Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

ROS Live Cell Imaging Under Neuronal Development

Published: February 9, 2021 doi: 10.3791/62165
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2,3
1Department of Biological Sciences, Purdue University, 2Purdue Institute for Integrative Neuroscience, Purdue University, 3Bindley Bioscience Center, Purdue University

Summary

Denne protokol beskriver brugen af en genetisk kodet brintoverilte (H2O2)-biosensor i dyrkede zebrafisk neuroner og larver til vurdering af de fysiologiske signalroller af H2O2 under udvikling af nervesystemet. Det kan anvendes til forskellige celletyper og modificeres med eksperimentelle behandlinger for at studere reaktive iltarter (ROS) i generel udvikling.

Abstract

Reaktive iltarter (ROS) er veletablerede signalmolekyler, som er vigtige i normal udvikling, homøostase og fysiologi. Blandt de forskellige ROS er brintoverilte (H2O2) bedst karakteriseret med hensyn til roller i cellulær signalering. H2O2 har været impliceret under udviklingen i flere arter. For eksempel er der påvist en forbigående stigning i H2O2 i zebrafiskembryoner i de første dage efter befrugtningen. Desuden nedbryder en vigtig cellulær H2O2 kilde, NADPH oxidase (NOX), forringer nervesystemet udvikling såsom differentiering, axonal vækst, og vejledning af nethinde ganglion celler (RGCs) både in vivo og in vitro. Her beskriver vi en metode til billeddannelse intracellulær H2O2 niveauer i dyrkede zebrafisk neuroner og hele larver under udvikling ved hjælp af genetisk kodet H2O2-specifikbiosensor, roGFP2-Orp1. Denne sonde kan være forbigående eller stabilt udtrykt i zebrafisk larver. Desuden mindsker den ratiometriske udlæsning sandsynligheden for at opdage artefakter på grund af differentialgenudtryk eller volumeneffekter. For det første demonstrerer vi, hvordan man isolerer og dyrker RDC'er afledt af zebrafiskembryoner, der forbigående udtrykker roGFP2-Orp1. Derefter bruger vi hele larver til at overvåge H2O2-niveauer på vævsniveau. Sensoren er blevet valideret ved tilsætning af H2O2. Desuden kunne denne metode anvendes til at måle H2O2-niveauer i specifikke celletyper og væv ved at generere transgene dyr med vævsspecifik biosensorudtryk. Da zebrafisk fremmer genetiske og udviklingsmæssige manipulationer, kan den fremgangsmåde, der demonstreres her, tjene som en rørledning til at teste H 2 O2'srolle under neuronal og generel embryonal udvikling i hvirveldyr.

Introduction

Reaktive iltarter (ROS) signalering regulerer udviklingen og funktionen af nervesystemet1. En vigtig cellulær ROS-kilde er NADPH-oxider (NOX), som er transmembranproteiner, der genererer superoxid og hydrogenperoxid (H2O2)2. NOX enzymer findes i hele centralnervesystemet (CNS), og NOX-afledt ROS bidrager til neuronal udvikling3,4,5,6. Vedligeholdelse og differentiering af neurale stamceller, etablering af neuronal polaritet, neuritvækst og synaptisk plasticitet har vist sig at kræve passende niveauer af ROS7,8,9,10,11. På den anden side bidrager ukontrolleret produktion af ROS af NOX'er til neurodegenerative lidelser, herunder Alzheimers sygdom, multipel sklerose og traumatisk hjerneskade12,13,14. Derfor er produktion af fysiologisk relevant ROS afgørende for at opretholde sunde forhold.

Udvikling af genetisk kodede biosensorer lettede detektionen af cellulær ROS meget. En vigtig fordel ved genetisk kodede biosensorer er den øgede tidsmæssige og rumlige opløsning af ROS-signalet, da disse sensorer specifikt kan målrettes mod forskellige steder. Redox-følsomme GFP (roGFP) er en type af sådanne ROS biosensorer. Den roGFP2-Orp1 variant specifikt registrerer H2O2 gennem sin Orp1 domæne, som er en glutathion peroxiredoxin familie protein fra gær15,16. Oxidationen af Orp1-proteinet overføres til roGFP2 for at ændre dets kropsbygning (Figur 1A). Sonden udviser to excitation toppe nær 405 nm og 480 nm, og en enkelt emission peak på 515 nm. Ved oxidation ændres fluorescensintensiteten omkring excitationstoppene: mens 405 nm excitation øges, falder 480 nm excitation. RoGFP2-Orp1 er således en ratiometrisk biosensor, og H2O2-niveaueropdages ved forholdet mellem fluorescensintensiteter, der er ophidset ved to forskellige bølgelængder (figur 1B). Samlet set roGFP2-Orp1 er et alsidigt værktøj til ROS billedbehandling, der kan udnyttes effektivt in vivo.

Figure 1
Figur 1: Skematisk repræsentation og excitationsspektre af roGFP2-Orp1. (A) Oxidantoverførsel finder sted mellem Orp1 og roGFP2 som svar på H2O2, hvilket fører til konformationsmæssige ændringer i roGFP2. (B) Den excitation spektre af roGFP2-Orp1 udviser to excitation toppe på 405 nm og 480 nm og enkelt emission peak på 515 nm. Ved oxidation med H2O2øges 405 nm excitationen, mens 480 nm excitation falder. Dette resulterer i en ratiometrisk udlæsning for H2O2 tilstedeværelse. Tallet er blevet ændret fra Bilan og Belousov (2017)16 og Morgan et al. (2011)25. Klik her for at se en større version af dette tal.

Danio rerio (zebrafisk) modelsystemet har flere fordele ved at anvende genetisk kodede biosensorer. Den optiske gennemsigtighed af embryoner og larver muliggør ikke-invasiv in vivo-billeddannelse. Der udvikles nye billedbehandlingsværktøjer for at opnå højere opløsning og dybere gennemtrængning17. Desuden findes der etablerede værktøjer til genmanipulation (ektopisk mRNA-ekspression, Tol2-transgenese osv.) og genomredigering (TALEN'er, CRISPR/Cas9 osv.), som fremmer generering af transgene dyr18. Efterhånden som zebrafiskembryoner udvikler sig uden for moderen, giver dette system yderligere lettere adgang til og manipulation af embryonerne. For eksempel kan en-celle fase injektioner og medicinske behandlinger nemt gøres.

Her brugte vi zebrafisk til forbigående at udtrykke H2O2-specifikbiosensor roGFP2-Orp1 ved at injicere in vitro-transskriberet mRNA. Disse embryoner kan anvendes til både in vitro-billeddannelse af dyrkede neuroner og in vivo-billeddannelse (figur 2). Vi beskriver en protokol til dissekering og plating nethinde ganglion celler (RGCs) fra zebrafisk embryoner efterfulgt af en vurdering H2O2-niveaueri dyrkede neuroner. Derefter præsenterer vi en metode til in vivo-billeddannelse af roGFP2-Orp1-udtrykkende embryoner og larver ved hjælp af konfokal mikroskopi. Denne tilgang gør det ikke kun muligt at bestemme fysiologiske H2O2-niveauer,men også potentielle ændringer, der forekommer i forskellige udviklingsstadier eller forhold. Samlet set giver dette system en pålidelig metode til påvisning af H2O2 i levende celler og dyr til at studere H 2 O2'srolle inden for udvikling, sundhed og sygdom.

Figure 2
Figur 2. Oversigt over den eksperimentelle tilgang. Kort efter embryonindsamling injiceres roGFP2-Orp1 mRNA i æggeblommen på zebrafiskembryoner i en cellefase. Udvikling af embryoner kan anvendes til både (A) in vitro og (B) in vivo billeddannelse. (A) GFP-positive embryoner anvendes til dissekere nethinder til RGC-indsamling ved 34 hkf. Dissociated RGCs er belagt på PDL/laminin-coated coverslips i ZFCM (+) medier. Vækst kegle billeddannelse kan udføres som RGCs udvide deres axoner efter 6-24 timer af plating. Celler kan udsættes for forskellige behandlinger for at måle de potentielle ændringer i H2O2-niveauer. Her målte vi H2O2-niveauer i vækstkeglerne på RDC'er (rød). (B) GFP-positive embryoner anvendes til in vivo-billeddannelse. I den ønskede alder kan embryoner bedøves og monteres på 35 mm glasbundretter til konfokal billeddannelse. Her er embryoner monteret ventrally for nethinde billeddannelse. Skematisk viser nethinde udvikling i zebrafisk. RGCs danner ganglion cellelag (GCL), som er det inderste lag i nethinden. RGC axoner udvikler sig til synsnerve til at krydse midterlinjen og danner optisk chiasm. Derefter vokser RGC axoner dorsalt for at lave synapser i det optiske tectum i mellemskraben. Klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle dyreforsøg blev etisk gennemgået og godkendt af Purdue Animal Care and Use Committee (PACUC) i henhold til NIH-retningslinjerne med protokollen 2006002050 godkendt den 24.7.2020.

1. Udarbejdelse af løsninger

  1. E2-medier (1x)
    1. Forbered 100x E2A-løsninger (500 mL), 500x E2B (100 mL) og 500x E2C (100 mL) ved at kombinere alle komponenter, der er vist i tabel 1. Autoklave E2A-, E2B- og E2C-løsninger. Opbevares ved 4 °C.
    2. Til 1x E2-medier: Kombiner 5 mL 100x E2A, 1 mL 500x E2B og 1 mL 500x E2C. Bring volumen til 500 mL med sterilt vand. Juster pH-vinduet til 7,0-7,5.
    3. Forbered 50 mL aliquots af 1x E2 mediebutik ved -20 °C til langtidsopbevaring. Nedbør kan dog forekomme ved optøning. Sørg for, at nedbøren er helt opløst, før du bruger stamopløsningen.
opløsning komponent beløb koncentration
100X E2A (500mL)
NaCl 43,8 g 1500 mM
KCl 1,88 g 50 mM
MgSO4 6 g 100 mM
KH2PO4 1,03 g 15 mM
Na2HPO4 0,34 g 5 mM
500X E2B (100 mL)
CaCl2 5,5 g 500 mM
500X E2C (100 mL)
NaHCO3 3 g 350 mM
1X E2 (500 mL)
100X E2A 5 mL 1X
500X E2B 1 mL 1X
500X E2C 1 mL 1X

Tabel 1: Komponenter i 1x E2-medier til zebrafiskcellekultur.

  1. E3 Medier (1x)
    1. Komponenterne opløses i 1 L sterilt vand som vist i tabel 2 for at fremstille 100x lager. Fortynd bestanden i sterilt vand for at gøre 1x E3 medier.
    2. Tilsæt 0,2% methylenblåt. For 20 mL 1x E3 medier tilsættes 40 μL methylenblåt.
    3. Lav et andet parti uden methylenblåt til fluorescerende billeddannelse.
komponent Beløb (g) Koncentration i 100X lager (mM)
NaCl 29.22 500
KCl 1.26 17
CaCl2 2H2O 4.85 33
MgSO4 7H2O 8.13 33

Tabel 2: Komponenter i 100x E3-medier til vedligeholdelse af zebrafiskembryoner.

  1. 80x saltvand lagerløsning
    1. Kombiner alle de komponenter, der er vist i tabel 3. Tilsæt vand for at lave 100 ml opløsning. Bland, indtil alle komponenter er opløst. Opløsningen opbevares ved 4 °C.
komponent Beløb (g) Koncentration på lager (mM)
glukose 1.44 80
Natrium pyruvat 0.44 40
CaCl2 2H2O 0.148 10
HEPES 6.1 256

Tabel 3: Komponenter af 80x saltvandsopløsning til zebrafiskcellekulturmedier.

  1. Zebrafisk cellekultur medium (ZFCM+)
    1. Kombiner alle komponenter, der er vist i tabel 4, for at fremstille 250 mL medier. Juster pH-vinduet til 7,5. Filtermedier med 0,22 μm filter og opbevares ved 4 °C.
komponent Beløb (mL) Mængde i %
L-15 medium (med phenolrød) 212.75 85.1
Føtalt kvægserum (FBS) 5 2
Penicillin/Streptomycin 1 0.4
80X Saltvandsløsning 3.125 1.25
Vand 28.125 11.25

Tabel 4: Komponenter af zebrafiskcellekulturmedie med serum og antibiotika.

  1. Zebrafisk cellekultur medium til billeddannelse (ZFCM-)
    1. Kombiner alle de komponenter, der er vist i tabel 5, for at fremstille 250 mL medier. Juster pH-vinduet til 7,5. Filtermedier med 0,22 μm filter.
    2. Lav engangsbrug aliquots (50 mL partier) for at forhindre forurening. Ved 4 °C.
komponent Beløb (mL) Mængde i %
L-15 medium (ingen phenol rød) 212.75 85.1
80X Saltvandsløsning 3.125 1.25
Vand 34.125 13.65

Tabel 5: Komponenter i zebrafiskcellekulturmedie uden serum og antibiotika til in vitro-billeddannelse.

  1. Sprøjteforme
    1. Opløs 1,5% agarose i E3 medier. Hæld ~ 25 mL agarose i en 100 x 15 mm Petri parabol.
    2. Læg formen på toppen af agarose med en 45 ° vinkel med hensyn til overfladen, og lad det flyde på agarose med en slowmotion. Dette vil hjælpe med at undgå bobler. Lad agarose køle ned og størkne på bænken toppen.
    3. Når helt størknet, fjerne formen langsomt for at forhindre brud på agarose. Tilsæt friske E3-medier, tilsæt paraffinfilm rundt om skålen for at forhindre spild, og opbevar ved 4 °C ( Figur 3).

Figure 3
Figur 3:Sprøjteformbilleder. Formen har seks ramper, en 90 ° og en 45 ° facet side til at holde embryoner på plads. (B) Sprøjtepladen efter størknet agarose og skimmel fjernes. Skalalinjer = 1 cm. Klik her for at se en større version af dette tal.

2. Forberedelse og injektion af roGFP2-Orp1 mRNA

BEMÆRK: roGFP2-Orp1 konstruktion blev opnået fra Dr. Tobias Dick, DKFZ, Tyskland. Det blev sub-klonet ind i PCS2 + vektor i Dr. Qing Deng's Lab, Purdue University. For at forhindre nedbrydning af RNase skal der træffes flere forholdsregler. RNase-fri reagenser og rør skal altid anvendes, handsker skal bæres til alle trin, og alternativt kan materialer og overflader tørres af med et rengøringsmiddel til RNase-fjernelse.

  1. Lineariser 3-10 μg pCS2+/roGFP2-Orp1-vektoren med NotI.
  2. Purificer den lineariserede plasmid med et PCR-oprydningssæt.
  3. In vitro transskribere roGFP2-Orp1 mRNA med en in vitro transskription kit i overensstemmelse med instruktionerne fra producenten.
    1. Begrænset transskription reaktion forsamling
      1. Placer RNA polymerase og lineariseret/renset DNA på is. Hvirvel 10x reaktionsbuffer og 2x NTP/CAP, indtil de er helt i opløsning. Opbevar NTP/CAP på is, men hold bufferen ved stuetemperatur (RT), mens reaktionen monteres. Touch-spin alle reagenser før åbning rør for at forhindre forurening.
      2. Opsæt RNA-syntesereaktion i den rækkefølge, der er angivet nedenfor ved RT, i et RNase-frit 0,5 mL centrifugerør. Det endelige volumen af reaktionen er 20 μL. Reaktionsopsætningen er vist i tabel 6.
      3. Der tilsættes 10 μL ribonukleotidblanding, 2x NTP/CAP og nukleasefrit vand, hvis det er nødvendigt, til røret. Der tilsættes 2 μL 10X reaktionsbuffer. Der tilsættes 1-1,5 μg lineært DNA (op til 6 μL). Hvis det er nødvendigt, tilsættes nukleasefrit vand for at udgøre 20 μL reaktionsvolumen.
      4. Luk røret, vortex kort og touch-spin mikrofuge. Der tilsættes 2 μL 10x SP6-enzymblanding. Luk med et fingerklik og touch-spin i en mikrofuge.
      5. Placer i 37 °C i 2-2,5 timer (kan gå op til 18 timer).
        BEMÆRK: I det præsenterede eksperiment blev der natten over udført 16-18 timers inkubation ved 37 °C for at opnå de bedste resultater.
      6. Der tilsættes 1 μL DNase for at fjerne DNA-skabelon, fingerklik, berøringsspin og inkuber ved 37 °C i 15 min.
Reagens Volumen (μL) Beløb i reaktion
2X NTP/CAP 10 1X
10X reaktionsbuffer 2 1X
DNA-skabelon Op til 6 1-1,5 μg
Nuklease-fri vand Tilføj for at gøre 20 μL
10X SP6 enzymblanding 2 1X

Tabel 6: Reaktionsopsætning for roGFP2-Orp1 mRNA in vitro transskription.

  1. RNA-gendannelse
    1. Der tilsættes 25 μL lithiumchlorid (LiCl), der leveres i in vitro-transskriptionssættet. Placer ved -20 °C i en ikke-frostfryser i mindst 30 min.
    2. Spin i 25 minutter ved maksimal hastighed i en bordpladecentrifuge ved 4 °C. Fjern og kassér supernatant omhyggeligt, for ikke at forstyrre pellet. Der tilsættes 25 μL kold ethanol på 75 % og spin i 5 min ved 4 °C.
    3. Fjern forsigtigt og kassér supernatanten. Lad pellet luft tørre i mindst 5 min på RT. Lad ikke tørre. Der tilsættes 12 μL nukleasefri Tris-EDTA -buffer (pH 7.0), og prøven holdes på is.
    4. Mål RNA-koncentrationen med et spektrofotometer. 0,5- 1 μg/μL opnås normalt.
    5. Der fremstilles 100 ng/μL mRNA i phenolrød opløsning (0,5% phenolrød i Dulbeccos fosfatbufferede saltvand -DPBS) og aliquot til engangsbrug (3-5 μL). MRNA-aliquots opbevares ved - 80 °C.
  1. Mikroinjection af mRNA
    1. På injektionsdagen skal du bruge en af mRNA-aliquoterne og følge protokollen til injektion af zebrafiskembryoner for at injicere 1 nL af mRNA'et i encellede embryoner gennem deres æggeblomme19. Nedenfor gives en kort beskrivelse.
    2. Avl voksne fisk og indsamle embryoner som tidligere beskrevet20.
    3. Træk mikroinjection nåle med pipette puller. Skær nålespidsen over med tang for at skabe en åbning på 10 μm spids.
    4. Juster embryoner i en sprøjteform, der blev beskrevet i trin 1.6.
    5. 1 nL af mRNA'et injiceres i phenolrød med en mikroinjektionspipette af glas.
    6. Indsamle embryoner og holde dem i E3 medier.
    7. Opbevar embryoner i 27 °C inkubatoren i E3-medier, indtil den ønskede udviklingsstadie er opnået. Injicerede embryoner kan anvendes til både in vitro (punkt 3 og 4) og in vivo-billeddannelse (punkt 5). Embryoner, der udtrykker roGFP2-Orp1, kan forvalges inden forsøg med et almindeligt dissektionsmikroskop udstyret med fluorescerende lys og et blåt/grønt filtersæt.

3. Primær nethinde ganglion cellekultur stammer fra zebrafisk embryoner

BEMÆRK: Denne protokol er tilpasset fra en tidligere offentliggjort metode 21. Udfør trin 3.1 og 3.2 i en laminar flow hætte.

  1. Forberedelse af coverslips
    1. Forbered 4-6 kulturplader i hvert eksperiment. Brug syrerensede coverslips (22 x 22 mm kvadrat; 0,16-0,19 mm tykkelse), der opbevares i 100% ethanol.
    2. Fjern en coverlip fra opbevaringsbeholderen ved hjælp af pincet og flamme det for at fjerne resterende ethanol.
    3. Lufttørre coverslip helt ved at placere den i en vinkel inde i en 35-mm kultur parabol.
    4. Poly-D-Lysin (PDL) arbejdsopløsning (1x) fremstilles ved fortynding af 10x bestand (5 mg/mL) i sterilt vand.
    5. Påfør 100 μL på 0,5 mg/mL PDL i midten af hver coverlip og undgå spredning af opløsningen til kanterne.
    6. Inkubat PDL på coverslips i 20-30 min ved stuetemperatur (RT). Sørg for, at PDL ikke tørrer ud.
    7. PDL vaskes med 0,5 mL sterilt vand tre gange. Lad pladerne tørre helt.
    8. Laminin arbejdsopløsning (1x) fremstilles ved fortynding af 50x lager (1 mg/mL) i 1x PBS.
    9. Påfør 100 μL på 20 μg/mL laminin i PBS i midten af hver coverlip og undgå spredning af opløsning til kanterne.
    10. Pladerne inkuberes ved 37 °C i en befugtet inkubator i 2-6 timer. Undgå tørring af lamininopløsningen.
  2. Embryodissektion og plating-RDC'er
    1. Forbered og mærk fire 35 mm vævskulturretter, og fyld med 4 mL af: 70% ethanol, "E2 media 1", "E2 media 2", "E2 media 3" på dissektionsdagen. Opvasken opbevares i køleskabet, indtil der er dissektioner.
    2. Når zebrafisk embryoner er 34 timer efter befrugtning (hpf), tage kultur retter belagt med laminin ud af inkubatoren og vask coverslips tre gange med 0,5 mL 1x PBS.
    3. Efter den endelige vask tilsættes 4 mL ZFCM(+) medier til hver kulturskål og undgår tørring af pladen.
    4. Hent de tilberedte kulturretter fra trin 3.2.1. Lad dem ligevægt til RT.
    5. Fyld 4-6 PCR-rør med 15 μL ZFCM(+) medier. Et rør er nødvendigt for at forberede RGCs fra 4 øjne, der skal belagt på en coverlip.
    6. Hent zebrafiskembryoner fra inkubatoren, og nedsænk embryoner i 35 mm vævskulturfad, der indeholder 70% ethanol i 5-10 s for at sterilisere.
    7. Ved hjælp af en overførsel pipette, overføre embryoner til E2 Media 1 fad, der indeholder sterile E2 medier til at vaske overskydende ethanol.
    8. Overfør embryoner til E2 Media 2 parabol og fjerne deres chorions med skarpe pincet.
    9. Overfør embryoner til den endelige E2 Media 3 parabol til at udføre dissektioner.
    10. Brug et par fine pincet, dissekere de nethinder som tidligere beskrevet 22.
    11. Placer og hold embryoner foran deres æggeblomme med en af pincet og fjern halen posterior til æggeblomme sæk med de andre pincet.
    12. Grib halsen med pincet og tage hovedet af for at udsætte hjerne og øjne til E2 medier. Undgå at skære æggeblommesækken.
    13. Med spidsen af fine pincet ruller forsigtigt øjnene væk fra hovedet, mens du holder kranievævet nede med den anden tang. Hold øjnene isoleret fra de tilstødende vævsrester.
    14. Fire øjne overføres til et af de tidligere fremstillede rør, der indeholder ZFCM(+).
    15. Forsigtigt titrere op og ned med P20 pipette og en gul spids omkring 45 gange for at adskille celler. Undgå luftbobler.
    16. Overfør ZFCM(+) med adskilte celler til midten af coverlipet. Gentag trin 10-12 for yderligere coverlips.
    17. Hold kulturer på bænken ved 22 °C på et polystyrenskumsstativ for at absorbere vibrationer.
    18. Udfør billedbehandling 6-24 timer efter plating.
      BEMÆRK: Brug overførselspipette til at translokere embryoner til forskellige kulturretter. Skift pipetten for hver opløsning for at forhindre overførsel af ethanol (trin 6-8).

4. In vitro ROS billeddannelse af dyrkede RGC neuroner

  1. På dagen for billeddannelse (typisk 6-24 timer efter cellebelægning), skal du kontrollere celler under mikroskop for at validere væksten af RGC axoner.
  2. For levende-celle billeddannelse, overførsel coverslips fra kultur parabol til en levende celle billeddannelse kammer. I dette tilfælde blev et skræddersyet åbent kammer, som tidligere er beskrevet, brugt23.
  3. Opsæt mikroskop til billedbehandling. Brug et omvendt mikroskop udstyret med en differentialinterferenskontrast (DIC) mål, OG590 langpas rødt filter og et EM-CCD-kamera.
  4. Før billedbehandling skal du erstatte ZFCM(+) -mediet med ZFCM(-).
  5. Når cellerne er placeret med 10x mål, erhverve billeder ved 60x forstørrelse ved hjælp af en høj NA olie nedsænkning mål. Brug en ekstra forstørrelse på 1,5 x.
  6. Først erhverve DIC billeder. Derefter billedet roGFP2-Orp1 ved hjælp af et passende filter sæt. Excite roGFP2-Orp1 med 405/20 og 480/30 nm excitation filtre sekventielt og erhverve billeder med 535/30 nm emissionsfilter efter emissionslys har passeret dichroic spejl 505DCXR.
  7. Efter at have taget det første sæt billeder, udveksle medier med medier, der indeholder forskellige behandlingsløsninger. Medier bør ændres hver 30 minutters billedbehandling for at undgå pH og osmolarity ændringer.

5. In vivo ROS-billeddannelse af embryoner under udvikling

  1. For in vivo billeddannelse, holde embryoner i E3 medier, der indeholder 0,003% Phenylthiourea (PTU) uden methylenblåt fra 22-24 hkf. Udveksle medier og dagligt fjerne døde embryoner.
  2. I den ønskede alder bedøver embryoner i 0,016% trikain. Monter bedøvede embryoner i 1% lavt smeltende agarose på 35 mm glasbundskulturretter. Embryoner kan være orienteret dorsalt, ventrally eller lateralt, afhængigt af regionen af interesse for billeddannelse.
  3. Efter agarose størkner, fyldes opvasken med E3 medier uden methylenblåt/0,016% tricain.
  4. Sæt mikroskopet op til billeddannelse. Brug et omvendt laserscanningskonfokalt mikroskop. Alternativt kan du bruge en opretstående konfokal mikroskop udstyret med en vand nedsænkning linse til billede embryoner monteret på toppen af en agarose drop.
  5. Excite roGFP2-Orp1 med 405 nm og 488 nm excitation filtre sekventielt og erhverve tilsvarende billeder med emissionsfiltre i intervallet 515-535 nm.
  6. Anskaffe z-stakke med 5 μm sektionstykkelse gennem den ønskede del af embryonerne. Embryoner kan opbevares til billeddannelse på senere udviklingsstadier.
  7. Efter billeddannelse, fjerne embryoner fra agarose med fine pincet og holde i inkubatoren indtil ønsket alder i methylenblåt-fri medier med PTU.

6. Billedanalyse og -behandling

  1. Måling af H2O2-niveauer baseret på forholdet 405/480
    1. Brug en passende software til billedanalyse. ImageJ software blev brugt her til billedanalyse og behandling.
    2. Åbn DIC-, 405/535- og 480/535-billeder i ImageJ-softwaren ved enten at trække filerne eller klikke på Filer | Åbn. Hvis det ikke allerede er gjort, skal du konvertere billeder til 32-bit ved at klikke på Billede | Skriv | 32-bit.
    3. Definer interesseområde (ROI) med frithåndsværktøj fra kontrollinjen (cellekrop, vækstkegler, nethinden osv.). Åbn ROI Manager ved at klikke på Analyser | Værktøj | ROI Manager. Klik på Tilføj under fanen ROI Manager for at tilføje det definerede investeringsafkast.
    4. Tegn et område tæt på investeringsafkastet, og tilføj som baggrundsafkast. Mål gennemsnitlige baggrundsværdier ved at vælge investeringsafkastet og klikke på Mål under fanen ROI Manager.
    5. Bemærk de gennemsnitlige intensitetsværdier fra målingen. Træk værdien af den gennemsnitlige baggrund fra fluorescerende billeder ved at klikke på Proces | Matematik | Træk . Udfør dette trin for både 405/535- og 480/535-billeder.
    6. Tilføj værdi af "1" til 480/535 fluorescerende billede for at fjerne "0" værdier ved at klikke på Proces | Matematik | Tilføj funktion før ratioberegning.
    7. Klik på Proces | | billedberegner Divider funktion i ImageJ at opdele 405/535 billede med 480/535 billede pixel-for-pixel. Vælg 405/535 billede, der skal divideres med 480/535 billede. Vælg et 32-bit outputbillede.
    8. Anvend billedet roi på forhold ved først at klikke på ratiobilledet og derefter på investeringsafkastet under fanen ROI manager.
    9. Mål gennemsnitsforholdsværdierne på 405/535-billedet til 480/535-billede ved at klikke på Mål under fanen ROI Manager.
    10. Udfør trin 6.1.2-6.1.9 for så mange prøver som muligt for at udføre den relevante statistiske analyse.
  2. Billede af visningsforhold
    BEMÆRK: Denne fremgangsmåde er at trække baggrunden uden for prøven og anvende en farveopslagstabel på billedet.
    1. Når ratio-billedet er oprettet i ImageJ i trin 6.1.7., skal du oprette et 32-bit sort billede ved at klikke på Filer | Ny | Billede.
    2. Anvend det investeringsafkast, du vil have vist H2O2-niveauer for, på det nye billede ved først at klikke på det nye billede og derefter på investeringsafkastet fra fanen ROI manager.
    3. Opret en maske ved at klikke på Rediger | Valg | Opret maske.
    4. Divider maskebilledet med 255 for at justere ROI-værdien til "1", og baggrundsværdierne vil være "0". Klik på Proces | Matematik | Del og skriv 255.
    5. Multiplicer maske med forholdsbilledet ved at klikke på Proces | | billedberegner Multiplicer funktion. Dette vil resultere i et billede med gråtonerforhold, der kun viser investeringsafkastet.
    6. Skift slå tabellen op til "Fire" ved at klikke på Billede | Slå tabeller op | Skyd.
      BEMÆRK: Der kan anvendes en multiplikationsfaktor på alle billeder for at opnå en bedre visualisering af forholdet ved at klikke på Proces | Billede | Gang .
    7. Konverter forholdsbilledet til 8-bit ved at klikke på Billede | Skriv | 8-bit.
    8. Tilføj kalibreringslinjen ved at klikke på Analyser | Værktøj | Kalibreringslinje.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Dyrkede zebrafisk-RDC'er strækker axoner inden for 1d. Et repræsentativt billede af forholdet H2O 2 -biosensor i forholdet 405/480 er vist i figur 4A. Cellekroppen, axonen og vækstkeglerne er tydeligt synlige i individuelle neuroner. Disse neuroner kan udsættes for forskellige behandlinger over tid for at overvåge H2O2 ændringer. Vi har tidligere konstateret, at tilføjelse af 100 μM H2O2 til kulturmedier øger forholdet værdier, viser, at real-time ændringer kan påvises med dette system (Figur 4)24.

Figure 4
Figur 4: H2O2 billeddannelse i dyrkede zebrafisk-RGC-RGC-neuroner med 34 hkf gamle zebrafiskembryoner. Neuron til venstre blev behandlet med serumfrit kontrolmedium, og neuron til højre blev behandlet med 100 μM H2O2 i 30 min. Skalastang = 10 μm. (B) Søjlediagrammer, der viser de gennemsnitlige H2O2-niveauer i de vilde zebrafisk RGC-vækstkegler før og efter behandling med enten kontrol eller 100 μM H2O2. Dataene blev normaliseret for at kontrollere behandlingen. Data vises middelværdi ± SEM. Antallet af vækstkegler vises i parentes for hver gruppe. To-tailed Wilcoxon matchede par underskrevet rang test; **p = 0,0009. Tallet er ændret fra vores tidligere publikation24. Klik her for at se en større version af dette tal.

H2O2-niveauerne kan også bestemmes i hele zebrafiskembryoner (figur 5). Da mRNA injiceres i encellestadiet, udtrykker alle væv roGFP2-Orp1 biosensoren. I figur 5Aviser vi hovedregionen af zebrafisklarver på to forskellige tidspunkter med fokus på H2O2-niveauerne i nethinden som et eksempel. Vi har tidligere vist, at tilsætning af H2O2 øger forholdet værdier i realtid, mens tilføjelsen af reduktion agent DTT vender denne effekt in vivo24. Her målte vi de basale niveauer af H2O2 i de samme zebrafiskembryoner ved 2 dpf og 5 dpf. Ved 2 dpf var forholdsværdierne betydeligt lavere end ved 5 dpf (p<0,0001; Figur 5B). Desuden viste hvert dyr en forskellig stigning i deres nethinde H2O2-indhold (figur 5C).

Figure 5
Figur 5: In vivo H2O2 billeddannelse i zebrafisklarver med roGFP2-Orp1. (A) DIC og 405/480 nm ratio billeder af 2 og 5 dpf zebrafisk larver. ROI defineres som nethinden (gule linjer) til måling af forholdsværdier. De samme larver blev analyseret ved 2 og 5 dpf. Skalastænger = 50 μm. (B) Måling af gennemsnitlige H2O2-niveauer i nethinder på 2 og 5 dpf zebrafisk. Ved 5 dpf øges H2O2-niveauernebetydeligt i nethinden sammenlignet med 2 dpf. (C) Linjegraf over målinger af de enkelte fisk. Hvert dyr udviser en stigning i H2O2-niveauernei deres nethinde fra 2 til 5 dpf. Data vises som middelværdi ± SEM. Antal analyserede larver vises i parentes for hver gruppe. To-tailed Wilcoxon matchede par underskrevet rang test, ****p<0.0001. Klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Der er flere kritiske trin, der kræver opmærksomhed i hele denne protokol. Vi mener, at overvejer disse punkter vil forbedre den eksperimentelle flow. For primær RGC-kultur er steriliteten af ZFCM(-) meget vigtig, da dette kulturmedie ikke indeholder antibiotika, og forurening kan forekomme før eller under billeddannelse. For at undgå det anbefaler vi kun at forberede og bruge ZFCM(-) inde i et biosikkerhedsskab og regelmæssigt lave friske ZFCM(-) medier (trin 1.5). Desuden bør lamininbestandene holdes på -80 °C. Optøet laminin skal til enhver tid opbevares ved 4 °C. Hold ikke lamininopløsninger ved stuetemperatur eller genfryses, da det reducerer proteinets neuritevækstfremmende aktivitet.

Dissekering zebrafisk nethinden på det rigtige tidspunkt er vigtigt at give nok RGCs at udvide axoner. Zebrafisk RGCs er født på 28 hkf og udvide axoner ud af nethinden starter 32-36 hkf. Derfor er det afgørende at plade-RGCs efter 28 hkf, helst mellem 32-36 hkf, for at give mulighed for fuld differentiering af RGCs. Kulturer udarbejdet på tidligere tidspunkt punkter kan ikke give nok RGCs eller vil give RGCs, der ikke kan forlænge axoner inden for 24 timer efter plating. Det anbefales på det kraftigste at ændre ZFCM(-) mediet, når der bliver billedbehandling, i mere end 30 minutter. Da dette medie mangler phenolrød, er pH-ændringer ikke synlige og skal muligvis overvejes. Udveksle medier meget omhyggeligt for at undgå at løsne neuroner under processen (trin 4.7).

Endelig er det nødvendigt at ændre medierne til E3 med PTU, men uden methylenblåt med 24 hkf. PTU forhindrer pigmentering for øget larvegennemsigtighed, der kræves til in vivo-fluorescensbilleddannelse; Tidligere behandling med PTU kan dog forårsage udviklingsdefekter26. Methylenblåt fjernes fra E3-medier for at reducere autofluorescens, hovedsageligt fra æggeblommen (trin 5.1).

Denne metode gør det muligt at detektering af H2O2. Subcellulær opdeling af H2O2 bidrager dog til lokal signalering, og cytoplasmiske H2O2-niveauergiver muligvis ikke tilstrækkelige oplysninger om specifikke signalroller på H2O2. Da roGFP2-Orp1 er en genetisk kodet biosensor, kan den målrettes mod vævsspecifikt udtryk (f.eks. neuroner, astrocytter, gliaceller osv.) eller specifikke subcellulære placeringer (f.eks. plasmamembran, mitokondrier, kerne osv.). Da roGFP2-Orp1 er en GFP-baseret biosensor, er kombinationen med andre fluorescerende sonder begrænset til emissionsbølgelængder uden for det grønne spektrum. Da GFP er meget udbredt som transgenese markør, udnyttelse af GFP-baserede biosensorer kan begrænses. For at løse denne udfordring er der for nylig udviklet røde fluorescerende proteiner til H2O2-detektion27. Desuden udtrykkes roGFP2-Orp1 i forbigående rækkefølge i den metode, der præsenteres her. Derfor vil mRNA- og proteinudtrykket henfalde over tid. Vi var stadig i stand til at opdage signalet i 5 dpf larver; der skal dog etableres transgene fiskelinjer for et stabilt udtryk for biosensoren under hele udviklingen og ind i voksenalderen.

Flere farvebaserede assays er tilgængelige til påvisning af intracellulær ROS (f.eks. H2DCF-DA) eller specifikt H2O2 (PF6-AM)28,29. Brug af en genetisk kodet biosensor, såsom roGFP2-Orp1, har flere fordele i forhold til farvebaserede metoder. For det første giver det mulighed for påvisning af både forbigående ændringer i oxidativ status på grund af reversibilitet såvel som på specifikke subcellulære placeringer. Derfor overvåges de dynamiske ændringer godt med høj grad af rumlig opløsning30. For det andet udviser det generelt mindre toksicitet for celler eller væv sammenlignet med farvemolekyler. Endelig kan biosensoren manipuleres yderligere genetisk for at imødekomme behovene i forbindelse med specifikke forsøg31. roGFP2-Orp1 er en ratiometrisk biosensor, da den har to excitation og en emission peak. Ved interaktion med H2O2,405 nm excitation stiger, og 480 nm excitation falder. Udlæsningen er derfor forholdet mellem de intensitetsværdier, der erhverves med henholdsvis 405 og 480 nm excitation. Da denne sonde er ratiometrisk, bliver det unødvendigt at anvende en anden sonde for at korrigere for potentielle volumeneffekter. Da denne sonde desuden kun indebærer udtryk for en polypeptid, lider den ikke af potentielle problemer med differentialudtryk af mere end ét protein, som i tilfælde af intermolekylær fluorescens Resonans Energy Transfer (FRET).

RoGFP2-Orp1 er en alsidig H2O2 sonde til at studere ROS produktion og signalering. I levende celler, udstiller denne sonde dynamikområde på 4,8 (omkring 4 i transgene zebrafisk embryoner)15,32. RoGFP2-Orp1's redoxtilstand er imidlertid genstand for ændringer ved endogene thioredoxin- og glutaredoxinsystemer; derfor blev mere følsomme sonder udviklet ved at erstatte Orp1 med en anden gær peroxiredoxin, Tsa233,34. Mens roGFP2-Orp1 er nyttig til at opdage ændringer i H2O2 i zebrafisk embryoner, følsomheden er for det meste begrænset til højere koncentrationer af eksogent anvendt H2O224,31, eller til potente stimuli. For eksempel øgede slids2 behandling roGFP2-Orp1 signalet i vilde type RGCs, men ikke i nox2 mutant RGCs35. På den anden side var der ingen forskel i basal H2O2 niveauer mellem wildtype og nox2 mutant RGCs og 2 dpf embryoner24,35. Derfor vil der være behov for højere følsomhedssonder for at opdage basale niveauer eller små ændringer i H2O2.

HyPer er en anden udbredt genetisk kodet og ratiometrisk H2O2-specifikbiosensor36. Følsomhederne af begge sonder er ens; roGFP2-Orp1 udviste dog langsommere lydhørhed over for H2O2 ændringer15. Derfor kan præcis registrering af ændringer i realtid kræve HyPer i stedet for roGFP2-Orp1. Mens de første HyPer-versioner påvirkes af pH-ændringer, er roGFP2-Orp1 ikke16,36. Derfor er det vigtigt at medtage en pH-kontrol sonde (SypHer3s), mens du bruger HyPer37. Den seneste HyPer sonde, HyPer7, overvandt mange af ulemperne ved eksisterende H2O2 sonder: HyPer7 har en højere pH-stabilitet, øget lysstyrke, hurtigere kinetik og højere dynamikområde38. Desuden valideres HyPer7 både in vitro og in vivo, hvilket viser den subcellulære opdeling og overvågning af realtid H2O2 ændringer i zebrafiskembryoner under sårheling38.

Den metode , der præsenteres her , kan udvides til at undersøge ROS-signalets rolle både in vitro og in vivo. roGFP2-Orp1 udtrykke neuroner kan udsættes for forskellige behandlinger for at studere deres virkning på H2O2 signalering. For eksempel viste vi, at RGCs reagerer på ændringer i H2O2-niveauer i realtid (Figur 4), hvilket tyder på, at biosensoren kan opdage øjeblikkelige ændringer i H2O2. Det ville imidlertid kræve omfattende kalibrering af systemet at bestemme absolutte intracellulære H2O2-koncentrationer. Detektionsgrænsen for biosensoren er også uklar. Derudover er den detaljerede rumlige fordeling af biosensoren i cellen ikke helt kendt, hvilket kan forstyrre fortolkningen af resultaterne. Desuden kan fastsættelsen af det nøjagtige placeringssignal fra roGFP2-Orp1 afsløre, om der er stedsspecifik H2O2-produktion, der bidrager til lokaliseret intracellulær signalering.

Oprettelse af transgene fisk, der udtrykker roGFP2-Orp1, har mange fordele. Biosensoren kan udtrykkes allestedsnærværende eller under en vævsspecifik promotor til undersøgelse af cellespecifik H2O2-signalering ved hjælp af Tol2 transgenese i zebrafisk39. H 2 O2's rolle i udviklingen kan studeres ved allestedsnærværende udtryk for biosensoren. F.eks. kan transgene zebrafiskembryoner overvåges for at vurdere ændringer i H2O2-niveauer, og hvordan disse ændringer bidrager til forskellige udviklingsstadier. På den anden side fokuserer den roGFP2-Orp1's vævsspecifikke udtryk på virkningerne af H2O2-produktionen i celler eller væv af interesse. Væv eller celle-specifikke initiativtagere kan bruges til at drive udtryk for roGFP2-Orp1 i specifikke celler. Desuden kan Gal4/UAS-systemet bruges til sparsom mærkning af individuelle neuroner. Derfor giver denne tilgang mulighed for at detektere H2O2-niveauer ved en cellulær opløsning in vivo. Endelig kan stabile transgene linjer bruges til screening af stoffer med høj gennemløb, der involverer ROS-signalering og oxidativ stress hos zebrafiskembryoner.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfattere erklærer, at de ikke har nogen interessekonflikt.

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet af National Institutes of Health (Grant R01NS117701), National Science Foundation (Grant 1146944-IOS), Indiana Traumatic Spinal Cord and Brain Injury Research Fund (Grant 20000289), Purdue Research Foundation (Grant 209911) og kontoret for Executive Vice President for Research and Partnerships ved Purdue University (Grant 210362). Vi takker Dr. Cory J. Weaver og Haley Roeder for at etablere zebrafisk RGC kultur protokol. Vi takker Haley Roeder yderligere for at levere dataene i figur 4. Vi takker Leah Biasi og Kenny Nguyen for hjælpen med RGC-kulturen. Vi takker Gentry Lee for at redigere teksten. Vi takker Dr. Tobias Dick for at give roGFP2-Orp1 og Dr. Qing Deng for pCS2 + vektor, der indeholder roGFP2-Orp1. Figur 2 oprettes med Biorender.com.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
35-mm culture dish Sarstedt 83-3900
35-mm glass bottom dish MatTek P35G-1.5-10-C
Agarose Fisher Scientific BP160-500
Borosilicate Glass Capillary Tubes Sutter/Fisher Scientific NC9029378
Calcium Chloride Dihydrate Fisher Scientific C79-500
Cover glass Corning 2850-22
Disposable Petri Dishes (100 x 15 mm) VWR 25384-094
Fetal Bovine Serum ThermoFisher Scientific 26140087
Glucose Sigma Aldich G7528
HEPES Sigma Aldich H4034
Injection Mold Adaptive Science Tools TU-1
Inverted Microscope Nikon TE2000
Laminin ThermoFisher Scientific 23017-015
Laser Scanning Confocal Microscopy Zeiss 710
Leibovitz's L-15 Medium with phenol red Gibco/Fisher Scientific 11-415-064
Leibovitz's L-15 Medium without phenol red Gibco/Fisher Scientific 21-083-027
Low melting agarose Promega V2111
mMessage mMachine SP6 Transcription Kit Invitrogen AM1340
NotI New England Biolabs R0189S
PBS Hyclone/Fisher Scientific SH3025601
Penicillin/streptomycin ThermoFisher Scientific 15140122
Phenol Red Sigma Aldich P0290
Phenylthiourea (PTU) Sigma Aldich P7629
Pneumatic PicoPump World Precision Instruments PV820
Poly-D-Lysine (PDL) Sigma Aldich P7280
QiaQUICK PCR Purification Kit QIAGEN 28104
Recombinant mouse slit2 R&D Systems 5444-SL-050
Sodium Pyruvate Sigma Aldich P5280
Steritop 0.22 µm filter Millipore S2GPT05RE
TE Buffer Ambion AM9860
Tricaine Methanesulfonate Sigma Aldich E10521
Vertical Pipette Puller David Kopf Instruments 700C

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bórquez, D. A., et al. Dissecting the role of redox signaling in neuronal development. Journal of Neurochemistry. 137 (4), 506-517 (2016).
  2. Bedard, K., Krause, K. -H. The NOX family of ROS-generating NADPH oxidases: Physiology and pathophysiology. Physiological Reviews. 87 (1), 245-313 (2007).
  3. Weaver, C. J., Leung, Y. F., Suter, D. M. Expression dynamics of NADPH oxidases during early zebrafish development. Journal of Comparative Neurology. 524 (10), 2130-2141 (2016).
  4. Terzi, A., Suter, D. M. The role of NADPH oxidases in neuronal development. Free Radical Biology and Medicine. 154, 33-47 (2020).
  5. Infanger, D. W., Sharma, R. V., Davisson, R. L. NADPH oxidases of the brain: Distribution, regulation, and function. Antioxidants & Redox Signaling. 8 (9-10), 1583-1596 (2006).
  6. Coyoy, A., Olguin-Albuerne, M., Martinez-Briseno, P., Moran, J. Role of reactive oxygen species and NADPH-oxidase in the development of rat cerebellum. Neurochemistry International. 62 (7), 998-1011 (2013).
  7. Le Belle, J. E., et al. Proliferative neural stem cells have high endogenous ROS levels that regulate self-renewal and neurogenesis in a PI3K/Akt-dependant manner. Cell Stem Cell. 8 (1), 59-71 (2011).
  8. Nayernia, Z., et al. Decreased neural precursor cell pool in NADPH oxidase 2-deficiency: from mouse brain to neural differentiation of patient derived iPSC. Redox Biology. 13, 82-93 (2017).
  9. Wilson, C., Nunez, M. T., González-Billault, C. Contribution of NADPH oxidase to the establishment of hippocampal neuronal polarity in culture. Journal of Cell Science. 128 (16), 2989-2995 (2015).
  10. Munnamalai, V., et al. Bidirectional interactions between Nox2-type NADPH oxidase and the F-actin cytoskeleton in neuronal growth cones. Journal of Neurochemistry. 130 (4), 526-540 (2014).
  11. Kishida, K. T., et al. Synaptic plasticity deficits and mild memory impairments in mouse models of chronic granulomatous disease. Molecular and Cellular Biology. 26 (15), 5908-5920 (2006).
  12. Ravelli, K. G., et al. Nox2-dependent neuroinflammation in an EAE model of multiple sclerosis. Translational Neuroscience. 10 (1), 1-9 (2019).
  13. Park, L., et al. Nox2-derived radicals contribute to neurovascular and behavioral dysfunction in mice overexpressing the amyloid precursor protein. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (4), 1347-1352 (2008).
  14. Schiavone, S., Neri, M., Trabace, L., Turillazzi, E. The NADPH oxidase NOX2 mediates loss of parvalbumin interneurons in traumatic brain injury: Human autoptic immunohistochemical evidence. Scientific Reports. 7 (1), 8752 (2017).
  15. Gutscher, M., et al. Proximity-based protein thiol oxidation by H2O2-scavenging peroxidases. Journal of Biological Chemistry. 284 (46), 31532-31540 (2009).
  16. Bilan, D. S., Belousov, V. V. New tools for redox biology: from imaging to manipulation. Free Radical Biology and Medicine. 109, 167-188 (2016).
  17. Abu-Siniyeh, A., Al-Zyoud, W. Highlights on selected microscopy techniques to study zebrafish developmental biology. Laboratory Animal Research. 36 (1), 12 (2020).
  18. Sassen, W. A., Koster, R. W. A molecular toolbox for genetic manipulation of zebrafish. Advances in Genomics and Genetics. 5, 151-163 (2015).
  19. Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. Journal of Visualized Experiments. (25), e1115 (2009).
  20. Avdesh, A., et al. Regular care and maintenance of a Zebrafish (Danio rerio) laboratory: An introduction. Journal of Visualized Experiments. (69), e4196 (2012).
  21. Chen, Z., et al. Primary neuron culture for nerve growth and axon guidance studies in Zebrafish (Danio rerio). PLoS One. 8 (3), 57539 (2013).
  22. Zhang, L., Leung, Y. F. Microdissection of zebrafish embryonic eye tissues. Journal of Visualized Experiments. (40), e2028 (2010).
  23. Suter, D. M. Live cell imaging of neuronal growth cone motility and duidance in vitro. Cell Migration: Methods in Molecular Biology. , 65-86 (2011).
  24. Weaver, C. J., et al. nox2/cybb deficiency affects zebrafish retinotectal connectivity. Journal of Neuroscience. 38 (26), 5854-5871 (2018).
  25. Morgan, B., Sobotta, M. C., Dick, T. P. Measuring EGSH and H2O2 with roGFP2-based redox probes. Free Radical Biology and Medicine. 51, 1943-1951 (2011).
  26. Li, Z., et al. Phenylthiourea specifically reduces zebrafish eye size. PLoS One. 7 (6), 40132 (2012).
  27. Ermakova, Y. G., et al. Red fluorescent genetically encoded indicator for intracellular hydrogen peroxide. Nature Communications. 5, 5222 (2014).
  28. Oparka, M., et al. Quantifying ROS levels using CM-H2DCFDA and HyPer. Methods. 109, 3-11 (2016).
  29. Dickinson, B. C., Peltier, J., Stone, D., Schaffer, D. V., Chang, C. J. Nox2 redox signaling maintains essential cell populations in the brain. Nature Chemical Biology. 7 (2), 106-112 (2011).
  30. Cannon, M. B., Remington, S. J. Redox-sensitive green fluorescent protein: Probes for dynamic intracellular redox responses. A review. Methods in Molecular Biology. 476, 51-65 (2009).
  31. Meyer, A. J., Dick, T. P. Fluorescent protein-based redox probes. Antioxidants & Redox Signaling. 13 (5), 621-650 (2010).
  32. Panieri, E., Millia, C., Santoro, M. M. Real-time quantification of subcellular H2O2 and glutathione redox potential in living cardiovascular tissues. Free Radical Biology and Medicine. 109, 189-200 (2017).
  33. Breus, O., Dickmeis, T. Genetically encoded thiol redox-sensors in the zebrafish model: Lessons for embryonic development and regeneration. Biological Chemistry. , (2020).
  34. Morgan, B., et al. Real-time monitoring of basal H2O2 levels with peroxiredoxin-based probes. Nature Chemical Biology. 12 (6), 437-443 (2016).
  35. Terzi, A., Roeder, H., Weaver, C. J., Suter, D. M. Neuronal NADPH oxidase 2 regulates growth cone guidance downstream of slit2/robo2. Developmental Neurobiology. , (2020).
  36. Bilan, D. S., Belousov, V. V. HyPer family probes: State of the art. Antioxidants & Redox Signaling. 24 (13), 731-751 (2016).
  37. Ermankova, Y. G., et al. SypHer3s: a genetically encoded fluorescent ratiometric probe with enhanced brightness and an improved dynamic range. Chemistry Communications. 54 (23), 2898-2901 (2018).
  38. Pak, V. V., et al. Ultrasensitive genetically encoded indicator for hydrogen peroxide identifies roles for the oxidant in cell migration and mitochondrial function. Cell Metabolism. 31 (3), 642-653 (2020).
  39. Kwan, K. M., et al. The Tol2kit: A multisite gateway-based construction Kit for Tol2 transposon transgenesis constructs. Developmental Dynamics. 236 (11), 3088-3099 (2007).

Tags

Neurovidenskab ROS brintoverilte roGFP2-Orp1 biosensor RGC zebrafisk neuronal udvikling
ROS Live Cell Imaging Under Neuronal Development
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Terzi, A., Alam, S. M. S., Suter, D. … More

Terzi, A., Alam, S. M. S., Suter, D. M. ROS Live Cell Imaging During Neuronal Development. J. Vis. Exp. (168), e62165, doi:10.3791/62165 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter