प्रोटोकॉल का वर्णन करता है कि एनोफिलीज़ मलेरिया मच्छरों के जीनोम में साइट-निर्देशित संशोधनों को कैसे प्राप्त किया जाए, जो कि ΠC31 प्रणाली का उपयोग कर रहे हैं। वर्णित संशोधनों में एटीपी-असर डॉकिंग लाइनों के जीनोम में ट्रांसजेनिक कैसेट के एकीकरण और विनिमय दोनों शामिल हैं।
मलेरिया के आनुवंशिक नियंत्रण के लिए कार्यात्मक जीनोमिक विश्लेषण और संबंधित रणनीतियां एनोफिलीज मच्छरों के जीनोम को सही ढंग से संशोधित करने के लिए मान्य और पुन: प्रस्तुत करने योग्य तरीकों पर निर्भर करती हैं। इन विधियों में से, πC31 प्रणाली सटीक और स्थिर साइट-निर्देशित ट्रांसजीन के एकीकरण, या पुनर्संयोजन-मध्यस्थता कैसेट एक्सचेंज (आरएमसीई) के माध्यम से एकीकृत ट्रांसजेनिक कैसेट्स के प्रतिस्थापन की अनुमति देती है। यह विधि दो विशिष्ट अनुलग्नक साइटों के बीच पुनर्संयोजन को उत्प्रेरित करने के लिए स्ट्रेप्टोमाइसेस की कार्रवाई पर निर्भर करती है, जो एटीटीपी (फेज से व्युत्पन्न) और एटीटीबी (मेजबान जीवाणु से व्युत्पन्न) नामित दो विशिष्ट अनुलग्नक साइटों के बीच पुनर्संयोजन को उत्प्रेरित करती है। सिस्टम एक या दो ATTP साइटों का उपयोग करता है जिन्हें पहले मच्छर जीनोम में एकीकृत किया गया है और दाता टेम्पलेट डीएनए में attB साइट (ओं) है। यहां हम बताते हैं कि दो प्लास्मिडों का उपयोग करके ATTP-असर Anopheles डॉकिंग लाइनों के जीनोम को स्थिर रूप से कैसे संशोधित किया जाए: एक attB-टैग किए गए दाता जो एकीकरण या विनिमय टेम्पलेट को ले जाते हैं और एक सहायक प्लास्मिड एन्कोडिंग को एन्कोडिंग करता है। हम दो प्रतिनिधि परिणामों की रिपोर्ट करते हैं, जो कि C31-मध्यस्थता साइट-निर्देशित संशोधन है: An. stephensi में एक ट्रांसजेनिक कैसेट का एकल एकीकरण और An. gambiae मच्छरों में RMCE। ΠC31-मध्यस्थता जीनोम हेरफेर मान्य, फिटनेस तटस्थ जीनोमिक साइटों से पुन: प्रस्तुत करने योग्य ट्रांसजीन अभिव्यक्ति का लाभ प्रदान करता है, जो फेनोटाइप के तुलनात्मक गुणात्मक और मात्रात्मक विश्लेषण की अनुमति देता है। एकीकरण की साइट-निर्देशित प्रकृति भी एक स्थिर ट्रांसजेनिक लाइन प्राप्त करने के लिए एकल सम्मिलन साइट और संभोग योजना के सत्यापन को काफी हद तक सरल बनाती है। ये और अन्य विशेषताएं मलेरिया मच्छरों और अन्य कीट वैक्टरों के ट्रांसजेनिक हेरफेर के लिए आनुवंशिक टूलकिट का एक आवश्यक घटक हैं।
रोगों के मच्छर वैक्टर के जीनोम को मज़बूती से और पुनरुत्पादित रूप से संशोधित करने की क्षमता ने जीन के विवो कार्यात्मक सत्यापन में वृद्धि की है और वास्तविक आनुवंशिक वेक्टर नियंत्रण रणनीतियों के लिए दरवाजे खोल दिए हैं, जैसे कि एनोफिल्स मच्छरों को लक्षित करने वाले जो मलेरिया को प्रसारित करते हैं।
प्रारंभिक मच्छर जीनोम संपादन पूरी तरह से ट्रांसपोसेबल तत्व (टीई) -मध्यस्थता परिवर्तन पर निर्भर था, जिसमें पिग्गीबैक एनोफिल्स 2,3,4 में सबसे अधिक इस्तेमाल किया जाने वाला ट्रांसपोसन था। हालांकि, टीई एकीकरण की यादृच्छिक प्रकृति अवांछनीय संशोधनों को जन्म दे सकती है जैसे कि जीन नॉकआउट (सम्मिलन म्यूटाजेनेसिस) और ट्रांसजीन अभिव्यक्ति पर महत्वपूर्ण स्थिति प्रभाव5,6,7,8। कई सम्मिलन भी एक आम घटना है जब piggyBac5,9 का उपयोग कर रहे हैं, जो सत्यापन और एकल सम्मिलन श्रमसाध्य के साथ ट्रांसजेनिक लाइनों के अलगाव बनाता है. अन्य कमियों में उनके संभावित पुनरुत्थान शामिल हैं, जैसा कि एनोफिलीज़ स्टीफेंसी की जर्मलाइन में देखा गया है जब पिग्गीबैक ट्रांसपोसे 10,11,12 का स्रोत प्रदान किया जाता है, और डीएनए कार्गो के उनके सीमित आकार (लंबाई में 10-15 केबी) में परिवर्तन दक्षता दाता प्लास्मिड 13,14 के बढ़ते आकार के साथ गिरावट आई है।
इन मुद्दों को दरकिनार करने के लिए साइट-निर्देशित एकीकरण दृष्टिकोण पेश किए गए थे। मच्छरों में सबसे आम साइट-निर्देशित जीनोम संशोधन यह है कि πC31 प्रणाली (चित्रा 1a) द्वारा मध्यस्थता की जाती है। यह एक वायरल इंटीग्रेज़ द्वारा संचालित होता है जो दो हेटरोस्पेसिफिक अटैचमेंट (एटीटी) साइटों के बीच पुनर्संयोजन को उत्प्रेरित करता है जो स्वाभाविक रूप से बैक्टीरियोफेज के जीनोम में होता है, और स्ट्रेप्टोमाइसेस बैक्टीरिया होस्ट (एटीटीबी) 15 में स्वाभाविक रूप से होता है। दो साइटों का पुनर्संयोजन यूनिडायरेक्शनल है और इसके परिणामस्वरूप हाइब्रिड साइटों (attL और attR) का गठन होता है। इस तरह के हाइब्रिड साइटों के पुनर्संयोजन (डीएनए उच्छेदन के लिए अग्रणी) को न केवल एक सक्रिय वायरल इंटीग्रेज़ की उपस्थिति की आवश्यकता होगी, बल्कि एक और फेज-एन्कोडेड पुनर्संयोजन कारक 16,17 की भी आवश्यकता होगी। एक स्थिर एकीकरण साइट इस प्रकार उत्पन्न होती है जो संभावित अवांछित remobilization15 के मुद्दे को राहत देती है। इसके अलावा, सिस्टम बड़े कार्गो के एकीकरण की अनुमति देता है (उदाहरण के लिए, >100 केबी निर्माणों का एकीकरण डी मेलानोगास्टर 18 में रिपोर्ट किया गया था), काफी क्षमताओं को ले जाने की क्षमता में वृद्धि हुई है। एकीकरण एक एकल पूर्वनिर्धारित जीनोमिक लोकस में होता है जो एक स्थिर ट्रांसजेनिक लाइन प्राप्त करने के लिए सम्मिलन और संभोग योजना के सत्यापन को बहुत सरल बनाता है। अंत में, एकीकरण की साइट-निर्देशित प्रकृति अभिव्यक्ति के सामान्यीकरण की अनुमति देती है क्योंकि वैकल्पिक ट्रांसजीन एक ही स्थान पर स्थित होते हैं और इसलिए एक ही पड़ोसी जीनोमिक संदर्भ में विनियमित होते हैं। दरअसल, तकनीक के मुख्य अनुप्रयोगों में से एक एक समान स्थान में सम्मिलन के बाद विभिन्न ट्रांसजीन द्वारा प्रदान किए गए फेनोटाइप की सीधी तुलना है।
ΠC31-मध्यस्थता एकीकरण को प्राप्त करने में दो चरण शामिल हैं: चरण I, एटीपी साइट (ओं) को ले जाने वाली ट्रांसजेनिक डॉकिंग लाइनों का निर्माण है, और चरण II डॉकिंग लाइन 19 के जीनोम में एक एटीटीबी-फ्लैंक्ड कार्गो का साइट-निर्देशित एकीकरण है। चरण I डॉकिंग लाइनों के निर्माण ने ATTP-टैग किए गए निर्माणों के TE-मध्यस्थता यादृच्छिक एकीकरण पर भरोसा किया है और इस प्रकार एक प्रारंभिक श्रमसाध्य प्रक्रिया (एकल-महिला संतानों पर दक्षिणी धब्बा और व्युत्क्रम पीसीआर विश्लेषण सहित) को अद्वितीय, ट्रांसक्रिप्शनल रूप से सक्रिय और फिटनेस तटस्थ जीनोमिक स्थानों में एक एकल एकीकरण घटना को ले जाने वाली ट्रांसजेनिक लाइनों को अलग और मान्य करने के लिए शामिल किया गया है। फिर भी, कई डॉकिंग लाइनों को विकसित किया गया है और An. C31-मध्यस्थता एकल एकीकरण के लिए An. gambiae19,20,21,22 और An. stephensi23,24,25 (तालिका 1) में मान्य किया गया है। इन लाइनों में से प्रत्येक डॉकिंग साइट के जीनोमिक स्थान और तनाव-विशिष्ट आनुवंशिक पृष्ठभूमि के संदर्भ में भिन्न होता है और उनसे नई ट्रांसजेनिक लाइनों की एक बड़ी विविधता बनाई जा सकती है। डॉकिंग लाइनों के उत्पादन के लिए TE-मध्यस्थता एकीकरण के जटिल सत्यापन को अब CRISPR / Cas9 technology26 द्वारा दरकिनार किया जा सकता है; हालांकि यह तटस्थ लोकी के एक प्राथमिकता ज्ञान पर निर्भर करता है लक्षित किया जा करने के लिए और उनके आसपास के अनुक्रमों.
मॉडल जीव डी. मेलानोगास्टर 27 से कीट जीनोम संपादन के लिए बड़े पैमाने पर लागू किया गया है, मच्छरों एडीज एजिप्टी 13,28, एई अल्बोपिक्टस 29, एन. गाम्बिया19, और एन।
विशेष रूप से वेक्टर नियंत्रण के लिए संभावित क्षेत्र रिलीज के मद्देनजर, विशेष रूप से वेक्टर नियंत्रण के लिए संभावित क्षेत्र रिलीज के मद्देनजर, पूरे एटीटीबी-असर दाता प्लास्मिड के मच्छर जीनोम में एकीकरण है, जिसमें अवांछनीय अनुक्रम जैसे एंटीबायोटिक-प्रतिरोध जीन मार्कर और जीवाणु मूल के प्लास्मिड बैकबोन घटक शामिल हैं। इसे संबोधित करने के लिए, मानक प्रणाली का एक संशोधन, पुनर्संयोजन-मध्यस्थता कैसेट एक्सचेंज (आरएमसीई), को लागू किया गया था जो एक नए दाता डीएनए (चित्रा 1 बी) के साथ पहले से एकीकृत ट्रांसजेनिक कैसेट के सटीक प्रतिस्थापन की अनुमति देता है। यह प्रत्येक छोर पर दाता और प्राप्तकर्ता कैसेट को फ्लैंक करने वाली दो उलटी एटीटी साइटों का उपयोग करके प्राप्त किया जाता है, जो प्लास्मिड बैकबोन के एकीकरण के बिना कैसेट एक्सचेंज के परिणामस्वरूप दो स्वतंत्र पुनर्संयोजन घटनाओं को एक साथ होने के लिए प्रेरित करता है। यह बेहतर डिजाइन अवांछित अनुक्रमों के एकीकरण को दरकिनार करता है और उदाहरण के लिए पहले से एकीकृत फ्लोरोसेंट मार्कर 32 के नुकसान के लिए स्क्रीनिंग द्वारा अचिह्नित डीएनए कार्गो के एकीकरण को शामिल करने के लिए πC31 सिस्टम के आवेदन का विस्तार करता है।
आरएमसीई को पहले डी मेलानोगास्टर 32 के साथ प्राप्त किया गया था और बाद में गैर-मॉडल कीड़ों पर सफलतापूर्वक लागू किया गया था, जिसमें An. gambiae9,26,33, Ae. aegypti34, Plutella xylostella34, और B. mori35 शामिल हैं। RMCE के लिए कई डॉकिंग लाइनों को विकसित किया गया है और An. gambiae5,9,26 (तालिका 1) में मान्य किया गया है। हमारे ज्ञान के लिए, आरएमसीई को अभी तक अन्य एनोफिलीज़ वैक्टर प्रजातियों में खोजा जाना बाकी है।
आज तक, एनोफिलीज मच्छरों में व्यापक रूप से एनोफिलीज मच्छरों में एंटीमलेरिया प्रभावकों 19,24,36, GAL4 / UAS प्रणाली के घटकों सहित विभिन्न प्रकार के अणुओं को पेश करने और अध्ययन करने के लिए व्यापक रूप से उपयोग किया गया है, कीटनाशक प्रतिरोध अध्ययन9,33, नियामक तत्व, रिपोर्टर जीन 5,21,37, और जीन-ड्राइव तत्व26 के लिए जीन को ओवरएक्सप्रेस और नॉकडाउन करने के लिए ,38।
यह प्रोटोकॉल वर्णन करता है कि 1) एटीटीबी-फ्लैंक्ड कार्गो का साइट-निर्देशित एकीकरण कैसे किया जाए और 2) एनोफिलीज़ डॉकिंग लाइनों के जीनोम में उल्टे एटीबी साइटों द्वारा फ्लैंक किए गए निर्माण के आरएमसीई। यह दो प्लास्मिड का उपयोग करके प्राप्त किया जाता है: एक दाता एटीटीबी-टैग किए गए प्लास्मिड ब्याज के ट्रांसजीन को ले जाते हैं, और एक सहायक प्लास्मिड जो πC31 integrase को व्यक्त करता है। प्रमुख मलेरिया वैक्टर An. gambiae और An. stephensi का उपयोग विशिष्ट उदाहरणों के रूप में किया जाता है, हालांकि ये प्रोटोकॉल अन्य एनोफिल्स प्रजातियों पर लागू होते हैं।
चित्र 1. साइट-निर्देशित जीनोम संशोधन, एकल एकीकरण और पुन: संयोजन-मध्यस्थता कैसेट एक्सचेंज (आरएमसीई), का उपयोग करके, πC31 प्रणाली का उपयोग करके। एक दाता प्लास्मिड में मौजूद एटीटीबी साइट (एस) (बैंगनी धारीदार) और एक प्राप्त डॉकिंग लाइन में मौजूद एटीपी साइट (ओं) (नीली धारीदार) के बीच पुनर्संयोजन को उत्प्रेरित करता है, जिसके परिणामस्वरूप हाइब्रिड साइटों एटीटीएल और एटीटीआर का गठन होता है। ए) एकीकरण तब प्राप्त किया जाता है जब एकल एटीटीबी और एटीटीपी साइटें फिर से संयोजित होती हैं और परिणामस्वरूप दो एकीकृत मार्करों (नीले और लाल) की उपस्थिति होती है। बी) आरएमसीई तब होता है जब दो एटीटीबी / पी साइटें एक साथ फिर से संयोजित होती हैं और इसके परिणामस्वरूप दाता प्लास्मिड (लाल मार्कर) द्वारा किए गए डॉकिंग लाइन (नीले मार्कर) की एटीटी साइटों के बीच कैसेट के प्रतिस्थापन में परिणाम होता है। C) ATTP (नीला) और ATTB (बैंगनी) के आंशिक न्यूक्लियोटाइड अनुक्रम और हाइब्रिड साइटों attL / R। पुनर्संयोजन बोल्ड ब्लैक में हाइलाइट किए गए ‘टीटी’ कोर अनुक्रमों के बीच होता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
एटीटीबी-टैग किए गए प्लास्मिड का सटीक डिजाइन जो पसंद की डॉकिंग लाइन के साथ संगत है, प्रयोग की सफलता के लिए सर्वोपरि है। ट्रांसफॉर्मेंट की स्क्रीनिंग के लिए उपयोग किए जाने वाले मार्कर की पसंद पर सावधानीपूर्वक विचार किया जाना चाहिए, जिसमें प्रतिदीप्ति रंग और अभिव्यक्ति का पैटर्न शामिल है, जो डॉकिंग लाइन में पहले से मौजूद पैटर्न के अधीन होगा। फ्लोरोसेंट मार्करों का उपयोग करना आवश्यक है जो आसानी से अलग-अलग हैं: अच्छे मार्कर संयोजनों में आरएफपी (लाल)/ सीएफपी (सियान), आरएफपी (लाल)/ जीएफपी (हरा), आरएफपी (लाल)/ वाईएफपी (पीला), और वाईएफपी (पीला)/ सीएफपी (सियान) शामिल हैं, जबकि बचने के लिए संयोजन वाईएफपी (पीला)/ जीएफपी (हरा) और सीएफपी (सियान) / जीएफपी (हरा) हैं। 3xP3 प्रमोटर 39, आंखों और तंत्रिका कॉर्ड के लिए विशिष्ट, मच्छर ट्रांसजेनेसिस के लिए फ्लोरोसेंट मार्करों की अभिव्यक्ति को चलाने के लिए सबसे अधिक बार उपयोग किया जाता है। दरअसल, वर्तमान में उपलब्ध सभी एनोफिलीज़ डॉकिंग लाइनें इस प्रमोटर का उपयोग करती हैं। वैकल्पिक नियामक क्षेत्र An. gambiae polyubiquitin जीन (PUBc)5 या वायरल प्रमोटर IE120 के हैं, जो कई ऊतकों में अभिव्यक्ति को चलाते हैं। जब 3xP3 के साथ उपयोग किया जाता है, तो ये प्रमोटर संभावित रंग संयोजनों और यहां तक कि एक ही फ्लोरोफोर के उपयोग का विस्तार करेंगे। संकेतित प्रमोटर मच्छर जीवन चक्र के दौरान सक्रिय होते हैं जो सभी जीवन चरणों में स्क्रीनिंग और प्रतिदीप्ति निगरानी की अनुमति देते हैं। प्लास्मिड डिजाइन के दौरान एक अतिरिक्त विचार एकीकृत या आदान-प्रदान किए जाने वाले कार्गो का आकार है। जबकि πC31 प्रणाली में उल्लेखनीय वहन क्षमता 18 है, यह माना जाना चाहिए कि दाता प्लास्मिड का आकार आम तौर पर परिवर्तन दक्षता 22 के साथ नकारात्मक रूप से संबंधित है।
वर्णित प्रोटोकॉल में इंटीग्रेज़ का स्रोत एक सहायक प्लास्मिड है जो एंजाइम को सर्वव्यापी रूप से व्यक्त करता है। इंटीग्रेज़ की सर्वव्यापी उपस्थिति दैहिक कोशिकाओं के परिवर्तन का कारण बन सकती है यदि माइक्रोइंजेक्शन को ठीक से उस क्षेत्र में निर्देशित नहीं किया जाता है जहां जर्मलाइन बनता है। जबकि इस तरह की परिवर्तन घटनाएं खो जाएंगी क्योंकि वे वंशानुगत नहीं हैं, दैहिक प्रभाव इंजेक्ट किए गए व्यक्तियों की फिटनेस को कम कर सकते हैं। इससे बचने और परिवर्तन दक्षता बढ़ाने के लिए, इंटीग्रेज़ अभिव्यक्ति को जर्मलाइन तक सीमित किया जा सकता है, उदाहरण के लिए वासा प्रमोटर 22,26 का उपयोग करके। अन्य प्रोटोकॉल इन विट्रो ट्रांसक्रिप्टेड मैसेंजर आरएनए (एमआरएनए) के उपयोग का वर्णन करते हैं, जो 19,24,43 के स्रोत के रूप में है। हालांकि, इसमें एमआरएनए की श्रमसाध्य तैयारी शामिल है और इसमें इंजेक्शन मिश्रण की सावधानीपूर्वक हैंडलिंग और गिरावट से बचने के लिए आरनेस मुक्त अभिकर्मकों के उपयोग की आवश्यकता होती है। इंटीग्रेज़ के प्लास्मिड स्रोतों को An. gambiae9,21,22,26,33,37 और An. stephensi (A.A. व्यक्तिगत संचार) दोनों में विश्वसनीय होने और कुशल परिवर्तन के लिए नेतृत्व करने के लिए प्रदर्शित किया गया है, और इस प्रकार हमारे पसंदीदा विकल्प हैं। इंटीग्रेज़ डिलीवरी के लिए एक और विकल्प स्व-डॉकिंग हेल्पर लाइनों में विवो उत्पादन में है। इस तरह की लाइनें An. gambiae में बनाई गई थीं जो जर्मलाइन-विशिष्ट प्रमोटर नैनो के विनियमन के तहत πC31 integrase को व्यक्त करती हैं और एक बेहतर अस्तित्व और परिवर्तन दक्षता 20 का नेतृत्व करने के लिए पाई गई थीं। हालांकि, सहायक लाइन पर इंटीग्रेज़ एंजाइम के इन विवो उत्पादन द्वारा लगाए गए संभावित फिटनेस लोड पर विचार किया जाना चाहिए।
अन्य ट्रांसजेनिक तकनीकों के साथ, विशेष देखभाल को इंजेक्ट किए गए भ्रूण से प्राप्त होने वाले व्यक्तियों के पालन और क्रॉसिंग के लिए आरक्षित किया जाना चाहिए ताकि ट्रांसफॉर्मेंट को पुनर्प्राप्त करने की संभावनाओं को अधिकतम किया जा सके। जिन व्यक्तियों को ट्रांसजीन विरासत में मिला है, उन्हें सबसे पहले जी 1 संतानों पर पुनर्प्राप्त किया जा सकता है। हालांकि, संभावित परिवर्तन के शुरुआती संकेतों का मूल्यांकन 3xP3 प्रमोटर 43 का उपयोग करते समय गुदा पैपिले और / या जी 0 पहले और दूसरे इंस्टार लार्वा के तंत्रिका कॉर्ड में फ्लोरोसेंट मार्कर की क्षणिक एपिसोमल अभिव्यक्ति की उपस्थिति से किया जा सकता है। जबकि क्षणिक प्रतिदीप्ति की उपस्थिति सफल प्लास्मिड वितरण का सुझाव देती है, यह वंशानुगत जर्मलाइन परिवर्तन की गारंटी नहीं देती है। इसी तरह, क्षणिक अभिव्यक्ति की कमी सफल परिवर्तन को बाहर नहीं करती है। फिर भी, यह देखा गया है कि क्षणिक रूप से सकारात्मक व्यक्तियों को क्षणिक रूप से नकारात्मक लोगों की तुलना में ट्रांसजेनिक संतान उत्पन्न करने की अधिक संभावना है43,48। विशेषज्ञ हाथों में, केवल सकारात्मक व्यक्तियों का पालन और पार करना मच्छरों की संख्या को कम करने का एक विकल्प हो सकता है। हालांकि, छोटे जी 0 लार्वा के महत्व और नाजुकता को देखते हुए, हेरफेर की कम से कम मात्रा अभी भी उचित है और सभी जी 0 व्यक्तियों के पालन की हमेशा सिफारिश की जाती है।
इस प्रोटोकॉल में रिपोर्ट की गई संभोग योजना को संभोग की संभावना को अधिकतम करने और स्वतंत्र परिवर्तन की घटनाओं को अलग करने के लिए डिज़ाइन किया गया है। हालांकि, यदि कीटकारी स्थान या कर्मियों की उपलब्धता एक मुद्दा है, तो जी 0 वयस्कों को एकल पिंजरों में सेक्स द्वारा पूल किया जा सकता है यदि पर्याप्त विपरीत-लिंग वाले व्यक्ति प्रदान किए जाते हैं। इस तरह का सेटअप एक ही पिंजरे से व्यक्तियों में होने वाली कई परिवर्तन घटनाओं के बीच भेदभाव की अनुमति नहीं देगा। प्रयोगात्मक सेटअप के आधार पर, स्क्रीनिंग प्रक्रिया के दौरान एक डबल (एकल एकीकरण) या एकल (आरएमसीई) मार्कर की उपस्थिति की उम्मीद की जाती है। एकल एकीकरण प्रयोगों में डॉकिंग लाइन से मूल मार्कर की उपस्थिति को सत्यापित करना महत्वपूर्ण है, जबकि आरएमसीई में पहले से एकीकृत मार्कर के नुकसान को सत्यापित करना महत्वपूर्ण है। दरअसल, आरएमसीई डिजाइनों में ट्रांसफॉर्मेंट को पुनर्प्राप्त करने के लिए असामान्य नहीं है जिसमें विनिमय के बजाय एकल एकीकरण एक एकल attP साइट 9,33 के पुनर्संयोजन के कारण हुआ था। ऐसे व्यक्तियों में दोनों फ्लोरोसेंट मार्कर मौजूद हैं और साथ ही पूरे दाता प्लास्मिड बैकबोन दोनों फ्लोरोसेंट मार्करों के लिए पूरी तरह से स्क्रीनिंग करने के महत्व को उजागर करते हैं।
जबकि अपेक्षित प्रतिदीप्ति पैटर्न की उपस्थिति सफल परिवर्तन को इंगित करती है, सम्मिलन साइट के आणविक लक्षण वर्णन को किया जाना चाहिए। ऐसा करने के लिए, डॉकिंग लाइन के फ्लैंकिंग जीनोमिक क्षेत्रों सहित अनुमानित सम्मिलन लोकस के सटीक मानचित्रों की तैयारी, जीन प्रवर्धन विश्लेषण के लिए पर्याप्त नैदानिक ओलिगोन्यूक्लियोटाइड प्राइमरों के डिजाइन के लिए महत्वपूर्ण है। एकल एकीकरण की घटनाओं के परिणामस्वरूप नए एकीकृत डीएनए और पहले से सम्मिलित कैसेट के बीच जंक्शन पर attR और attL हाइब्रिड साइटों का गठन होता है। इन साइटों को सम्मिलन साइट मान्यता के लिए लक्षित किया जा सकता है. आरएमसीई डिजाइनों में, दाता कैसेट का सम्मिलन जीनोमिक लोकस के संबंध में दो वैकल्पिक अभिविन्यासों में हो सकता है, इस प्रकार चार प्राइमरों का उपयोग वैकल्पिक पीसीआर संयोजनों में यह पता लगाने के लिए किया जा सकता है कि लाइन किस अभिविन्यास को वहन करती है। जैसा कि कैसेट सम्मिलन का अभिविन्यास ट्रांसजीन अभिव्यक्ति को प्रभावित कर सकता है, तुलनात्मक जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण में सम्मिलन के समान अभिविन्यास को ले जाने वाली लाइनों का उपयोग करना महत्वपूर्ण है।
ट्रांसफॉर्मेंट की कम संख्या के साथ काम करते समय आणविक विश्लेषण के लिए पूरे व्यक्तियों का बलिदान करना वांछनीय नहीं हो सकता है। इसका एक विकल्प एकल वयस्क के पैरों से निकाले गए डीएनए पर आणविक विश्लेषण कर रहा है46 क्योंकि पैर की हानि एक वयस्क महिला को संभोग करने की क्षमता को प्रभावित नहीं करती है और ओवीपोसिट 49। हालांकि, पैर हटाने की प्रक्रिया में व्यक्ति को नुकसान पहुंचाने का खतरा है। सफलता को छोड़े गए प्यूपल मामलों (एल ग्रिगोराकी व्यक्तिगत संचार) का उपयोग करके प्राप्त किया गया है, हालांकि सबसे सुरक्षित दृष्टिकोण व्यवहार्य जी 3 संतानों को प्राप्त करने के बाद जी 2 माता-पिता पर आणविक विश्लेषण करना है।
हाल के वर्षों में, CRISPR / Cas9 ने साइट-विशिष्ट जीनोम संपादन 26,41,50,51 करने के तरीके में क्रांति ला दी है। साइट-निर्देशित आरएमसीई के विपरीत, CRISPR / Cas9-मध्यस्थता जीन एकीकरण (नॉक-इन्स) केवल एक-चरणीय परिवर्तन घटना की आवश्यकता के साथ पूर्व-सम्मिलित पुनर्संयोजन साइटों की उपस्थिति से स्वतंत्र हैं। फिर भी, CRISPR / Cas9 प्रणाली सफल होमोलॉजी निर्देशित मरम्मत के लिए वांछित सम्मिलन साइट के साथ-साथ गाइड आरएनए द्वारा मध्यस्थता की गई कुशल साइट मान्यता पर बड़े ज्ञात जीनोमिक अनुक्रमों की उपस्थिति पर निर्भर करती है। इन शर्तों को हमेशा पूरा नहीं किया जा सकता है या समस्या निवारण के लिए श्रमसाध्य हो सकता है और, An. gambiae और An. stephensi में कई डॉकिंग लाइनों की उपलब्धता और उनसे व्युत्पन्न लाइनों को देखते हुए, एक ही जीनोमिक स्थानों पर ट्रांसजीन के बीच प्रत्यक्ष फेनोटाइपिक तुलना करने के लिए एक बहुत ही मूल्यवान उपकरण बना हुआ है।
The authors have nothing to disclose.
हम ट्रांसजेनिक An. stephensi लार्वा की छवियों को प्रदान करने के लिए Kiona Parker (UCI) के लिए आभारी हैं, और फ्रेजर Colman (LSTM) और बेथ Poulton (LSTM) के लिए ट्रांसजेनिक An. gambiae लार्वा प्रदान करने के लिए। बेथ पॉल्टन (एलएसटीएम) ने एएन गाम्बिया लार्वा की इमेजिंग के दौरान कीमती सहायता भी प्रदान की। इस काम को टाटा इंस्टीट्यूट फॉर जेनेटिक्स एंड सोसाइटी (TIGS) और LSTM के निदेशक उत्प्रेरक कोष द्वारा वित्त पोषित किया गया था, जिसे ए.ए. (DCF2014AA) से सम्मानित किया गया था। ए.ए.जे. कैलिफ़ोर्निया विश्वविद्यालय, इरविन में एक डोनाल्ड ब्रेन प्रोफेसर हैं।
1.5 mL eppendorf tubes | |||
8-well microslides | VWR | MARI1216690 | |
DNeasy Blood & Tissue Kit | Qiagen | 69504 | |
EndoFree Plasmid Maxi Kit (10) | Qiagen | 12362 | |
Ethanol, Absolute, Molecular Biology Grade | |||
Filter set CFP for Leica MZ FLIII Excitation 436/20 nm, extinction 480/40 nm | Leica | 10446363 | |
Filter set dsRED for Leica MZ FLIII Excitation 545/30 nm, extinction 620/60 nm | Leica | 10447079 | |
Filter set YFP customised for Leica MZ FLIII | Omega Optical | 500QM25, 500QM35 | |
Halocarbon oil 27 | Sigma | H8773 | |
Halocarbon oil 700 | Sigma | H8898 | |
Petri dishes | |||
Potassium chloride | |||
Sodium Chloride | |||
Sodium phosphate dibasic | |||
Sodium Acetate Solution (3 M), pH 5.2 | Thermo Fisher Scientific (Life Technologies) | R1181 | |
Stable brush Size 0 |