Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

ROS Live Cell Imaging under neuronal utveckling

Published: February 9, 2021 doi: 10.3791/62165
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2,3
1Department of Biological Sciences, Purdue University, 2Purdue Institute for Integrative Neuroscience, Purdue University, 3Bindley Bioscience Center, Purdue University

Summary

Detta protokoll beskriver användningen av en genetiskt kodad väteperoxid (H2O2)-biosensori odlade zebrafisk nervceller och larver för att bedöma de fysiologiska signalrollerna för H2O2 under nervsystemet utveckling. Det kan appliceras på olika celltyper och modifieras med experimentella behandlingar för att studera reaktiva syrearter (ROS) i allmän utveckling.

Abstract

Reaktiva syrearter (ROS) är väletablerade signalmolekyler, som är viktiga i normal utveckling, homeostas och fysiologi. Bland de olika ROS kännetecknas väteperoxid (H2O2) bäst med avseende på roller i cellulär signalering. H2O2 har varit inblandad under utvecklingen i flera arter. Till exempel har en övergående ökning av H2O2 upptäckts i zebrafiskembryon under de första dagarna efter befruktning. Dessutom försämrar utarmning av en viktig cellulär H2O2-källa, NADPH oxidas (NOX), nervsystemets utveckling såsom differentiering, axonal tillväxt och vägledning av retinala ganglionceller (RGCs) både in vivo och in vitro. Här beskriver vi en metod för avbildning intracellulära H2O2 nivåer i odlade zebrafisk nervceller och hela larver under utveckling med hjälp av den genetiskt kodade H2O2-specifikabiosensor, roGFP2-Orp1. Denna sond kan vara övergående eller stabilt uttryckt i zebrafisklarver. Dessutom minskar ratiometric avläsning sannolikheten för att upptäcka artefakter på grund av differentiella genuttryck eller volym effekter. För det första visar vi hur man isolerar och odlar RGCs som härrör från zebrafiskembryon som tillfälligt uttrycker roGFP2-Orp1. Sedan använder vi hela larver för att övervaka H2O2-nivåer på vävnadsnivå. Sensorn har validerats genom tillsats av H2O2. Dessutom skulle denna metod kunna användas för att mäta H2O2-nivåer i specifika celltyper och vävnader genom att generera transgena djur med vävnadsspecifikt biosensoruttryck. Eftersom zebrafisk underlättar genetiska och utvecklingsmässiga manipuleringar, kan det tillvägagångssätt som demonstreras här fungera som en pipeline för att testa rollen som H2O2 under neuronal och allmän embryonal utveckling hos ryggradsdjur.

Introduction

Reaktiva syrearter (ROS) signalering reglerar utvecklingen och funktionen hos nervsystemet1. En viktig cellulär ROS källa är NADPH oxidaser (NOX), som är transmembranproteiner som genererar superoxid och väteperoxid (H2O2)2. NOX enzymer finns i hela centrala nervsystemet (CNS), och NOX-härledda ROS bidrar till neuronal utveckling3,4,5,6. Underhåll och differentiering av neurala stamceller, upprättande av neuronal polaritet, neurit utväxt och synaptisk plasticitet har visat sig kräva tillräckliga nivåer av ROS7,8,9,10,11. Å andra sidan bidrar okontrollerad produktion av ROS av NOXes till neurodegenerativa störningar inklusive Alzheimers sjukdom, multipel skleros och traumatisk hjärnskada12,13,14. Därför är produktion av fysiologiskt relevant ROS avgörande för att upprätthålla hälsosamma förhållanden.

Utveckling av genetiskt kodade biosensorer underlättade upptäckten av cellulära ROS kraftigt. En viktig fördel med genetiskt kodade biosensorer är den ökade temporala och rumsliga upplösningen av ROS-signalen, eftersom dessa sensorer specifikt kan riktas till olika platser. Redoxkänslig GFP (roGFP) är en typ av sådana ROS-biosensorer. RoGFP2-Orp1-varianten upptäcker specifikt H2O2 genom sin Orp1-domän, som är ett glutationperoxiredoxinfamiljprotein från jäst15,16. Oxidationen av Orp1-proteinet överförs till roGFP2 för att ändra dess konformation (figur 1A). Sonden uppvisar två excitationstoppar nära 405 nm och 480 nm, och en enda utsläppstopp vid 515 nm. Vid oxidation förändras fluorescensintensiteten runt excitationstopparna: medan 405 nm excitation ökar minskar 480 nm excitation. Således är roGFP2-Orp1 en ratiometric biosensor, och H2O2-nivåerdetekteras av förhållandet mellan fluorescensintensiteter upphetsade vid två olika våglängder (Figur 1B). Sammantaget är roGFP2-Orp1 ett mångsidigt verktyg för ROS-avbildning som kan användas effektivt in vivo.

Figure 1
Figur 1: Schematisk representation ochexcitationsspektra av roGFP2-Orp1. (A) Oxidantöverföring sker mellan Orp1 och roGFP2 som svar på H2O2,vilket leder till konformationsförändringar i roGFP2. B)RoGFP2-Orp1:s excitationsspektra uppvisar två excitationstoppar vid 405 nm och 480 nm och en enda utsläppstopp vid 515 nm. Vid oxidation med H2O2ökar excitationen på 405 nm medan 480 nm excitation minskar. Detta resulterar i en ratiometric avläsning för H2O2 närvaro. Siffran har ändrats från Bilan och Belousov (2017)16 och Morgan et al. (2011)25. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Danio rerio (zebrafisk) modellsystem har flera fördelar med att applicera genetiskt kodade biosensorer. Den optiska transparensen hos embryon och larver möjliggör icke-invasiv in vivo-avbildning. Nya bildverktyg utvecklas för att uppnå högre upplösning och djupare penetration17. Dessutom finns det etablerade verktyg för genetisk manipulering (ectopic mRNA-uttryck, Tol2-transgenes, etc.) och genomredigering (TALENs, CRISPR/ Cas9, etc.), vilket främjar genereringen av transgena djur18. När zebrafiskembryon utvecklas utanför modern möjliggör detta system ytterligare enklare åtkomst och manipulering av embryona. Till exempel kan encelliga injektioner och läkemedelsbehandlingar enkelt göras.

