficiëntie worden verhoogd door eerst poppen ongeveer 4 tot 5 diep in lijnen uit te lijnen en de doelpoppen uit deze lijn te verplaatsen.
    3. Verwijder met behulp van een Pasteur-pipet voorzichtig bijna al het water rond de poppen. Laat net genoeg water rond poppen zodat ze effectief immotiel zijn, maar gemakkelijk kunnen worden verplaatst met een fijne borstel. Als ze moeilijk te verplaatsen worden, voeg dan meer water toe.
      OPMERKING: Wanneer voldoende water is verwijderd, zullen de poppen op hun zij liggen, waardoor visualisatie van de ogen mogelijk is voor fluorescentiedetectie en identificatie van dimorfe genitaliën (figuur 4DE).
      LET OP: Zorg ervoor dat poppen niet uitdrogen. Als er slechts een zeer klein volume water overblijft, kan het verder verminderen met de warmte van de lamp van de microscoop en bij splitsing tussen poelen poppen. Soms moet tijdens het proces extra water worden toegevoegd met behulp van een Pasteur-pipet van 3 ml aan de gewenste groep (en).
  2. Identificatie van fluorescerende markers in poppen
    OPMERKING: Het gebruik van een stereoscoop met lage vergroting maakt breedveldscreening mogelijk, sorteren kan worden gedaan op een omgekeerde samengestelde microscoop, maar moet individueel worden gedaan.
    1. Bij het screenen op een fluorescerende marker is het eerst cruciaal om de verwachte patronen van expressie en overerving te kennen. Overweeg het volgende:
      1. Kleur(en): bepaal welke filter(s) de expressie moet(en) visualiseren.
      2. Spatiotemporaal expressiepatroon: Begrijp waar en in welke levensfase je expressie verwacht te zien.
      3. Verhouding van verschillende fenotypen: bepaal welk percentage van de bevolking de markers van belang moet dragen.
    2. Voer fluorescerende screening uit in het donker, omdat zelfs weinig licht de resolutie van fluorescentie kan verstoren. Gebruik echter een lamp naast de stereoscoop wanneer licht nodig is voor andere manipulaties.
      LET OP: Zorg ervoor dat de werkruimte rond de fluorescerende stereoscoop vrij is voordat u de lichten uitschakelt.
    3. Zet de fluorescentielamp aan en laat opwarmen gedurende de door de fabrikant aanbevolen periode (normaal gesproken 10-15 minuten). Selecteer het gewenste filter op de fluorescerende stereoscoop en controleer of er een gekleurde lichtstraal zichtbaar is die op het midden van de podiumplaat is gericht. Als dit niet zichtbaar of erg zwak is, is de fluorescentielamp mogelijk niet volledig opgewarmd, is de sluiter gesloten of is de microscoopoptiek niet goed uitgelijnd.
    4. Gebruik wit licht, centreer de poppen in het gezichtsveld en breng ze in beeld. Deze vergroting moet mogelijk worden gewijzigd bij het schakelen tussen verschillende filters, afhankelijk van de fluorescentie-intensiteit.
    5. Het gebruik van een fijne detaillering verfkwast zorgt ervoor dat de onderzochte poppen elkaar niet overlappen.
    6. Schakel het witte licht van de stereoscoop uit en gebruik de fijne focus om het gebied van de poppen met het fenotype van belang in beeld te brengen. Het fluorescerende patroon moet zichtbaar zijn. Voorbeelden van 3xP3 promotor-gecontroleerde fluorescentie zijn te vinden in figuur 3.
      1. Gebruik de laagste vergroting waarbij het verwachte fluorescerende fenotype betrouwbaar kan worden onderscheiden van personen zonder fluorescen.
      2. Gebruik voor stammen met heldere fluorescentie ook een helder veldlicht met lage intensiteit tijdens het screenen, als het fluorescerende signaal nog steeds duidelijk identificeerbaar is.
      3. Wanneer de primaire screening is voltooid, scant u snel populaties onder andere filters om potentiële besmetting te detecteren.
        LET OP: Zorg ervoor dat er een duidelijke afstand is tussen de groepen gesorteerde poppen om besmetting door poppenbewegingen te voorkomen. Houd er rekening mee dat de grootte van de groepen zal veranderen naarmate poppen worden gesekst en dat afstanden groter kunnen lijken wanneer ze onder vergroting kijken. Wees vooral voorzichtig wanneer de zwembaden niet binnen het gezichtsveld liggen.

Figure 3
Figuur 3 - Anopheles gambiae poppen die fluorescerende markers uitdrukken die worden aangedreven door de 3xP3 promotor (A) eYFP, (B) dsRed en (C) eCFP. Vergroting: A=16X, B,C=20X.

  1. Sexing Poppen
    1. Verzamel poppen. Verwijder overtollig water, maar zorg voldoende zodat de anale peddels iets van de genitaliën scheiden om visualisatie en morfologische karakterisering te bevorderen (figuur 4D, E).
    2. Als een pop / e niet op hun kant zijn, gebruik dan een fijne detailverfkwast om de pop voorzichtig te draaien en de anale peddels te bewegen zodat uitwendige genitaliën kunnen worden geïdentificeerd.
    3. Afzonderlijke poppen op basis van onderscheidende uitwendige genitaliën; mannetjes hebben een lange buis die uit het laatste dorsale segment ongeveer de helft van de lengte van de anale peddels extrudeert (figuur 4B). De uitwendige genitaliën van vrouwelijke poppen zijn aanzienlijk korter en splitsen zich (figuur 4A).
      OPMERKING: Soms, als het 4e instar larvale exoskelet blijft zitten of de uitwendige genitaliën beschadigd zijn (figuur 4C), is een betrouwbare identificatie van het geslacht moeilijker. Wanneer het geslacht van een pop niet duidelijk is, is het het beste om het weg te gooien. Als het individu moet worden gehouden, moet de pop geïsoleerd tevoorschijn kunnen komen en moet het geslacht ervan worden bepaald met behulp van volwassen morfologische kenmerken. Het is waarschijnlijk dat als de genitaliën beschadigd zijn, het individu mogelijk niet met succes paren.
    4. Maak een zwembad voor elk geslacht aan de andere kant van het gerecht naar het ongesekste zwembad en beweeg geïdentificeerde poppen over het gerecht met behulp van een fijne detaillering verfkwast. Label de onderkant van de schotel waar de twee zwembaden zullen worden verzameld om ze later te identificeren.
    5. Wanneer zowel sexing als fluorescerende screening vereist is, voer dan eerst fluorescerende screening uit, omdat dit het snellere proces van de twee is.

Figure 4
Figuur 4 - Sexing Anopheles gambiae poppen. Individuele poppen die wijzen op de uitwendige genitaliën van (A) een vrouwtje (B) een mannetje en (C) een individu dat niet gemakkelijk kan worden geïdentificeerd als gevolg van onvolledige loslating van het larvale exoskelet. Vergrote afbeeldingen hieronder die de uitwendige genitaliën benadrukken. Poppen met ♀ (vrouwelijk) en ♂ (mannelijk) die de uitwendige genitaliën van poppen aangeven met (D) ~ 50% van de poppen ondergedompeld in water en met (E) al het water verwijderd, wat het verschil in visualisatie van de uitwendige genitaliën benadrukt. Vergroting: A,B,C=40x, D,E=30x. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

  1. Seksbevestiging als volwassenen
    1. Totdat een zeer laag foutenpercentage is aangetoond, bevestig poppenseks door volwassen morfologie na opkomst. Scheid gesekste poppen in groepen van 10 of minder in een heldere buis van 20 ml met een paar ml water, sluit af met een bolletje watten, gelabeld met het verwachte geslacht en laat 's nachts tevoorschijn komen.
      OPMERKING: Aangezien volwassenen de volgende ochtend worden overgebracht, is het niet nodig om opkomende volwassenen van voedsel te voorzien.
    2. Bevestig het geslacht van opkomende volwassenen met behulp van morfologische kenmerken de volgende dag.
    3. Als er mannetjes aanwezig zijn in de vrouwelijke collecties, gooi de vrouwtjes dan weg, voor het geval de paring al heeft plaatsgevonden.
    4. Als er vrouwtjes aanwezig zijn in de mannelijke verzameling, verwijder dan de vrouw (en) en houd de mannetjes voor kruising.
  2. Gal4-UAS-systeemkruisen instellen
    1. Zuig het gewenste aantal mannelijke en vrouwelijke volwassenen uit de buizen in stap 2.4 in een kooi of kleine emmer die op de standaardmanier voor an. gambiae-opfok is opgesteld.
      OPMERKING: Zorg ervoor dat u de volwassenen niet beschadigt tijdens deze overdracht.
    2. Gebruik ongeveer 50 vrouwtjes met een gelijk aantal mannetjes, wanneer ~ 2000 volwassenen nodig zijn van het nageslacht.
      OPMERKING: Wanneer een kruis meerdere keren moet worden gevoerd om meerdere batches te genereren, kan maximaal 200 van elk geslacht worden opgesteld in kooien van 30 cm x 30 cm x 30 cm. Wanneer slechts een klein aantal vrouwtjes (<20) beschikbaar is voor het kruis, voegen we ~ 4x het aantal mannetjes toe om de kans op een succesvolle paring te vergroten.
    3. Bloed voedt de gekruiste vrouwtjes en achterste nakomelingen naar het juiste stadium, volgens standaardprotocollen26, om fenotypische beoordeling uit te voeren (bijv. Insecticideresistentie, vectoriële capaciteit en fitnesskostentests).
    4. Wanneer het maternale effect van transgenexpressie waarschijnlijk is, stelt u wederkerige kruisingen van de driver- en responderlijnen in en test u het verwachte fenotype.
      OPMERKING: Kruisingen met behulp van 'heterozygote' of gemengde populaties van driver- en responderlijnen, produceren nakomelingen met elk van de 4 mogelijke genotypen. Dit biedt wild type, UAS alleen en GAL4 alleen controles, evenals de transheterozygoten GAL4-UAS waarmee fenotype te analyseren. Als homozygote populaties worden gekruist, stel dan extra kruisingen in om geschikte controles te bieden om fenotypen te vergelijken. Het nageslacht moet worden gescreend zoals hierboven het scheiden van nakomelingen die zowel of slechts een van beide markers, evenals negatieven dragen, voor fenotypische beoordeling.
  3. Het vaststellen van homozygote populaties uit lijnen gegenereerd door RCME met alternatieve fluorescerende markers
    OPMERKING: Het is essentieel dat de fluorescerende marker van beide lijnen op dezelfde genomische locatie aanwezig is en dat ze volledig te onderscheiden zijn.
    1. Stel een ouderkruis op van ongeveer 200 volwassenen met gelijke aantallen differentieel gemarkeerde mannetjes van de ene lijn en vrouwtjes van de andere lijn na screening om personen te selecteren die de juiste fluorescentie en geslacht vertonen, zoals hierboven beschreven. Ongeveer een week later voedt bloed het kruis met behulp van vastgestelde protocollen26.
      1. Fok het F1-nageslacht om poppen te maken met behulp van standaardprotocollen en verzamel poppen zoals eerder beschreven.
    2. Screen voor fluorescentie met selectie van degenen die beide ouderlijke markers dragen (transheterozygoot). Zet een F1 kruising op met deze poppen.
    3. Een week later voedt het bloed de F1-vrouwtjes en achterste nakomelingen naar het popstadium volgens standaardprotocollen.
    4. Scherm de F2-poppen en selecteer de poppen die SLECHTS één van de markeringen weergeven. Deze zullen homozygoot zijn voor het inbrengen. Slechts 25% van het nageslacht zal homozygoot zijn voor elke inbrenging, dus zorg ervoor dat er voldoende nakomelingen worden grootgebracht om een voorraadkooi te bieden (400-500).
      OPMERKING: De selectie van transheterozygote nakomelingen moet volledig rigoureus zijn, anders wordt het proces besmet en kan volledige homozygositeit niet worden bereikt. Controleer alle nakomelingen die zijn geselecteerd voor de F1-intercross.

3. Een protocol voor het opruimen van embryo's

  1. Bloedtoevoer en -onderhoud
    1. Achtervolgende An. gambiae muggen aan volwassenen volgens standaardprotocollen (bijv. MR4).
    2. Bloed voedt 5-7 dagen oude vrouwelijke volwassenen, zodat de meeste volledig zijn opgezwollen.
      LET OP: In dit hele protocol is snel werken essentieel om ervoor te zorgen dat eieren niet mogen uitdrogen.
  2. Geïnduceerde ei leggen
    1. 3 dagen na bloedtoevoer eieren verzamelen door geïnduceerd leggen.
    2. Monteer de ovipositiekamer.
      1. Vul de ovipositiepot met water tot een diepte van ongeveer 5 mm. Bevestig de pot aan het ene uiteinde van een polypropyleen buis van 50 ml, vooraf gesneden met een ijzerzaag zodat beide uiteinden open zijn. (We gebruiken een plastic schijf voor een pot (figuur 5); in plaats daarvan kan echter het originele deksel van de buis worden gebruikt).
      2. Bedek het andere uiteinde van de gesneden polypropyleenbuis met materiaal (slang/panty's) of delen van latexhandschoen die met een elastische band zijn vastgezet, zodat volwassenen kunnen worden ingebracht maar niet kunnen ontsnappen (figuur 5). Andere alternatieve ovipositiekamerontwerpen bestaan en kunnen worden gebruikt26.
    3. Introduceer voorzichtig 10-15 vrouwtjes (bloed gevoed in stap 3.1.2) in de ovipositiekamer. Bedek de ovipositiekamer om duisternis te produceren en laat 20 minuten staan.
      LET OP: Vermijd het verplaatsen van de ovipositiepot zodra de eieren zijn gelegd om stranding en uitdroging van eieren te voorkomen.
    4. Maak de polypropyleenbuis van 50 ml voorzichtig los van de ovipositiepot, terwijl u ervoor zorgt dat de muggen niet vrijkomen. Witte eieren moeten zichtbaar zijn. Controleer of er voldoende zijn gelegd voor verboden doeleinden. Herhaal indien nodig.
    5. Dek de pot af (voor stofbescherming) en laat eieren rijpen tot het ontwikkelingsstadium van belang.
    6. Gebruik een fijne detailleringskwast om eieren uit de pot te halen en leg ze op water in een uitgegraven glasblok van 40 mm2.

Figure 5
Figuur 5 - Voorbeeld van een Ovipositiekamer (A) gedemonteerd om de componenten te markeren en (B) geassembleerd. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. 

  1. Embryo Fixing
    LET OP: Voer alle bevestigingsstappen (stap 3.3) uit in een zuurkast vanwege het gebruik van formaldehyde.
    1. Bereid FAA-oplossing zoals beschreven in Kaiser et al. (2014)22. FAA bestaat uit 3,6 M formaldehyde, 0,87 M azijnzuur en 8,5 M absolute ethanol tot volume gemaakt met gedestilleerd water (dH2O).
      1. Combineer voor 10 ml FAA 2,68 ml 13,42 m formaldehyde, 4,96 ml 17,14 m ethanol en 0,5 ml 17,4 m azijnzuur met 1,86 ml gedestilleerd H2O. Fixatief kan ten minste 3 maanden worden bewaard in een goed afgesloten glazen container, bewaard in een aangewezen chemische kast.
    2. Verwijder voorzichtig het water uit het glazen blok met een micropipette en dek de eieren af met 500 μL FAA en oscilleer zachtjes (~ 25 RPM) op een orbitale shaker bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten. Er is op dit punt geen kleurverandering zichtbaar.
    3. Spoel eieren grondig af met gedestilleerd water. Spoel 15 keer om alle sporen van formaldehyde te verwijderen. Gebruik een micropipette van 1000 μL en verwijder deze en verwijder vervolgens 1 ml dH2O per keer om ervoor te zorgen dat de eieren daarbij niet worden beschadigd.
    4. Bewaar afvalwater van spoelingen in een aangewezen formaldehyde-afvalcontainer voor verwijdering volgens de veiligheidsrichtlijnen.
    5. Op dit punt kunnen vaste eieren 's nachts bij 4 °C in water worden bewaard om ze gehydrateerd te houden.
  2. Embryo bleken
    LET OP: Voer alle bleekstappen (stap 4) uit in een zuurkast vanwege de mogelijke afgifte van chloorgas wanneer natriumhypochloriet en azijnzuur worden gecombineerd.
    1. Bereid bleekoplossing (Trpiš-oplossing - beschreven in Trpiš (1970)21 en gewijzigd volgens Kaiser et al. (2014)22). Trpiš oplossing is 0,59 M natriumhypochloriet en 0,35 M azijnzuur opgelost in gedestilleerd H2O.
      1. Combineer voor een 10 ml ovolume Trpiš-oplossing 2,68 ml 2,2 m natriumhypochloriet en 0,2 ml 17,4 m azijnzuur met 7,12 ml gedestilleerd H2O.
        OPMERKING:Trpiš-oplossing kan ten minste 3 maanden worden bewaard in een goed afgesloten glazen container en worden bewaard in een veilige chemische kast. De oplossing moet mogelijk na opslag worden vortexed en moet altijd in een zuurkast worden geopend in geval van afgifte van chloorgas.
    2. Bedek vaste eieren met 1 ml Trpiš-oplossing en incubeer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. Eieren beginnen bleke vlekken te ontwikkelen na ongeveer 5 minuten incubatie en bereiken uiteindelijk een melkwitte kleur zodra ze zijn gewist.
    3. Spoel de eieren zoals in stap 3.3.3 om de Trpiš-oplossing te verwijderen.
    4. Bewaar afvalwater in een aangewezen afvalcontainer en gooi het overtollige water in de afvoer.
  3. Opslag
    1. Bewaren in 500 μL dH2O en enkele dagen bewaren tussen 2-8 °C. Verwijder het grootste deel van het water zorgvuldig voordat u het bekijkt en op massa afbeeldt, maar vermijd uitdroging van de eieren door een klein volume water in het horlogeglas te laten. Dit zal het fotograferen van de eieren niet verstoren. Individuele eieren kunnen op microscoopglaasjes worden geplaatst voor beeldvorming met een hogere vergroting.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

3xP3-expressie van eYFP, dsRed en eCFP biedt betrouwbare, gemakkelijk te onderscheiden identificatie van individuen die de markergenen bezitten die expressie in ogen en ventrale ganglia van An. gambiae poppen produceren (figuur 3). De differentiële morfologie waargenomen in mannelijke en vrouwelijke uitwendige genitaliën die worden gebruikt voor seksing en een voorbeeld van een niet-identificeerbare poppen worden benadrukt in figuur 4. Het verwijderen van al het water uit poppen verhoogt de seksingsmoeilijkheden omdat anale peddels de visualisatie van genitaliën verduisteren (figuur 4D, E). Het bipartiete GAL4-UAS-systeem maakt modificatie van genexpressie mogelijk op een gecontroleerde spatio-temporele manier die kan worden gevisualiseerd door de alomtegenwoordige (Figuur 6A,C) en oenocytendriver (Figuur 6B,D) lijnen te kruisen met de responderlijn UAS-mCD8:mCherry10. De morfologische kenmerken waargenomen in verschillende stadia van embryonale ontwikkeling op 12, 24 en 36 uur na het leggen zijn duidelijk na voltooiing van protocol nummer 3 (figuur 7).

Figure 6
Figuur 6 - Weefselspecifieke expressievisualisatie. (A, B) Larven en (C, D) volwassenen die mCherry tot expressie brengen, aangedreven door (A, C) alomtegenwoordige en (B, D) eicelspecifieke driverlijnen. Vergroting: A,B=32X, C=25X, D=40X. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 7
Figuur 7 - Embryo Clearing Voorbeeld resultaten. Beelden van embryo's volgens het beschreven protocol (A) 12, (B) 24 en (C) 36 uur na ovipositie en (D) een mislukte poging met behulp van huishoudelijk bleekmiddel waarbij overbleken verkleuring en barsten van embryo's veroorzaakte. Vergroting: 50x. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Type Lijn Tevreden 3xP3 stift Beschrijving Bron
Responder mCherry UAS-mCD8:mCherry eCFP, eYFP Drukt de mCherry-coderingsvolgorde uit wanneer deze wordt gekruist met een bestuurderslijn Adolfi. A et al (2018)
16i UAS-RNAi cyp4g16 eYFP Bevat een RNAi-haarspeldconstruct dat zich richt op cyp4g16 dat wordt uitgedrukt en knockdown van cyp4g16 veroorzaakt wanneer het wordt gekruist met een driverlijn Lynd. A et al (2020)
17i UAS-RNAi cyp4g17 eYFP Bevat een RNAi-haarspeldconstruct dat zich richt op cyp4g17 dat wordt uitgedrukt en knockdown van cyp4g17 veroorzaakt wanneer het wordt gekruist met een driverlijn Lynd. A et al (2020)
M2 UAS-cyp6m2 eYFP Drukt cyp6m2 uit wanneer gekruist met een bestuurderslijn Adolfi. A et al (2019)
P3 UAS-cyp6p3 eYFP Drukt cyp6p3 uit wanneer gekruist met een bestuurderslijn Adolfi. A et al (2019)
E2 UAS-GSTe2 eYFP Drukt GSTe2 uit wanneer deze wordt gekruist met een bestuurderslijn Adolfi. A et al (2019)
Sap2 UAS-Sap2 eYFP Drukt Sap2 uit wanneer deze wordt gekruist met een bestuurderslijn Ingham. V et al (2019)
FAS1899i UAS-RNAi FAS1899 eYFP Bevat een RNAi-haarspeldconstructie die zich richt op FAS1899 die wordt uitgedrukt en knockdown van FAS1899 veroorzaakt wanneer deze wordt gekruist met een driverlijn Grigoraki. L et al (2020)
3050i UAS-RNAi Desat3050 eYFP Bevat een RNAi-haarspeldconstructie die zich richt op Desat3050 die wordt uitgedrukt en knockdown van Desat3050 veroorzaakt wanneer deze wordt gekruist met een driverlijn Grigoraki. L et al (2020)
Wnd UAS-eYFPnls-luc eCFP Bij kruising met een GAL4-lijn wordt eYFP uitgedrukt. Gegenereerd met piggybac (MR4-code: MRA-1165) Lynd. A et al (2011) ·
Mbl UAS-eYFPnls-luc eCFP Bij kruising met een GAL4-lijn wordt eYFP uitgedrukt. Gegenereerd met piggybac (MR4-code: MRA-1164) Lynd. A et al (2011) ·
Docking A11 VG-LRIM1 eCFP Het dragen van de vereiste attP docking sites die nodig zijn voor ΦC31 gemedieerde cassette-uitwisseling Lynd.A et al (2019)
Bestuurder + Docking A10 Ubi-A10 GAL4 eCFP Bevat de transcriptiefactor GAL4-coderende sequentie gecontroleerd door het An. gambiae Polyubiquitin-c (PUBc) gen. Bevat ook de attP docking sites die nodig zijn voor ΦC31 gemedieerde cassette-uitwisseling Adolfi. A et al (2018)
Chauffeur Gareth Oenocyt enhancer-GAL4 dsRed Drukt GAL4 uit, gecontroleerd door een eicelspecifieke versterker Lynd. A et al (2012) ·
hml- GAL4 hml-GAL4-hml- Gal80 eYFP-nls Drukt GAL4 en GAL80 uit, aangedreven door een hemocytspecifieke promotor Pondeville. E et al (2020)
F carboxypeptidase promotor - GFY-GAL4 dsRed Drukt GAL4 uit in het middendarm en wanneer gekruist met een UAS-lijn zal YFP worden uitgedrukt. Gegenereerd met piggybac (MR4-code: MRA-1167) Lynd. A et al (2011) ·
Dgl carboxypeptidase promotor - GFY-GAL4 dsRed Drukt GAL4 uit in het middendarm en wanneer gekruist met een UAS-lijn zal YFP worden uitgedrukt. Gegenereerd met piggybac (MR4-code: MRA-1166) Lynd. A et al (2011) ·

Tabel 1 - Tabel met gepubliceerde regels, korte beschrijvingen en de referentie waarin de creatiemethodologie wordt beschreven. De catalogusnummers voor regels die momenteel zijn opgeslagen in de MR4-opslagplaats worden vermeld in de beschrijving.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Het begrijpen van de functie van muggengenen is van vitaal belang om nieuwe benaderingen te ontwikkelen om Anopheles te beheersen en de overdracht van malaria te beïnvloeden. Het beschreven GAL4-UAS-systeem is een veelzijdig en krachtig systeem voor functionele analyse van kandidaat-genen en tot op heden hebben we het systeem gebruikt om de genetische basis van insecticideresistentie17 en cuticulaire koolwaterstofproductie15,23 te onderzoeken, evenals om verschillende muggencelpopulaties fluorescerend te taggen8 . Tot nu toe zijn responderconstructen gegenereerd door restrictie-enzymklonen in een plasmide, met een meervoudige kloonlocatie stroomafwaarts van de UAS (figuur 1, tabel 1). Vanwege het modulaire karakter van de constructies met meerdere elementen (attB-locaties, 3xP3-YFP en zigeunerisolatorsequenties), zijn echter meer hedendaagse technieken haalbaar voor het construeren van nieuwe responderplasmiden. Typisch sequenties voor overexpressie kunnen worden versterkt door cDNA of gDNA met behulp van PCR, maar commerciële synthese kan soms de arbeid en tijd verminderen die gemoeid is met het genereren van nieuwe constructies. Het is belangrijk om de doelgenen te sequencen zodra ze zijn versterkt uit de respectieve sjablonen om de identiteit te valideren en potentiële SNP's te identificeren. Dit is met name relevant bij het commercieel synthetiseren van DNA, omdat het niet wordt aanbevolen om alleen op database-annotaties te vertrouwen.

Het genereren van sequenties voor RNAi-constructen is vaak complexer vanwege de vereiste om een inherent onstabiele omgekeerde herhaling van de doelsequentie te klonen voor dsRNA-vorming van het haarspeldproduct. Dit klonen wordt vaak bereikt door een intronsequentie tussen de herhalingen op te nemen om stabiele replicatie in Escherichia coli mogelijk te maken, en efficiënte splicing in de mug27. Versterking van haarspeldconstructies met behulp van asymmetrische PCR is efficiënt vanwege het eenstapskarakter. In vroege cycli van asymmetrische PCR wordt de streng versterkt door de voorwaartse primer bij voorkeur versterkt omdat deze primer wordt geleverd aan de reactie in overmaat (2x concentratie van brugprimer). Dit product hoopt zich op als enkele strengen. Het 3'-uiteinde van deze strengen is complementair aan het begin van het doelexon. In middenfasecycli vormt zich een lus als de complementaire 3'-eindgloeien naar het begin van het doelexon. Wanneer dit gebeurt, wordt de complementaire sequentie van het doelexon versterkt vanaf het 3'-uiteinde dat een product genereert [inverted-exon: intron: exon]. In late cycli wordt dit eindproduct versterkt door de voorwaartse primer en kan het gemakkelijk worden geïsoleerd en gekloond. Een vergelijkbaar omgekeerd herhalingsconstruct kan worden geproduceerd door fusie PCR28 zoals aangegeven in figuur 2. Voor beide methoden moet echter een geschikte doellocatie die aan de vereiste eigenschappen voor RNAi24 voldoet, direct grenzen aan een intron van de juiste grootte voor klonen. Wanneer er geen geschikt doelwit beschikbaar is, kan een gemodificeerde fusie-PCR of commerciële synthese worden gebruikt waarbij de omgekeerde sequenties worden gefuseerd met een intronsequentie als drie afzonderlijke fragmenten in respectievelijk een PCR-reactie of in silico. We hebben met succes het 4e intron van het Drosophila witte gen gebruikt als een gekloofde spacersequentie23. In dit geval had het bedrijf een afstandhouder (intron) nodig van ten minste gelijke lengte als de doelherhalingssequenties om een efficiënte synthese mogelijk te maken. Naarmate de kosten van commerciële synthese toenemen met de grootte en complexiteit van het fragment, wordt meestal alleen het haarspeld- of genfragment gesynthetiseerd en vervolgens gekloond in de gewenste vector in tegenstelling tot de synthese van het hele plasmide. Bij het gebruik van commerciële synthese om constructies voor transgenese te genereren, is het belangrijk om in gedachten te houden dat de verwachte sequentie-annotatie verschillen kan hebben, zoals SNP's, in vergelijking met sequenties die aanwezig zijn in laboratoriumstammen. Daarnaast is het belangrijk om rekening te houden met de impact van Kozak-sequenties en ervoor te zorgen dat ze waar nodig worden opgenomen in de uiteindelijke constructie29.

Zoals hierboven beschreven, breidt de scheiding van de GAL4- en UAS-componenten het potentieel van elke lijn uit, waardoor evaluatie in combinaties en analyse van dodelijke of schadelijke fenotypen mogelijk is. Er werden bijvoorbeeld enorm verschillende resistentiefenotypen waargenomen bij het alomtegenwoordig tot expressie brengen van metabole enzymen, in plaats van in de darm of oenocyten, waarvan eerder werd gedacht dat ze enkele van de belangrijkste weefsels waren die insecticideresistentie verleenden17. Bovendien heeft weefselspecifieke expressie/knockdown van genen die betrokken zijn bij de productie van cuticulaire koolwaterstoffen de rol van eicellen in de ontwikkeling van larven en volwassen eclosie benadrukt15,23. In de toekomst kan het genereren van driverlijnen met alternatieve ruimtelijk-temporele weefselspecifieke GAL4-expressie wel eens worden vereenvoudigd door CRISPR-Cas-technologie. Eerdere driverlijnen werden gegenereerd met beperkte kennis van promotorsequenties om expressie te reguleren en waren vaak 'hit and miss' in hun activiteit, die vaak wordt verergerd door positie-effecten. Dit kan worden ondervangen door gerichte insertie van GAL4 met een zelfklivend peptide (zoals T2A)30 stroomafwaarts van een doelgen dat expressie van GAL4 zou moeten produceren op de spatiotemporele manier van het beoogde gen31. Deze strategie is effectief gebruikt in D. melanogaster32, inclusief het genereren van een bibliotheek van aandelen die GAL4 tot expressie brengen onder controle van verschillende endogene promotors33. Hoewel nog niet uitgebreid getest bij muggen en er anekdotische vragen zijn over de efficiëntie van co-expressie, is de veelzijdigheid en het aanpassingsvermogen van deze gerichte aanpak opwindend.

Zelfs bij het gebruik van dergelijke methoden voor de productie van bestuurders, is seksen en screenen van poppen op een efficiënte en betrouwbare manier van fundamenteel belang voor het gebruik van het GAL4-UAS-systeem bij muggen. De hier beschreven protocollen zijn robuuste methoden voor kleinschalige analyse. Wanneer hogere muggenaantallen nodig zijn, wordt het zeer tijdrovend om handmatig te screenen op genotype. Dit kan worden ondervangen door homozygote bestuurders- en responderlijnen te overschrijden, zodat alle nakomelingen transheterozygoot zijn en dus geen rigoureuze screening en scheiding vereisen. Het is vaak mogelijk om homozygote muggen te onderscheiden op basis van de intensiteit van markerfluorescentie en deze zo te kruisen om stabiele homozygote lijnen te produceren. De effectiviteit van deze methode is echter enigszins afhankelijk van de bekendheid van de gebruiker met expressiepatronen. Bovendien hebben sommige regels geen consistente, ondubbelzinnige verschillen in expressie met betrekking tot het aantal markerkopieën. Een eenvoudigere manier om homozygote lijnen te genereren wordt beschreven in protocol 2.6 en is van toepassing wanneer twee lijnen zijn gegenereerd met verschillende fluorescerende markers in dezelfde genomische locus (bijvoorbeeld viaΦC31  site gerichte transformatie in dezelfde dockinglijn). Een of beide lijnen kunnen betrouwbaar homozygoot worden gemaakt door eenvoudige kruising en screening. De methode is gebaseerd op het kunnen onderscheiden van de verschillende fluorescerende markers, en van de meest gebruikte markers kunnen eCFP, eYFP en dsRED ondubbelzinnig worden onderscheiden met behulp van geschikte filtersets. Helaas overlappen de emissiespectra van eGFP aanzienlijk met eCFP en eYFP en kunnen ze over het algemeen niet in combinatie met deze markers worden gebruikt, hoewel dsRED en eGFP een geschikte koppeling vormen.

Een hogere doorvoer van analyse kan ook worden bereikt door automatische sortering van fluorescerend getagde larven. Dit is beschreven met de Complex Object Parametric Analyzer and Sorter (COPAS) machine34, die op dezelfde manier werkt als een fluorescentie-geactiveerde celsorteerder om individuele muggen te beschermen op basis van hun markerexpressie. De methode is ook gebruikt om differentieel getagde mannetjes en vrouwtjes te isoleren34. Vanwege de grootte zijn grotere stadia, zoals poppen, nog niet met succes gescreend met behulp van het COPAS-systeem. Geautomatiseerde geslachtssortering voor volwassenen met behulp van video- en machine learning-algoritmen is ook ontwikkeld voor grootschalige veldreleases35, maar dit is nog niet kostenefficiënt voor de schaal waarop GAL4-UAS-systeemtransgenen doorgaans worden gebruikt. Differentieel gelabelde geslachten zijn nog niet beschikbaar voor GAL4-UAS-muggen en dus is handmatige seks als poppen nog steeds nodig om specifieke kruisingen uit te voeren. De hier beschreven methode voor het seksen van poppen op basis van morfologische verschillen in uitwendige genitaliën is robuust. Het is echter onderhevig aan bedieningsfouten en voor stagiairs is het een goede gewoonte om de nauwkeurigheid van seks te bevestigen door te observeren of het juiste volwassen geslacht is geïsoleerd. Eenmaal zeker van 100% nauwkeurigheid, kunnen de poppen direct in de paringskooi worden geplaatst om tijd te besparen.

We beschrijven ook een aangepaste methode voor analyse van embryo-ontwikkeling door fixatie en verduidelijking van eieren na nauwkeurig getimede verzameling. Onze eerdere pogingen om embryo's te verwijderen met behulp van huishoudelijk bleekmiddel zoals beschreven in Goltsev, Rezende, et al.36, Rezende, Martins, et al.37, Vargas, Farnesi, et al.38 en Chang, Liu, et al.39, veroorzaakten verbranding van de embryo's zoals aangegeven in figuur 7D. De chloorconcentratie in huishoudelijk bleekmiddel kan aanzienlijk variëren, dus we hebben ervoor gekozen om chemicaliën van hoge kwaliteit te gebruiken. We hebben deze methode gebruikt om de mate van embryo-ontwikkeling na genetische modificatie van hormonale activering te observeren. Door observatie van het zich ontwikkelende embryo werd duidelijk dat de afwezigheid van larvale hatching te wijten was aan ontwikkelingsveranderingen in plaats van vruchtbaarheidsproblemen bij de volwassenen. Vergelijkbare technieken zijn gebruikt voor immuno-histochemie en RNA-hybridisatie zoals beschreven door Clemons, Flannery, et al.40 en Juhn en James 41 respectievelijk. Zoals we hebben aangetoond, is het GAL4-UAS-systeem in An. gambiae van onschatbare waarde gebleken voor het onderzoeken van bepaalde aspecten van muggenbiologie en -ontwikkeling, en de basisprotocollen die zijn beschreven voor transgenontwerp, fluorescerende screening, handmatige poppenseksing en embryo-clearing zijn vereist voor een efficiënt gebruik van dit belangrijke systeem.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgments

We erkennen dankbaar de financiering van LSTM en IVCC (Adriana Adolfi), BBSRC (New Investigator Award (AL), MRC (PhD studentship to BCP:MR/P016197/1), Wellcome (Sir Henry Wellcome Postdoctoral fellowship to LG: 215894/Z/19/Z) die Gal4UAS-analyse in de voorstellen hebben opgenomen.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
100 x 15 mm plastic Petri dish SLS 2175546 Pack of 10
1000 µL Gilson Pipette Gilson F144059P
20/25 mL Universal Tubes Starlab E1412-3020 Pack of 400
3 mL Pasteur Pipettes SLS G612398 Greiner Pasteur pipette 3 mL sterile individually wrapped
50 mL Falcon Tubes Fisher Scientific 11512303
Absolute Ethanol Fisher Scientific BP2818-500 500 mL
Acetic Acid SLS 45726-1L-F 1 L
Cages SLS E6099 30x30x30 with screen port
Fine Paint Brushes Amazon UKDPB66 KOLAMOON 9 Pieces Detail Painting Brush Set Miniture Brushes for Watercolor, Acrylic Painting, Oil Painting (Wine Red)
Fish food Amazon Tetra Min Fish Food, Complete Food for All Tropical Fish for Health, Colour and Vitality, 10 L 
Formaldehyde Solution Sigma Aldrich F8775
Mouth Aspirator John Hock 612
Pond Salt Amazon Blagdon Guardian Pond Tonic Salt, for Fish Health, Water Quality, General Tonic, pH Buffer, 9.08 kg, treats 9,092 L 
Pupae Pots Cater4you SP8OZ 250 pots with lids
Small Plastic Buckets Amazon 2.5 L White Plastic Pail Complete with White Lid (Pack of 10) 
Sodium Hypochlorite Fisher Scientific S25552

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Brand, A. H., Perimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118 (2), 401-415 (1993).
  2. Duffy, J. B. GAL4 system in drosophila: A fly geneticist's swiss army knife. Journal of Genetics and Development. 34 (1-2), 1-15 (2002).
  3. Dow, J. A. ELS. , John WIley & Sons, Ltd. (2012).
  4. Edi, C. V., et al. CYP6 P450 Enzymes and ACE-1 Duplication Produce Extreme and Multiple Insecticide Resistance in the Malaria Mosquito Anopheles gambiae. PLoS Genetics. 10 (3), 1004236 (2014).
  5. Daborn, P. J., et al. Using Drosophila melanogaster to validate metabolism-based insecticide resistance from insect pests. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 42 (12), 918-924 (2012).
  6. Riveron, J. M., et al. Genome-wide transcription and functional analyses reveal heterogeneous molecular mechanisms driving pyrethroids resistance in the major malaria vector Anopheles funestus across Africa. Genes Genomes Genetics. 7 (6), 1819-1832 (2017).
  7. Riveron, J. M., et al. A single mutation in the GSTe2 gene allows tracking of metabolically based insecticide resistance in a major malaria vector. Genome Biology. 15 (2), (2014).
  8. Lynd, A., Lycett, G. J. Development of the Bi-Partite Gal4-UAS System in the African Malaria Mosquito, Anopheles gambiae. PLoS ONE. 7 (2), 31552 (2012).
  9. Lynd, A., Lycett, G. J. Optimization of the Gal4-UAS system in an Anopheles gambiae cell line. Insect Molecular Biology. 20 (5), 599-608 (2011).
  10. Adolfi, A., Pondeville, E., Lynd, A., Bourgouin, C., Lycett, G. J. Multi-tissue GAL4-mediated gene expression in all Anopheles gambiae life stages using an endogenous polyubiquitin promoter. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 96, 1-9 (2018).
  11. Kokoza, V. A., Raikhel, A. A. Targeted gene expression in the transgenic Aedes aegypti using the binary Gal4-UAS system. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 41, 637-644 (2011).
  12. O'Brochta, D. A., Pilitt, K. L., Harrell, R. A., Aluvihare, C., Alford, R. T. Gal4-based Enhancer-Trapping in the Malaria Mosquito Anopheles stephensi. Genes Genomes Genetics. 2, 21305-21315 (2012).
  13. Zhao, B., et al. Regulation of the Gut-Specific Carboxypeptidase: A Study Using the Binary Gal4/UAS System in the Mosquito Aedes Aegypti. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 54, 1-10 (2014).
  14. Imamura, M., et al. Targeted Gene Expression Using the GAL4/UAS System in the Silkworm Bombyx mori. Genetics. 165 (3), 1329-1340 (2003).
  15. Lynd, A., et al. Development of a functional genetic tool for Anopheles gambiae oenocyte characterisation: application to cuticular hydrocarbon synthesis. bioRxiv. , (2019).
  16. Pondeville, E., et al. Hemocyte-targeted gene expression in the female malaria mosquito using the hemolectin promoter from Drosophila. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 120, 103339 (2020).
  17. Adolfi, A., et al. Functional genetic validation of key genes conferring insecticide resistance in the major African malaria vector, Anopheles gambiae. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (51), 25764-25772 (2019).
  18. Pondeville, E., et al. Efficient integrase-mediated site-specific germline transformation of Anopheles gambiae. Nature Protocols. 9 (7), 1698-1712 (2014).
  19. Horn, C., Schmid, B. G. M., Pogoda, F. S., Wimmer, E. A. Fluorescent transformation markers for insect transgenesis. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 32, 1221-1235 (2002).
  20. Clements, A. A. Biology of Mosquitoes, Volume 1: Development, Nutrition and Reproduction. 1, CABI Publishing. (1992).
  21. Trpiš, M. A new bleaching and decalcifying method for general use in zoology. Canadian Journal of Zoology. 48, 892-893 (1970).
  22. Kaiser, M. L., Duncan, F. D., Brooke, B. D. Embryonic Development and Rates of Metabolic Activity in Early and Late Hatching Eggs of the Major Malaria Vector Anopheles gambiae. PLoS ONE. 9 (12), 114381 (2014).
  23. Grigoraki, L., Grau-Bové, X., Yates, H. C., Lycett, G. J., Ranson, H. Isolation and transcriptomic analysis of Anopheles gambiae oenocytes enables the delineation of hydrocarbon biosynthesis. eLife. 9, 58019 (2020).
  24. Xiao, Y. -H., Yin, M. -H., Hou, L., Pei, Y. Direct amplification of intron-containing hairpin RNA construct from genomic DNA. BioTechniques. 41 (5), 548-552 (2006).
  25. Livak, K. J. Organization and Mapping of a Sequence on the Drosophila melanogaster X and Y Chromosomes That Is Transcribed during Spermatogenesis. Genetics. 107 (4), 611-634 (1984).
  26. MR4, CDC, NEI & beiResources. The MR4 Methods in Anopheles Research Laboratory Manual. 5th Edition. , (2015).
  27. Sik Lee, Y., Carthew, R. W. Making a better RNAi vector for Drosophila: use of intron spacers. Methods. 30 (4), 322-329 (2003).
  28. Cha-aim, K., Hoshida, H., Fukunaga, T., Akada, R. Gene Synthesis: Methods and Protocols. Peccoud, J. , Humana Press. 97-110 (2012).
  29. Cavener, D. R. Comparison of the consensus sequence flanking translational start sites in Drosophila and vertebrates. Nucleic Acids Research. 15 (4), 1353-1361 (1987).
  30. Wang, Y., Wang, F., Wang, R., Zhao, P., Xia, Q. 2A self-cleaving peptide-based multi-gene expression system in the silkworm Bombyx mori. Scientific Reports. 5, (2015).
  31. Galizi, R., et al. A synthetic sex ratio distortion system for the control of the human malaria mosquito. Nature Communications. 5, 3977 (2014).
  32. Kondo, S., et al. Neurochemical organisation of the Drosophila Brain Visualised by Endogenously Tagged Neurotransmitter Receptors. Cell Reports. 30 (1), 284-297 (2020).
  33. Lee, P. -T., et al. A gene-specific T2A-GAL4 library for Drosophila. eLife. 7, 35574 (2018).
  34. Marois, E., et al. High-throughput sorting of mosquito larvae for laboratory studies and for future vector control interventions. Malaria Journal. 11, 302 (2012).
  35. Crawford, J. E., et al. Efficient production of male Wolbachia-infected Aedes aegypti mosquitoes enables large-scale suppression of wild populations. Nature Biotechnology. 38 (4), 482-492 (2020).
  36. Goltsev, Y., et al. Developmental and evolutionary basis for drought tolerance of the Anopheles gambiae embryo. Developmental Biology. 330 (2), 462-470 (2009).
  37. Rezende, G. L., et al. Embryonic desiccation resistance in Aedes aegypti: presumptive role of the chitinized Serosal Cuticle. BMC Developmental Biology. 8 (1), 82 (2008).
  38. Vargas, H. C. M., Farnesi, L. C., Martins, A. J., Valle, D., Rezende, G. L. Serosal cuticle formation and distinct degrees of desiccation resistance in embryos of the mosquito vectors Aedes aegypti, Anopheles aquasalis and Culex quinquefasciatus. Journal of Insect Physiology. 62, 54-60 (2014).
  39. Chang, C. -H., et al. The non-canonical Notch signaling is essential for the control of fertility in Aedes aegypti. PLOS Neglected Tropical Diseases. 12 (3), 0006307 (2018).
  40. Clemons, A., Flannery, E., Kast, K., Severson, D., Duman-Scheel, M. Immunohistochemical Analysis of Protein Expression during Aedes aegypti Development. Spring Harbor Protocols. 10, 1-4 (2010).
  41. Juhn, J., James, A. A. Hybridization in situ of Salivary Glands, Ovaries and Embryos of Vector Mosquitoes. Journal of Visualized Experiments. , e3709 (2012).

Tags

Genetica 3xP3 Localization Endogenous Expression RNAi Knockdown Microscopie bipartiet Insecticide resistentie vectoriële capaciteit.
Gebruik van het GAL4-UAS-systeem voor functionele genetica in <em>Anopheles gambiae</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Poulton, B. C., Colman, F.,… More

Poulton, B. C., Colman, F., Anthousi, A., Grigoraki, L., Adolfi, A., Lynd, A., Lycett, G. J. Using the GAL4-UAS System for Functional Genetics in Anopheles gambiae. J. Vis. Exp. (170), e62131, doi:10.3791/62131 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter