Anopheles gambiae में कार्यात्मक आनुवंशिकी के लिए GAL4-UAS प्रणाली का उपयोग करना
Summary
द्विपक्षीय GAL4-UAS प्रणाली एक नियंत्रित spatiotemporal तरीके से जीन अभिव्यक्ति के संशोधन के लिए एक बहुमुखी उपकरण है जो Anopheles gambiae में कार्यात्मक आनुवंशिक विश्लेषण की अनुमति देता है। इस प्रणाली का उपयोग करने के लिए वर्णित प्रक्रियाएं एक अर्ध-मानकीकृत क्लोनिंग रणनीति, सेक्सिंग और फ्लोरोसेंट प्रोटीन मार्करों और भ्रूण निर्धारण के लिए प्यूपे की स्क्रीनिंग हैं।
Abstract
द्विपक्षीय GAL4-UAS प्रणाली कार्यात्मक आनुवंशिक विश्लेषण के लिए एक बहुमुखी और शक्तिशाली उपकरण है। प्रणाली का सार ट्रांसजेनिक ‘ड्राइवर’ लाइनों को पार करना है जो खमीर प्रतिलेखन कारक GAL4 को ऊतक विशिष्ट तरीके से व्यक्त करते हैं, ट्रांसजेनिक ‘उत्तरदाता’ लाइनों के साथ एक उम्मीदवार जीन / आरएनए हस्तक्षेप निर्माण को ले जाता है जिसकी अभिव्यक्ति अपस्ट्रीम सक्रियण अनुक्रम (यूएएस) द्वारा नियंत्रित होती है जो GAL4 को बांधती है। आगामी संतानों में, जीन या मौन निर्माण इस प्रकार एक निर्धारित स्पैटिओटेम्पोरल तरीके से व्यक्त किया जाता है, जिससे परिणामी फेनोटाइप्स को परखने और जीन फ़ंक्शन का अनुमान लगाया जा सकता है। बाइनरी सिस्टम कई ऊतक-विशिष्ट पैटर्न में ट्रांसजीन अभिव्यक्ति द्वारा उत्पन्न फेनोटाइप्स को स्क्रीन करने के लिए प्रयोगात्मक दृष्टिकोण में लचीलापन सक्षम बनाता है, भले ही गंभीर फिटनेस लागत प्रेरित हो। हमने अफ्रीका में प्रमुख मलेरिया वेक्टर एनोफिलीज़ गाम्बिया के लिए इस प्रणाली को अनुकूलित किया है।
इस लेख में, हम GAL4-UAS विश्लेषण के दौरान उपयोग की जाने वाली कुछ सामान्य प्रक्रियाएं प्रदान करते हैं। हम पहले से ही उत्पन्न एक गाम्बिया GAL4-UAS लाइनों का वर्णन करते हैं, साथ ही साथ upregulation और RNAI नॉकडाउन के लिए नए उत्तरदाता निर्माणों की क्लोनिंग का वर्णन करते हैं। हम आनुवांशिक क्रॉस स्थापित करने के लिए मच्छर प्यूपे के सेक्सिंग के लिए एक कदम-दर-चरण मार्गदर्शिका निर्दिष्ट करते हैं, जिसमें फ्लोरोसेंट जीन मार्करों की विरासत का पालन करने के लिए स्क्रीनिंग संतान भी शामिल है जो ड्राइवर और उत्तरदाता सम्मिलन को टैग करते हैं। हम भ्रूण के विकास का अध्ययन करने के लिए एक गाम्बिया भ्रूण को साफ करने के लिए एक प्रोटोकॉल भी प्रस्तुत करते हैं। अंत में, हम लक्ष्य जीन के नीचे GAL4 के CRISPR / Cas9 सम्मिलन के माध्यम से ड्राइवर लाइनों को उत्पन्न करने के लिए विधि के संभावित अनुकूलन का परिचय देते हैं।
Introduction
द्विपक्षीय GAL4-UAS प्रणाली कीट मॉडल जीव ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर 1,2,3 में जीन के कार्यात्मक लक्षण वर्णन का वर्कहॉर्स है। GAL4-UAS प्रणाली का उपयोग करने के लिए, ट्रांसजेनिक ड्राइवर लाइनों, एक नियामक अनुक्रम के नियंत्रण के तहत खमीर प्रतिलेखन कारक GAL4 व्यक्त करते हुए, ब्याज या आरएनए हस्तक्षेप (आरएनएआई) के जीन को ले जाने वाली उत्तरदाता लाइनों के साथ पार किया जाता है जो GAL4 द्वारा मान्यता प्राप्त अपस्ट्रीम सक्रियण अनुक्रम (यूएएस) द्वारा नियंत्रित होता है। इस क्रॉस की संतान एक spatiotemporal पैटर्न में ब्याज के ट्रांसजीन को व्यक्त एक spatiotemporal पैटर्न GAL4 अभिव्यक्ति को नियंत्रित करने वाले प्रमोटर द्वारा निर्धारित (चित्रा 1). चालक-उत्तरदाता क्रॉस की संतानों द्वारा प्रदर्शित फेनोटाइप्स का मूल्यांकन उम्मीदवार जीन के कार्य को स्पष्ट करने के लिए किया जा सकता है। यद्यपि डी मेलानोगास्टर का उपयोग अन्य जीवों से जीन की जांच करने के लिए किया गया है4,5,6,7, GAL4-UAS प्रणाली को अब चिकित्सा और कृषि महत्व के कीड़ों में उपयोग के लिए अनुकूलित किया गया है ताकि ब्याज की प्रजातियों में प्रत्यक्ष विश्लेषण प्रदान किया जा सके 8,9,10,11,12,13,14।
अफ्रीकी मलेरिया मच्छर, एनोफिलीज़ गाम्बिया में, GAL4-UAS प्रणाली का परीक्षण पहली बार सेल लाइन सह-अभिकर्मक9 द्वारा किया गया था। कई constructs विभिन्न pairwise संयोजनों में दक्षता के लिए परख किए गए थे और पाया कि 14 tandemly दोहराया UAS एक छोटे से कृत्रिम intron (UAS-14i) के साथ पूरक सक्रियण क्षमता की व्यापक रेंज प्रदर्शित जब GAL4 ड्राइवरों के एक पैनल के साथ इस्तेमाल किया. विवो कार्यक्षमता में प्रदर्शित करने के लिए, इन निर्माणों का उपयोग तब पिग्गीबैक ट्रांसफॉर्मेशन 8 द्वारा दो अलग-अलग ट्रांसजेनिक एन गाम्बिया लाइनों को बनाने के लिए किया गया था: एक मिडगट विशिष्ट प्रमोटर द्वारा संचालित जीएएल 4 को ले जाने वाली एक ड्राइवर लाइन, और यूएएस अनुक्रमों के विनियमन के तहत लूसिफेरस और एन्हांस्ड पीले फ्लोरोसेंट प्रोटीन (ईवाईएफपी) जीन दोनों युक्त एक उत्तरदाता लाइन। आंत विशिष्ट लूसिफेरस गतिविधि और संतानों में प्रतिदीप्ति ने संकेत दिया कि सिस्टम एनोफिल्स में कुशल था। तब से, चालक लाइनों को वेक्टरियल क्षमता और कीटनाशक प्रतिरोध के लिए महत्वपूर्ण अन्य ऊतकों में ट्रांसजीन को व्यक्त करते हुए बनाया गया है, जिसमें ओनोसाइट्स 15 और हेमोसाइट्स 16 शामिल हैं, और सर्वव्यापी पैटर्न 10 के करीब हैं। कई यूएएस लाइनों को भी परख जीन के लिए उत्पन्न किया गया है जो चयापचय और सीक्वेंसिंग मध्यस्थता कीटनाशक प्रतिरोध, क्यूटिकुलर हाइड्रोकार्बन संश्लेषण में शामिल होने और फ्लोरोसेंटली विभिन्न सेल और ऊतक प्रकारों को टैग करने के लिए माना जाता है (तालिका 1)। उत्तरदाता लाइनों के लिए, ट्रांसजीन की साइट-निर्देशित एकीकरण अब यूएएस विनियमित जीन के जीनोमिक संदर्भ को ठीक करने के लिए ΠC31 उत्प्रेरित पुनर्संयोजन कैसेट एक्सचेंज 17,18 द्वारा किया जाता है। इस तरह, ट्रांसजीन अभिव्यक्ति को जीनोमिक सम्मिलन स्थान के बारे में सामान्यीकृत किया जाता है, जिससे विभिन्न उम्मीदवार जीनों के फेनोटाइपिक प्रभावों की अधिक सटीक तुलना की जा सकती है।
आज तक बनाई गई उत्तरदाता लाइनों को या तो उच्च स्तर पर ट्रांसजीन को व्यक्त करने या आरएनए हस्तक्षेप (आरएनएआई) के माध्यम से जीन अभिव्यक्ति को कम करने के लिए डिज़ाइन किया गया है। आमतौर पर सीडीएनए क्लोन को उपयुक्त अभिव्यक्ति प्लास्मिड उत्पन्न करने के लिए यूएएस अनुक्रम में फ्यूज किया जाता है, हालांकि पूर्ण जीनोमिक अनुक्रम भी संभव हैं यह मानते हुए कि वे क्लोनिंग के लिए बहुत बड़े नहीं हैं। मौन निर्माणों को उत्पन्न करने के लिए, हमने उपयुक्त अग्रानुक्रम उल्टे अनुक्रमों को प्राप्त करने के लिए तीन अलग-अलग तरीकों का उपयोग किया है जो हेयरपिन डीएसआरएनए बनाते हैं जो आरएनएआई को उत्तेजित करता है। इनमें संलयन पीसीआर, असममित पीसीआर और हेयरपिन निर्माणों का वाणिज्यिक संश्लेषण शामिल है। प्रत्येक विधि के लिए आम क्लोनिंग स्थिरता प्रदान करने के लिए उल्टे अनुक्रमों के बीच एक इंट्रोन अनुक्रम का समावेश है। उत्तरदाता प्लास्मिड जिसमें ब्याज / आरएनएआई निर्माण का एक जीन डाला जा सकता है, विकसित किया गया है15। ये प्लास्मिड आरएमसीई के लिए आवश्यक ΠC31 attB साइटों को भी ले जाते हैं (जो कि जोव पेपर के साथ एडोल्फी में वर्णित है जो आरसीएमई तकनीक का विस्तार से वर्णन करता है)। Overexpression के लिए इन plasmids में से एक में सम्मिलन के लिए अनुक्रम का चयन करते समय आवश्यक महत्वपूर्ण चरणों को कवर करने वाले प्रोटोकॉल इस पांडुलिपि में शामिल हैं। इसके अतिरिक्त, आरएनएआई हेयरपिन निर्माण निर्माण के लिए दो प्रोटोकॉल का वर्णन और सचित्र है।
नई लाइनें बनाते समय, ट्रांसजेनिक उपनिवेशों को स्थापित करने और बनाए रखने के लिए दुर्लभ ट्रांसजेनिक व्यक्तियों की पहचान करना महत्वपूर्ण है। GAL4-UAS प्रणाली के लिए सबसे महत्वपूर्ण बात यह है कि क्रॉस स्थापित करने और व्यक्तिगत संतानों की पहचान करने के लिए उत्तरदाता और ड्राइवर लाइनों को अलग करने की आवश्यकता है जो दोनों ट्रांसजीन ले जाते हैं। यह ड्राइवर और उत्तरदाता कैसेट से जुड़े विभिन्न प्रमुख चयन योग्य मार्कर जीन का उपयोग करके प्राप्त किया जाता है। आमतौर पर ये फ्लोरोसेंट मार्कर जीन होते हैं जो ऑप्टिकल फिल्टर का उपयोग करके स्पष्ट रूप से अलग-अलग होते हैं (उदाहरण के लिए, eYFP, eCFP, dsRed)। यह महत्वपूर्ण है कि मार्करों को एक ज्ञात और विश्वसनीय स्पैटिओटेम्पोरल पैटर्न में व्यक्त किया जाता है क्योंकि यह असामान्यताओं और संदूषण की पहचान को आसान बनाता है। फ्लोरोसेंट मार्कर जीन अभिव्यक्ति को नियमित रूप से सिंथेटिक 3xP3 प्रमोटर द्वारा विनियमित किया जाता है, जो An. gambiae development19 के सभी चरणों में आंख और वेंट्रल गैन्ग्लिया विशिष्ट अभिव्यक्ति का कारण बनता है। 3xP3 द्वारा नियंत्रित फ्लोरोसेंट मार्करों को इस लेख में वर्णित सभी परिवर्तन प्लास्मिड में शामिल किया गया है। फ्लोरोसेंट An. gambiae pupae GAL4-UAS लाइनों को स्क्रीन करने के लिए उपयोग किए जाने वाले सामान्य तरीकों का विवरण देने वाला एक प्रोटोकॉल यहां शामिल है।
GAL4-UAS सिस्टम के प्रमुख तत्वों में से एक विभेदक रूप से चिह्नित ड्राइवर और उत्तरदाता लाइनों को पार करने की आवश्यकता है। ऐसा करने के लिए प्रत्येक पंक्ति से नर और मादा को संभोग से पहले अलग किया जाना चाहिए। वयस्कों को दृष्टि से आसानी से अलग किया जा सकता है, हालांकि, आनुवांशिक क्रॉस की स्थापना के लिए वयस्क उद्भव से पहले लिंगों को अलग करना समझदार है ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि संभोग नहीं हुआ है। पुरुष और महिला के बीच सामान्य आकार का अंतर An. gambiae pupae लिंग निर्धारण की एक कुशल और भरोसेमंद विधि होने के लिए बहुत परिवर्तनशील है20। इसके बजाय बाहरी जननांगों में स्पष्ट रूपात्मक अंतर An. gambiae में सेक्सिंग के लिए एक विश्वसनीय आधार प्रदान करते हैं। इस लेख में, हम उपयुक्त क्रॉस स्थापित करने के लिए An. gambiae pupae को सेक्स करने के लिए एक भरोसेमंद विधि का वर्णन करते हैं।
चित्रा 1 – Anopheles गाम्बिया में द्विपक्षीय GAL4-UAS प्रणाली का उपयोग करने के लिए प्रक्रिया का आरेखीय प्रतिनिधित्व। (ए) एक उदाहरण वेक्टर (pSL-attB-UAS14-gyp[3xp3-eYFP]) के प्रमुख घटकों को चित्रित किया गया है, जो कई क्लोनिंग साइटों के भीतर उपलब्ध प्रतिबंध साइटों (EcoRI, NheI, XhoI और NcoI) का विवरण देते हैं जो ब्याज के जीन के लिए हेयरपिन निर्माण या कोडिंग अनुक्रम डालने के लिए उपयोग के लिए उपयुक्त हैं। डॉकिंग लाइन की संरचना को भी दर्शाया गया है। (बी) क्रॉसिंग चरण को ड्राइवर लाइन से पुरुषों के उपयोग को दर्शाते हुए सचित्र किया गया है (3xP3 प्रमोटर द्वारा संचालित ब्याज और ईसीएफपी के प्रमोटर द्वारा जीएएल 4 ड्राइवर को ले जाना) और उत्तरदाता लाइन से महिलाएं (यूएएस प्रमोटर द्वारा नियंत्रित ब्याज या हेयरपिन निर्माण के जीन को ले जाना और 3xP3 प्रमोटर द्वारा नियंत्रित एक ईवाईएफपी मार्कर)। (C) B में क्रॉस की संतानों में रुचि के जीन की GAL4 ड्राइविंग अभिव्यक्ति का एक आरेखीय प्रतिनिधित्व और कुछ विशिष्ट फेनोटाइप्स की एक सूची जिसका मूल्यांकन किया जाता है। संक्षिप्त रूप: एकाधिक क्लोनिंग साइट (MCS), Recombinase मध्यस्थता कैसेट एक्सचेंज (RMCE), अपस्ट्रीम उत्प्रेरक अनुक्रम (UAS), बढ़ाया पीला फ्लोरोसेंट प्रोटीन (eYFP), बढ़ाया सियान फ्लोरोसेंट प्रोटीन (eCFP). कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
यह क्रॉस का उपयोग है जो GAL4-UAS प्रणाली की द्विपक्षीय प्रकृति प्रदान करता है, जिसके अधिक रैखिक दृष्टिकोणों पर अलग-अलग फायदे हैं। उदाहरण के लिए, ड्राइवर और उत्तरदाता लाइनों के कई और संयोजनों का आकलन किया जा सकता है, यदि प्रत्येक प्रमोटर / जीन संयोजन के लिए एक नई ट्रांसजेनिक लाइन उत्पन्न और बनाए रखी जानी थी तो संभव होगा। इससे भी महत्वपूर्ण बात यह है कि यह जीन के विश्लेषण की अनुमति देता है जो घातक या बाँझ फेनोटाइप का उत्पादन करते हैं जब उनकी अभिव्यक्ति परेशान होती है जो एक रैखिक प्रणाली में बनाने / बनाए रखने के लिए मुश्किल होती है। इस तरह के घातक फेनोटाइप जीन फ़ंक्शन और स्पैटिओटेम्पोरल अभिव्यक्ति के आधार पर सभी विकास ता्मक चरणों में प्रकट हो सकते हैं, लेकिन भ्रूण के विकास के दौरान अक्सर देखे जाते हैं। मच्छर भ्रूण के विकास की कल्पना करने के लिए अपारदर्शी चोरियन के समाशोधन की आवश्यकता होती है जो अंडे को कोट करता है। Trpis (1970)21 और कैसर एट अल.(2014)22 में वर्णित विधियों के बाद, हम उन प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं जिनका उपयोग हम भ्रूण को ठीक करने के लिए करते हैं, जबकि संरचनात्मक अखंडता को बनाए रखते हुए, और एंडोकोरियन को साफ करने के लिए ब्लीचिंग करते हैं जो माइक्रोस्कोपिक विज़ुअलाइज़ेशन और इमेजिंग की अनुमति देता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
एनोफिलीज को नियंत्रित करने और मलेरिया संचरण को प्रभावित करने के लिए नए दृष्टिकोण विकसित करने के लिए मच्छर जीन समारोह को समझना महत्वपूर्ण है। वर्णित GAL4-UAS प्रणाली उम्मीदवार जीन के कार्यात्मक विश्ले…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम कृतज्ञतापूर्वक LSTM और IVCC (एड्रियाना एडॉल्फी), BBSRC (नए अन्वेषक पुरस्कार (AL), MRC (BCP: MR/ P016197/1 के लिए पीएचडी studentship), Wellcome (सर हेनरी वेलकम पोस्टडॉक्टरल फैलोशिप से एलजी: 215894 / Z / 19 / Z) से धन को स्वीकार करते हैं, जिन्होंने प्रस्तावों में Gal4UAS विश्लेषण को शामिल किया है।
Materials
| 100 x 15 mm plastic Petri dish | SLS | 2175546 | Pack of 10 |
| 1000 µL Gilson Pipette | Gilson | F144059P | |
| 20/25 mL Universal Tubes | Starlab | E1412-3020 | Pack of 400 |
| 3 mL Pasteur Pipettes | SLS | G612398 | Greiner Pasteur pipette 3 mL sterile individually wrapped |
| 50 mL Falcon Tubes | Fisher Scientific | 11512303 | |
| Absolute Ethanol | Fisher Scientific | BP2818-500 | 500 mL |
| Acetic Acid | SLS | 45726-1L-F | 1 L |
| Cages | SLS | E6099 | 30x30x30 with screen port |
| Fine Paint Brushes | Amazon | UKDPB66 | KOLAMOON 9 Pieces Detail Painting Brush Set Miniture Brushes for Watercolor, Acrylic Painting, Oil Painting (Wine Red) |
| Fish food | Amazon | Tetra Min Fish Food, Complete Food for All Tropical Fish for Health, Colour and Vitality, 10 L | |
| Formaldehyde Solution | Sigma Aldrich | F8775 | |
| Mouth Aspirator | John Hock | 612 | |
| Pond Salt | Amazon | Blagdon Guardian Pond Tonic Salt, for Fish Health, Water Quality, General Tonic, pH Buffer, 9.08 kg, treats 9,092 L | |
| Pupae Pots | Cater4you | SP8OZ | 250 pots with lids |
| Small Plastic Buckets | Amazon | 2.5 L White Plastic Pail Complete with White Lid (Pack of 10) | |
| Sodium Hypochlorite | Fisher Scientific | S25552 |
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