Här använde vi zebrafisk för att tillfälligt uttrycka H2O2-specifikabiosensor roGFP2-Orp1 genom att injicera in vitro-transkriberad mRNA. Dessa embryon kan användas för både in vitro-avbildning av odlade nervceller och in vivo-avbildning (figur 2). Vi beskriver ett protokoll för dissekering och plätering retinal ganglion celler (RGCs) från zebrafish embryon följt av bedömning H2O2-nivåer i odlade nervceller. Sedan presenterar vi en metod för in vivo-avbildning av roGFP2-Orp1-uttryckande embryon och larver med konfokal mikroskopi. Detta tillvägagångssätt tillåter inte bara att bestämma fysiologiska H2O2-nivåerutan också potentiella förändringar som inträffar i olika utvecklingsstadier eller förhållanden. Sammantaget ger detta system en tillförlitlig metod för att upptäcka H2O2 i levande celler och djur för att studera H2O2: s roll i utveckling, hälsa och sjukdom.

Figure 2
Figur 2. Översikt över det experimentella tillvägagångssättet. Kort, efter embryosamling, injiceras roGFP2-Orp1 mRNA i äggulan av encelliga zebrafiskembryon. Utveckling av embryon kan användas för både (A) in vitro och (B) in vivo imaging. A)GFP-positiva embryon används för att dissekera näthinne för RGC-insamling vid 34 hpf. Dissocierade RGCs pläteras på PDL/lamininbelagda täcken i ZFCM (+) media. Tillväxt kon imaging kan utföras som RGCs utöka sina axons efter 6-24 h plätering. Celler kan utsättas för olika behandlingar för att mäta de potentiella förändringarna i H2O2-nivåer. Här mätte vi H2O2-nivåeri tillväxtkonerna hos RGCs (röd). B)GFP-positiva embryon används för in vivo-avbildning. Vid önskad ålder kan embryon bedövas och monteras på 35 mm glasbottenfat för konfokal avbildning. Här monteras embryon ventrally för retinal avbildning. Schematiska visar retinal utveckling i zebrafisk. RGCs bildar ganglion cell lager (GCL), som är det innersta skiktet i näthinnan. RGC axoner utvecklas till optisk nerv för att korsa mittlinjen, bilda optik chiasm. Sedan växer RGC-axoner dorsally för att göra synapser i det optiska tectumet i midbrain. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alla djurförsök granskades etiskt och godkändes av Purdue Animal Care and Use Committee (PACUC), i enlighet med NIH:s riktlinjer med protokollet 2006002050 som godkändes den 2020-07-24.

1. Utarbetande av lösningar

  1. E2 media (1x)
    1. Förbered 100x E2A (500 ml), 500x E2B (100 ml) och 500x E2C (100 mL) lösningar genom att kombinera alla komponenter som visas i tabell 1. Autoklav E2A-, E2B- och E2C-lösningar. Förvara vid 4 °C.
    2. För 1x E2-media: Kombinera 5 ml 100x E2A, 1 ml 500x E2B och 1 ml 500x E2C. För volymen till 500 ml med sterilt vatten. Justera pH-talet till 7,0-7,5.
    3. Förbered 50 ml alikvoter på 1x E2-medielager vid -20 °C för långtidslagring. Nederbörd kan dock uppstå vid upptining. Se till att nederbörden är helt upplöst innan du använder stamlösningen.
lösning komponent belopp koncentration
100X E2A (500mL)
NaCl (NaCl) 43,8 g 1500 mM
KCl (kcl) 1,88 g 50 mM
MgSO4 (olika) 6 g 100 mM
KH2PO4 (kh2PO4) 1,03 g 15 mM
Na2HPO4 (på Na2HPO4) 0,34 g 5 mM
500X E2B (100 ml)
CaCl2 (cacl2) 5,5 g 500 mM
500X E2C (100 ml)
NaHCO3 (på NaHCO3) 3 g 350 mM
1X E2 (500 ml)
100X E2A 5 ml 1X
500X E2B 1 ml 1X
500X E2C 1 ml 1X

Tabell 1: Komponenter i 1x E2-medier för zebrafiskcellskultur.

  1. E3 Media (1x)
    1. Lös upp komponenterna i 1 L sterilt vatten enligt tabell 2 för att göra 100x lager. Späd buljongen i sterilt vatten för att göra 1x E3-media.
    2. Tillsätt 0,2% metylenblått. För 20 ml 1x E3-media, tillsätt 40 μL metylenblått.
    3. Gör en annan sats utan metylenblått för fluorescerande avbildning.
komponent Belopp (g) Koncentration i 100X lager (mM)
NaCl (NaCl) 29.22 500
KCl (kcl) 1.26 17
CaCl2 2H2O 4.85 33
MgSO4 7H2O 8.13 33

Tabell 2: Komponenter i 100x E3-medier för läftande zebrafiskembryon.

  1. 80x saltlösning
    1. Kombinera alla komponenter som visas i tabell 3. Tillsätt vatten för att göra 100 ml lösning. Blanda tills alla komponenter är upplösta. Förvara lösningen vid 4 °C.
komponent Belopp (g) Koncentration i lager (mM)
glukos 1.44 80
Natrium pyruvat 0.44 40
CaCl2 2H2O 0.148 10
HEPES (HEPES) 6.1 256

Tabell 3: Komponenter i 80x saltlösning för zebrafiskcellskulturmedier.

  1. Zebrafisk cell kultur medium (ZFCM +)
    1. Kombinera alla komponenter som visas i tabell 4 för att skapa 250 ml media. Justera pH-skat till 7,5. Filtrera media med 0,22 μm filter och förvara vid 4 °C.
komponent Belopp (ml) Volym %
L-15 medium (med fenolrött) 212.75 85.1
Fetala nötkreatursserum (FBS) 5 2
Penicillin/Streptomycin 1 0.4
80X saltlösning 3.125 1.25
Vatten 28.125 11.25

Tabell 4: Komponenter i zebrafiskcellsodlingsmedium med serum och antibiotika.

  1. Zebrafisk cell kultur medium för avbildning (ZFCM-)
    1. Kombinera alla komponenter som visas i tabell 5 för att skapa 250 ml media. Justera pH-skat till 7,5. Filtermedia med 0,22 μm filter.
    2. Använd alikvoter för engångsbruk (50 ml partier) för att förhindra kontaminering. Håll dig på 4 °C.
komponent Belopp (ml) Volym %
L-15 medium (ingen fenolröd) 212.75 85.1
80X saltlösning 3.125 1.25
Vatten 34.125 13.65

Tabell 5: Komponenter i zebrafiskcellsodlingsmedium utan serum och antibiotika för in vitro-avbildning.

  1. Formsprutning
    1. Lös upp 1,5% agarose i E3-media. Häll ~ 25 ml agarose i en 100 x 15 mm Petri-skål.
    2. Lägg ner formen ovanpå agarosen med en 45° vinkel med avseende på ytan och låt den flyta på agarose med en långsam rörelse. Detta hjälper till att undvika bubblor. Låt agarosen svalna och stelna på bänkskivan.
    3. När formen är helt stelnad, ta bort formen långsamt för att förhindra att agarose bryts. Tillsätt färska E3-medier, lägg till paraffinfilm runt skålen för att förhindra spill och förvara vid 4 °C ( figur 3).

