Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

التكامل بوساطة φC31 الموجهة بالموقع وتبادل الكاسيت في نواقل الأنوفيليس للملاريا

Published: February 2, 2021 doi: 10.3791/62146
Automatic Translation
1,2, 1, 1, 2,3
1Vector Biology Department, Liverpool School of Tropical Medicine, 2Department of Microbiology & Molecular Genetics, University of California, 3Department of Molecular Biology & Biochemistry, University of California

Summary

يصف البروتوكول كيفية تحقيق تعديلات موجهة للموقع في جينوم بعوض ملاريا الأنوفيليس باستخدام نظام φC31 . وتشمل التعديلات الموصوفة كلا من تكامل وتبادل الأشرطة المعدلة وراثيا في جينوم خطوط الالتحام الحاملة ل attP.

Abstract

يعتمد التحليل الجينومي الوظيفي والاستراتيجيات ذات الصلة للمكافحة الجينية للملاريا على طرق معتمدة وقابلة للتكرار لتعديل جينوم بعوض الأنوفيليس بدقة. من بين هذه الطرق ، يسمح نظام φC31 بالتكامل الدقيق والمستقر الموجه نحو الموقع للجينات المحورة ، أو استبدال الكاسيت المعدلة وراثيا المتكاملة عبر تبادل الكاسيت بوساطة المؤتلف (RMCE). تعتمد هذه الطريقة على عمل البكتيريا العقدية φC31 integrase لتحفيز إعادة التركيب بين موقعين محددين للتعلق المعينين attP (المشتقين من العاثية) و attB (المشتق من البكتيريا المضيفة). يستخدم النظام موقعا أو موقعين من مواقع attP التي تم دمجها سابقا في جينوم البعوض وموقع (مواقع) attB في الحمض النووي لقالب المانح. نوضح هنا كيفية تعديل جينوم خطوط التحام الأنوفيلة الحاملة ل attP بشكل ثابت باستخدام اثنين من البلازميدات: متبرع يحمل علامة attB يحمل قالب التكامل أو التبادل وبلازميد مساعد يشفر تكامل φC31 integrase. لقد أبلغنا عن نتيجتين تمثيليتين للتعديل الموجه بوساطة φC31: التكامل الفردي لكاسيت معدل وراثيا في An. Stephensi و RMCE في البعوض An. gambiae. يوفر التلاعب بالجينوم بوساطة φC31 ميزة التعبير الجيني العابر القابل للتكرار من مواقع الجينوم المحايدة التي تم التحقق من صحتها ، مما يسمح بإجراء تحليلات نوعية وكمية مقارنة للأنماط الظاهرية. كما أن طبيعة التكامل الموجهة نحو الموقع تبسط إلى حد كبير التحقق من صحة موقع الإدراج الفردي ومخطط التزاوج للحصول على خط معدل وراثيا مستقر. هذه الخصائص وغيرها تجعل من نظام φC31 مكونا أساسيا في مجموعة الأدوات الجينية للتلاعب المعدل وراثيا ببعوض الملاريا وغيره من نواقل الحشرات.

Introduction

وقد عززت القدرة على تعديل جينوم نواقل البعوض للأمراض بشكل موثوق وقابل للتكرار التحقق الوظيفي للجينات في الجسم الحي وفتحت الأبواب أمام استراتيجيات قابلة للتحقيق لمكافحة النواقل الوراثية، مثل تلك التي تستهدف بعوض الأنوفيليس الذي ينقل الملاريا1.

اعتمد تحرير جينوم البعوض المبكر فقط على التحول بوساطة العناصر القابلة للتحويل (TE) ، مع كون piggyBac هو الترانسبوزون الأكثر استخداما في Anopheles2,3,4. ومع ذلك، يمكن أن تؤدي الطبيعة العشوائية لتكامل TE إلى تعديلات غير مرغوب فيها مثل الضربات القاضية الجينية (الطفرات الإدراجية) وتأثيرات الموضع الكبيرة على التعبير الجيني المتغير5،6،7،8. عمليات الإدراج المتعددة هي أيضا أمر شائع الحدوث عند استخدام piggyBac5,9 ، مما يجعل التحقق من صحة وعزل الخطوط المعدلة وراثيا مع عمليات الإدخال الفردية شاقة. وتشمل العيوب الأخرى إعادة تعبئتها المحتملة ، كما لوحظ في الخط الجرثومي ل Anopheles stephensi عند توفير مصدر ل piggyBac transposase10,11,12 ، وحجمها المحدود من شحنات الحمض النووي (10-15 كيلو بايت في الطول) مع انخفاض كفاءة التحول مع زيادة حجم البلازميد المانح 13,14.

تم إدخال نهج التكامل الموجهة نحو الموقع للتحايل على هذه القضايا. تعديل الجينوم الأكثر شيوعا الموجه للموقع في البعوض هو ذلك الذي يتوسط فيه نظام φC31 (الشكل 1 أ). ويعزى ذلك إلى التكاملات الفيروسية التي تحفز إعادة التركيب بين موقعين مرتبطين غير متجانسين (att) يحدثان بشكل طبيعي في جينوم البكتيريا φC31 (attP) وفي مضيف بكتيريا العقدية (attB)15. إعادة تركيب الموقعين أحادية الاتجاه وتؤدي إلى تكوين مواقع هجينة (attL و attR). إن إعادة تركيب مثل هذه المواقع الهجينة (التي تؤدي إلى استئصال الحمض النووي) لن تتطلب فقط وجود إنتيغراز فيروسي نشط ولكن أيضا عامل إعادة تركيب آخر مشفر بالعاثيات16,17. وهكذا ينشأ موقع تكامل مستقر يخفف من مسألة احتمال إعادة التعبئة غير المرغوب فيها(15). علاوة على ذلك ، يسمح النظام بدمج الشحنات الكبيرة (على سبيل المثال ، تم الإبلاغ عن تكامل هياكل > 100 كيلو بايت في D. melanogaster18) ، مما يزيد بشكل كبير من القدرات الاستيعابية. يحدث التكامل في موضع جينومي واحد محدد مسبقا مما يبسط إلى حد كبير التحقق من صحة الإدخال ومخطط التزاوج للحصول على خط معدل وراثيا مستقر. وأخيرا، تسمح طبيعة التكامل الموجهة نحو الموقع بتطبيع التعبير حيث توجد الجينات المحورة البديلة في نفس الموضع وبالتالي يتم تنظيمها في نفس السياق الجينومي المجاور. في الواقع ، أحد التطبيقات الرئيسية لهذه التقنية هو المقارنة المباشرة للأنماط الظاهرية التي تمنحها الجينات المحورة المختلفة بعد إدخالها في موضع مماثل.

ينطوي تحقيق التكامل بوساطة φC31 على مرحلتين: المرحلة الأولى هي إنشاء خطوط إرساء معدلة وراثيا تحمل موقع (مواقع) attP، والمرحلة الثانية هي التكامل الموجه نحو الموقع لشحنة محاطة ب attB في جينوم خط الالتحام 19. اعتمد إنشاء خطوط الالتحام في المرحلة الأولى على التكامل العشوائي بوساطة TE للتركيبات الموسومة بعلامة attP ، وبالتالي تضمن عملية شاقة أولية (بما في ذلك اللطخة الجنوبية وتحليلات PCR العكسية على ذرية أنثى واحدة) لعزل والتحقق من صحة الخطوط المعدلة وراثيا التي تحمل حدث تكامل واحد في مواقع جينومية فريدة ونشطة نسخيا ومحايدة للياقة البدنية. ومع ذلك ، تم تطوير العديد من خطوط الالتحام للتكامل الفردي بوساطة φC31 والتحقق من صحتها في An. gambiae19,20,21,22 وفي An. stephensi23,24,25 (الجدول 1). يختلف كل من هذه الخطوط من حيث الموقع الجينومي لموقع الالتحام والخلفية الجينية الخاصة بالسلالة ويمكن من خلالها إنشاء مجموعة كبيرة ومتنوعة من الخطوط المعدلة وراثيا الجديدة. يمكن الآن التحايل على التحقق المعقد من عمليات التكامل بوساطة TE لإنتاج خطوط الإرساء بواسطة تقنية CRISPR/Cas926؛ ومع ذلك ، يعتمد هذا على المعرفة المسبقة بالمواقع المحايدة التي سيتم استهدافها والتسلسلات المحيطة بها.

تم تطبيق التكامل بوساطة φC31 على نطاق واسع لتحرير جينوم الحشرات من الكائن الحي النموذجي D. melanogaster27 ، إلى البعوض Aedes aegypti13,28 ، Ae. albopictus29 ، An. gambiae19 ، و An. stephensi24 ، بالإضافة إلى الحشرات الأخرى بما في ذلك Ceratitis capitata30 و Bombyx mori31.

ومن القيود المفروضة على التكامل بوساطة φC31، لا سيما بالنظر إلى الإطلاقات الميدانية المحتملة لمكافحة النواقل، التكامل في جينوم البعوض لكامل البلازميد المانح الحامل ل attB، بما في ذلك التسلسلات غير المرغوب فيها مثل العلامات الجينية المقاومة للمضادات الحيوية ومكونات العمود الفقري للبلازميد ذات الأصل البكتيري. ولمعالجة ذلك، تم تنفيذ تعديل للنظام القياسي، وهو تبادل الكاسيت بوساطة المؤتلف (RMCE)، الذي يسمح بالاستعاضة الدقيقة عن كاسيت معدل وراثيا كان متكاملا سابقا بحمض نووي جديد للمتبرع (الشكل 1 ب). ويتحقق ذلك باستخدام موقعين مقلوبين يحيطان بأشرطة الكاسيت المانحة والمتلقية في كل طرف، مما يدفع حدثين مستقلين لإعادة التركيب يحدثان في وقت واحد مما يؤدي إلى تبادل الكاسيت دون تكامل العمود الفقري للبلازميد. هذا التصميم المحسن يتحايل على تكامل التسلسلات غير المرغوب فيها ويوسع نطاق تطبيق أنظمة φC31 لتشمل على سبيل المثال تكامل شحنات الحمض النووي غير المميزة عن طريق فحص فقدان علامة الفلورسنت المدمجة سابقا32.

تم تحقيق RMCE أولا مع D. melanogaster32 وتم تطبيقه لاحقا بنجاح على الحشرات غير النموذجية بما في ذلك An. gambiae9,26,33 و Ae. aegypti34 و Plutella xylostella34 و B. mori35. تم تطوير العديد من خطوط الإرساء ل RMCE والتحقق من صحتها في An. gambiae5,9,26 (الجدول 1). على حد علمنا ، لم يتم استكشاف RMCE بعد في أنواع ناقلات الأنوفيلة الأخرى.

حتى الآن، تم استخدام نظام φC31 على نطاق واسع في بعوض الأنوفيليس لإدخال ودراسة مجموعة متنوعة من الجزيئات بما في ذلك المستجيبات المضادة للملاريا19،24،36، ومكونات نظام GAL4/UAS للمبالغة في التعبير عن الجينات وتدميرها لدراسات مقاومة المبيدات الحشرية9،33، والعناصر التنظيمية، والجينات المراسلة5،21،37، وعناصر محرك الجينات26 ، 38.

يصف هذا البروتوكول كيفية إجراء 1) التكامل الموجه نحو الموقع لشحنة محاطة ب attB و 2) RMCE لمبنى محاط بمواقع attB مقلوبة في جينوم خطوط التحام Anopheles . ويتحقق ذلك باستخدام اثنين من البلازميدات: بلازميد المتبرع الموسوم بعلامة attB الذي يحمل الجين المتحول محل الاهتمام ، والبلازميد المساعد الذي يعبر عن تكامل φC31 . وتستخدم نواقل الملاريا الرئيسية An. gambiae و An. stephensi كأمثلة محددة، ومع ذلك فإن هذه البروتوكولات تنطبق على أنواع الأنوفيلة الأخرى.

Figure 1
الشكل 1. تعديلات الجينوم الموجهة للموقع ، والتكامل الفردي وتبادل الكاسيت بوساطة المؤتلف (RMCE) ، باستخدام نظام φC31. يحفز تكامل φC31 (INT ، سهم مزدوج رمادي) إعادة التركيب بين موقع (مواقع) attB (مخطط أرجواني) موجود في بلازميد مانح وموقع (مواقع) attP (مخطط أزرق) موجود في خط الالتحام المتلقي ، مما يؤدي إلى تكوين مواقع هجينة attL و attR. أ) يتحقق التكامل عندما يتم إعادة دمج مواقع attB و attP المفردة وينتج عنها وجود علامتين متكاملتين (الأزرق والأحمر). ب) يحدث RMCE عندما يعاد دمج موقعين attB / P في وقت واحد ويؤدي إلى استبدال الكاسيت بين مواقع att لخط الالتحام (العلامة الزرقاء) بتلك التي يحملها البلازميد المانح (العلامة الحمراء). ج) تسلسلات النيوكليوتيدات الجزئية ل attP (الأزرق) و attB (الأرجواني) والمواقع الهجينة attL / R. تحدث إعادة التركيب بين التسلسلات الأساسية "TT" المميزة باللون الأسود الغامق. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Protocol

ملاحظة: يظهر سير عمل تخطيطي للبروتوكول الموضح في الشكل 2.

1. تصميم البلازميدات φC31 attB الموسومة (الشكل 3)

  1. إنشاء بلازميدات مانحة attB تحمل المكونات الأساسية التالية
    1. علامة الفلورسنت المهيمنة
      1. اختر مروجا لدفع التعبير عن علامة الفلورسنت.
        ملاحظة: بالنسبة لتحول الأنوفيلس، عادة ما تكون علامات الفلورسنت تحت تنظيم المروج 3xP39، الذي يدفع التعبير في العينين والحبل العصبي. بدلا من ذلك ، يمكن استخدام مروج PUBc5 عند الرغبة في التعبير في أنسجة متعددة. يتم وضع علامة على البلازميدات المانحة وخطوط الإرساء المستخدمة كأمثلة في هذا البروتوكول باستخدام مروج 3xP3.
      2. اختر بروتين الفلورسنت (FP) المتوافق مع بروتين خط الإرساء المتلقي بحيث يمكن تمييزه بسهولة.
        ملاحظة: لا تستخدم نفس العلامة الموجودة بالفعل في خط الإرساء وتجنب الاستخدام المتزامن ل GFP (أخضر)/YFP (أصفر) وGFP (أخضر)/CFP (سماوي) لأنه من الصعب جدا التمييز بينهما بشكل موثوق. يتم تمييز البلازميدات المانحة المستخدمة كأمثلة في هذا البروتوكول إما ب DsRed أو YFP حيث سيتم دمجها في خط الإرساء المميز ب CFP.
    2. موقع (مواقع) إعادة التركيب attB
      1. استخدم موقع attB واحد لدمج كاسيت معدل وراثيا (تصميم attB واحد) (الشكل 3A).
      2. استخدم موقعين مقلوبين ل attB ل RMCE (تصميم مزدوج attB ) حيث تقع المواقع مقلوبة فيما يتعلق ببعضها البعض وأرفق قالب الحمض النووي للمتبرع (الشكل 3B).
        ملاحظة: يجب أن يكون اتجاه موقع (مواقع) attB متوافقا مع اتجاه موقع (مواقع) attP الموجود في خط الإرساء.
    3. البضائع الجينية المحورة المطلوبة
      1. استخدم أي ميزات أخرى مرغوبة ليتم دمجها في جينوم البعوض بناء على الغرض المحدد من التجربة. هنا ، نصف دمج جزيء مستجيب مضاد للملاريا في جينوم An. stephensi ودمج مكونات نظام GAL4 / UAS في البعوض An. gambiae.
    4. مكونات العمود الفقري البلازميد
      1. تشمل ، من بين المكونات الأساسية الأخرى لتكرار البلازميد في البكتيريا ، علامة لاختيار البلازميد في المختبر (أي جين مقاوم للمضادات الحيوية).
        ملاحظة: سيتم دمج العمود الفقري للبلازميد في جينوم البعوض في تصميم attB أحادي للتكامل (الشكل 3A) ، في حين أنه لن يتم إدراجه في تصميم attB المزدوج ل RMCE (الشكل 3B).

2. تحضير البلازميدات لمزيج الحقن المجهري

ملاحظة: يتضمن البروتوكول الموضح هنا استخدام اثنين من البلازميدات: بلازميد مانح يحمل الجين المتحول محل الاهتمام ، وبلازميد مساعد يعبر عن تكامل φC31 بموجب تنظيم مروج ذبابة الفاكهة Hsp7040.

  1. تنقية البلازميدات المانحة والمساعدة، باستخدام مجموعة تنقية البلازميد الخالية من السموم الداخلية.
    ملاحظة: تسلسل إعداد البلازميد النهائي المستخدم للحقن للتحقق من سلامة جميع المكونات.
  2. الجمع بين كميات مناسبة من اثنين من البلازميدات للحصول على مزيج مع تركيز نهائي من 350 نانوغرام / ميكرولتر من البلازميد المانحة و 150 نانوغرام / ميكرولتر من البلازميد المساعد عند إعادة تعليقه في مخزن الحقن المؤقت.
    ملاحظة: عند حساب الحجم اللازم من المزيج ، ضع في اعتبارك أن 10-15 ميكرولتر كافية لكل يوم من الحقن المخطط لها ويمكن تحضير الحمض النووي مسبقا وتخزينه عند -20 درجة مئوية. كما تم الإبلاغ عن تركيزات بلازميد مساعد إنتيغراز من 60-500 نانوغرام/ميكرولتر وتركيزات بلازميد مانح من 85-200 نانوغرام/ميكرولتر21،22،26،41.
  3. عجل الحمض النووي عن طريق إضافة 0.1 حجم من 3 M خلات الصوديوم (الرقم الهيدروجيني 5.2) و 2.5 حجم من الجليد البارد 100٪ EtOH والدوامة. يجب أن يكون الراسب الأبيض مرئيا على الفور. وجود مستحضرات البلازميد الأولية عالية التركيز (أي ~ 1 ميكروغرام / ميكرولتر) يحسن كفاءة هطول الأمطار.
    ملاحظة: نقطة التوقف - يمكن تخزين الراسب عند -20 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
  4. جهاز طرد مركزي عند 15000 × جم لمدة 20 دقيقة عند 4 درجات مئوية ، وتخلص من السوبرناتانت ، واغسل الكريات ب 1 مل من الثلج البارد 70٪ EtOH.
  5. اغسل الكريات ب 1 مل من EtOH المثلج بنسبة 70٪ وأجهزة الطرد المركزي عند 15000 × g لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
  6. تخلص من السوبرناتانت دون إزعاج الكريات وجفف الهواء.
  7. أعد تعليق الكريات في مخزن مؤقت للحقن 1x (0.1 mM Na3PO4 ، 5 mM KCl ، pH 7.2 ، مرشح 0.22 μm معقم) للوصول إلى تركيز نهائي إجمالي قدره 500 نانوغرام / ميكرولتر.
    ملاحظة: افترض أن بعض الحمض النووي سيفقد أثناء عملية هطول الأمطار. لذلك ، أضف حجما أصغر من مخزن الحقن المؤقت أولا ، وتحقق من التركيز على مقياس الطيف الضوئي (على سبيل المثال ، Nanodrop) ، ثم أضف حجما متبقيا مناسبا للوصول إلى 500 نانوغرام / ميكرولتر.
  8. تأكد من إنعاش الحمض النووي تماما ، وإعداد الأليكوتات من 10-15 ميكرولتر لكل منها وتخزينها عند -20 درجة مئوية.
  9. في يوم الحقن ، قم بإذابة أليكوت واحد وأجهزة طرد مركزي عند 15000 × g لمدة 5 دقائق لإزالة أي بقايا جسيمات.
    ملاحظة: هناك طريقة بديلة لإزالة الجسيمات وهي تصفية المحلول من خلال مرشح 0.22 ميكرومتر. تجنب وجود بقايا الجسيمات في مزيج الحقن لأنها تؤدي إلى انسداد الإبرة أثناء الحقن المجهري للجنين.

3. الحقن المجهري للأجنة من خط التحام الأنوفيليس

  1. يقوم الدم بتغذية البعوض البالغ من العمر 4-7 أيام من خط الالتحام المطلوب قبل 72 ساعة من الحقن المجهري (أي للحقن يومي الاثنين والثلاثاء إطعام الإناث في يوم الجمعة السابق ؛ للحقن يومي الخميس والجمعة إطعام الإناث يوم الاثنين من نفس الأسبوع).
  2. تغذية الدم البعوض من النوع البري (WT) (أي البعوض مع نفس الخلفية الجينومية لخط الالتحام) في نفس اليوم ؛ ستكون هناك حاجة إلى هذه للعبور.
    ملاحظة: يؤثر حجم ونوعية وجبة الدم على جودة البيض ، لذلك يوصى دائما باستخدام الدم الطازج (أي الدم المسحوب خلال الأيام ال 7 السابقة). قد تزيد تغذية الذراع أو التغذية على الفئران من جودة وكمية البيض ، ولكن لا يتم تشجيع هذه الأساليب. ستكون البروتوكولات المعتمدة المحددة ضرورية للاستخدام البشري والحيواني.
  3. إجراء الحقن المجهري للأجنة
    1. إجراء الحقن المجهري للجنين الغامبي في 25 mM NaCl42 عن طريق استهداف القطب الخلفي للجنين بزاوية 45 درجة. للحصول على بروتوكول مفصل لجمع الأجنة ومحاذاتها وحقنها المجهري، يرجى الرجوع إلى Pondeville et al.43 و Lobo et al.44.
    2. إجراء الحقن المجهري لجنين An. Stephensi في زيت الهالوكربون 700:27 (2:1) عن طريق استهداف القطب الخلفي للجنين بزاوية 30 درجة. يمكن العثور على بروتوكول مفصل لجمع الأجنة ومحاذاتها وحقنها المجهري في Terenius et al.45 و Lobo et al.44.
    3. انقل البيض مباشرة بعد الحقن في طبق بتري مملوء بالماء المقطر المعقم (الرقم الهيدروجيني 7.2) وأعاده إلى الظروف الحشرية.
  4. عند الفقس ، انقل يرقات G0 إلى صينية بالماء المقطر المملح (0.1٪ من الملح المنشط) يوميا والخلفية إلى الشرانق.
  5. معدل الفقس القياسي (أي عدد اليرقات التي فقست / عدد الأجنة التي تم حقنها).
    ملاحظة: تساعد حركة الأجنة على الفقس ، لذا فإن الدوران اللطيف أمر مرغوب فيه. يجب أن يبدأ الفقس ~ 48 ساعة بعد الحقن. نظرا لأن الحقن قد يسبب تأخيرا طفيفا في النمو ، فمن المستحسن الاستمرار في مراقبة اليرقات المتأخرة الفقس لمدة 3-4 أيام.

4. عبور وفحص الأفراد المتحولين

  1. [خطوة اختيارية] شاشة G0 (حقن) 1st أو 2nd instar يرقات (L1-L2) للتعبير العابر عن علامة الفلورسنت.
    1. استخدم ماصة زجاجية دقيقة الأطراف لنقل يرقات G0 L1-L2 إلى شرائح المجهر مع الآبار. ضع يرقة واحدة في كل بئر.
    2. استخدم مجسما فلوريا مزودا بالمرشح المناسب للكشف عن وجود تعبير عابر عن علامة الفلورسنت.
      ملاحظة: يتم إملاء نمط التعبير العابر من قبل المروج المستخدم. عند استخدام مروج 3xP3 ، يكون التعبير العابر لعلامة الفلورسنت مرئيا في الحليمات الشرجية (انظر الشكل 6 في Pondeville et al.43)
    3. الأفراد الإيجابيون G0 الخلفيون بشكل منفصل.
  2. فرز الشرانق G0 حسب الجنس تحت منظار مجسم52.
  3. دع الذكور يظهرون في أقفاص منفصلة في مجموعات من 3-5 (العائلات المؤسسة) وإضافة فائض 10 أضعاف من إناث WT المتطابقة مع العمر.
    ملاحظة: نظرا لأن الذكور يتزاوجون عدة مرات ، فمن المهم توفير فائض من إناث WT لزيادة فرص التزاوج لكل ذكر.
  4. دع الإناث تظهر في أقفاص منفصلة في مجموعات من 10-15 (العائلات المؤسسة) وإضافة عدد متساو من الذكور WT المتطابقة مع العمر.
    ملاحظة: إذا كانت هناك مساحة محدودة في الحشرات ، يمكن أن تظهر الإناث معا في قفص واحد. يمكن أن تكون نسبة الإناث إلى الذكور منخفضة مثل 1 ذكر إلى 3 إناث.
  5. السماح للبالغين بالتزاوج لمدة 4-5 أيام وتزويد الإناث بوجبة دم.
    ملاحظة: تغذية الدم وجمع البيض من الإناث G0 عدة مرات لزيادة فرص الحصول على المحولات من دورات التغذية البنية المتعددة.
  6. تغذية الدم الأفراد WT في نفس الوقت للعبور.
  7. جمع البيض والخلفية الناشئة الجيل القادم G1s.
  8. شاشة يرقات G1 L3-L4 للتألق المناسب لتحديد المحولات.
    1. اجمع اليرقات في طبق بتري مبطن بورق ترشيح أو على شريحة مجهر وشاشة باستخدام مجسمة فلورية مع مرشحات مناسبة لوجود العلامة المقدمة مع الشحنة الموسومة ب attB.
      ملاحظة: التألق المدفوع من قبل المروج 3xP3 مرئي في جميع مراحل ما بعد الجنين ويمكن إجراء الفحص على اليرقات الأصغر سنا ، ومع ذلك فهي أكثر هشاشة ويجب التعامل معها بعناية نسبية. يمكن أيضا فحص الشرانق .
      1. لتصميمات attB المفردة لشاشة التكامل لوجود العلامة الجديدة والموجودة مسبقا ؛ يجب أن يكون كلاهما موجودا نظرا لإدراج الكاسيت الجديد بجوار الكاسيت الأصلي (الشكل 3A ، الشكل 4). 
        ملاحظة: استثناء الفحص لتصميمات attB المفردة: عند استخدام خطوط الإرساء بدون علامة22، قم بفحص وجود العلامة الجديدة فقط. عند استخدام خطوط الإرساء حيث يؤدي التكامل إلى تعطيل العلامة الموجودة مسبقا21، قم بفحص وجود العلامة الجديدة وفقدان العلامة الموجودة مسبقا.
      2. بالنسبة للتصاميم المزدوجة attB ل RMCE ، وشاشة لوجود العلامة الجديدة وفقدان العلامة الموجودة مسبقا ، يجب أن تكون العلامة التي تم إدخالها حديثا فقط موجودة لأن الكاسيت الجديد يحل محل الكاسيت الأصلي (الشكل 3B ، الشكل 5).
        ملاحظة: يمكن استرداد أحداث التكامل العرضية في تجارب RMCE حيث يتم إعادة دمج attP واحد فقط وبالتالي سيكون كلا العلامتين موجودين. يمكن إجراء فحص أفراد G1 أيضا في مرحلة الخادرة باتباع نفس الإجراء52.
  9. نقل تحويل الأفراد G1 إلى صينية يرقات والخلفية إلى الشرانق. تجاهل الأفراد غير الفلورسنت والأفراد الذين لديهم نمط تعبير علامة غير متوقع.
  10. فرز الشرانق G1 المحولة حسب الجنس وعبورها بشكل جماعي مع أفراد WT المطابقين للعمر من الجنس الآخر.
  11. اسمح للبالغين بالتزاوج لمدة 4-5 أيام ، وتقديم وجبة دم ، وجمع البيض ، وتربية الجيل التالي من ذرية G2 .
    1. بالنسبة لتجارب التكامل الفردية ، اجمع البيض مباشرة من الصليب الجماعي لأن موقع التكامل متطابق في جميع الأفراد.
    2. بالنسبة لتجارب RMCE ، قم بجمع البيض من الإناث العازبات والحفاظ على النسل منفصلا حتى يكتمل التقييم الجزيئي بسبب الوجود المحتمل لاتجاهين بديلين للكاسيت (الشكل 3B).
  12. فحص ذرية G2 (إما في مرحلة اليرقة أو الخادرة) لوجود علامة الفلورسنت (من المتوقع أن يكون 50٪ من الأفراد إيجابيين) ، وتجاهل النسل غير الفلوري.
  13. ضع جانبا مجموعة فرعية من الأفراد الإيجابيين G2 للتحليل الجزيئي ، وقم بإرجاع الباقي إلى مرحلة البلوغ.
    ملاحظة: إذا كان يجب إبقاء جميع أفراد G2 على قيد الحياة، يمكن إجراء التحليل الجزيئي على أرجل شخص بالغ واحد46 أو استخراج الحمض النووي لحالة العذراء (L. Grigoraki Personal Communication). بدلا من ذلك ، يمكن إجراء التحليل الجزيئي بعد أن يكون جميع أفراد G2 قد أوضحوا وفقس البيض.
  14. السماح للذكور والإناث البالغين بالتقاطع في نفس القفص لإنشاء خط جديد معدل وراثيا.
    ملاحظة: بالنسبة لتجارب RMCE ، يجب أن يحدث تقاطع البالغين بين الأشقاء المشتقين من أنثى واحدة حتى يتم تحديد اتجاه الإدخال عن طريق التحليل الجزيئي.

5. التحقق الجزيئي من موقع الإدخال عن طريق تضخيم الحمض النووي (PCR)

  1. إعداد خريطة لموقع الإدراج المتوقع في جينوم خط الالتحام بعد التحول.
    1. تكامل واحد: تأكد من أن موقع الإدخال المتوقع يحمل بنية الإرساء الأصلية بالإضافة إلى التسلسل الكامل للبلازميد المانح بين الموقعين الهجينين attL و attR (الشكل 3A).
    2. RMCE: تأكد من أن موقع الإدراج المتوقع مطابق لموقع خط الإرساء حيث تحل مواقع attL المقلوبة المختلطة محل مواقع attP المقلوبة الأصلية ويحل قالب التبادل محل الكاسيت الموجود أصلا بينهما (الشكل 3B).
  2. تصميم أوليغونوكليوتيد الاشعال لتضخيم التقاطع الإدخالي على جانبي موضع التكامل.
    1. تكامل واحد: تصميم أزواج أوليغونوكليوتيد التمهيدي التي تمتد عبر مواقع attR و / أو attL . يجب أن يرتبط أحد التمهيدي ببناء الالتحام المتكامل سابقا والآخر بالجين المتحول المدمج حديثا (الشكل 3A).
    2. RMCE: يمكن أن يحدث استبدال الكاسيت في اتجاهين مختلفين فيما يتعلق بالكروموسوم (المعين A و B). تصميم مجموعات بديلة من 4 أوليغ نوكليوتيد أولي لإعطاء منتج منفصل في اتجاه واحد فقط ، مع تشخيص زوج واحد للاتجاه A ، والآخر للاتجاه B (الشكل 3B ، الشكل 6).
  3. استخراج الحمض النووي الجينومي من الأفراد الإيجابيين G2 وإجراء PCR التشخيصي والرحلان الكهربائي الهلامي لتصور وجود الأمبليكونات التشخيصية المتوقعة من خرائط موقع التكامل المتوقعة.
    ملاحظة: يمكن بدلا من ذلك استخراج الحمض النووي من أرجل شخص بالغ واحد46 أو حالات العذراء (L. Grigoraki التواصل الشخصي).
  4. تسلسل منتجات PCR لتأكيد التسلسلات المتوقعة.

Figure 2
الشكل 2. رسم تخطيطي لسير العمل لتعديل الجينوم φC31 الموجه للموقع في بعوض الأنوفيلس . يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3. الأساس الجزيئي للتكامل الفردي بوساطة φC31 (A) و RMCE (B)". أ) خرائط تخطيطية للإدراج الجينومي في خط التحام An. Stephensi (80.9 ، الجدول 1) يحمل موقعا واحدا ل attP ومعلما ب CFP (أعلى) ، وبلازميد مانح بتصميم attB واحد يحمل علامة DsRed (في الوسط) ، وموقع الإدراج المتوقع الناتج بعد التكامل الناجح (أسفل). ب) خرائط تخطيطية للإدراج الجينومي في خط التحام في الغامبية (A11، الجدول 1) تحمل موقعين مقلوبين ل attP ومعلمين ب CFP (أعلى)، وبلازميد مانح بتصميم مزدوج attB يحمل علامة YFP (وسط)، وموقع الإدراج المتوقع الناتج بعد نجاح RMCE (أسفل). خط متموج: جينوم البعوض. الأسهم المخططة: أذرع الترانسبوزون piggyBac ؛ 3xP3: مروج لعلامة الفلورسنت ؛ SV40: المنهي الفيروسي. أوري: أصل التكرار. AmpR: جين مقاومة الأمبيسلين. تمثل خطوط العبور موقع (مواقع) إعادة التركيب بين موقعي attP و attB. تمثل الأسهم السوداء المرقمة مواقع ربط تمهيدية للتحقق الجزيئي من موضع الإدراج (الخطوة 5 من البروتوكول). تتوفر البلازميدات المفردة والمزدوجة الموسومة بعلامة attB المشروحة بالكامل من المؤلفين عند الطلب. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Representative Results

يتيح البروتوكول الموضح هنا توليد خط أنوفيليس مستقر معدل وراثيا في حوالي 10 أسابيع (بافتراض دورة حياة البعوض لمدة 21 يوما).

من المتوقع أن تكون معدلات فقس اليرقات بعد الحقن في An. gambiae أقل بشكل عام من An. Stephensi ، ولكن تم الإبلاغ عن معدلات الفقس بين 10-50٪ 9,20,24,26,33,43,47. بالنظر إلى تقنية الحقن المناسبة ، فإن معدلات الفقس التي تبلغ ≥20٪ كافية بشكل عام لإنتاج المحولات. يمكن تقييم امتصاص الحمض النووي من قبل الأجنة عن طريق فحص اليرقات الصغيرة للتعبير العابر عن علامة الفلورسنت. في تجارب RMCE الناجحة في An. gambiae باستخدام مروج 3xP3 ، أظهر ما يصل إلى 50٪ من يرقات G0 الباقية على قيد الحياة تعبيرا عرضيا عن العلامة في الحليمات الشرجية48.

من الصعب تقييم التقديرات المعممة لكفاءة التحول بين المختبرات وحتى بين التجارب لأن التحول يعتمد على تفاعل معقد للمتغيرات بما في ذلك النقاء والتركيز والحجم والسمية المحتملة للحمض النووي المحقون ، وجودة البيض ، والتعامل مع البيض قبل وبعد الحقن ، وتربية البعوض ، والأهم من ذلك تجربة المشغل. تم الحصول على معدلات تحويل تصل إلى 7٪ ل RMCE في An. gambiae (محسوبة على أنها عدد أحداث التحول المستقلة في إجمالي أفراد G0) 9,26,33 ، وما يصل إلى 2.2٪ معدل التحويل للتكامل في An. stephensi. نقترح حقن ما لا يقل عن 500 جنين ، مما يؤدي إلى فقس ما لا يقل عن 100 يرقات G0 وإلى مؤسسي G0 البالغين الذين يمكن من خلالها الحصول على ذرية متحولة بشكل ثابت. إذا كان فحص التعبير العابر في يرقات G0 ، يمكن توقع ما يصل إلى 40 يرقات إيجابية.

يتم الإبلاغ عن أمثلة على التحقق من صحة النمط الظاهري للتحول عن طريق فحص علامات الفلورسنت التي ينظمها مروج 3xP3 في الشكل 4 والشكل  5. يوضح الشكل 4 خطا جديدا ل An. Stephensi تم الحصول عليه عن طريق إدخال كاسيت يحمل علامة DsRed في خط إرساء يحمل علامة CFP (80.9 ، الجدول 1) ، مما أدى إلى تعبير ذرية G1 عن كلا العلامتين كما هو موضح في التألق الأحمر والأزرق المكتشف في العينين.

ومن المتوقع بدلا من ذلك أن تؤدي تصاميم RMCE إلى استبدال العلامة التي تم إدخالها أصلا في خط الالتحام بعلامة البلازميد المانحة. ويبين الشكل 5 ألف والشكل باء تبادل العلامات هذا في خط التحام في الغامبيا الموسومة ب CFP (A11، الجدول 1) حيث تفقد علامة CFP بعد نجاح RMCE وتكتسب علامة YFP مما يؤدي إلى تألق أصفر (ولكن ليس أزرق) للعين والحبل  العصبي33. في بعض الأحيان ، يمكن أن يؤدي RMCE إلى حدث تكامل واحد بدلا من تبادل الكاسيت المعدل وراثيا المطلوب كما هو موضح في الشكل 5C ، حيث يتم عرض يرقة مميزة بكل من علامات CFP الأصلية وعلامات YFP الجديدة. يذكر أن ما يصل إلى 50٪ من إجمالي عدد أحداث التحول هي عمليات تكامل فردية9,33.

عند فحص وجود علامة الفلورسنت ، من الأهمية بمكان التمييز بين إشارتها والتألق الذاتي المحتمل في الخلفية. هذا مهم بشكل خاص عند استخدام CFP حيث تعرض يرقات الأنوفيليس التألق الذاتي الأزرق الطبيعي (الشكل 6A). إن زيادة التكبير والتركيز على الأنسجة والأعضاء التي يتوقع أن يكون فيها التألق مدفوعا من قبل المروج ضروري لتحديد الأفراد الحقيقيين الإيجابيين ل CFP كما هو موضح في الشكل 6B باستخدام علامة 3xP3-CFP.

يتم أخيرا تقييم المحولات الفردية جزيئيا عبر PCR لتأكيد موقع الإدخال المتوقع. ويشير الشكل 7 إلى التحقق من صحة تفاعل البوليميراز المتسلسل لدى الأفراد من خط تبادل An. gambiae الذي يبين الاتجاهين المحتملين للإدراج في جينوم البعوض33.

Figure 4
الشكل 4. التحقق من صحة التكامل الفردي φC31 في يرقات An. stephensi (العرض الظهري). أ) يعبر خط الإرساء (80.9 ، الجدول 1) عن CFP في العيون بموجب تنظيم مروج 3xP3 . ب) يؤدي التكامل الناجح إلى التعبير عن DsRed المكتسبة حديثا بالإضافة إلى علامة CFP الأصلية في العينين. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 5
الشكل 5. التحقق من صحة φC31 RMCE في يرقات الغامبية (عرض بطني). أ) يعبر خط الالتحام (A10 ، الجدول 1) عن CFP بموجب تنظيم المروج 3xP3 في العينين (ه) والحبل العصبي (nc)5. ب) نتائج RMCE الناجحة في مبادلة علامة الفلورسنت من CFP إلى YFP33. ج) حدث تكامل واحد حدث أثناء تجربة RMCE حيث تعبر اليرقة المحولة عن كل من علامات CFP و YFP. تحمل هذه اليرقة مكونات GAL4 / UAS التي تسبب نمط تعبير واسع من YFP ، قوي بشكل خاص في عضلات البطن (am). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 6
الشكل 6. CFP autofluorescence في يرقات An. gambiae (عرض الظهرية). أ) صورة جنبا إلى جنب ليرقة L4 إيجابية (CFP+) وسالبة (CFP-) باستخدام مرشح CFP. ب) صورة مقربة لعيون اليرقات تكشف عن CFP + مقابل CFP- فرد. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 7
الشكل 7. التحقق الجزيئي من اتجاه إدخال الكاسيت في An. gambiae المعدلة وراثيا التمثيلية التي أنشأتها φC31 RMCE. يمكن إدخال الكاسيت المعدل وراثيا في أحد الاتجاهين البديلين (A أو B) فيما يتعلق بموقع الإدراج. يستخدم كل تفاعل PCR (I - IV) مزيجا من الاشعال (5-8)33 المصممة لإعطاء جزء تضخيم تشخيصي لكل اتجاه كما هو موضح في خرائط البلازميد التخطيطية. T1: تمثيل الفرد المعدل وراثيا الذي يحمل اتجاه الإدخال A ؛ T2: تمثيل الفرد المعدل وراثيا الذي يحمل اتجاه الإدخال B ؛ WT: نوع البرية. DL: خط الإرساء ؛ -: تفاعل سلبي التحكم حيث تم استخدام الماء كقالب. تم تعديل هذا الرقم من Adolfi et al. (2019)33. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

جنس وتر اسم attP (ق) كروموسوم بعض علامة المروج مؤسسة المنشأ مرجع
أ. ستيفنسي إنديانا 26.10ب واحد 2R 3xP3-eCFP جامعة كاليفورنيا إيرفين 25
أ. ستيفنسي إنديانا 44 سيبل واحد X 3xP3-eCFP جامعة كاليفورنيا إيرفين 23, 24
أ. ستيفنسي إنديانا 80.9ب واحد 2 لتر 3xP3-eCFP جامعة كاليفورنيا إيرفين هذه الدراسة
الغامبية جي 3 113 واحد 2R 3xP3-eCFP جامعة كاليفورنيا إيرفين هذه الدراسة
الغامبية كيل إي سي واحد 3R 3xP3-eCFP جامعة كيلي. 19, 43
الغامبية جي 3 اكس 1 واحد 2 لتر لا توجد علامة جامعة ستراسبورغ 22
الغامبية جي 3 YAttP واحد Y 3xP3-RFP إمبريال كوليدج لندن 21
الغامبية جي 3 أ١٠ ب مزدوج 2R 3xP3-eCFP مدرسة ليفربول Trop. Med. 5
الغامبية جي 3 أ١١ ب مزدوج 2R 3xP3-eCFP مدرسة ليفربول Trop. Med. 9
a. سلالة من جامعة جونز هوبكنز (هدية من M. Jacobs-Lorena) وفي الثقافة في جامعة كاليفورنيا إيرفين لمدة >20 عاما.
b. هذه السطور متاحة من المؤلفين بناء على طلب معقول.
ج. هذا الخط متاح في مستودع BEI www.beiresources.org باسم MRA-1163.

الجدول 1. خطوط إرساء Anopheles attP .

Discussion

يعد التصميم الدقيق للبلازميدات الموسومة بعلامة attB المتوافقة مع خط الإرساء المفضل أمرا بالغ الأهمية لنجاح التجربة. يجب النظر بعناية في اختيار العلامة المستخدمة لفحص المحولات ، بما في ذلك لون التألق ونمط تعبيره ، والذي سيخضع للنمط الموجود بالفعل في خط الالتحام. من الضروري استخدام علامات الفلورسنت التي يمكن تمييزها بسهولة: تشمل مجموعات العلامات الجيدة RFP (أحمر) / CFP (سماوي) ، RFP (أحمر) / GFP (أخضر) ، RFP (أحمر) / YFP (أصفر) ، و YFP (أصفر) / CFP (سماوي) ، في حين أن المجموعات التي يجب تجنبها هي YFP (أصفر) / GFP (أخضر) و CFP (سماوي) / GFP (أخضر). يعد المروج 3xP39 ، الخاص بالعينين والحبل العصبي ، هو الأكثر استخداما لدفع التعبير عن علامات الفلورسنت لتكوين البعوض. في الواقع ، تستخدم جميع خطوط إرساء Anopheles المتاحة حاليا هذا المروج. المناطق التنظيمية البديلة هي تلك الخاصة بجين An. gambiae polyubiquitin (PUBc)5 أو المروج الفيروسي IE120 ، الذي يدفع التعبير في أنسجة متعددة. عند استخدامها جنبا إلى جنب مع 3xP3 ، فإن هؤلاء المروجين سيوسعون مجموعات الألوان المحتملة وحتى استخدام نفس الفلوروفور. ينشط المروجون المشار إليهم طوال دورة حياة البعوض مما يسمح بالفحص ومراقبة التألق في جميع مراحل الحياة. هناك اعتبار إضافي أثناء تصميم البلازميد وهو حجم الشحنة المراد دمجها أو تبادلها. في حين أن نظام φC31 لديه قدرات حمل ملحوظة18 ، ينبغي اعتبار أن حجم البلازميد المانح يرتبط بشكل سلبي بشكل عام بكفاءة التحول22.

في البروتوكول الموصوف ، مصدر integrase هو بلازميد مساعد يعبر عن الإنزيم في كل مكان40. قد يؤدي وجود التكاملات في كل مكان إلى تحول الخلايا الجسدية إذا لم يتم توجيه الحقن المجهري بدقة إلى المنطقة التي يتشكل فيها الخط الجرثومي. في حين أن أحداث التحول هذه ستفقد لأنها غير قابلة للتوريث ، فإن التأثيرات الجسدية يمكن أن تقلل من لياقة الأفراد الذين يتم حقنهم. لتجنب ذلك وزيادة كفاءة التحول، يمكن أن يقتصر تعبير integrase على الخط الجرثومي، على سبيل المثال باستخدام مروج vasa22,26. تصف بروتوكولات أخرى استخدام الحمض النووي الريبي الرسولي المنسوخ في المختبر (mRNA) كمصدر ل φC31 integrase19,24,43. ومع ذلك ، فإن هذا ينطوي على إعداد شاق للحمض النووي الريبوزي المرسال ويتطلب معالجة دقيقة لمزيج الحقن واستخدام الكواشف الخالية من RNase لتجنب التدهور. وقد ثبت أن مصادر البلازميد للتكامل في كل من An. gambiae9,21,22,26,33,37 و An. Stephensi (A.A. التواصل الشخصي) موثوقة وتؤدي إلى تحول فعال ، وبالتالي فهي خيارنا المفضل. خيار آخر لتسليم integrase هو إنتاجه في الجسم الحي في خطوط مساعدة ذاتية الالتحام. تم إنشاء مثل هذه الخطوط في An. gambiae التي تعبر عن تكامل φC31 تحت تنظيم nanos المروج الخاص بالخط الجرثومي ووجد أنها تؤدي إلى تحسين كفاءة البقاء على قيد الحياة والتحول20. ومع ذلك ، يجب النظر في أحمال اللياقة البدنية المحتملة التي يفرضها الإنتاج في الجسم الحي لإنزيم integrase على خط المساعدة.

وكما هو الحال مع التقنيات المعدلة وراثيا الأخرى، يجب إيلاء عناية خاصة لتربية وعبور الأفراد المشتقين من الأجنة المحقونة لزيادة فرص استعادة المحولات إلى أقصى حد. يمكن أولا استرداد الأفراد الذين ورثوا الجين المحور بثبات في ذرية G1. ومع ذلك ، يمكن تقييم العلامات المبكرة للتحول المحتمل من خلال وجود تعبير عرضي عابر لعلامة الفلورسنت في الحليمات الشرجية و / أو الحبل العصبي ليرقات G0 الأولى والثانية عند استخدام مروج 3xP343. في حين أن وجود التألق العابر يشير إلى نجاح توصيل البلازميد ، إلا أنه لا يضمن تحول الخط الجرثومي الوراثي. وبالمثل ، فإن عدم وجود تعبير عابر لا يستبعد التحول الناجح. ومع ذلك ، فقد لوحظ أن الأفراد الإيجابيين بشكل عابر هم أكثر عرضة لإنتاج ذرية معدلة وراثيا مقارنة بالأفراد السلبيين العابرين 43,48. في أيدي الخبراء ، قد تكون تربية وعبور الأفراد الإيجابيين فقط خيارا لتقليل أعداد البعوض. ومع ذلك ، نظرا لأهمية وهشاشة يرقات G0 الصغيرة ، لا يزال من المستحسن أقل قدر من التلاعب ويوصى دائما بتربية جميع أفراد G0.

تم تصميم مخطط التزاوج المبلغ عنه في هذا البروتوكول لزيادة فرصة التزاوج إلى أقصى حد وعزل أحداث التحول المستقلة. ومع ذلك ، إذا كانت المساحة الحشرية أو توافر الموظفين يمثل مشكلة ، فيمكن تجميع البالغين G0 حسب الجنس في أقفاص واحدة إذا تم توفير عدد كاف من الأفراد من الجنس الآخر. مثل هذا الإعداد لن يسمح بالتمييز بين أحداث التحول المتعددة التي تحدث في الأفراد من نفس القفص. اعتمادا على الإعداد التجريبي ، من المتوقع وجود علامة مزدوجة (تكامل فردي) أو واحدة (RMCE) أثناء عملية الفحص. في تجارب التكامل الفردي ، من المهم التحقق من وجود العلامة الأصلية من خط الإرساء ، بينما في RMCE من المهم التحقق من فقدان العلامة المدمجة سابقا. في الواقع ، ليس من غير المألوف في تصميمات RMCE استعادة المحولات التي حدث فيها تكامل واحد بدلا من التبادل بسبب إعادة تركيب موقع attP واحد9,33. في مثل هؤلاء الأفراد ، توجد علامات الفلورسنت بالإضافة إلى العمود الفقري البلازميد الكامل للمتبرع الذي يسلط الضوء على أهمية إجراء فحص شامل لكل من علامات الفلورسنت.

في حين أن وجود أنماط التألق المتوقعة يشير إلى التحول الناجح ، يجب إجراء التوصيف الجزيئي لموقع الإدراج. وللقيام بذلك، يعد إعداد خرائط دقيقة لموضع الإدخال المتوقع، بما في ذلك المناطق الجينومية المحيطة بخط الالتحام، أمرا بالغ الأهمية لتصميم أوليغونوكليوتيد أوليغونوكليوتيد تشخيصي كاف لتحليلات تضخيم الجينات. تؤدي أحداث التكامل الفردي إلى تكوين مواقع هجينة attR و attL عند التقاطع بين الحمض النووي المدمج حديثا والكاسيت الذي تم إدخاله مسبقا. يمكن استهداف هذه المواقع للتحقق من صحة موقع الإدراج. في تصاميم RMCE ، يمكن أن يحدث إدخال كاسيت المتبرع في اتجاهين بديلين فيما يتعلق بالموضع الجينومي ، وبالتالي يمكن استخدام أربعة اشعال في مجموعات PCR بديلة للكشف عن الاتجاه الذي يحمله الخط. نظرا لأن اتجاه إدخال الكاسيت قد يؤثر على التعبير الجيني العابر ، في تحليل التعبير الجيني المقارن ، من المهم استخدام خطوط تحمل نفس اتجاه الإدراج.

عند العمل مع أعداد منخفضة من المحولات ، قد لا يكون من المستحسن التضحية بأفراد كاملين من أجل التحليل الجزيئي. ويتمثل أحد الخيارات في ذلك في إجراء تحليل جزيئي على الحمض النووي المستخرج من أرجل شخص بالغ واحد46 لأن فقدان الساق لا يؤثر على قدرة الأنثى البالغة على التزاوج والبيض49. ومع ذلك ، هناك خطر من إتلاف الفرد في عملية إزالة الساق. تم الحصول على النجاح باستخدام حالات العذراء المهملة (L. Grigoraki التواصل الشخصي) ، ولكن النهج الأكثر أمانا هو إجراء التحليل الجزيئي على الآباء G2 بعد الحصول على ذرية G3 قابلة للحياة.

في السنوات الأخيرة، أحدثت تقنية كريسبر/كاس9 ثورة في طريقة إجراء تحرير الجينوم الخاص بالموقع26,41,50,51. على عكس RMCE الموجهة للموقع ، فإن عمليات تكامل الجينات بوساطة CRISPR / Cas9 (طرق الاختراق) مستقلة عن وجود مواقع إعادة التركيب المدرجة مسبقا مع حدث تحويل من خطوة واحدة فقط مطلوبة. ومع ذلك، يعتمد نظام كريسبر/كاس9 على وجود تسلسلات جينومية كبيرة معروفة تحيط بموقع الإدخال المطلوب للإصلاح الموجه بالتماثل الناجح، وكذلك على التعرف الفعال على الموقع بوساطة الحمض النووي الريبي المرشد. لا يمكن دائما استيفاء هذه الشروط أو قد تكون شاقة لاستكشاف الأخطاء وإصلاحها ، وبالنظر إلى توفر خطوط التحام متعددة في An. gambiae و An. Stephensi والخطوط المشتقة منها ، يظل نظام φC31 أداة قيمة للغاية لإجراء مقارنات مباشرة بين الأنماط الظاهرية بين الجينات المحورة في نفس المواقع الجينومية.

Disclosures

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

Acknowledgments

نحن ممتنون لكيونا باركر (UCI) لتقديمها صورا ليرقات An. Stephensi المعدلة وراثيا ، ولفريزر كولمان (LSTM) وبيث بولتون (LSTM) لتوفير يرقات An. gambiae المعدلة وراثيا. كما قدمت بيث بولتون (LSTM) مساعدة ثمينة أثناء تصوير يرقات الغامبيا . تم تمويل هذا العمل من قبل معهد تاتا لعلم الوراثة والمجتمع (TIGS) وصندوق محفز مدير LSTM الممنوح ل A.A. (DCF2014AA). A.A.J. هو أستاذ دونالد برين في جامعة كاليفورنيا ، إيرفين.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5 mL eppendorf tubes
8-well microslides VWR MARI1216690
DNeasy Blood & Tissue Kit Qiagen 69504
EndoFree Plasmid Maxi Kit (10) Qiagen 12362
Ethanol, Absolute, Molecular Biology Grade
Filter set CFP for Leica MZ FLIII Excitation 436/20 nm, extinction 480/40 nm Leica 10446363
Filter set dsRED for Leica MZ FLIII Excitation 545/30 nm, extinction 620/60 nm Leica 10447079
Filter set YFP customised for Leica MZ FLIII Omega Optical 500QM25, 500QM35
Halocarbon oil 27 Sigma H8773
Halocarbon oil 700 Sigma H8898
Petri dishes
Potassium chloride
Sodium Chloride
Sodium phosphate dibasic
Sodium Acetate Solution (3 M), pH 5.2 Thermo Fisher Scientific (Life Technologies) R1181
Stable brush Size 0

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Adolfi, A., Lycett, G. J. Opening the toolkit for genetic analysis and control of Anopheles mosquito vectors. Current Opinion in Insect Science. 30, 8-18 (2018).
  2. Grossman, G. L., Rafferty, C. S., Clayton, J. R., Stevens, T. K., Mukabayire, O., Benedict, M. Q. Germline transformation of the malaria vector, Anopheles gambiae, with the piggyBac transposable element. Insect Molecular Biology. 10 (6), 597-604 (2001).
  3. Nolan, T., Bower, T. M., Brown, A. E., Crisanti, A., Catteruccia, F. piggyBac-mediated germline transformation of the malaria mosquito Anopheles stephensi using the red fluorescent protein dsRED as a selectable marker. Journal of Biological Chemistry. 277 (11), 8759-8762 (2002).
  4. Perera, O. P., Harrell, R. A., Handler, A. M. Germ-line transformation of the South American malaria vector, Anopheles albimanus, with a piggyBac/EGFP transposon vector is routine and highly efficient. Insect Molecular Biology. 11 (4), 291-297 (2002).
  5. Adolfi, A., Pondeville, E., Lynd, A., Bourgouin, C., Lycett, G. J. Multi-tissue GAL4-mediated gene expression in all Anopheles gambiae life stages using an endogenous polyubiquitin promoter. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 96, 1-9 (2018).
  6. Carballar-Lejarazú, R., Jasinskiene, N., James, A. Exogenous gypsy insulator sequences modulate transgene expression in the malaria vector mosquito, Anopheles stephensi. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (18), 7176-7181 (2013).
  7. Galizi, R., et al. A synthetic sex ratio distortion system for the control of the human malaria mosquito. Nature Communications. 5, 3977 (2014).
  8. Nolan, T., Petris, E., Müller, H. M., Cronin, A., Catteruccia, F., Crisanti, A. Analysis of two novel midgut-specific promoters driving transgene expression in Anopheles stephensi mosquitoes. PLoS ONE. 6 (2), 16471 (2011).
  9. Lynd, A., Balabanidou, V., Vontas, J., Lycett, G. J. Development of a functional genetic tool for Anopheles gambiae oenocyte characterisation: appliction to cuticular hydrocarbon synthesis. BioRxiv. , (2019).
  10. O'Brochta, D. A., Alford, R. T., Pilitt, K. L., Aluvihare, C. U., Harrell, R. A., Harrell, R. A. piggyBac transposon remobilization and enhancer detection in Anopheles mosquitoes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (39), 16339-16344 (2011).
  11. O'Brochta, D. A., Pilitt, K. L., Harrell, R. A., Aluvihare, C., Alford, R. T. Gal4-based enhancer-trapping in the malaria mosquito Anopheles stephensi. G3. 2 (11), Bethesda. 1305-1315 (2012).
  12. Macias, V. M., et al. nanos-Driven expression of piggyBac transposase induces mobilization of a synthetic autonomous transposon in the malaria vector mosquito, Anopheles stephensi. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 87, 81-89 (2017).
  13. Nimmo, D. D., Alphey, L., Meredith, J. M., Eggleston, P. High efficiency site-specific genetic engineering of the mosquito genome. Insect Molecular Biology. 15 (2), 129-136 (2006).
  14. Kim, A., Pyykko, I. Size matters: Versatile use of PiggyBac transposons as a genetic manipulation tool. Molecular and Cellular Biochemistry. 354, 301-309 (2011).
  15. Thorpe, H. M., Smith, M. C. M. In vitro site-specific integration of bacteriophage DNA catalyzed by a recombinase of the resolvase/invertase family. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (10), 5505-5510 (1998).
  16. Khaleel, T., Younger, E., Mcewan, A. R., Varghese, A. S., Smith, M. C. M. A phage protein that binds φC31 integrase to switch its directionality. Molecular Microbiology. 80 (6), 1450-1463 (2011).
  17. Farruggio, A. P., Chavez, C. L., Mikell, C. L., Calos, M. P. Efficient reversal of phiC31 integrase recombination in mammalian cells. Biotechnology Journal. 7 (11), 1332-1336 (2012).
  18. Venken, K. J. T., He, Y., Hoskins, R. A., Bellen, H. J. P[acman]: A BAC Transgenic Platform for Targeted Insertion of Large DNA Fragments in D. melanogaster. Science. 314 (5806), 1747-1751 (2006).
  19. Meredith, J. M., et al. Site-specific integration and expression of an anti-malarial gene in transgenic Anopheles gambiae significantly reduces Plasmodium infections. PLoS ONE. 6 (1), 14587 (2011).
  20. Meredith, J. M., Underhill, A., McArthur, C. C., Eggleston, P. Next-Generation Site-Directed Transgenesis in the Malaria Vector Mosquito Anopheles gambiae: Self-Docking Strains Expressing Germline-Specific phiC31 Integrase. PLoS ONE. 8 (3), 59264 (2013).
  21. Bernardini, F., et al. Site-specific genetic engineering of the Anopheles gambiae Y chromosome. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (21), 7600-7605 (2014).
  22. Volohonsky, G., et al. Tools for Anopheles gambiae Transgenesis. G3. 5 (6), Bethesda. 1151-1163 (2015).
  23. Amenya, D. A., et al. Comparative fitness assessment of Anopheles stephensi transgenic lines receptive to site-specific integration. Insect Molecular Biology. 19 (2), 263-269 (2010).
  24. Isaacs, A. T., et al. Transgenic Anopheles stephensi coexpressing single-chain antibodies resist Plasmodium falciparum development. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (28), 1922-1930 (2012).
  25. Pham, T. B., et al. Experimental population modification of the malaria vector mosquito, Anopheles stephensi. PLoS Genetics. 15 (12), 1008440 (2019).
  26. Hammond, A., et al. A CRISPR-Cas9 gene drive system targeting female reproduction in the malaria mosquito vector Anopheles gambiae. Nature Biotechnology. 34 (1), 78-83 (2015).
  27. Groth, A. C., Fish, M., Nusse, R., Calos, M. P. Construction of Transgenic Drosophila by Using the Site-Specific Integrase from Phage phiC31. Genetics. 166 (4), 1775-1782 (2004).
  28. Franz, A. W. E., et al. Comparison of transgene expression in Aedes aegypti generated by mariner Mos1 transposition and site-directed recombination. Insect Molecular Biology. 20 (5), 587-598 (2011).
  29. Labbé, G., Nimmo, D., Alphey, L. piggybac-and PhiC31-Mediated Genetic Transformation of the Asian Tiger Mosquito, Aedes albopictus (Skuse). PLoS Neglected Tropical Diseases. 4 (8), 788 (2010).
  30. Schetelig, M. F., Scolaric, F., Handler, A. M., Kittelmann, S., Gasperi, G., Wimmer, E. A. Site-specific recombination for the modification of transgenic strains of the Mediterranean fruit fly Ceratitis capitata. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (43), 18171-18176 (2009).
  31. Yonemura, N., et al. phiC31-integrase-mediated, site-specific integration of transgenes in the silkworm, Bombyx mori (Lepidoptera: Bombycidae). Applied Entomology and Zoology. 43 (11), 997-1008 (2013).
  32. Bateman, J. R., Lee, A. M., Wu, C. T. Site-specific transformation of Drosophila via phiC31 integrase-mediated cassette exchange. Genetics. 173 (2), 769-777 (2006).
  33. Adolfi, A., Poulton, B., Anthousi, A., Macilwee, S., Ranson, H., Lycett, G. J. Functional genetic validation of key genes conferring insecticide resistance in the major African malaria vector, Anopheles gambiae. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (51), 25764-25772 (2019).
  34. Haghighat-Khah, R. E., et al. Site-specific cassette exchange systems in the aedes aegypti mosquito and the Plutella xylostella moth. PLoS ONE. 10 (4), 0121097 (2015).
  35. Long, D., Lu, W., Zhang, Y., Bi, L., Xiang, Z., Zhao, A. An efficient strategy for producing a stable, replaceable, highly efficient transgene expression system in silkworm, Bombyx mori. Scientific Reports. 5 (1), 8802 (2015).
  36. Volohonsky, G., et al. Transgenic Expression of the Anti-parasitic Factor TEP1 in the Malaria Mosquito Anopheles gambiae. PLoS Pathogens. 13 (1), 1006113 (2017).
  37. Grigoraki, L., Grau-Bové, X., Yates, H. C., Lycett, G. J., Ranson, H. Isolation and transcriptomic analysis of anopheles gambiae oenocytes enables the delineation of hydrocarbon biosynthesis. eLife. 9, 58019 (2020).
  38. Kyrou, K., et al. A CRISPR-Cas9 gene drive targeting doublesex causes complete population suppression in caged Anopheles gambiae mosquitoes. Nature Biotechnology. 36 (11), 1062-1066 (2018).
  39. Berghammer, A. J., Klingler, M., Wimmer, E. A. A universal marker for transgenic insects. Nature. 402 (6760), 370-371 (1999).
  40. Ringrose, L. Transgenesis in Drosophila melanogaster. Methods in Molecular Biology. 561, 3-19 (2009).
  41. Dong, Y., Simões, M. L., Marois, E., Dimopoulos, G. CRISPR/Cas9 -mediated gene knockout of Anopheles gambiae FREP1 suppresses malaria parasite infection. PLoS Pathogens. 14 (3), 1006898 (2018).
  42. Lombardo, F., Lycett, G. J., Lanfrancotti, A., Coluzzi, M., Arcà, B. Analysis of apyrase 5' upstream region validates improved Anopheles gambiae transformation technique. BMC research notes. 2, 24 (2009).
  43. Pondeville, E., et al. Efficient ΦC31 integrase-mediated site-specific germline transformation of Anopheles gambiae. Nature Protocols. 9 (7), 1698-1712 (2014).
  44. Lobo, N. F., Clayton, J. R., Fraser, M. J., Kafatos, F. C., Collins, F. H. High efficiency germ-line transformation of mosquitoes. Nature protocols. 1 (3), 1312-1317 (2006).
  45. Terenius, O., Juhn, J., James, A. A. Injection of An. stephensi embryos to generate malaria-resistant mosquitoes. Journal of Visualized Experiments. 5, 216 (2007).
  46. Lynd, A., et al. Insecticide resistance in Anopheles gambiae from the northern Democratic Republic of Congo, with extreme knockdown resistance (kdr) mutation frequencies revealed by a new diagnostic assay. Malaria Journal. 17 (1), 412 (2018).
  47. Marinotti, O., et al. Development of a population suppression strain of the human malaria vector mosquito, Anopheles stephensi. Malaria Journal. 12 (1), 142 (2013).
  48. Adolfi, A. In vivo functional genetic analysis of insecticide resistance in the malaria mosquito Anopheles gambiae. University of Liverpool. , PhD thesis (2017).
  49. Isaacs, A. T., Lynd, A., Donnelly, M. J. Insecticide-induced leg loss does not eliminate biting and reproduction in Anopheles gambiae mosquitoes. Scientific Reports. 7, 46674 (2017).
  50. Gantz, V. M., et al. Highly efficient Cas9-mediated gene drive for population modification of the malaria vector mosquito Anopheles stephensi. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (49), 6736-6743 (2015).
  51. Li, M., Akbari, O. S., White, B. J. Highly efficient site-specific mutagenesis in malaria mosquitoes using CRISPR. G3: Genes, Genomes, Genetics. 8 (2), 653-658 (2018).
  52. Poulton, B. C., et al. Using the GAL4-UAS System for Functional Genetics in Anopheles gambiae. J. Vis. Exp. , (2021).

Tags

علم الوراثة ، العدد 168 ، Anopheles ، φC31 ، موجه للموقع ، الالتحام ، التكامل ، تبادل الكاسيت ، البعوض ، المعدل وراثيا
التكامل بوساطة <em>φC31</em> الموجهة بالموقع وتبادل الكاسيت في نواقل <em>الأنوفيليس</em> للملاريا
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Adolfi, A., Lynd, A., Lycett, G. J., … More

Adolfi, A., Lynd, A., Lycett, G. J., James, A. A. Site-Directed φC31-Mediated Integration and Cassette Exchange in Anopheles Vectors of Malaria. J. Vis. Exp. (168), e62146, doi:10.3791/62146 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter