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Genetics

Integración mediada por φC31 dirigida por sitios e intercambio de casetes en anopheles vectores de malaria

Published: February 2, 2021 doi: 10.3791/62146
Automatic Translation
1,2, 1, 1, 2,3
1Vector Biology Department, Liverpool School of Tropical Medicine, 2Department of Microbiology & Molecular Genetics, University of California, 3Department of Molecular Biology & Biochemistry, University of California

Summary

El protocolo describe cómo lograr modificaciones dirigidas al sitio en el genoma de los mosquitos de la malaria Anopheles utilizando el sistema φC31 . Las modificaciones descritas incluyen tanto la integración como el intercambio de casetes transgénicos en el genoma de las líneas de acoplamiento que llevan attP.

Abstract

El análisis genómico funcional y las estrategias relacionadas para el control genético de la malaria se basan en métodos validados y reproducibles para modificar con precisión el genoma de los mosquitos Anopheles. Entre estos métodos, el sistema φC31 permite la integración precisa y estable de transgenes dirigidos al sitio, o la sustitución de casetes transgénicos integrados a través del intercambio de casetes mediado por recombinasa (RMCE). Este método se basa en la acción de la integrasa del bacteriófago Streptomyces φC31 para catalizar la recombinación entre dos sitios de unión específicos designados attP (derivado del fago) y attB (derivado de la bacteria huésped). El sistema utiliza uno o dos sitios attP que se han integrado previamente en el genoma del mosquito y sitio(s) attB en la plantilla de ADN del donante. Aquí ilustramos cómo modificar de manera estable el genoma de las líneas de acoplamiento de Anopheles portadoras de attP utilizando dos plásmidos: un donante marcado con attB que lleva la plantilla de integración o intercambio y un plásmido auxiliar que codifica la integrasa φC31. Presentamos dos resultados representativos de la modificación dirigida al sitio mediada por φC31: la integración única de un casete transgénico en mosquitos An. stephensi y RMCE en mosquitos An. gambiae. La manipulación del genoma mediada por φC31 ofrece la ventaja de la expresión reproducible de transgenes a partir de sitios genómicos validados y neutros, lo que permite análisis cualitativos y cuantitativos comparativos de fenotipos. La naturaleza dirigida al sitio de la integración también simplifica sustancialmente la validación del sitio de inserción único y el esquema de apareamiento para obtener una línea transgénica estable. Estas y otras características hacen del sistema φC31 un componente esencial del conjunto de herramientas genéticas para la manipulación transgénica de mosquitos de la malaria y otros insectos vectores.

Introduction

La capacidad de modificar el genoma de los mosquitos vectores de enfermedades de manera confiable y reproducible ha reforzado la validación funcional in vivo de los genes y ha abierto las puertas a estrategias de control genético de vectores realizables, como las dirigidas a los mosquitos Anopheles que transmiten la malaria1.

La edición temprana del genoma del mosquito se basó únicamente en la transformación mediada por elementos transponibles (TE), siendo piggyBac el transposón más utilizado en Anopheles2,3,4. Sin embargo, la naturaleza aleatoria de la integración de TE puede conducir a modificaciones indeseables como knockouts de genes (mutagénesis insercional) y efectos de posición significativos en la expresión transgénica5,6,7,8. Las inserciones múltiples también son una ocurrencia común cuando se usa piggyBac5,9, lo que hace que la validación y el aislamiento de líneas transgénicas con inserciones individuales sea laborioso. Otros inconvenientes incluyen su potencial removilización, como se observa en la línea germinal de Anopheles stephensi al proporcionar una fuente de transposasa piggyBac10,11,12, y su tamaño limitado de carga de ADN (10-15 kb de longitud) con una eficiencia de transformación que disminuye con el aumento del tamaño del plásmido donante13,14.

Se introdujeron enfoques de integración dirigidos al sitio para eludir estos problemas. La modificación del genoma dirigida al sitio más común en los mosquitos es la mediada por el sistema φC31 (Figura 1a). Esto es impulsado por una integrasa viral que cataliza la recombinación entre dos sitios de unión heteroespecíficos (att) que ocurren naturalmente en el genoma del bacteriófago φC31 (attP) y en el huésped de la bacteria Streptomyces (attB)15. La recombinación de los dos sitios es unidireccional y da como resultado la formación de sitios híbridos (attL y attR). La recombinación de tales sitios híbridos (que conduzca a la escisión del ADN) requeriría no solo la presencia de una integrasa viral activa, sino también de otro factor de recombinación codificado por fagos16,17. De este modo, se genera un sitio de integración estable que alivia el problema de la posible removilización no deseada15. Además, el sistema permite la integración de grandes cargas (por ejemplo, la integración de construcciones de >100 kb se informó en D. melanogaster18), aumentando significativamente las capacidades de carga. La integración se produce en un único locus genómico predefinido lo que simplifica enormemente la validación de la inserción y el esquema de apareamiento para obtener una línea transgénica estable. Finalmente, la naturaleza dirigida al sitio de la integración permite la normalización de la expresión, ya que los transgenes alternativos se encuentran en el mismo locus y, por lo tanto, se regulan dentro del mismo contexto genómico vecino. De hecho, una de las principales aplicaciones de la técnica es la comparación directa de fenotipos conferidos por diferentes transgenes después de la inserción en un locus idéntico.

Lograr la integración mediada por φC31 implica dos fases: la fase I es la creación de líneas de acoplamiento transgénicas que transportan sitio(s) attP, y la fase II es la integración dirigida al sitio de una carga flanqueada por attB en el genoma de la línea de atraque19. La creación de líneas de acoplamiento de fase I se ha basado en la integración aleatoria mediada por TE de constructos etiquetados con attP y, por lo tanto, implicó un proceso laborioso inicial (incluidos los análisis de SOUTHERN blot y PCR inversa en progenie de una sola hembra) para aislar y validar líneas transgénicas que llevan un solo evento de integración en ubicaciones genómicas únicas, transcripcionalmente activas y neutrales. No obstante, se han desarrollado y validado varias líneas de acoplamiento para la integración única mediada por φC31 en An. gambiae19,20,21,22 y en An. stephensi23,24,25 (Tabla 1). Cada una de estas líneas varía en términos de la ubicación genómica del sitio de acoplamiento y el fondo genético específico de la cepa y a partir de ellas se puede crear una gran variedad de nuevas líneas transgénicas. La compleja validación de las integraciones mediadas por TE para la producción de líneas de acoplamiento ahora puede ser eludida por la tecnología CRISPR/Cas926; sin embargo, esto se basa en el conocimiento a priori de los loci neutros a los que se dirigirá y sus secuencias circundantes.

La integración mediada por φC31 se ha aplicado ampliamente a la edición del genoma de insectos desde el organismo modelo D. melanogaster27, hasta los mosquitos Aedes aegypti13,28, Ae. albopictus29, An. gambiae19 y An. stephensi24, así como otros insectos como Ceratitis capitata30 y Bombyx mori31.

Una limitación de la integración mediada por φC31, especialmente en vista de las posibles liberaciones de campo para el control de vectores, es la integración en el genoma del mosquito de todo el plásmido donante portador de attB, incluidas secuencias indeseables como marcadores genéticos de resistencia a antibióticos y componentes de la columna vertebral del plásmido de origen bacteriano. Para abordar esto, se implementó una modificación del sistema estándar, el intercambio de casetes mediado por recombinasas (RMCE), que permite el reemplazo preciso de un cassette transgénico previamente integrado con un nuevo ADN donante (Figura 1b). Esto se logra mediante el uso de dos sitios att invertidos que flanquean los casetes donante y receptor en cada extremo, lo que impulsa dos eventos de recombinación independientes que tienen lugar simultáneamente, lo que resulta en el intercambio de casetes sin integración de la columna vertebral del plásmido. Este diseño mejorado elude la integración de secuencias no deseadas y amplía la aplicación de los sistemas φC31 para incluir, por ejemplo, la integración de cargas de ADN no marcadas mediante la detección de la pérdida de un marcador fluorescente previamente integrado32.

RMCE se logró primero con D. melanogaster32 y luego se aplicó con éxito a insectos no modelo, incluidos An. gambiae9,26,33, Ae. aegypti34, Plutella xylostella34 y B. mori35. Se han desarrollado y validado varias líneas de acoplamiento para RMCE en An. gambiae5,9,26 (Tabla 1). Hasta donde sabemos, RMCE aún no se ha explorado en otras especies de vectores de Anopheles.

Hasta la fecha, el sistema φC31 se ha utilizado ampliamente en mosquitos Anopheles para introducir y estudiar una variedad de moléculas, incluidos los efectores antimalarias19,24,36, componentes del sistema GAL4/UAS para sobreexpresar y derribar genes para estudios de resistencia a insecticidas9,33, elementos reguladores, genes reporteros5,21,37 y elementos impulsores genéticos26 ,38.

Este protocolo describe cómo realizar 1) la integración dirigida al sitio de una carga flanqueada por attB y 2) RMCE de una construcción flanqueada por sitios attB invertidos en el genoma de las líneas de acoplamiento de Anopheles . Esto se logra mediante el uso de dos plásmidos: un plásmido de donante marcado con attB que lleva el transgén de interés, y un plásmido ayudante que expresa la integrasa φC31 . Los principales vectores de malaria An. gambiae y An. stephensi se utilizan como ejemplos específicos, sin embargo, estos protocolos son aplicables a otras especies de Anopheles .

Figure 1
Figura 1. Modificaciones del genoma dirigidas al sitio, integración única e intercambio de casetes mediado por recombinasa (RMCE), utilizando el sistema φC31. La integrasa φC31 (INT, flecha doble gris) cataliza la recombinación entre el(los) sitio(s) attB (raya púrpura) presente(s) en un plásmido donante y el(los) sitio(s) attP (raya azul) presente(s) en una línea de acoplamiento receptora, lo que resulta en la formación de sitios híbridos attL y attR. A) La integración se logra cuando los sitios attB y attP individuales se recombinan y da como resultado la presencia de dos marcadores integrados (azul y rojo). B) RMCE ocurre cuando dos sitios attB/P se recombinan simultáneamente y resulta en el reemplazo del cassette entre los sitios att de la línea de acoplamiento (marcador azul) con el transportado por el plásmido donante (marcador rojo). C) Secuencias parciales de nucleótidos de attP (azul) y attB (púrpura) y los sitios híbridos attL/R. La recombinación se produce entre las secuencias de núcleo 'TT' resaltadas en negrita negra. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Protocol

Nota : un flujo de trabajo esquemático del protocolo ilustrado se muestra en la figura 2.

1. Diseño de plásmidos etiquetados con φC31 attB (Figura 3)

  1. Crear plásmidos donantes attB que lleven los siguientes componentes esenciales
    1. Marcador fluorescente dominante
      1. Elija un promotor para impulsar la expresión del marcador fluorescente.
        NOTA: Para la transgénesis de Anopheles, los marcadores fluorescentes suelen estar bajo la regulación del promotor 3xP39, que impulsa la expresión en los ojos y el cordón nervioso. Alternativamente, el promotor PUBc5 se puede utilizar cuando se desea la expresión en múltiples tejidos. Los plásmidos donantes y las líneas de acoplamiento utilizadas como ejemplos en este protocolo se marcan utilizando el promotor 3xP3.
      2. Elija una proteína fluorescente (FP) que sea compatible con la de la línea de acoplamiento receptora para que sean fácilmente distinguibles.
        NOTA: No utilice el mismo marcador que ya está presente en la línea de acoplamiento y evite el uso simultáneo de GFP (verde) / YFP (amarillo) y GFP (verde) / CFP (cian) ya que son muy difíciles de diferenciar de manera confiable. Los plásmidos donantes utilizados como ejemplos en este protocolo están marcados con DsRed o YFP, ya que deben integrarse en una línea de acoplamiento marcada con CFP.
    2. sitio(s) de recombinación attB
      1. Utilice un único sitio attB para la integración de un casete transgénico (diseño de un solo attB ) (Figura 3A).
      2. Utilice dos sitios attB invertidos para RMCE (diseño de doble attB) donde los sitios se encuentran invertidos entre sí y encierre la plantilla de ADN del donante (Figura 3B).
        NOTA: La orientación de los sitios attB debe ser compatible con la de los sitios attP presentes en la línea de acoplamiento.
    3. Carga transgénica deseada
      1. Utilice cualquier otra característica deseada para integrarse en el genoma del mosquito en función del propósito específico del experimento. Aquí, describimos la integración de una molécula efectora antipalúdica en el genoma de An. stephensi y la integración de los componentes del sistema GAL4/UAS en mosquitos An. gambiae .
    4. Componentes de la columna vertebral del plásmido
      1. Incluir, entre otros componentes esenciales para la replicación de plásmidos en bacterias, un marcador para la selección de plásmidos in vitro (es decir, un gen de resistencia a los antibióticos).
        NOTA: La columna vertebral del plásmido se integrará en el genoma del mosquito en el diseño de un solo attB para la integración (Figura 3A), mientras que no se insertará en el diseño de doble attB para RMCE (Figura 3B).

2. Preparación de plásmidos para la mezcla de microinyección

NOTA: El protocolo aquí ilustrado implica el uso de dos plásmidos: un plásmido donante marcado con attB que lleva el transgén de interés, y un plásmido ayudante que expresa la integrasa φC31 bajo la regulación del promotor Drosophila Hsp7040.

  1. Purifique los plásmidos donantes y ayudantes utilizando un kit de purificación de plásmidos sin endotoxinas.
    NOTA: Secuenciar la preparación final del plásmido utilizado para la inyección para verificar la integridad de todos los componentes.
  2. Combinar cantidades apropiadas de los dos plásmidos para obtener una mezcla con una concentración final de 350 ng/μL del plásmido donante y 150 ng/μL del plásmido ayudante cuando se resuspenda en tampón de inyección.
    NOTA: Al calcular el volumen necesario de mezcla, considere que 10-15 μL son suficientes para cada día de inyecciones planificadas y el ADN se puede preparar con anticipación y almacenar a -20 ° C. También se han notificado concentraciones de plásmidos auxiliares integrasa de 60-500 ng/μL y concentraciones de plásmidos donantes de 85-200 ng/μL21,22,26,41.
  3. Precipitar el ADN añadiendo 0,1 volúmenes de 3 M de acetato de sodio (pH 5,2) y 2,5 volúmenes de 100% EtOH y vórtice helados. Un precipitado blanco debe ser inmediatamente visible. Tener preparaciones iniciales de plásmidos altamente concentradas (es decir, ~ 1 μg / μL) mejora la eficiencia de la precipitación.
    NOTA: Punto de parada: el precipitado se puede almacenar a -20 °C durante la noche.
  4. Centrifugar a 15.000 x g durante 20 min a 4 °C, desechar el sobrenadante y lavar el pellet con 1 mL de EtOH 70% helado.
  5. Lave el pellet con 1 ml de EtOH 70% helado y centrífuga a 15.000 x g durante 5 min a temperatura ambiente.
  6. Deseche el sobrenadante sin molestar el pellet y seque al aire.
  7. Resuspend el pellet en 1x tampón de inyección (0,1 mM Na3PO4, 5 mM KCl, pH 7,2, filtro de 0,22 μm esterilizado) para alcanzar una concentración final total de 500 ng/μL.
    NOTA: Supongamos que parte del ADN se perderá durante el proceso de precipitación; por lo tanto, primero agregue un volumen más pequeño de tampón de inyección, verifique la concentración en un espectrofotómetro (por ejemplo, Nanodrop) y luego agregue un volumen restante apropiado para alcanzar 500 ng / μL.
  8. Asegúrese de que el ADN se resuspenda completamente, prepare alícuotas de 10-15 μL cada una y guárdelas a -20 ° C.
  9. El día de la inyección, descongele una alícuota y centrífuga a 15.000 x g durante 5 min para eliminar cualquier residuo de partículas.
    NOTA: Un método alternativo para la eliminación de partículas es filtrar la solución a través de un filtro de 0,22 μm. Evite la presencia de residuos de partículas en la mezcla de inyección, ya que conducen a la obstrucción de la aguja durante la microinyección del embrión.

3. Microinyección de embriones de una línea de acoplamiento de Anopheles

  1. Alimentar con sangre a mosquitos de 4-7 días de edad de la línea de acoplamiento deseada 72 h antes de la microinyección (es decir, para inyección el lunes y martes alimentar a las hembras el viernes anterior; para inyección el jueves y viernes alimentar a las hembras el lunes de la misma semana).
  2. La sangre alimenta a los mosquitos de tipo silvestre (WT) (es decir, mosquitos con el mismo fondo genómico de la línea de atraque) el mismo día; estos serán necesarios para el cruce.
    NOTA: El tamaño y la calidad de la harina de sangre afectan la calidad del huevo, por lo que se recomienda usar siempre sangre fresca (es decir, sangre extraída dentro de los 7 días anteriores). La alimentación con el brazo o la alimentación de ratones puede aumentar la calidad y la cantidad de huevos, sin embargo, estos métodos no se recomiendan. Serán necesarios protocolos específicos aprobados para el uso humano y animal.
  3. Realizar microinyecciones embrionarias
    1. Realizar microinyecciones embrionarias de An. gambiae en NaCl42 de 25 mM dirigiéndose al polo posterior del embrión en un ángulo de 45 grados. Para un protocolo detallado para la recolección, alineación y microinyección de embriones, consulte Pondeville et al.43 y Lobo et al.44.
    2. Realice microinyecciones embrionarias de An. stephensi en aceite de halocarbono 700: 27 (2: 1) apuntando al polo posterior del embrión en un ángulo de 30 grados. Un protocolo detallado para la recolección, alineación y microinyección de embriones se puede encontrar en Terenius et al.45 y Lobo et al.44.
    3. Transfiera los huevos inmediatamente después de la inyección en una placa de Petri llena de agua destilada estéril (pH 7.2) y devuélvalos a condiciones insectarias.
  4. Al eclosionar, transfiera las larvas de G0 a una bandeja con agua destilada salada (0.1% de sal tónica) diariamente y vuelva a las pupas.
  5. Tasa de eclosión récord (es decir, número de larvas eclosionadas/número de embriones inyectados).
    NOTA: El movimiento del embrión ayuda a la eclosión, por lo que es deseable un remolino suave. La eclosión debe comenzar ~ 48 h después de la inyección. Dado que la inyección puede causar un ligero retraso en el desarrollo, es aconsejable mantener el monitoreo de larvas de eclosión tardía durante 3-4 días.

4. Cruce y selección de individuos transformados

  1. [PASO OPCIONAL] Cribado G0 (inyectado) 1ª o 2ª larva instar (L1-L2) para la expresión transitoria del marcador fluorescente.
    1. Use una pipeta de vidrio de punta fina para transferir larvas de G0 L1-L2 a un portaobjetos de microscopio con pozos. Coloque una larva en cada pozo.
    2. Use un estereoscopio de fluorescencia con el filtro apropiado para detectar la presencia de expresión transitoria del marcador fluorescente.
      NOTA: El patrón de expresión transitoria es dictado por el promotor utilizado. Cuando se utiliza el promotor 3xP3, la expresión transitoria del marcador fluorescente es visible en las papilas anales (ver Figura 6 en Pondeville et al.43)
    3. Trasero G0 positivo individuos por separado.
  2. Clasifica las pupas G0 por sexo bajo un estereoscopio52.
  3. Deje que los machos emerjan en jaulas separadas en grupos de 3-5 (familias fundadoras) y agregue un exceso de 10 veces de hembras WT de la misma edad.
    NOTA: Dado que los machos se aparean varias veces, es importante proporcionar un exceso de hembras WT para maximizar las posibilidades de apareamiento de cada macho.
  4. Deje que las hembras emerjan en jaulas separadas en grupos de 10 a 15 (familias fundadoras) y agregue un número igual de machos WT de la misma edad.
    NOTA: Si hay espacio limitado en el insectario, las hembras pueden emerger todas juntas en una sola jaula. La proporción de mujeres a hombres puede ser tan baja como 1 hombre a 3 mujeres.
  5. Permita que los adultos se apareen durante 4-5 días y proporcione a las hembras una comida de sangre.
    NOTA: La sangre alimenta y recolecta huevos de hembras G0 varias veces para maximizar las posibilidades de obtener transformadores de múltiples ciclos gonótrofos.
  6. La sangre alimenta a los individuos WT al mismo tiempo para el cruce.
  7. Recolecta huevos y cría G1 de próxima generación emergentes.
  8. Examinar las larvas G1 L3-L4 para obtener la fluorescencia adecuada para identificar los transformadores.
    1. Recolecte las larvas en una placa de Petri forrada con papel de filtro o en un portaobjetos y una pantalla de microscopio utilizando un estereoscopio fluorescente con filtros apropiados para la presencia del marcador introducido con la carga etiquetada con attB.
      NOTA: La fluorescencia impulsada por el promotor 3xP3 es visible en todas las etapas postembrionarias y el cribado se puede realizar en larvas más jóvenes, sin embargo, estas son más frágiles y deben manejarse con relativo cuidado. Las pupas también se pueden cribar.
      1. Para diseños de un solo attB para la pantalla de integración para la presencia del marcador nuevo y preexistente; ambos deben estar presentes ya que el nuevo casete se inserta junto al original (Figura 3A, Figura 4). 
        NOTA: Excepción de detección para diseños de attB individuales: Cuando se utilizan líneas de acoplamiento sin marcador22, compruebe solo la presencia del nuevo marcador. Cuando se utilicen líneas de acoplamiento donde la integración resulte en la inactivación del marcador preexistente21, observe la presencia del nuevo marcador y la pérdida del preexistente.
      2. Para los diseños de doble attB para RMCE, pantalla para detectar la presencia del nuevo marcador y la pérdida del preexistente, solo debe estar presente el marcador recién introducido, ya que el nuevo casete reemplaza al original (Figura 3B, Figura 5).
        NOTA: Los eventos de integración ocasionales se pueden recuperar en experimentos RMCE donde solo se recombinó un solo attP y, por lo tanto, ambos marcadores estarán presentes. El cribado de individuos G1 se puede realizar también en la etapa de pupa siguiendo el mismo procedimiento52.
  9. La transferencia transformó a los individuos G1 en una bandeja larvaria y la parte trasera a las pupas. Descarte individuos no fluorescentes e individuos con un patrón de expresión de marcador inesperado.
  10. Clasifica las pupas G1 transformadas por sexo y cúbrelas en masa con individuos WT de sexo opuesto de la misma edad.
  11. Permita que los adultos se apareen durante 4-5 días, proporcione una comida de sangre, recoja los huevos y críe a la próxima generación de progenie G2 .
    1. Para experimentos de integración individual, recoja los huevos directamente de la cruz en masa , ya que el sitio de integración es idéntico en todos los individuos.
    2. Para los experimentos RMCE, recolectar huevos de hembras individuales y mantener la progenie separada hasta que se complete la evaluación molecular debido a la posible presencia de dos orientaciones alternativas de casete (Figura 3B).
  12. Examinar la progenie G2 (ya sea en la etapa de larva o pupa) para detectar la presencia del marcador fluorescente (se espera que el 50% de los individuos sean positivos), descartar la progenie no fluorescente.
  13. Apartar un subconjunto de individuos G2 positivos para el análisis molecular, criar el resto hasta la edad adulta.
    NOTA: Si todos los individuos G2 deben mantenerse con vida, se puede realizar un análisis molecular en las patas de un solo adulto46 o extracciones de ADN de caso pupal (comunicación personal de L. Grigoraki). Alternativamente, el análisis molecular se puede realizar después de que todos los individuos G2 hayan ovipositado y los huevos hayan eclosionado.
  14. Permita que los machos y las hembras adultos se crucen en la misma jaula para establecer la nueva línea transgénica.
    NOTA: Para los experimentos RMCE, el cruce adulto debe ocurrir entre hermanos derivados de una sola hembra hasta que se determine la orientación de la inserción a través del análisis molecular.

5. Validación molecular del sitio de inserción por amplificación de ADN (PCR)

  1. Prepare un mapa del sitio de inserción predicho en el genoma de la línea de acoplamiento después de la transformación.
    1. Integración única: Asegúrese de que el sitio de inserción previsto lleve la construcción de acoplamiento original más toda la secuencia del plásmido donante entre los dos sitios híbridos attL y attR (Figura 3A).
    2. RMCE: Asegúrese de que el sitio de inserción previsto sea idéntico al de la línea de acoplamiento donde los sitios attL invertidos híbridos reemplazan los sitios attP invertidos originales y la plantilla de intercambio reemplaza el cassette originalmente presente entre ellos (Figura 3B).
  2. Diseñe cebadores de oligonucleótidos para amplificar la unión de inserción a cada lado del locus de integración.
    1. Integración única: Diseñe pares de cebadores de oligonucleótidos que se extiendan a través de los sitios attR y / o attL . Una imprimación debe unirse a la construcción de acoplamiento previamente integrada y la otra al transgén recién integrado (Figura 3A).
    2. RMCE: El reemplazo de cassette puede ocurrir en dos orientaciones diferentes con respecto al cromosoma (designado A y B). Diseñe combinaciones alternativas de 4 cebadores de oligonucleótidos para dar un producto discreto en solo una de las orientaciones, con un par siendo diagnóstico para la orientación A y el otro para la orientación B (Figura 3B, Figura 6).
  3. Extraiga el ADN genómico de individuos G2 positivos y realice la PCR diagnóstica y la electroforesis en gel para visualizar la presencia de amplicones de diagnóstico esperados a partir de los mapas del sitio de integración predichos.
    NOTA: Alternativamente, el ADN puede extraerse de las patas de un solo adulto46 o de casos de pupa (comunicación personal de L. Grigoraki).
  4. Productos de PCR de secuencia para confirmar secuencias esperadas.

Figure 2
Figura 2. Diagrama de flujo de trabajo para la modificación del genoma φC31 dirigida al sitio en mosquitos Anopheles . Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3. Bases moleculares de la integración única mediada por φC31 (A) y RMCE (B). A) Mapas esquemáticos de la inserción genómica en una línea de acoplamiento de An. stephensi (80.9, Tabla 1) que llevan un solo sitio attP y marcado con CFP (arriba), un plásmido donante de diseño de un solo attB marcado con DsRed (medio), y el sitio de inserción esperado resultante después de una integración exitosa (abajo). B) Mapas esquemáticos de la inserción genómica en una línea de acoplamiento de An. gambiae (A11, Tabla 1) que lleva dos sitios attP invertidos y marcados con CFP (arriba), un plásmido donante de diseño de doble attB marcado con YFP (medio), y el sitio de inserción esperado resultante después de RMCE exitoso (abajo). Línea ondulada: genoma del mosquito; Flechas rayadas: brazos de transposón piggyBac; 3xP3: promotor del marcador fluorescente; SV40: terminador viral; Ori: origen de la replicación; AmpR: gen de resistencia a la ampicilina. Las líneas de cruce representan el(los) sitio(s) de recombinación entre los sitios attP y attB. Las flechas negras numeradas representan los sitios de unión de la imprimación para la validación molecular del locus de inserción (paso 5 del protocolo). Los plásmidos etiquetados con attB simple y doble totalmente anotados están disponibles de los autores a pedido. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Representative Results

El protocolo ilustrado aquí permite generar una línea transgénica estable de Anopheles en ~ 10 semanas (suponiendo un ciclo de vida de mosquitos de 21 días).

Se espera que las tasas de eclosión larvaria posterior a la inyección en An. gambiae sean generalmente más bajas que en An. stephensi, sin embargo, se han reportado tasas de eclosión entre 10-50%9,20,24,26,33,43,47. Dada la técnica de inyección adecuada, las tasas de eclosión de ≥20% son generalmente suficientes para producir transformadores. La absorción de ADN por los embriones se puede evaluar mediante el cribado de larvas jóvenes para la expresión transitoria del marcador fluorescente. En experimentos exitosos de RMCE en An. gambiae utilizando el promotor 3xP3, hasta el 50% de las larvas G0 supervivientes mostraron expresión episomal del marcador en las papilas anales48.

Las estimaciones generalizadas de la eficiencia de la transformación son difíciles de evaluar entre los laboratorios e incluso entre los experimentos, ya que la transformación depende de una compleja interacción de variables que incluyen la pureza, la concentración, el tamaño y la toxicidad potencial del ADN inyectado, la calidad de los huevos, el manejo de los huevos antes y después de la inyección, la cría de mosquitos y, lo que es más importante, la experiencia del operador. Se han obtenido tasas de transformación de hasta el 7% para RMCE en An. gambiae (calculadas como el número de eventos de transformación independientes en el total de individuos G0)9,26,33, y hasta un 2,2% de tasa de transformación para la integración en An. stephensi. Sugerimos inyectar al menos 500 embriones, lo que debería conducir a la eclosión de al menos 100 larvas G0 y a fundadores adultos de 2-7 G0 de los cuales se puede obtener una progenie transformada de manera estable. Si se detecta la expresión transitoria en larvas G0, se pueden esperar hasta 40 larvas positivas.

Ejemplos de validación fenotípica de la transformación a través del cribado de marcadores fluorescentes regulados por el promotor 3xP3 se reportan en la Figura 4 y  la Figura 5. La Figura 4 muestra una nueva línea de An. stephensi obtenida mediante la inserción de un cassette marcado con DsRed en una línea de acoplamiento marcada con CFP (80.9, Tabla 1), lo que resulta en que la progenie G1 exprese ambos marcadores según lo indicado por la fluorescencia roja y azul detectada en los ojos.

En cambio, se espera que los diseños de RMCE resulten en el reemplazo del marcador originalmente insertado en la línea de acoplamiento con el del plásmido donante. La Figura 5A y  la Figura B ilustran este intercambio de marcadores en una línea de acoplamiento de An. gambiae marcada con CFP (A11, Tabla 1) donde después de RMCE exitosa se pierde el marcador CFP y se adquiere el marcador YFP dando como resultado fluorescencia amarilla (pero no azul) del ojo y del cordón nervioso33. Ocasionalmente, RMCE puede resultar en un solo evento de integración en lugar del intercambio del casete transgénico deseado como se ilustra en la Figura 5C, donde se muestra una larva marcada con el CFP original y los nuevos marcadores YFP. Se informa que hasta el 50% del número total de eventos de transformación son integraciones individuales9,33.

Al detectar la presencia de un marcador fluorescente, es crucial distinguir su señal de la posible autofluorescencia de fondo. Esto es particularmente importante cuando se usa CFP, ya que las larvas de Anopheles muestran autofluorescencia azul natural (Figura 6A). Es necesario aumentar la ampliación y centrarse en los tejidos y órganos donde se espera que la fluorescencia sea impulsada por el promotor para identificar verdaderos individuos positivos para CFP, como se ilustra en la Figura 6B utilizando el marcador 3xP3-CFP.

Los transformadores individuales finalmente se evalúan molecularmente a través de PCR para confirmar el sitio de inserción esperado. La Figura 7 reporta la validación de pcr en individuos a partir de una línea de intercambio An. gambiae mostrando las dos orientaciones potenciales de inserción en el genoma del mosquito33.

Figure 4
Figura 4. Validación de la integración única de φC31 en larvas de An. stephensi (vista dorsal). A) La línea de acoplamiento (80.9, Tabla 1) expresa CFP a los ojos bajo la regulación del promotor 3xP3 . B) La integración exitosa da como resultado la expresión del DsRed recién adquirido, así como el marcador CFP original en los ojos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 5
Figura 5. Validación de φC31 RMCE en larvas de An. gambiae (vista ventral). A) La línea de acoplamiento (A10, Tabla 1) expresa CFP bajo la regulación del promotor 3xP3 en los ojos (e) y el cordón nervioso (nc)5. B) RmCE exitoso resulta en el intercambio de marcador fluorescente de CFP a YFP33. C) Evento de integración única ocurrió durante el experimento RMCE donde la larva transformadora expresa los marcadores CFP y YFP. Esta larva lleva componentes GAL4 / UAS que causan un amplio patrón de expresión de YFP, particularmente fuerte en los músculos abdominales (am). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 6
Figura 6. Autofluorescencia CFP en larvas de An. gambiae (vista dorsal). A) Imagen lado a lado de una larva L4 positiva (CFP+) y negativa (CFP-) utilizando el filtro CFP. B) Imagen en primer plano de los ojos larvales que revela un individuo CFP+ vs CFP-. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 7
Figura 7. Validación molecular de la orientación de inserción de cassette en transgénicos representativos An. gambiae creados por φC31 RMCE. El cassette transgénico se puede insertar en una de las dos orientaciones alternativas (A o B) con respecto al sitio de inserción. Cada reacción de PCR (I - IV) utiliza una combinación de cebadores (5-8)33 diseñados para dar un fragmento de amplificación diagnóstica para cada orientación como se indica en los mapas plásmidos esquemáticos. T1: individuo transgénico representativo que lleva orientación de la inserción A; T2: individuo transgénico representativo que lleva orientación de inserción B; WT: tipo salvaje; DL: línea de acoplamiento; -: reacción de control negativo donde se utilizó agua como plantilla. Esta cifra ha sido modificada a partir de Adolfi et al. (2019)33. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Especie Colar Nombre attP(s) Cromo-algunos Promotor-marcador Institución de origen Referencia
An. stephensi Indiana 26,10b Soltero 2R 3xP3-eCFP Universidad de California Irvine 25
An. stephensi Indiana 44Cb Soltero X 3xP3-eCFP Universidad de California Irvine 23, 24
An. stephensi Indiana 80,9b Soltero 2L 3xP3-eCFP Universidad de California Irvine Este estudio
An. gambiae G3 113 Soltero 2R 3xP3-eCFP Universidad de California Irvine Este estudio
An. gambiae KIL Ec Soltero 3R 3xP3-eCFP Keele Univ. 19, 43
An. gambiae G3 X1 Soltero 2L Sin marcador Universidad de Estrasburgo 22
An. gambiae G3 YAttP Soltero Y 3xP3-RFP Imperial College de Londres 21
An. gambiae G3 A10b Doble 2R 3xP3-eCFP Liverpool School Trop. Med. 5
An. gambiae G3 A11b Doble 2R 3xP3-eCFP Liverpool School Trop. Med. 9
un. Cepa de la Universidad Johns Hopkins (regalo de M. Jacobs-Lorena) y en cultura en la Universidad de California Irvine durante >20 años.
b. Estas líneas están disponibles de los autores a petición razonable.
c. Esta línea está disponible en el repositorio BEI www.beiresources.org como MRA-1163.

Tabla 1. Líneas de acoplamiento anopheles attP .

Discussion

El diseño preciso de plásmidos marcados con attB que sean compatibles con la línea de acoplamiento de elección es primordial para el éxito del experimento. Se debe considerar cuidadosamente la elección del marcador utilizado para el cribado de transformadores, incluido el color de fluorescencia y su patrón de expresión, que estará sujeto al patrón ya presente en la línea de acoplamiento. Es necesario utilizar marcadores fluorescentes que sean fácilmente distinguibles: las buenas combinaciones de marcadores incluyen RFP (rojo) / CFP (cian), RFP (rojo) / GFP (verde), RFP (rojo) / YFP (amarillo) y YFP (amarillo) / CFP (cian), mientras que las combinaciones a evitar son YFP (amarillo) / GFP (verde) y CFP (cian) / GFP (verde). El promotor 3xP39, específico para los ojos y el cordón nervioso, es el más utilizado para impulsar la expresión de marcadores fluorescentes para la transgénesis de mosquitos. De hecho, todas las líneas de acoplamiento de Anopheles actualmente disponibles utilizan este promotor. Las regiones reguladoras alternativas son la del gen de la poliubiquitina An. gambiae (PUBc)5 o el promotor viral IE120, que impulsan la expresión en múltiples tejidos. Cuando se usan junto con 3xP3, estos promotores ampliarían las posibles combinaciones de colores e incluso el uso del mismo fluoróforo. Los promotores indicados están activos durante todo el ciclo de vida del mosquito, lo que permite el cribado y la monitorización de la fluorescencia en todas las etapas de la vida. Una consideración adicional durante el diseño de plásmidos es el tamaño de la carga a integrar o intercambiar. Si bien el sistema φC31 tiene notables capacidades de carga18, debe considerarse que el tamaño del plásmido donante generalmente se correlaciona negativamente con la eficiencia de transformación22.

En el protocolo descrito, la fuente de integrasa es un plásmido ayudante que expresa la enzima de forma ubicua40. La presencia ubicua de la integrasa puede conducir a la transformación de las células somáticas si las microinyecciones no se dirigen con precisión al área donde se forma la línea germinal. Si bien tales eventos de transformación se perderán ya que no son hereditarios, los efectos somáticos pueden disminuir la aptitud de los individuos inyectados. Para evitar esto y aumentar la eficiencia de transformación, la expresión de la integrasa puede restringirse a la línea germinal, por ejemplo, mediante el uso del promotor vasa22,26. Otros protocolos describen el uso de ARN mensajero transcrito in vitro (ARNm) como fuente de integrasa φC3111111111,24,43. Sin embargo, esto implica la preparación laboriosa de ARNm y requiere un manejo cuidadoso de la mezcla de inyección y el uso de reactivos libres de RNasa para evitar la degradación. Se ha demostrado que las fuentes plasmáticas de integrasa tanto en An. gambiae9,21,22,26,33,37 como en An. stephensi (A.A. comunicación personal) son confiables y conducen a una transformación eficiente, y por lo tanto son nuestra opción preferida. Otra opción para la entrega de integrase es su producción in vivo en líneas auxiliares de autoacoplamiento. Tales líneas fueron creadas en An. gambiae que expresan la integrasa φC31 bajo la regulación de los nanos promotores específicos de la línea germinal y se encontró que conducen a una mejor supervivencia y eficiencia de transformación20. Sin embargo, se deben considerar las cargas potenciales de aptitud impuestas por la producción in vivo de la enzima integrasa en la línea auxiliar.

Al igual que con otras técnicas transgénicas, se debe tener especial cuidado en la cría y el cruce de individuos derivados de embriones inyectados para maximizar las posibilidades de recuperar transformadores. Los individuos que han heredado de manera estable el transgén pueden recuperarse primero en la progenie G1. Sin embargo, los primeros signos de transformación potencial pueden evaluarse mediante la presencia de expresión episomal transitoria del marcador fluorescente en las papilas anales y/o el cordón nervioso de las larvas G0 de primer y segundo instar cuando se utiliza el promotor 3xP343. Si bien la presencia de fluorescencia transitoria sugiere una administración exitosa de plásmidos, no garantiza la transformación hereditaria de la línea germinal. Del mismo modo, la falta de expresión transitoria no excluye la transformación exitosa. Sin embargo, se ha observado que los individuos transitoriamente positivos tienen más probabilidades de producir progenie transgénica en comparación con los transitorios negativos43,48. En manos expertas, la cría y el cruce de solo individuos positivos puede ser una opción para reducir el número de mosquitos. Sin embargo, dada la importancia y fragilidad de las larvas pequeñas de G0, la menor cantidad de manipulación sigue siendo aconsejable y siempre se recomienda la cría de todos los individuos G0.

El esquema de apareamiento reportado en este protocolo está diseñado para maximizar la posibilidad de apareamiento y aislar eventos de transformación independientes. Sin embargo, si el espacio insectario o la disponibilidad de personal es un problema, los adultos G0 se pueden agrupar por sexo en jaulas individuales si se proporcionan suficientes individuos del sexo opuesto. Tal configuración no permitirá la discriminación entre múltiples eventos de transformación que ocurren en individuos de la misma jaula. Dependiendo de la configuración experimental, se espera la presencia de un marcador doble (integración simple) o simple (RMCE) durante el proceso de selección. En experimentos de integración única es importante verificar la presencia del marcador original de la línea de acoplamiento, mientras que en RMCE es importante verificar la pérdida del marcador previamente integrado. De hecho, no es raro en los diseños RMCE recuperar transformadores en los que se produjo una sola integración en lugar de intercambio debido a la recombinación de un solo sitio attP9,33. En tales individuos, tanto los marcadores fluorescentes están presentes como toda la columna vertebral del plásmido del donante, lo que destaca la importancia de realizar un cribado exhaustivo de ambos marcadores fluorescentes.

Si bien la presencia de patrones de fluorescencia esperados indica una transformación exitosa, se debe realizar la caracterización molecular del sitio de inserción. Para ello, la preparación de mapas precisos del locus de inserción previsto, incluidas las regiones genómicas flanqueantes de la línea de acoplamiento, es crucial para el diseño de cebadores de oligonucleótidos de diagnóstico adecuados para los análisis de amplificación de genes. Los eventos de integración individual dan como resultado la formación de sitios híbridos attR y attL en la unión entre el ADN recién integrado y el cassette previamente insertado. Estos sitios pueden ser objeto de validación de sitios de inserción. En los diseños RMCE, la inserción del cassette donante puede ocurrir en dos orientaciones alternativas con respecto al locus genómico, por lo que se pueden usar cuatro cebadores en combinaciones alternativas de PCR para detectar qué orientación lleva la línea. Como la orientación de la inserción del cassette puede afectar la expresión transgénica, en el análisis comparativo de la expresión génica es importante utilizar líneas que lleven la misma orientación de inserción.

Cuando se trabaja con un bajo número de transformadores, puede que no sea deseable sacrificar individuos enteros para el análisis molecular. Una opción para esto es la realización de análisis moleculares en el ADN extraído de las piernas de un solo adulto46, ya que la pérdida de piernas no afecta la capacidad de una hembra adulta para aparearse y oviposit49. Sin embargo, existe el riesgo de dañar al individuo en el proceso de extracción de piernas. El éxito se ha obtenido utilizando casos de pupa descartados (comunicación personal de L. Grigoraki), sin embargo, el enfoque más seguro es realizar análisis moleculares en padres G2 después de obtener progenie G3 viable.

En los últimos años, CRISPR/Cas9 ha revolucionado la forma de realizar la edición del genoma site-specific26,41,50,51. A diferencia de la RMCE dirigida al sitio, las integraciones de genes mediadas por CRISPR / Cas9 (knock-ins) son independientes de la presencia de sitios de recombinación preinsertados con solo un evento de transformación de un paso necesario. Sin embargo, el sistema CRISPR/Cas9 se basa en la presencia de grandes secuencias genómicas conocidas que flanquean el sitio de inserción deseado para una reparación dirigida a homología exitosa, así como en el reconocimiento eficiente del sitio mediado por ARN guía. Estas condiciones no siempre se pueden cumplir o pueden ser laboriosas de solucionar y, dada la disponibilidad de múltiples líneas de acoplamiento en An. gambiae y An. stephensi y líneas derivadas de ellas, el sistema φC31 sigue siendo una herramienta muy valiosa para realizar comparaciones fenotípicas directas entre transgenes en las mismas ubicaciones genómicas.

Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Agradecemos a Kiona Parker (UCI) por proporcionar imágenes de larvas transgénicas de An. stephensi , y a Fraser Colman (LSTM) y Beth Poulton (LSTM) por proporcionar larvas transgénicas de An. gambiae . Beth Poulton (LSTM) también proporcionó una valiosa asistencia durante las imágenes de las larvas de An. gambiae . Este trabajo fue financiado por el Tata Institute for Genetics and Society (TIGS) y el Director Catalyst Fund de LSTM otorgado a A.A. (DCF2014AA). A.A.J. es profesor Donald Bren en la Universidad de California, Irvine.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5 mL eppendorf tubes
8-well microslides VWR MARI1216690
DNeasy Blood & Tissue Kit Qiagen 69504
EndoFree Plasmid Maxi Kit (10) Qiagen 12362
Ethanol, Absolute, Molecular Biology Grade
Filter set CFP for Leica MZ FLIII Excitation 436/20 nm, extinction 480/40 nm Leica 10446363
Filter set dsRED for Leica MZ FLIII Excitation 545/30 nm, extinction 620/60 nm Leica 10447079
Filter set YFP customised for Leica MZ FLIII Omega Optical 500QM25, 500QM35
Halocarbon oil 27 Sigma H8773
Halocarbon oil 700 Sigma H8898
Petri dishes
Potassium chloride
Sodium Chloride
Sodium phosphate dibasic
Sodium Acetate Solution (3 M), pH 5.2 Thermo Fisher Scientific (Life Technologies) R1181
Stable brush Size 0

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Genética Número 168 Anopheles φC31 site-directed docking integración intercambio de casetes mosquitos transgénicos
Integración mediada por <em>φC31 dirigida por</em> sitios e intercambio de <em>casetes en anopheles vectores</em> de malaria
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