Figure 3
Bild 3: Formsprutningsbilder. Formen har sex ramper, en 90° och en 45° fasad sida för att hålla embryon på plats. B)Injektionsplattan efter att agarosen stelnat och mögel har avlägsnats. Skalstänger = 1 cm. Klicka här för att se en större version av den här figuren.

2. Beredning och injektion av roGFP2-Orp1 mRNA

OBS: roGFP2-Orp1 konstruktion erhölls från Dr. Tobias Dick, DKFZ, Tyskland. Det var subklonerat i pCS2 + vektorn i Dr. Qing Deng's Lab, Purdue University. För att förhindra nedbrytning av RNase måste flera försiktighetsåtgärder vidtas. RNase-fria reagenser och rör måste alltid användas, handskar måste bäras för alla steg, och alternativt kan material och ytor torkas med ett rengöringsmedel för RNase-borttagning.

  1. Linjärisera 3-10 μg pCS2 +/roGFP2-Orp1 vektor med NotI.
  2. Rena den linjäriserade plasmiden med ett PCR-rengöringskit.
  3. In vitro transkribera roGFP2-Orp1 mRNA med ett in vitro-transkriptionskit enligt tillverkarens instruktioner.
    1. Begränsad transkriptionsreaktionsuppsättning
      1. Placera RNA-polymeras och linjäriserat/renat DNA på is. Vortex 10x reaktionsbuffert och 2x NTP/CAP tills de är helt i lösning. Förvara NTP/CAP på is men håll bufferten vid rumstemperatur (RT) medan du monterar reaktionen. Tryck på alla reagenser innan du öppnar rören för att förhindra kontaminering.
      2. Ställ in RNA-syntesreaktion i den ordning som anges nedan vid RT i ett RNase-fritt 0,5 ml centrifugeringsrör. Reaktionens slutliga volym är 20 μL. Reaktionsinställningen visas i tabell 6.
      3. Tillsätt 10 μL ribonukleotidblandning, 2x NTP/CAP och nukleasfritt vatten om det behövs till röret. Tillsätt 2 μL 10X reaktionsbuffert. Tillsätt 1-1,5 μg linjärt DNA (upp till 6 μL). Tillsätt vid behov nukleasfritt vatten för att göra upp 20 μL reaktionsvolym.
      4. Stäng röret, virveln kort och touch-spin microfuge. Tillsätt 2 μL 10x SP6 enzymblandning. Stäng med ett fingerklick och tryck-snurra i en mikrofuge.
      5. Placera i 37 °C i 2-2,5 h (kan gå upp till 18 h).
        OBS: I det presenterade experimentet över natten utfördes 16-18 h inkubation vid 37 °C för bästa resultat.
      6. Tillsätt 1 μL DNase för att ta bort DNA-mall, fingerklicka, tryck på spinn och inkubera vid 37 °C i 15 minuter.
reagens Volym (μL) Mängd i reaktion
2X NTP/CAP 10 1X
10X reaktionsbuffert 2 1X
Mall DNA Upp till 6 1-1,5 μg
Nukleasfritt vatten Lägg till att göra 20 μL
10X SP6 enzymblandning 2 1X

Tabell 6: Reaktionsinställning för roGFP2-Orp1 mRNA in vitro-transkription.

  1. RNA-återhämtning
    1. Tillsätt 25 μL litiumklorid (LiCl) som medföljer in vitro-transkriptionssatsen. Placera vid -20 °C i en frys utan frost i minst 30 minuter.
    2. Snurra i 25 min vid maximal hastighet i en bordscentrifug vid 4 °C. Ta bort och kassera supernaten försiktigt för att inte störa pelleten. Tillsätt 25 μL kall 75% etanol och snurra i 5 min vid 4 °C.
    3. Ta bort försiktigt och kassera supernaten. Låt pelletsluften torka i minst 5 minuter på RT. Låt inte torka. Tillsätt 12 μL nukleasfri Tris-EDTA-buffert (TE) (pH 7.0) och håll provet på is.
    4. Mät RNA-koncentrationen med en spektrofotometer. 0,5- 1 μg/μL erhålls vanligtvis.
    5. Bered 100 ng/μL mRNA i fenolröd lösning (0,5% fenolrött i Dulbeccos fosfatbuffrade saltlösning -DPBS) och alikvot för engångsbruk (3-5 μL). Förvara mRNA-alikvoterna vid - 80 °C.
  1. Mikroinjektion av mRNA
    1. På injektionsdagen, använd en av mRNA alikvoterna och följ zebrafiskens embryoinjektionsprotokoll för att injicera 1 nL av mRNA i encellsstegets embryon genom derasäggula 19. En kort beskrivning ges nedan.
    2. Odla vuxen fisk och samla embryon som tidigare beskrivits20.
    3. Dra mikroinjektionsnålar med pipettdragare. Skär nålarnas spets med tång för att skapa en 10 μm spetsöppning.
    4. Justera embryon i en formsprutning som beskrevs i steg 1,6.
    5. Injicera 1 nL av mRNA i fenolrött med en glasmikroinjektionspipett.
    6. Samla embryon och förvara dem i E3-media.
    7. Förvara embryon i inkubatorn 27 °C i E3-media tills önskat utvecklingsstadium har uppnåtts. Injicerade embryon kan användas för både in vitro (avsnitt 3 och avsnitt 4) och in vivo-avbildning (avsnitt 5). Embryon som uttrycker roGFP2-Orp1 kan förvalas före experiment med ett regelbundet dissekeringsmikroskop utrustat med fluorescerande ljus och en blå/grön filteruppsättning.

3. Primär retinal ganglion cellkultur som härrör från zebrafiskembryon

OBS: Detta protokoll är anpassat från en tidigare publicerad metod 21. Utför steg 3.1 och 3.2 i en laminär flödeshuv.

  1. Förberedelse av täckglas
    1. Förbered 4-6 odlingsplattor i varje experiment. Använd syrarengjorda täcken (22 x 22 mm kvadrat; 0,16-0,19 mm tjocklek) som lagras i 100% etanol.
    2. Ta bort ett locklip från förvaringsbehållaren genom att använda tång och elda upp det för att avlägsna kvarvarande etanol.
    3. Lufttorka täcket helt genom att placera det i en vinkel inuti en 35 mm kulturform.
    4. Förbered poly-D-Lysin (PDL) arbetslösning (1x) genom att späda ut 10x lager (5 mg/ml) i sterilt vatten.
    5. Applicera 100 μL 0,5 mg/ml PDL på mitten av varje täckglas och undvik att sprida lösningen mot kanterna.
    6. Inkubera PDL på täckglas i 20-30 min vid rumstemperatur (RT). Se till att PDL inte torkar ut.
    7. Tvätta PDL med 0,5 ml sterilt vatten tre gånger. Låt plattorna torka helt.
    8. Bered laminin arbetslösning (1x) genom att späda ut 50x lager (1 mg/ml) i 1x PBS.
    9. Applicera 100 μL 20 μg/ml laminin i PBS på mitten av varje täckglas och undvik spridning av lösningen till kanterna.
    10. Inkubera plattorna vid 37 °C i en fuktad inkubator i 2-6 timmar. Undvik torkning av lamininlösningen.
  2. Embryo dissekering och plätering RGCs
    1. Förbered och märk fyra 35 mm vävnadskulturrätter och fyll med 4 ml: 70% etanol, "E2 media 1", "E2 media 2", "E2 media 3" på dissekeringsdagen. Förvara disken i kylskåpet tills dissekeringarna.
    2. När zebrafiskembryon är 34 timmar efter befruktning (hpf), ta kulturrätterna belagda med laminin ur inkubatorn och tvätta täckena tre gånger med 0,5 ml 1x PBS.
    3. Efter den slutliga tvätten, tillsätt 4 ml ZFCM(+) media till varje odlingsfat och undvik att torka plattan.
    4. Hämta de förberedda kulturrätterna från steg 3.2.1. Låt dem jämvikta till RT.
    5. Fyll 4-6 PCR-rör med 15 μL ZFCM(+) media. Ett rör behövs för att förbereda RGCs från 4 ögon för att plätera på ett täckglas.
    6. Hämta zebrafiskembryon från inkubatorn och sänk ner embryon i 35 mm vävnadskulturrätt som innehåller 70% etanol i 5-10 s för att sterilisera.
    7. Använd en överföringspipett och överför embryon till E2 Media 1-maträtt som innehåller sterilt E2-medium för att tvätta överflödig etanol.
    8. Överför embryon till E2 Media 2-maträtt och ta bort deras kor med skarpa tång.
    9. Överför embryon till den slutliga E2 Media 3-skålen för att utföra dissekeringar.
    10. Använd ett par fina tångar, dissekera retinorna som tidigare beskrivits 22.
    11. Placera och håll embryona främre mot äggulan med en av tångarna och ta bort svansen bakom till äggulans säck med de andra tångarna.
    12. Ta tag i nacken med tång och ta av huvudet för att exponera hjärna och ögon för E2-media. Undvik att skära äggulasäcken.
    13. Med spetsen av fina tångar, rulla försiktigt ögonen från huvudet, samtidigt som du håller kranialvävnaden ner med de andra tångarna. Håll ögonen isolerade från intilliggande vävnadsskräp.
    14. Överför fyra ögon till ett av de tidigare preparerade rören som innehåller ZFCM(+).
    15. Titrera försiktigt upp och ner med P20-pipetten och en gul spets ca 45 gånger för att skilja celler åt. Undvik luftbubblor.
    16. Överför ZFCM(+) med dissocierade celler till mitten av täckglaset. Upprepa steg 10-12 för ytterligare täcken.
    17. Håll kulturer på bänkskivan vid 22 °C på ett polystyrenskumställ för att absorbera vibrationer.
    18. Utför bildbehandling 6-24 timmar efter plätering.
      OBS: Använd överföringspipetten för att flytta embryon till olika odlingsrätter. Byt pipett för varje lösning för att förhindra att etanol transporteras (steg 6-8).

4. In vitro ROS imaging av odlade RGC nervceller

  1. På avbildningsdagen (vanligtvis 6-24 timmar efter cellplätering) kontrollerar du celler under mikroskop för att validera tillväxten av RGC-axoner.
  2. För live-cell imaging, överföra coverslips från kultur maträtt till en levande cell imaging kammare. I detta fall användes en skräddarsydd öppen kammare, som tidigare harbeskrivits, 23.
  3. Ställ in mikroskop för avbildning. Använd ett inverterat mikroskop utrustat med ett DIC-mål (Differential Interference Contrast), OG590 långpass rött filter och en EM-CCD-kamera.
  4. Innan avbildning, byt ut ZFCM(+) medium med ZFCM(-).
  5. När celler är placerade med 10x mål, förvärva bilder vid 60x förstoring med hjälp av ett högt NA-oljesänkningsmål. Använd ytterligare en 1,5x förstoring.
  6. Först skaffa DIC-bilder. Avbilda sedan roGFP2-Orp1 med en lämplig filteruppsättning. Excite roGFP2-Orp1 med 405/20 och 480/30 nm excitationsfilter sekventiellt och skaffa bilder med 535/30 nm emissionsfilter efter att emissionsljuset har passerat den dichroiska spegeln 505DCXR.
  7. Efter att ha tagit den första uppsättningen bilder, utbyta media med media som innehåller olika behandlingslösningar. Media bör bytas var 30:e minuts bildbehandling för att undvika förändringar i pH och osmolaritet.

5. In vivo ROS imaging av utvecklande embryon

  1. För in vivo-avbildning, förvara embryon i E3-media som innehåller 0,003% fenylthiourea (PTU) utan metylenblått från 22-24 hpf. Utbyta media och ta bort döda embryon dagligen.
  2. Vid önskad ålder kan man bedöva embryon i 0,016% trikain. Montera sövda embryon i 1% lågsmält agarosa på 35 mm glasbottenkulturrätter. Embryon kan orienteras dorsally, ventrally eller i andra lydnad, beroende på den region som är av intresse för avbildning.
  3. När agarose stelnat, fyll disken med E3-media utan metylenblått/0,016% trikain.
  4. Ställ in mikroskopet för avbildning. Använd ett inverterat laserskanningskonfokalt mikroskop. Alternativt kan du använda ett upprätt konfokalt mikroskop utrustat med en vattensänkningslins för att avbilda embryon monterade ovanpå en agarose droppe.
  5. Excitera roGFP2-Orp1 med 405 nm och 488 nm excitationsfilter sekventiellt och få motsvarande bilder med emissionsfilter i intervallet 515-535 nm.
  6. Inför z-stackar med 5 μm sektionstjocklek genom önskad del av embryona. Embryon kan hållas för avbildning i senare utvecklingsstadier.
  7. Efter avbildning, ta bort embryon från agarose med fina tångar och förvara i inkubatorn till önskad ålder i metylenblåfria medier med PTU.

6. Bildanalys och bearbetning

  1. Mätning av H2O2-nivåer baserat på 405/480-förhållandesvärden
    1. Använd en lämplig programvara för bildanalys. ImageJ-programvara användes här för bildanalys och bearbetning.
    2. Öppna DIC-, 405/535- och 480/535-bilder i ImageJ-programvaran genom att antingen dra filerna eller klicka på | Öppna. Om det inte redan är gjort konverterar du bilder till 32-bitars genom att klicka på Bild | Skriv | 32-bitars.
    3. Definiera intresseområde (ROI) med frihandsverktyg från kontrollfältet (cellkropp, tillväxtkon, näthinna osv.). Öppna ROI-chefen genom att klicka på Analysera | Verktyg | ROI-chef. Klicka på Lägg till på fliken ROI-chef om du vill lägga till den definierade AVKASTNINGEN.
    4. Rita en region nära ROI och lägg till som bakgrund ROI. Mät genomsnittliga bakgrundsvärden genom att välja ROI och klicka på Mått på fliken ROI-chef.
    5. Observera de genomsnittliga intensitetsvärdena från mätningen. Subtrahera värdet för genomsnittlig bakgrund från de fluorescerande bilderna genom att klicka på | Matte | Subtrahera. Utför det här steget för både 405/535 och 480/535 bilder.
    6. Lägg till värdet "1" till 480/535 fluorescerande bild för att eliminera "0" -värden genom att klicka på Process | Matte | Lägg till funktion före förhållandeberäkning.
    7. Klicka på Bearbeta | Bildkalkylator | Dela funktionen i ImageJ för att dividera 405/535-bilden med 480/535 bild pixel för pixel. Välj 405/535 bild som ska delas med 480/535 bild. Välj en 32-bitars utdatabild.
    8. Använd ROI-bild för förhållande genom att först klicka på förhållandesbilden och sedan ROI på fliken ROI-chef.
    9. Mät medelvärdena för förhållandet 405/535 till 480/535-bilden genom att klicka på Mått på fliken ROI-chef.
    10. Gör steg 6.1.2-6.1.9 för så många prover som möjligt för att utföra lämplig statistisk analys.
  2. Bild av visningsförhållande
    OBS: Den här proceduren är att subtrahera bakgrunden utanför provet och applicera en färgbildstabell på bilden.
    1. När ratio-bilden har skapats i ImageJ i steg 6.1.7 skapar du en 32-bitars svart bild genom att klicka på | Nya | Bild.
    2. Använd den ROI som du vill visa H2O2-nivåer för på den nya bilden genom att först klicka på den nya bilden och sedan ROI från fliken ROI-chef.
    3. Skapa en mask genom att klicka på Redigera | Urval | Skapa mask.
    4. Dividera maskbilden med 255 för att justera ROI-värdet till "1" och bakgrundsvärdena blir "0". Klicka på Bearbeta | Matte | Dela och skriv 255.
    5. Multiplicera masken med förhållandesbilden genom att klicka på | Bildkalkylator | Funktionen Multiplicera. Detta resulterar i en gråskaleförhållandebild som bara visar AVKASTNINGEN.
    6. Ändra uppringningstabellen till "Fire" genom att klicka på | Slå upp tabeller | Eld.
      OBS: En multiplikationsfaktor kan tillämpas på alla bilder för bättre visualisering av förhållandet genom att klicka på Process | Bild | Multiplicera.
    7. Konvertera förhållandesbilden till 8-bitars genom att klicka på Bild | Skriv | 8-bitars.
    8. Lägg till kalibreringsfält genom att klicka på Analysera | Verktyg | Kalibreringsfält.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Odlade zebrafisk RGCs utökar axoner inom 1d. En representativ 405/480-ratio-bild av H2O2-biosensornvisas i figur 4A. Cellkroppen, axon och tillväxt koner är tydligt synliga i enskilda nervceller. Dessa nervceller kan utsättas för olika behandlingar över tid för att övervaka H2O2 förändringar. Vi har tidigare funnit att om man lägger till 100 μM H2O2 till odlingsmedier ökar förhållandesvärdena, vilket visar att realtidsförändringar kan upptäckas med detta system (figur 4)24.

Figure 4
Figur 4: H2O2 avbildning i odlade zebrafisk RGCs med roGFP2-Orp1. (A) Representativa 405/480 nm ratio bilder av odlade RGC nervceller från 34 hpf gamla zebrafisk embryon. Neuron till vänster behandlades med serum-fri kontroll medium och neuron till höger behandlades med 100 μM H2O2 för 30 min. Skala stång = 10 μm. (B) Stapeldiagram som visar de genomsnittliga H2O2-nivåerna i tillväxtkonerna av vild typ zebrafisk RGC före och efter behandling med antingen kontroll eller 100 μM H2O2. Data normaliserades för att kontrollera behandlingen. Data visas medelvärde ± SEM. Antal tillväxtkoner visas inom parentes för varje grupp. Tvåstjärtade Wilcoxon matchade par signerade rankningstest; **p = 0,0009. Siffran har ändrats från vår tidigare publikation24. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

H2O2-halter kan också bestämmas i hela zebrafiskembryon (figur 5). Eftersom mRNA injiceras under encellsstadiet uttrycker alla vävnader roGFP2-Orp1-biosensorn. I figur 5Avisar vi huvudregionen av zebrafisklarver vid två olika tidpunkter, med fokus på H2O2-nivåerna i näthinnan, som ett exempel. Vi har tidigare visat att tillägg av H2O2 ökar förhållandesvärdena i realtid, medan tillägg av reducerande medel DTT vänder denna effekt in vivo24. Här mätte vi basala nivåer av H2O2 i samma zebrafiskembryon vid 2 dpf och 5 dpf. Vid 2 dpf var förhållandesvärdena signifikant lägre än vid 5 dpf (p<0.0001; Figur 5B). Dessutom uppvisade varje djur en annan ökningsnivå i sin näthinnehalt H2O2 (figur 5C).

Figure 5
Figur 5: In vivo H 2 O2avbildning i zebrafisklarver med roGFP2-Orp1. A)DIC och 405/480 nm ratio bilder av 2 och 5 dpf zebrafisk larver. ROI definieras som näthinna (gula linjer) för att mäta förhållandesvärden. Samma larver analyserades vid 2 och 5 dpf. Skalstänger = 50 μm. (B) Mätning av genomsnittliga H2O2 nivåer i näthinnorna 2 och 5 dpf zebrafisk. Vid 5 dpf ökas H2O2-nivåerna signifikant i näthinnan jämfört med 2 dpf. C)Linjediagram över mätningar av enskilda fiskar. Varje djur uppvisar en ökning av H2O2-nivåernai näthinnan från 2 till 5 dpf. Data visas som medelvärde ± SEM. Antalet analyserade larver visas inom parentes för varje grupp. Tvåstjärtade Wilcoxon matchade par signerade rankningstestet, ****p<0.0001. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Det finns flera kritiska steg som behöver uppmärksammas i hela protokollet. Vi tror att om man överväger dessa punkter kommer det experimentella flödet att förbättras. För primär RGC-kultur är steriliteten hos ZFCM(-) mycket viktig, eftersom detta kulturmedier inte innehåller antibiotika och förorening kan uppstå före eller under avbildning. För att undvika det rekommenderar vi att du förbereder och använder ZFCM(-) endast inuti ett biosäkerhetsskåp och gör färska ZFCM(-) media regelbundet (steg 1.5). Dessutom bör lamininlagren hållas vid -80 °C. Tinad laminin ska alltid förvaras vid 4 °C. Förvara inte lamininlösningar i rumstemperatur eller frys upp igen, eftersom det minskar neuritens utväxt som främjar proteinets aktivitet.

Dissekering av zebrafisk näthinna vid rätt tidpunkt är viktigt för att ge tillräckligt med RGCs som förlänger axoner. Zebrafish RGCs är födda på 28 hkf och förlänger axoner ur näthinnan med start 32-36 hpf. Därför är det viktigt att plätera RGCs efter 28 hkf, helst mellan 32-36 hkf, för att möjliggöra fullständig differentiering av RGCs. Kulturer som utarbetats vid tidigare tidpunkter kanske inte ger tillräckligt med RGCs eller kommer att ge RGCs som inte kan förlänga axoner inom 24 timmar efter plätering. Vi rekommenderar starkt att du ändrar ZFCM(-) media vid avbildning i mer än 30 minuter. Eftersom detta media saknar fenolrött är pH-förändringar inte synliga och kan behöva övervägas. Byt media mycket noggrant för att undvika att rubba nervceller under processen (steg 4.7).

Slutligen är det nödvändigt med 24 hkf att byta media till E3 med PTU men utan metylenblått. PTU förhindrar pigmentering för förbättrad larvtransparens som krävs för in vivo fluorescens imaging; Tidigare behandling med PTU kan dock orsaka utvecklingsdefekter26. Metylenblått tas bort från E3-media för att minska autofluorescensen, främst med ursprung i äggulan (steg 5.1).

Denna metod möjliggör cytoplasmisk detektion av H2O2. Subcellulär compartmentalization av H2O2 bidrar dock till lokal signalering, och cytoplasmic H2O2-nivåer får inte ge tillräcklig information om specifika signalering roller H2O2. Eftersom roGFP2-Orp1 är en genetiskt kodad biosensor kan den riktas mot vävnadsspecifika uttryck (t.ex. nervceller, astrocyter, gliaceller etc.) eller specifika subcellulära platser (t.ex. plasmamembran, mitokondrier, kärnan osv.). Eftersom roGFP2-Orp1 är en GFP-baserad biosensor är kombinationen med andra fluorescerande sonder begränsad till utsläppsvåglängder utanför det gröna spektrumet. Eftersom GFP används i stor utsträckning som transgenesmarkör kan användningen av GFP-baserade biosensorer begränsas. För att möta denna utmaning har röda fluorescerande proteiner för H2O2-detektionutvecklats nyligen27. Dessutom uttrycks roGFP2-Orp1 tillfälligt i den metod som presenteras här. Därför kommer mRNA och proteinuttrycket att förfalla med tiden. Vi kunde fortfarande upptäcka signalen i 5 dpf larver; Transgena fisklinjer måste dock upprättas för ett stabilt uttryck av biosensorn under hela utvecklingen och in i vuxenlivet.

Flera färgämnesbaserade analyser finns tillgängliga för detektering av intracellulär ROS (t.ex. H2DCF-DA), eller specifikt H2O2 (PF6-AM)28,29. Att använda en genetiskt kodad biosensor, såsom roGFP2-Orp1, har flera fördelar jämfört med färgbaserade metoder. För det första gör det det möjligt att upptäcka både övergående förändringar i oxidativ status på grund av reversibilitet såväl som på specifika subcellulära platser. Därför övervakas de dynamiska förändringarna väl med hög grad av rumslig upplösning30. För det andra uppvisar det i allmänhet mindre toxicitet för celler eller vävnader jämfört med färgmolekyler. Slutligen kan biosensorn manipuleras ytterligare genetiskt för att möta behoven hos specifika experiment31. roGFP2-Orp1 är en ratiometrisk biosensor, eftersom den har två excitation och en utsläppstopp. Vid interaktion med H2O2ökar 405 nm excitation och 480 nm excitation minskar. Därför är avläsningen förhållandet mellan de intensitetsvärden som förvärvats av 405 respektive 480 nm excitation. Eftersom den här avsökningen är ratiometric blir det onödigt att använda en andra sond för att korrigera för potentiella volym effekter. Dessutom, eftersom denna sond innebär endast uttryck för en polypeptid, lider den inte av potentiella problem med differentiell uttryck av mer än ett protein, såsom vid intermolecular Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET).

RoGFP2-Orp1 är en mångsidig H2O2-sond för att studera ROS-produktion och signalering. I levande celler uppvisar denna sond dynamiskt intervall på 4,8 (cirka 4 i transgena zebrafiskembryon)15,32. Redox-tillståndet för roGFP2-Orp1 är dock föremål för förändringar av endogena tiooredoxin- och glutaredoxinsystem. därför utvecklades känsligare sonder genom att ersätta Orp1 med en annan jästperoxiredoxin, Tsa233,34. Medan roGFP2-Orp1 är användbart för att upptäcka förändringar i H2O2 i zebrafiskembryon, är känsligheten mestadels begränsad till högre koncentrationer av exogent applicerade H2O2 24,31, eller till potenta stimuli. Till exempel ökade slit2-behandlingen roGFP2-Orp1-signalen i vilda RGCs, men inte i nox2 mutant RGCs35. Å andra sidan fanns det ingen skillnad i basala H2O2 nivåer mellan wildtype och nox2 mutant RGCs och 2 dpf embryon24,35. Därför, för att upptäcka basala nivåer eller små förändringar i H2O2, kommer högre känslighetssonder att behövas.

HyPer är en annan allmänt använd genetiskt kodad och ratiometrisk H2O2-specifikbiosensor36. Känsligheten hos båda sonderna är liknande; roGFP2-Orp1 uppvisade dock långsammare svarstider för H2O2-ändringar 15. Därför kan exakt identifiering av realtidsändringar kräva HyPer istället för roGFP2-Orp1. Medan de första HyPer-versionerna påverkas av pH-ändringar, är roGFP2-Orp1inte 16,36. Därför är det viktigt att inkludera en pH-kontrollsond (SypHer3s) när du använder HyPer37. Den senaste HyPer-sonden, HyPer7, övervann många av nackdelarna med befintliga H2O2-sonder: HyPer7 har en högre pH-stabilitet, ökad ljusstyrka, snabbare kinetik och högre dynamiskt intervall38. Dessutom valideras HyPer7 både in vitro och in vivo, som visar subcellulär compartmentalization och övervakning i realtid H2O2 förändringar i zebrafiskembryon under sårläkning38.

Den metodik som presenteras här kan utökas för att studera ros-signalens roll både in vitro och in vivo. roGFP2-Orp1 uttrycker nervceller kan utsättas för olika behandlingar för att studera deras effekt på H2O2 signalering. Vi visade till exempel att RGCs svarar på förändringar i H2O2 nivåer i realtid (Figur 4), vilket tyder på att biosensorn kan upptäcka omedelbara förändringar i H2O2. Att fastställa absolut intracellulära H2O2-koncentrationer skulle dock kräva omfattande kalibrering av systemet. Detektionsgränsen för biosensorn är också oklar. Dessutom är den detaljerade rumsliga fördelningen av biosensorn i cellen inte helt känd, vilket kan störa tolkningen av resultaten. Att fastställa den exakta lokaliseringssignalen från roGFP2-Orp1 skulle dessutom kunna avslöja om det finns platsspecifik H2O2-produktion som bidrar till lokaliserad intracellulär signalering.

Att skapa transgen fisk som uttrycker roGFP2-Orp1 har många fördelar. Biosensorn kan uttryckas allestädes närvarande, eller under en vävnadsspecifik promotor för att studera cellspecifik H2O2-signalering med hjälp av Tol2-transgenes i zebrafisk39. Rollen som H2O2 i utveckling kan studeras genom allestädes närvarande uttryck av biosensorn. Transgena zebrafiskembryon kan till exempel övervakas för att bedöma förändringar i H2O2-nivåer och hur dessa förändringar bidrar till olika utvecklingsstadier. Å andra sidan fokuserar vävnadsspecifika uttryck för roGFP2-Orp1 på effekterna av H2O2-produktion i celler eller vävnader av intresse. Vävnads- eller cellspecifika promotors kan användas för att driva uttryck av roGFP2-Orp1 i specifika celler. Dessutom kan Gal4/UAS-systemet användas för gles märkning av enskilda nervceller. Därför gör detta tillvägagångssätt detektering H2O2 nivåer vid en cellulär upplösning in vivo. Slutligen kan stabila transgena linjer användas för läkemedelsscreening med hög genomströmning som innebär ROS-signalering och oxidativ stress i zebrafiskembryon.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författare förklarar att de inte har någon intressekonflikt.

Acknowledgments

Detta arbete stöddes av National Institutes of Health (Grant R01NS117701), National Science Foundation (Grant 1146944-IOS), Indiana Traumatic Spinal Cord and Brain Injury Research Fund (Grant 20000289), Purdue Research Foundation (Grant 209911) och Office of the Executive Vice President for Research and Partnerships vid Purdue University (Grant 210362). Vi tackar Dr. Cory J. Weaver och Haley Roeder för att de upprättade zebrafiskens RGC-kulturprotokoll. Vi tackar Haley Roeder dessutom för att han tillhandahåller uppgifterna i figur 4. Vi tackar Leah Biasi och Kenny Nguyen för hjälpen med RGC-kulturen. Vi tackar Gentry Lee för att han redigerade texten. Vi tackar Dr. Tobias Dick för att ge roGFP2-Orp1 och Dr. Qing Deng för pCS2 + vektor som innehåller roGFP2-Orp1. Bild 2 skapas med Biorender.com.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
35-mm culture dish Sarstedt 83-3900
35-mm glass bottom dish MatTek P35G-1.5-10-C
Agarose Fisher Scientific BP160-500
Borosilicate Glass Capillary Tubes Sutter/Fisher Scientific NC9029378
Calcium Chloride Dihydrate Fisher Scientific C79-500
Cover glass Corning 2850-22
Disposable Petri Dishes (100 x 15 mm) VWR 25384-094
Fetal Bovine Serum ThermoFisher Scientific 26140087
Glucose Sigma Aldich G7528
HEPES Sigma Aldich H4034
Injection Mold Adaptive Science Tools TU-1
Inverted Microscope Nikon TE2000
Laminin ThermoFisher Scientific 23017-015
Laser Scanning Confocal Microscopy Zeiss 710
Leibovitz's L-15 Medium with phenol red Gibco/Fisher Scientific 11-415-064
Leibovitz's L-15 Medium without phenol red Gibco/Fisher Scientific 21-083-027
Low melting agarose Promega V2111
mMessage mMachine SP6 Transcription Kit Invitrogen AM1340
NotI New England Biolabs R0189S
PBS Hyclone/Fisher Scientific SH3025601
Penicillin/streptomycin ThermoFisher Scientific 15140122
Phenol Red Sigma Aldich P0290
Phenylthiourea (PTU) Sigma Aldich P7629
Pneumatic PicoPump World Precision Instruments PV820
Poly-D-Lysine (PDL) Sigma Aldich P7280
QiaQUICK PCR Purification Kit QIAGEN 28104
Recombinant mouse slit2 R&D Systems 5444-SL-050
Sodium Pyruvate Sigma Aldich P5280
Steritop 0.22 µm filter Millipore S2GPT05RE
TE Buffer Ambion AM9860
Tricaine Methanesulfonate Sigma Aldich E10521
Vertical Pipette Puller David Kopf Instruments 700C

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bórquez, D. A., et al. Dissecting the role of redox signaling in neuronal development. Journal of Neurochemistry. 137 (4), 506-517 (2016).
  2. Bedard, K., Krause, K. -H. The NOX family of ROS-generating NADPH oxidases: Physiology and pathophysiology. Physiological Reviews. 87 (1), 245-313 (2007).
  3. Weaver, C. J., Leung, Y. F., Suter, D. M. Expression dynamics of NADPH oxidases during early zebrafish development. Journal of Comparative Neurology. 524 (10), 2130-2141 (2016).
  4. Terzi, A., Suter, D. M. The role of NADPH oxidases in neuronal development. Free Radical Biology and Medicine. 154, 33-47 (2020).
  5. Infanger, D. W., Sharma, R. V., Davisson, R. L. NADPH oxidases of the brain: Distribution, regulation, and function. Antioxidants & Redox Signaling. 8 (9-10), 1583-1596 (2006).
  6. Coyoy, A., Olguin-Albuerne, M., Martinez-Briseno, P., Moran, J. Role of reactive oxygen species and NADPH-oxidase in the development of rat cerebellum. Neurochemistry International. 62 (7), 998-1011 (2013).
  7. Le Belle, J. E., et al. Proliferative neural stem cells have high endogenous ROS levels that regulate self-renewal and neurogenesis in a PI3K/Akt-dependant manner. Cell Stem Cell. 8 (1), 59-71 (2011).
  8. Nayernia, Z., et al. Decreased neural precursor cell pool in NADPH oxidase 2-deficiency: from mouse brain to neural differentiation of patient derived iPSC. Redox Biology. 13, 82-93 (2017).
  9. Wilson, C., Nunez, M. T., González-Billault, C. Contribution of NADPH oxidase to the establishment of hippocampal neuronal polarity in culture. Journal of Cell Science. 128 (16), 2989-2995 (2015).
  10. Munnamalai, V., et al. Bidirectional interactions between Nox2-type NADPH oxidase and the F-actin cytoskeleton in neuronal growth cones. Journal of Neurochemistry. 130 (4), 526-540 (2014).
  11. Kishida, K. T., et al. Synaptic plasticity deficits and mild memory impairments in mouse models of chronic granulomatous disease. Molecular and Cellular Biology. 26 (15), 5908-5920 (2006).
  12. Ravelli, K. G., et al. Nox2-dependent neuroinflammation in an EAE model of multiple sclerosis. Translational Neuroscience. 10 (1), 1-9 (2019).
  13. Park, L., et al. Nox2-derived radicals contribute to neurovascular and behavioral dysfunction in mice overexpressing the amyloid precursor protein. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (4), 1347-1352 (2008).
  14. Schiavone, S., Neri, M., Trabace, L., Turillazzi, E. The NADPH oxidase NOX2 mediates loss of parvalbumin interneurons in traumatic brain injury: Human autoptic immunohistochemical evidence. Scientific Reports. 7 (1), 8752 (2017).
  15. Gutscher, M., et al. Proximity-based protein thiol oxidation by H2O2-scavenging peroxidases. Journal of Biological Chemistry. 284 (46), 31532-31540 (2009).
  16. Bilan, D. S., Belousov, V. V. New tools for redox biology: from imaging to manipulation. Free Radical Biology and Medicine. 109, 167-188 (2016).
  17. Abu-Siniyeh, A., Al-Zyoud, W. Highlights on selected microscopy techniques to study zebrafish developmental biology. Laboratory Animal Research. 36 (1), 12 (2020).
  18. Sassen, W. A., Koster, R. W. A molecular toolbox for genetic manipulation of zebrafish. Advances in Genomics and Genetics. 5, 151-163 (2015).
  19. Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. Journal of Visualized Experiments. (25), e1115 (2009).
  20. Avdesh, A., et al. Regular care and maintenance of a Zebrafish (Danio rerio) laboratory: An introduction. Journal of Visualized Experiments. (69), e4196 (2012).
  21. Chen, Z., et al. Primary neuron culture for nerve growth and axon guidance studies in Zebrafish (Danio rerio). PLoS One. 8 (3), 57539 (2013).
  22. Zhang, L., Leung, Y. F. Microdissection of zebrafish embryonic eye tissues. Journal of Visualized Experiments. (40), e2028 (2010).
  23. Suter, D. M. Live cell imaging of neuronal growth cone motility and duidance in vitro. Cell Migration: Methods in Molecular Biology. , 65-86 (2011).
  24. Weaver, C. J., et al. nox2/cybb deficiency affects zebrafish retinotectal connectivity. Journal of Neuroscience. 38 (26), 5854-5871 (2018).
  25. Morgan, B., Sobotta, M. C., Dick, T. P. Measuring EGSH and H2O2 with roGFP2-based redox probes. Free Radical Biology and Medicine. 51, 1943-1951 (2011).
  26. Li, Z., et al. Phenylthiourea specifically reduces zebrafish eye size. PLoS One. 7 (6), 40132 (2012).
  27. Ermakova, Y. G., et al. Red fluorescent genetically encoded indicator for intracellular hydrogen peroxide. Nature Communications. 5, 5222 (2014).
  28. Oparka, M., et al. Quantifying ROS levels using CM-H2DCFDA and HyPer. Methods. 109, 3-11 (2016).
  29. Dickinson, B. C., Peltier, J., Stone, D., Schaffer, D. V., Chang, C. J. Nox2 redox signaling maintains essential cell populations in the brain. Nature Chemical Biology. 7 (2), 106-112 (2011).
  30. Cannon, M. B., Remington, S. J. Redox-sensitive green fluorescent protein: Probes for dynamic intracellular redox responses. A review. Methods in Molecular Biology. 476, 51-65 (2009).
  31. Meyer, A. J., Dick, T. P. Fluorescent protein-based redox probes. Antioxidants & Redox Signaling. 13 (5), 621-650 (2010).
  32. Panieri, E., Millia, C., Santoro, M. M. Real-time quantification of subcellular H2O2 and glutathione redox potential in living cardiovascular tissues. Free Radical Biology and Medicine. 109, 189-200 (2017).
  33. Breus, O., Dickmeis, T. Genetically encoded thiol redox-sensors in the zebrafish model: Lessons for embryonic development and regeneration. Biological Chemistry. , (2020).
  34. Morgan, B., et al. Real-time monitoring of basal H2O2 levels with peroxiredoxin-based probes. Nature Chemical Biology. 12 (6), 437-443 (2016).
  35. Terzi, A., Roeder, H., Weaver, C. J., Suter, D. M. Neuronal NADPH oxidase 2 regulates growth cone guidance downstream of slit2/robo2. Developmental Neurobiology. , (2020).
  36. Bilan, D. S., Belousov, V. V. HyPer family probes: State of the art. Antioxidants & Redox Signaling. 24 (13), 731-751 (2016).
  37. Ermankova, Y. G., et al. SypHer3s: a genetically encoded fluorescent ratiometric probe with enhanced brightness and an improved dynamic range. Chemistry Communications. 54 (23), 2898-2901 (2018).
  38. Pak, V. V., et al. Ultrasensitive genetically encoded indicator for hydrogen peroxide identifies roles for the oxidant in cell migration and mitochondrial function. Cell Metabolism. 31 (3), 642-653 (2020).
  39. Kwan, K. M., et al. The Tol2kit: A multisite gateway-based construction Kit for Tol2 transposon transgenesis constructs. Developmental Dynamics. 236 (11), 3088-3099 (2007).

Tags

Neurovetenskap Nummer 168 ROS väteperoxid roGFP2-Orp1 biosensor RGC zebrafisk neuronal utveckling
ROS Live Cell Imaging under neuronal utveckling
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Terzi, A., Alam, S. M. S., Suter, D. … More

Terzi, A., Alam, S. M. S., Suter, D. M. ROS Live Cell Imaging During Neuronal Development. J. Vis. Exp. (168), e62165, doi:10.3791/62165 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter