Adaptações específicas de miose de ensaios de motilidade baseados em microscopia de fluorescência in vitro

Summary

Apresentado aqui é um procedimento para expressar e purificar a minodã 5a seguida de uma discussão de sua caracterização, usando ensaios baseados em microscopia de fluorescência in vitro, e como esses métodos podem ser modificados para a caracterização da minosina não-musculo 2b.

Abstract

As proteínas da miosina se ligam e interagem com a actina filamentosa (F-actin) e são encontradas em organismos através da árvore filogenética. Sua estrutura e propriedades enzimáticas são adaptadas para a função particular que executam em células. Myosin 5a anda processivamente em F-actin para transportar melanomas e vesículas em células. Por outro lado, a miose não-sem-músculo 2b opera como um filamento bipolar contendo aproximadamente 30 moléculas. Move F-actin de polaridade oposta em direção ao centro do filamento, onde as moléculas de minosina trabalham assincronamente para ligar actina, transmitir um golpe de força e dissociar antes de repetir o ciclo. A minosina não-muscle 2b, juntamente com suas outras isoformas de miose não-cancerosa 2, tem papéis que incluem aderência celular, citocinese e manutenção de tensão. A mecanoquímica das miosinas pode ser estudada realizando ensaios de motilidade in vitro usando proteínas purificadas. No ensaio de filamento de actina deslizante, as miosinas são vinculadas a uma superfície de deslizamento de microscópio e translocam fluorescentemente rotulada F-actin, que pode ser rastreada. No ensaio de motilidade de molécula/conjunto único, no entanto, f-actin é vinculado a um deslizamento de cobertura e o movimento de moléculas de minocina fluorescentemente rotuladas na F-actina é observado. Neste relatório, descreve-se a purificação da miose recombinante 5a de células Sf9 utilizando cromatografia de afinidade. Depois disso, descrevemos dois ensaios baseados em microscopia de fluorescência: o ensaio de filamento de actina deslizante e o ensaio de motilidade invertido. A partir desses ensaios, parâmetros como velocidades de translocação de actina e comprimentos de execução de molécula única e velocidades podem ser extraídos usando o software de análise de imagem. Essas técnicas também podem ser aplicadas para estudar o movimento de filamentos únicos das isoformas de miosina não-musada 2, aqui discutidas no contexto da miose não-musada 2b. Este fluxo de trabalho representa um protocolo e um conjunto de ferramentas quantitativas que podem ser usadas para estudar a dinâmica única de moléculas e conjuntos de miosinas não-omuscle.

Introduction

Miosinas são proteínas motoras que exercem força em filamentos de actina usando a energia derivada da hidrolise da adenosina triphosfato (ATP)¹. Myosins contêm um domínio de cabeça, pescoço e cauda. O domínio principal contém a região de ligação de actina, bem como o local de vinculação ATP e hidrólise. Os domínios do pescoço são compostos por motivos de QI, que se ligam a correntes de luz, calmodulin, ou proteínas semelhantes à calmodulina^2,3. A região da cauda possui várias funções específicas para cada classe de miosinas, incluindo, mas não se limitando à dimerização de duas cadeias pesadas, ligação de moléculas de carga e regulação da minosina através de interações autoinibitórias com os domínios da cabeça¹.

As propriedades motile da minosina variam muito entre as classes. Algumas dessas propriedades incluem a razão de serviço (a fração do ciclo mecânico da miosina em que a minoina é obrigada a atuar) e a processividade (a capacidade de um motor de fazer vários passos em sua pista antes do desprendimento)⁴. As mais de 40 classes de miosinas foram determinadas com base nas análises sequenciais^5,6,7,8. As minons classe 2 são classificadas como "convencionais" já que foram as primeiras a serem estudadas; todas as outras classes de miosinas são, portanto, classificadas como "não convencionais".

Myosin 5a (M5a) é uma minosina classe 5 e é um motor processivo, o que significa que pode dar vários passos ao longo de actin antes de dissociar. Possui uma alta relação de dever, indicando que passa grande parte de seu ciclo mecânico vinculado a atuar em^{9,10,11,12,13,14}. Em comum com outras miosinas, a cadeia pesada contém um domínio motor n-terminal que inclui tanto um actin-binding quanto um sítio de hidrólise ATP seguido por uma região do pescoço que serve como um braço de alavanca, com seis motivos de QI que se ligam a cadeias de luz essenciais (ELC) e calmodulin (CaM)¹⁵. A região da cauda contém bobinas enroladas α helicoidais, que escurecem a molécula, seguidas de uma região de cauda globular para carga de ligação. Sua cinética reflete seu envolvimento no transporte de melanócitos em melanócitos e do ântico endoplasmático nos neurônios Purkinje^16,17. M5a é considerado o motor prototípico de transporte de carga¹⁸.

As miosinas classe 2, ou as miosinas convencionais, incluem as miosinas que alimentam a contração do músculo esquelético, cardíaco e liso, além das isoformas de minosina não muscular 2 (NM2), NM2a, 2b e 2c¹⁹. Os isoformes NM2 são encontrados no citoplasma de todas as células e têm papéis compartilhados em citocina, adesão, morfogênese tecidual e migração celular^19,20,21,22. Este artigo discute protocolos convencionais de minosina no contexto da minosina não-muscle 2b (NM2b)²³. NM2b, em comparação com M5a, tem uma baixa taxa de imposto e é enzimaticamente mais lento com um V_máximo de 0,2 s^-123 em comparação com o V_máximo de M5a de ≈18 s^-124. Notavelmente, construções TN2b truncadas com duas cabeças não se movem prontamente processivamente em actin; em vez disso, cada encontro com actina resulta em um golpe de força seguido de dissociação da molécula²⁵.

O NM2b contém duas correntes pesadas de miosina, cada uma com um domínio de cabeça globular, um braço de alavanca (com um ELC e uma cadeia leve regulatória (RLC)), e um domínio de barra de bobina/cauda de bobina α helicoidal, aproximadamente 1.100 aminoácidos de comprimento, que escurece essas duas cadeias pesadas. A atividade enzimática e o estado estrutural do NM2b são regulados pela fosforilação da RLC²³. NM2b não fosforylated, na presença de FORÇAS Iônicas ATP e fisiológicas (aproximadamente 150 mM de sal), adota uma conformação compacta em que as duas cabeças participam de uma interação assimétrica e a cauda dobra sobre as cabeças em dois lugares²³. Neste estado, a minosina não interage fortemente com a actina e tem atividade enzimática muito baixa. Após a fosforilação RLC por quinase da cadeia de luz da miosina dependente da calmodulina (MLCK) ou quinase proteica associada a Rho, a molécula se estende e se associa a outras micosinas através da região da cauda para formar filamentos bipolares de aproximadamente 30 moléculas de minosina²³. A fosforilação acima mencionada do RLC também leva ao aumento da atividade ATPase ativada por actina de NM2b em aproximadamente quatro^{vezes 26,27,28}. Este arranjo de filamento bipolar, com muitos motores de miose em cada extremidade, é otimizado para papéis na manutenção de contração e tensão, onde os filamentos actin com polaridades opostas podem ser movidos em relação uns aos outros^23,29. Assim, o NM2b tem se mostrado um conjunto de motores ao interagir com actin. O grande número de motores dentro deste filamento permite que os filamentos NM2b se movam processivamente em filamentos de actina, tornando possível a processividade de filamento in vitro para caracterizar²⁹.

Embora tenha sido feito progresso na compreensão do papel das miosinas na célula, há a necessidade de entender suas características individuais no nível da proteína. Para entender as interações de actomiosina a um simples nível de interação proteína-proteína, em vez de dentro de uma célula, podemos expressar e purificar miosinas recombinantes para uso em estudos in vitro. Os resultados de tais estudos então informam os mecanobiologistas sobre as propriedades biofísicas de miosinas específicas que acabam por conduzir processos celulares complexos^{12,13,14,25,29}. Normalmente, isso é realizado adicionando uma etiqueta de afinidade a uma construção de minosina truncada ou de comprimento completo e purificando através da cromatografia de afinidade^29,30,31. Além disso, a construção pode ser projetada para incluir um fluorohore geneticamente encoável ou uma etiqueta para rotulagem de proteínas com um fluoróforo sintético. Adicionando tal rótulo fluorescente, estudos de imagem de molécula única podem ser realizados para observar a mecânica da miosina e cinética.

Após a purificação, a minosina pode ser caracterizada de várias maneiras. A atividade atpase pode ser medida por métodos colorimétricos, fornecendo insights sobre o consumo global de energia e a afinidade ativa do motor em diferentes condições³². Para aprender sobre a mecanoquímica de sua motilidade, mais experimentos são necessários. Este artigo detalha dois métodos à base de microscopia de fluorescência in vitro que podem ser usados para caracterizar as propriedades motil de uma proteína de minosina purificada.

O primeiro desses métodos é o ensaio de filamento de actina deslizante, que pode ser usado para estudar quantitativamente as propriedades do conjunto de motores de miosina, bem como estudar qualitativamente a qualidade de um lote de proteína purificada³³. Embora este artigo discuta o uso de microscopia de fluorescência interna total (TIRF) para este ensaio, esses experimentos podem ser efetivamente realizados usando um microscópio de fluorescência de campo amplo equipado com uma câmera digital, comumente encontrado em muitos laboratórios³⁴. Neste ensaio, uma camada saturada de motores de miosina é anexada a um deslizamento de tampa. Isso pode ser realizado usando nitrocelulose, anticorpos, membranas, superfícies derivadas_{sio 2}(como trimetilcloosilano), entre outros^{29,33,35,36,37,38}. Filamentos de actina fluorescentemente rotulados são passados através da câmara de deslizamento de cobertura, sobre a qual a actina se liga à mosina anexada à superfície. Após a adição de ATP (e quinases no estudo de NM2), a câmara é imageada para observar a translocação de filamentos de actina pelas miosinas ligadas à superfície. O software de rastreamento pode ser usado para correlacionar a velocidade e o comprimento de cada filamento de actin de deslizamento. O software de análise também pode fornecer uma medida do número de filamentos de actin móveis e estacionários, o que pode ser útil para determinar a qualidade de uma determinada preparação de mosina. A proporção de filamentos parados também pode ser intencionalmente modulada por amarração superficial de actina a outras proteínas e medida para determinar a dependência de carga da minoina³⁹. Como cada filamento de actina pode ser impulsionado por um grande número de motores disponíveis, este ensaio é muito reprodutível, com a velocidade medida final sendo robusta para perturbações como alterações na concentração inicial de mosina ou a presença de fatores adicionais na solução. Isso significa que pode ser facilmente modificado para estudar a atividade da mosina em diferentes condições, como fosforilação alterada, temperatura, força iônica, viscosidade da solução e os efeitos da carga induzida por amarras superficiais. Embora fatores como "cabeças mortas" de miose de ligação forte incapazes de hidrolise ATP possam causar filamentos de actin paralisados, existem múltiplos métodos para mitigar tais problemas e permitir medições precisas. As propriedades cinéticas da miosina variam muito entre as classes e, dependendo da miosina específica utilizada, a velocidade do planto de filamento actin neste ensaio pode variar de menos de 20 nm/s (miosina 9)^40,41, e até 60.000 nm/s(myosin characeano 11)⁴².

O segundo ensaio inverte a geometria do ensaio de filamento de planagem^{actin 12}. Aqui, os filamentos de actina são anexados à superfície do deslizamento de cobertura e o movimento de moléculas únicas de M5a ou de filamentos bipolares individuais de NM2b são visualizados. Este ensaio pode ser usado para quantificar os comprimentos de execução e velocidades de moléculas de miosina únicas ou filamentos em actina. Uma mancha de cobertura é revestida com um composto químico que bloqueia a ligação não específica e funcionaliza simultaneamente a superfície, como biotina-polietileno glicol (biotina-PEG). A adição de derivados de avidin modificados, em seguida, primes a superfície e actina biotinilada é passada através da câmara, resultando em uma camada de F-actin firmemente amarrado ao fundo da câmara. Finalmente, a minosina ativada e fluorescente (tipicamente 1-100 nM) é fluída através da câmara, que é então imagem para observar o movimento da mosina sobre os filamentos estacionários de actina.

Essas modalidades representam métodos rápidos e reprodutíveis que podem ser empregados para examinar a dinâmica tanto das miosinas não musculares quanto das miosinas musculares. Este relatório descreve os procedimentos para purificar e caracterizar tanto m5a quanto NM2b, representando miosinas não convencionais e convencionais, respectivamente. Isso é seguido por uma discussão de algumas das adaptações específicas da minosina, que podem ser realizadas para alcançar uma captura bem sucedida de movimento nos dois tipos do ensaio.

Expressão e biologia molecular
O cDNA para a minosina de interesse deve ser clonado em um vetor pFastBac1 modificado que codifica para uma tag BANDEIRA de terminal C (DYKDDDDK) se expressando M5a-HMM, ou uma tag BANDEIRA N-terminal se expressar a molécula de comprimento completo de NM2b^{23,43,44,45,46}. As tags FLAG do terminal C no NM2b resultam em uma afinidade enfraquecida da proteína para a coluna de afinidade bandeira. Em contraste, a proteína marcada por BANDEIRA N geralmente se liga bem à coluna de afinidade BANDEIRA²³. A proteína marcada n-terminalmente retém atividade enzimática, atividade mecânica e regulação dependente de fosforilação²³.

Neste artigo, foi utilizado um rato truncado M5a heavy meromyosin (HMM) com um GFP entre a tag FLAG e o C-terminus da cadeia pesada de miosina. Observe que, ao contrário do NM2b, o M5a-HMM pode ser marcado e purificado com sucesso com as tags FLAG N ou C-terminal e, em ambos os casos, a construção resultante estará ativa. A cadeia pesada M5a foi truncada no aminoácido 1090 e contém um linker de três aminoácidos (GCG) entre o GFP e a região da bobina enrolada do M5a⁴⁷. Nenhum linker adicional foi adicionado entre o GFP e o FLAG-tag. M5a-HMM foi co-expressado com calmodulin. A construção humana nM2b foi co-expressa com ELC e RLC. O N-termini do RLC foi fundido com um GFP através de um linker de cinco aminoácidos (SGLRS). Diretamente anexado à tag FLAG era um HaloTag. Entre o HaloTag e o N-terminus da cadeia pesada de minosina havia um linker feito de dois aminoácidos (AS).

Ambas as preparações de minosina foram purificadas a partir de um litro de cultura celular Sf9 infectada com baculovírus a uma densidade de aproximadamente 2 x 10⁶ células/mL. Os volumes do baculovírus para cada subunidade dependiam da multiplicidade de infecção do vírus, conforme determinado pelas instruções do fabricante. No caso do M5a, as células foram co-infectadas com dois baculovírus diferentes- um para calmodulin, e um para cadeia pesada M5A. No caso do NM2b, as células foram co-infectadas com três vírus diferentes- um para ELC, um para RLC e um para cadeia pesada NM2b. Para laboratórios que trabalham com uma diversidade de miose (ou outras proteínas multi-complexas), essa abordagem é eficiente, pois permite muitas combinações de cadeias pesadas e leves e cadeias leves comumente usadas, como a calmodulina, podem ser co-transfetadas com muitas cadeias pesadas de micosina diferentes. Todo o trabalho celular foi concluído em um armário de biossegurança com técnica estéril adequada para evitar contaminação.

Para a expressão de M5a e NM2b, as células Sf9 que produzem as miosinas recombinantes foram coletadas de 2 a 3 dias após a infecção, via centrifugação, e armazenadas a -80 °C. As pelotas celulares foram obtidas pela centrifugação das células Sf9 co-infectadas a 4 °C por 30 min a 2.800 x g. O processo de purificação de proteínas é detalhado abaixo.

Protocol

1. Purificação de proteínas

1. Lise celular e extração de proteínas
   1. Prepare um buffer de extração de 1,5x com base na Tabela 1. Filtrar e armazenar a 4 °C.
   2. Comece a descongelar as pelotas de célula no gelo. Enquanto as pelotas estão descongelando, suplemente 100 mL de Tampão de Extração com dithiothiothreitol de 1,2 mM (DTT), 5 μg/mL leupepína, 0,5 μM de flúor de fenilmetilasulfonyl (PMSF) e dois comprimidos inibidores de protease. Mantenha-se no gelo.
   3. Uma vez que a pelota tenha descongelado, adicione 1 mL do buffer de extração suplementado por 10 mL de cultura celular. Por exemplo, se as pelotas celulares foram formadas a partir de 500 mL de cultura celular, em seguida, adicione 50 mL de tampão de extração suplementar à pelota.
   4. Sonicar as pelotas de células enquanto as mantém no gelo. Para cada pelota, utilize as seguintes condições: 5 s ON, 5 s OFF, duração de 5 min, potência 4-5.
   5. Colete todos os lysate homogeneizados em um béquer e adicione ATP (solução de estoque de 0,1 M; pH 7.0) de tal forma que a concentração final de ATP seja de 1 mM. Mexa por 15 minutos em uma sala fria. O ATP dissocia a minoina ativa da actina, permitindo que ela seja separada na etapa de centrifugação seguinte. É, portanto, essencial avançar para o próximo passo imediatamente para minimizar a possibilidade de esgotamento e revincagem da ATP.
   6. Centrifugar os lysates a 48.000 x g por 1 h a 4 °C. Enquanto isso estiver ocorrendo, comece a lavar 1-5 mL de um chorume de 50% de resina de afinidade Anti-FLAG (para uma pelota formada a partir de 1 L de células) com soro fisco tamponado de 100 mL (PBS), de acordo com as instruções do fabricante. Por exemplo, para 5 mL de resina, lave 10 mL de um chorume de 50%. Na etapa final de lavagem, resuspenja a resina com 1-5 mL de PBS com volume suficiente para criar um chorume de 50%.
   7. Após a centrifugação de lise, combine o supernasce com o chorume de resina lavada e a rocha suavemente na sala fria por 1-4 h. Enquanto espera, faça os buffers descritos na Tabela 1 e mantenha-os no gelo.
2. Preparação de purificação de afinidade flag
   1. Centrifugar a solução na etapa 1.7 a 500 x g por 5 min a 4 °C. A resina será embalada na parte inferior do tubo. Sem perturbar a resina, remova o supernatante.
   2. Resuspenda a resina em 50 mL de Buffer A conforme detalhado na Tabela 1 e centrífuga a 500 x g por 5 min a 4 °C. Sem perturbar a resina, remova o supernatante.
   3. Resuspenda a resina em 50 mL de Buffer B conforme detalhado na Tabela 1 e centrífuga a 500 x g por 5 min a 4 °C. Repita esta etapa mais uma vez e resuspense a resina em 20 mL de Buffer B. Em seguida, misture a resina e o tampão cuidadosamente invertendo suavemente o tubo manualmente aproximadamente 10 vezes.
3. Elução e concentração de proteínas
   1. Faça 30 mL de Amortecedor de Elução como descrito na Tabela 1 e deixe esfriar no gelo.
   2. Coloque a coluna de eluição em uma sala fria. Despeje suavemente o chorume de resina na coluna. Lave a coluna com volumes de 1-2 colunas de Buffer B enquanto a resina embala na parte inferior, garantindo que a resina não seque.
   3. Flua 1 mL do Buffer de Elução através da resina e colete o fluxo através de um tubo de 1,5 mL. Repita de tal forma que 12, 1 mL frações são coletadas.
   4. Neste ponto, realize um teste bruto de Bradford nas frações para determinar qualitativamente quais frações são as⁴⁸mais concentradas . Em uma fileira de uma placa de 96 poços, pipeta 60 μL 1x reagente Bradford. À medida que as frações são coletadas, misture 20 μL de cada fração por poço. Uma coloração azul mais escura indica as frações mais concentradas.
   5. Em um tubo de 50 mL, colete a proteína restante tubondo suavemente o buffer de elução restante através da coluna, para liberar qualquer mose restante ligada à resina na coluna fluindo através. Este fluxo será concentrado na próxima etapa. Certifique-se de que a resina seja então regenerada para reutilização e armazenada de acordo com as instruções do fabricante.
   6. Acumule as três frações mais concentradas e concentre ainda mais o fluxo no tubo de 50 mL, bem como as frações restantes de 1 mL usando um tubo concentrador de 100.000 MWCO. Carregue a amostra agrupada no tubo concentrador e centrífuga a 750 x g por 15 minutos a 4 °C e repita até que toda a proteína elucida tenha sido concentrada a um volume final de aproximadamente 0,5-1 mL.
      NOTA: Este tamanho de poros permite a retenção das moléculas de minosina, que têm massas várias vezes o corte de peso molecular. As correntes de luz permanecem firmemente ligadas aos domínios do motor durante este período de concentração, conforme verificado pela realização da eletroforese de gel SDS-PAGE no produto final.
4. Diálise e congelamento de flash
   1. Faça 2 L de Tampão de Diálise, conforme descrito na Tabela 1. Carregue a amostra em um saco de diálise ou câmara e digele durante a noite na sala fria. Observe que a composição dos buffers de diálise difere para NM2b e M5a.
      NOTA: No caso do NM2b, o objetivo desta etapa de diálise é formar filamentos de miosina no buffer de baixa resistência iônica. A sedimentação desses filamentos fornece então uma etapa adicional de purificação e permite a concentração da amostra. Haverá, portanto, um precipitado branco visível na câmara de diálise no dia seguinte. Esses filamentos serão coletados por centrifugação e despolmerizados na etapa 5.1. No caso do M5a-HMM, após a diálise noturna, a proteína será suficientemente pura para o uso em ensaios subsequentes. Outras etapas de purificação, como filtração de gel ou cromatografia de troca iônica, podem ser realizadas, se necessário. Para recuperação de M5a após a diálise, vá para a etapa 5.2.
5. Recuperando a minosina após a diálise
   1. Para NM2b, descarregue cuidadosamente toda a amostra do saco de diálise ou câmara e centrífuga a 4 °C por 15 min a 49.000 x g para coletar os filamentos de miosina. Descarte o supernatante e adicione incrementalmente o buffer de armazenamento à pelota, conforme descrito na Tabela 1 até que ele tenha dissolvido. A tubulação suave para cima e para baixo ajuda a solubilizar a pelota. Normalmente, isso não requer mais de 500 μL por tubo. Depois de garantir que a pelota seja totalmente dissolvida no buffer de armazenamento de alta resistência iônica, uma etapa de centrifugação adicional (15 min a 49.000 x g) pode ser realizada para remover agregados indesejados, se necessário, uma vez que a minosina agora será não polimerizada e permanecerá no supernatário.
   2. Para M5a-HMM, colete cuidadosamente toda a amostra da câmara de diálise e centrífuga a 4 °C por 15 min a 49.000 x g no caso de quaisquer agregados indesejados estarem presentes. Pegue o supernatante.
6. Determinação de concentração e congelamento de flash
   1. Para determinar a concentração do produto, meça a absorvência utilizando um espectrofotômetro nos comprimentos de onda 260, 280, 290 e 320 nm. Calcule a concentração em mg/mL (c_mg/mL) com a Equação 1,onde A₂₈₀ representa a absorção em 280 nm e A₃₂₀ representa a absorção em 320 nm. A concentração resultante em mg/mL pode ser convertida em μM de moléculas de mosina com a Equação 2,onde M é o peso molecular de toda a proteína (incluindo as cadeias pesadas, cadeias leves, fluoroforos e todas as tags).
      c_mg/mL = (A₂₈₀ - A₃₂₀) / ε (1)
      moléculas μM = 1000c_mg/mL/M (2)
      NOTA: Se uma diluição for necessária, deve ser feita em um tampão de alta resistência iônica. O coeficiente de extinção (ε) pode ser determinado importando a sequência de aminoácidos da proteína em um programa como o ExPASy. O rendimento típico do M5a-HMM é de aproximadamente 0,5-1 mL de 1-5 mg/mL de proteína e para o NM2b de comprimento completo é de 0,5-1 mL de 0,5-2 mg/mL. O coeficiente de extinção do M5a-HMM utilizado neste artigo foi de 0,671. O coeficiente de extinção do NM2b utilizado neste artigo foi de 0,611.
   2. Guarde a miose purificada de uma das duas maneiras. Alíquota entre 10-20 μL em um tubo de paredes finas, como um tubo de reação em cadeia de polimerização, e deixe cair o tubo em um recipiente de nitrogênio líquido para congelamento de flash. Alternativamente, pipeta diretamente entre 20-25 μL de minosina em nitrogênio líquido e armazenar as contas congeladas de proteína em tubos criogênicos estéreis. Em ambos os casos, os tubos resultantes podem ser armazenados em -80 °C ou nitrogênio líquido para uso futuro.
      NOTA: Uma vez que ambos os ensaios de motilidade descritos abaixo requerem quantidades muito pequenas de proteína, o armazenamento em pequenas alíquotas, como descrito, é econômico.

2. Ensaio de filamento de actina de deslizamento

1. Preparação do Coverlip
   1. Faça uma solução de 1% de nitrocelulose em acetato de amilo.
   2. Obtenha um prato de cultura tecidual (150 x 25 mm) e adicione um papel filtro circular (125 mm de diâmetro) na parte inferior do prato.
   3. Carregue oito coberturas quadradas de 22 mm de espessura nº 1,5 mm em um rack e lave com aproximadamente 2-5 mL de etanol à prova de 200, seguido por 2-5 mL de água destilada (dH₂O). Repita esta etapa de lavagem, terminando com água. Em seguida, seque as tampas completamente usando uma linha de ar filtrada ou linha N_2.
   4. Pegue uma mancha de cobertura e pipeta lentamente 10 μL da solução de nitrocelulose de 1% ao longo de uma borda do deslizamento. Em seguida, em um movimento suave, esfregue-o através do resto da tampa usando o lado de uma ponta de pipeta de 200 μL de lado liso. Coloque esta mancha no prato de cultura tecidual com o lado nitrocelulose para cima. Repita para as tampas restantes e deixe-as secar enquanto preparam os reagentes restantes e use tampas dentro de 24 horas após o revestimento.
2. Preparação da câmara
   1. Limpe um slide de microscópio com um papel de lente óptica para limpar grandes detritos. Corte duas peças de fita dupla face, aproximadamente 2 cm de comprimento.
   2. Coloque uma peça ao longo do meio da borda longa do slide do microscópio. Certifique-se de que a borda da fita se alinha com a borda do slide. Coloque a segunda peça de fita cerca de 2 mm abaixo da primeira peça de fita de tal forma que os dois estejam paralelos e alinhados. Isso cria uma câmara de fluxo que pode conter aproximadamente 10 μL de solução (ver Figura 1).
   3. Pegue uma das tampas revestidas de nitrocelulose da Parte 1. Coloque cuidadosamente a mancha na fita de tal forma que o lado revestido com nitrocelulose esteja fazendo contato direto com a fita ( ver Figura 1). Usando uma ponta de pipeta, pressione suavemente para baixo na interface de fita deslizante para garantir que o deslizamento tenha aderido corretamente ao slide. Corte o excesso de fita pendurada sobre a borda do slide com uma lâmina de barbear.
3. Preparação actin
   1. Faça 20 μM F-actin polimerizando actina globular (G-actin) em tampão de polimerização (50 mM KCl, 2 mM MgCl₂, 1 mM DTT, 25 mM MOPS (pH 7.0)) a 4 °C durante a noite.
   2. Diluir F-actin a 5 μM no tampão de motilidade (20 mM MOPS, 5 mM MgCl₂, 0,1 mM EGTA, 1 mM DTT (pH 7.4)). Rotule com pelo menos 1,2x de excesso molar de rhodamina-phalloidin. Deixe (coberto de papel alumínio) por pelo menos 2 h no gelo. Isso pode ser usado por até 1-2 meses, armazenado no gelo.
4. Realizando o ensaio de filamento de planagem myosin 5a
   NOTA: Nesta seção, são fornecidos os detalhes do ensaio de deslizamento myosin 5a (HMM).
   1. Prepare as soluções para minosina 5a descritas na Tabela 2 e mantenha-as no gelo.
   2. Flua em 10 μL da minosina 5a (50-100 nM) através da câmara de fluxo e espere por 1 min.
   3. Flua em 10 μL do BSA de 1 mg/mL em 50 mM MB com 1 mM DTT (tampão "sal baixo"). Repita esta lavagem mais duas vezes e espere 1 min após a terceira lavagem. Use o canto de um papel de tecido ou papel filtro para passar a solução pelo canal, colocando suavemente o canto do papel na saída da câmara de fluxo.
   4. Lave com 10 μL de 50 mM MB com 1 mM DTT. Repita esta lavagem mais duas vezes.
   5. Flua em 10 μL da solução de actin preto (5 μM F-actin, 1 μM calmodulin e 1 mM ATP em 50 mM MB com 1 mM DTT) para eliminar "cabeças mortas", como discutido na seção Discussão.
      1. Pipeta a solução com uma seringa de 1 mL e agulha de 27 G para corte dos filamentos de actin antes de introduzir a solução para a câmara. Repita esta etapa mais duas vezes e espere 1 min após a terceira vez. Aproximadamente 20 eventos de pipetação são suficientes.
      2. Para realizar o giro "cabeça morta", adicione uma quantidade estequiométrica de F-actin à mosina na presença de 1 mM ATP e 1 mM MgCl₂ em uma concentração de sal de 500 mM. Em seguida, ultracentrifuuge a 480.000 x g para 15 min a 4 °C. A minosina morta estará na pelota.
   6. Flua em 50 μL de 50 mM MB com 1 mM DTT e 1 mM ATP para esgotar a câmara de filamentos de ato livre.
   7. Lave com 10 μL de 50 mM MB com 1 mM DTT. Repita esta lavagem mais duas vezes para esgotar a câmara de qualquer ATP.
   8. Flua em 10 μL de 20 nM rhodamine actin (Rh-Actin) solução contendo 1 mM DTT em 50 mM MB e espere por 1 min para permitir a vinculação rigorosa de filamentos actin ao myosin 5a anexado à superfície do deslizamento de cobertura.
   9. Lave com 10 μL de 50 mM MB com 1 mM DTT para lavar filamentos Rh-Actin não ligados à superfície. Repita esta lavagem mais duas vezes.
   10. Flua em 30 μL de Buffer Final.
   11. Grave imagens em um microscópio de fluorescência usando um comprimento de onda de excitação de 561 nm para visualizar Rh-Actin. Um tempo de exposição adequado é de 200 ms a 1,4 mW de potência laser para uma duração total de aquisição de 0,5-1 min.
       NOTA: Certifique-se de que a taxa de aquisição seja dimensionada adequadamente para a velocidade dos filamentos móveis. Uma consideração importante antes de coletar dados para uso com programas de rastreamento é a taxa de quadros de aquisição. Movimentos de subpixel entre quadros resultarão em uma superestimação da velocidade, e movimentos de várias centenas de nanômetros são necessários para obter valores precisos. Uma taxa de aquisição ótima apresenta o planante de pelo menos um pixel de distância entre os quadros. No caso do microscópio TIRF utilizado para a imagem aqui, este limiar se traduz em 130 nm; portanto, uma minosina esperada para viajar 1 μm/s deve ser imageda a uma taxa de 5 quadros/s (intervalo de 0,2 s) para alcançar 200 nm de movimento, enquanto uma mosina esperada para viajar 10 nm/s requer 0,05 quadros/s (intervalos de 20 s). Os dados podem, portanto, ser retirados nesta fase, se necessário (consulte Discussão para obter mais detalhes).
5. Realizando o ensaio de filamento de planagem de minosina não-musada 2b
   NOTA: Nesta seção, são fornecidos os detalhes do ensaio de deslizamento de minodão não-sem-músculo de comprimento completo 2b. O protocolo de ensaio de planagem de mísamo não-músculo 2b é diferente do protocolo myosin 5a em certos passos. Certifique-se de que os buffers corretos sejam usados para cada uma dessas etapas. Por exemplo, o ensaio NM2b requer a fixação da mosina ao deslizamento de cobertura em tampão de sal alto, enquanto o M5a pode ser anexado ao deslizamento de cobertura em tampões de sal altos ou baixos. Além disso, o ensaio de filamento de planagem M5a utiliza uma menor concentração de miose para mitigar a frequência de filamentos actin se rompendo durante a aquisição.
   1. Prepare as soluções para nM2b conforme descrito na Tabela 2 e mantenha-as no gelo.
   2. Flua em 10 μL da mosina não moída 2b (0,2 μM) em 500 mM M Motility Buffer (MB) (tampão "sal alto") e 1 mM dithiothreitol (DTT) através da câmara de fluxo e esperar por 1 min.
      NOTA: Os tampões de sal elevados dissociam filamentos de miosina e permitem a fixação de moléculas únicas de miosina à superfície, pois a mísmo não-hídis 2b pode polimerizar em filamentos na concentração iônica < 150 mM.
   3. Flua em 10 μL do albumina de soro bovino de 1 mg/mL (BSA) em 500 mM MB com 1 mM DTT (tampão de "sal alto") conforme descrito na Tabela 2. Repita esta lavagem mais duas vezes e espere 1 min após a terceira lavagem. Use o canto de um papel de tecido ou papel filtro para passar a solução pelo canal.
   4. Lave com 10 μL de 500 mM MB com 1 mM DTT conforme descrito na Tabela 2. Repita esta lavagem mais duas vezes.
   5. Flua em 10 μL da solução de actina negra, conforme descrito na Tabela 2, para eliminar "cabeças mortas", como discutido mais adiante na seção Discussão. A solução de actina preta contém 5 μM de F-actin não rotulado, 1-10 nM MLCK, 1 mM ATP, 0,2 mM CaCl₂, 1 μM CaM, e 1 mM DTT em 50 mM NaCl mCl mCl tampão de motilidade para fosforrylate o nãomuscleosin 2b na superfície da câmara.
      1. Pipeta a solução com uma seringa de 1 mL e agulha de 27 G para corte dos filamentos de actin antes de introduzir a solução para a câmara. Repita esta etapa mais duas vezes e espere 1 min após a terceira vez. Aproximadamente, 20 eventos de tubulação são suficientes.
   6. Flua em 50 μL de 50 mM MB com 1 mM DTT e 1 mM ATP para esgotar a câmara de filamentos de ato livre.
   7. Lave com 10 μL de 50 mM MB com 1 mM DTT. Repita esta lavagem mais duas vezes para esgotar a câmara de qualquer ATP.
   8. Flua em 10 μL de solução rh-actina de 20 nM contendo 1 mM DTT em 50 mM MB e espere 1 min para permitir a vinculação rigorosa de filamentos de actina ao mosina não mocle 2b anexado à superfície do deslizamento de cobertura.
   9. Lave com 10 μL de 50 mM MB com 1 mM DTT para lavar filamentos Rh-Actin não ligados à superfície. Repita esta lavagem mais duas vezes.
   10. Flua em 30 μL de Buffer Final. Para o ensaio de filamento de planagem de miose não-sem-músculo 2b, o Buffer Final também inclui calmodulin, CaCl₂e quinase da cadeia de luz da micosina para fornecer fosforilação completa da minosina não-musculo 2b durante a imagem de vídeo. 0,7% de metilcelulose também pode ser incluído no Buffer Final se os filamentos de actina estiverem apenas frouxamente ligados ou não estiverem vinculados à superfície. Isso é discutido ainda na seção discussão.
   11. Grave imagens em um microscópio de fluorescência usando um comprimento de onda de excitação de 561 nm. Um tempo de exposição adequado é de 200 ms a 1,4 mW de potência laser para uma duração total de aquisição de 0,5 -3 min.
       NOTA: Certifique-se de que a taxa de aquisição seja dimensionada adequadamente para a velocidade dos filamentos móveis. Uma consideração importante antes de coletar dados para uso com programas de rastreamento é a taxa de quadros de aquisição. Movimentos de subpixel entre quadros resultarão em uma superestimação da velocidade, e movimentos de várias centenas de nanômetros são necessários para obter valores precisos. Uma taxa de aquisição ótima apresenta o planante de pelo menos um pixel de distância entre os quadros. No caso do microscópio TIRF utilizado para a imagem aqui, este limiar se traduz em 130 nm; portanto, uma minosina esperada para viajar 1 μm/s deve ser imageda a uma taxa de 5 quadros/s (intervalo de 0,2 s) para alcançar 200 nm de movimento, enquanto uma mosina esperada para viajar 10 nm/s requer 0,05 quadros/s (intervalos de 20 s). Os dados podem, portanto, ser amostrados nesta fase, se necessário (consulte Discussão para obter mais detalhes).

3. Ensaio de TIRF de molécula única

1. Preparação do Coverlip
   1. Divida o pó de caldo em alíquotas de 10 mg (em tubos de 1,5 mL) de metoxi-Peg-silane (mPEG) e 10 mg de biotin-Peg-silane (bPEG). Armazene a -20 °C em um recipiente lacrado e sem umidade e use dentro de 6 meses.
   2. Carregue oito camadas de espessura nº 1,5H (alta precisão) 22 mm de cobertura quadrada em um rack e lave com 2-5 mL de etanol à prova de 200, seguido por 2-5 mL de água destilada. Repita esta etapa de lavagem, terminando com água. Em seguida, seque as tampas completamente usando uma linha de ar ou N₂ e limpa de plasma com argônio por 3 minutos.
   3. Coloque as tampas limpas no papel filtro (90 mm) em um prato de cultura de tecido (100 x 20 mm) e incubar em um forno de 70 °C enquanto realiza as etapas seguintes.
      NOTA: A limpeza plasmática pode ser substituída por outros métodos químicos de limpeza⁴⁹.
   4. Prepare 80% de solução de etanol com dH₂O e ajuste o pH para 2.0 usando HCl. Adicione 1 mL deste a uma alíquota de 10 mg de mPEG e 1 mL a uma alíquota de 10 mg de bPEG. Vórtice para dissolver, que não deve levar mais de 30 s.
   5. Pegue 100 μL da solução bPEG e adicione 900 μL de 80% de etanol (pH 2.0). Esta solução é de 1 mg/mL bPEG. Em seguida, faça uma solução de ambos os PEGs da seguinte forma, misturando-se completamente.
      1. 200 μL de 10 mg/mL mPEG (concentração final: 2 mg/mL).
      2. 10 μL do bPEG de 1 mg/mL (concentração final: 10 μg/mL).
      3. 790 μL da solução de 80% de etanol (pH 2.0).
   6. Tire as tampas do forno. Dispense cuidadosamente 100 μL da solução PEG no centro de cada deslizamento de cobertura, garantindo que apenas a superfície superior esteja molhada. Em seguida, coloque os deslizamentos de volta no forno e incubar por 20 a 30 min.
   7. Quando as tampas começarem a assumir uma aparência furada, com pequenos círculos aparentes através da superfície, remova-os do forno.
   8. Lave cada tampa com 100% de etanol, seque com uma linha de ar e coloque de volta no forno. Incubar apenas pelo tempo necessário para criar câmaras na etapa 2.
2. Preparação da câmara
   1. Limpe um slide de microscópio para uso na fabricação da câmara. Corte duas peças de fita dupla face, aproximadamente 2 cm de comprimento.
   2. Coloque uma peça ao longo do meio da borda longa do slide do microscópio. Certifique-se de que a borda da fita se alinha com a borda do slide. Coloque a segunda peça de fita cerca de 2 mm abaixo da primeira peça de fita de tal forma que os dois estejam paralelos e alinhados.
   3. Pegue uma das tampas funcionais do forno (criada em 3.1). Coloque cuidadosamente a mancha na fita de tal que o lado revestido com PEG esteja de brusão e fazendo contato direto com a fita, como mostrado na Figura 1. Usando uma ponta de pipeta, pressione suavemente para baixo na interface de fita deslizante para garantir que o deslizamento tenha aderido corretamente ao slide.
   4. Corte o excesso de fita que paira sobre o slide com uma lâmina de barbear. Estas câmaras podem ser usadas imediatamente ou colocadas em um tubo de 50 mL e armazenadas em um congelador de -80 °C para uso futuro. É importante armazenar imediatamente ou a superfície se degradará.
3. Realizando o ensaio de microscopia myosin 5a TIRF
   1. Prepare as soluções para minosina 5a ensaio de motilidade invertida descrito na Tabela 3 e mantenha-as no gelo.
   2. Lave a câmara com 10 μL de 50 mM MB com 1 mM DTT.
   3. Flua em 10 μL do BSA de 1 mg/mL em 50 mM MB com 1 mM DTT. Repita esta lavagem mais duas vezes e espere 1 min após a terceira lavagem. Use o canto de um papel de tecido ou papel filtro para passar a solução pelo canal.
   4. Lave com 10 μL de 50 mM MB com 1 mM DTT. Repita esta lavagem mais duas vezes.
   5. Flua em 10 μL da solução NeutrAvidin em 50 mM MB com 1 mM DTT e espere por 1 min.
   6. Lave com 10 μL de 50 mM MB com 1 mM DTT. Repita esta lavagem mais duas vezes.
   7. Flua em 10 μL de rhodamina biotinilada actina (bRh-Actin) contendo 1 mM DTT em 50 mM MB e espere por 1 min. Para este passo, use uma ponta de pipeta grande e entediada e evite pipetar para cima e para baixo para minimizar o corte dos filamentos fluorescentes de actina para garantir que filamentos de ato longo possam ser anexados à superfície (20-30 μm ou mais). Uma alternativa eficaz é cortar o cone de uma ponta de pipeta padrão (com uma abertura de ≈1-1,5 mm).
   8. Lave com 10 μL de 50 mM MB com 1 mM DTT. Repita esta lavagem mais duas vezes.
   9. Flua em 30 μL de Buffer Final com myosina 5a de 10 nM adicionada, em seguida, imediatamente carregar no microscópio TIRF e registrar depois de encontrar o foco ideal para a modalidade de imagem TIRF. Os tempos de exposição entre 100-200 ms são apropriados a 1,4 mW de potência laser para a mosina actina e gfp. O tempo de aquisição adequado para análise de velocidade é de 3 minutos.
4. Realizando o ensaio de microscopia de mísmo não-músculo 2b TIRF
   NOTA: Nesta seção, são fornecidos os detalhes do ensaio tirf de miosina não-hídula 2b utilizando filamentos polimerizados e fosforilados. O protocolo detalhado (seções 4.1-4.3) para fosforilação e polimerização da mísampara não-hísmo-2b em um tubo está incluído.
   1. Para fosforilar o NM2b purificado, faça uma mistura de quinase de 10x com as seguintes condições: 2 mM CaCl₂, 1 μM CaM, 1-10 nM MM MLCK e ATP de 0,1 mM. Isso pode ser levado a volume com 500 mM MB com 10 mM DTT. Adicione a mistura de quinase de 10x à miosina a uma razão volumosa de 1:10 e deixe incubar por 20-30 min à temperatura ambiente. Normalmente, a concentração de miosina para esta etapa é de 1 μM.
   2. Para polimerizar a miosina fosforílalada em filamentos, reduza a concentração de sal do NM2b para 150 mM NaCl. Para isso, faça um tampão de motilidade 1x (1x MB) sem sal diluindo o 4x MB quatro vezes em dH₂O. Este 1x MB pode ser usado para diminuir a concentração de sal porque o NM2b foi congelado em um tampão de sal de 500 mM.
   3. Para cada 3 μL de estoque NM2b, adicione 7 μL de 1x MB para diminuir a concentração de sal para 150 mM NaCl e incubar no gelo por 20-30 min para formar filamentos NM2b.
      NOTA: A ordem nas seções 4.1-4.3 não é crucial enquanto o NM2b for fosforilado e a concentração final de sal seja de 150 mM. A incubação na ordem de 30 min-1 h permite tempo suficiente para fosforilação completa e polimerização.
   4. Prepare as soluções para o ensaio de motilidade invertida de 2b invertidos descrito na Tabela 3 e mantenha-as no gelo.
   5. Lave a câmara com 10 μL de 150 mM MB com 1 mM DTT.
   6. Flua em 10 μL do BSA de 1 mg/mL em 150 mM MB com 1 mM DTT Repita esta lavagem mais duas vezes e espere 1 min após a terceira lavagem. Use o canto de um papel de tecido ou papel filtro para passar a solução pelo canal.
   7. Lave com 10 μL de 150 mM MB com 1 mM DTT. Repita esta lavagem mais duas vezes.
   8. Flua em 10 μL da solução NeutrAvidin em 150 mM MB com 1 mM DTT e espere por 1 min.
   9. Lave com 10 μL de 150 mM MB com 1 mM DTT. Repita esta lavagem mais duas vezes.
   10. Flua em 10 μL de bRh-Actin e espere por 1 min. Para este passo, use uma ponta de pipeta grande e entediada e evite pipetar para cima e para baixo para minimizar o corte dos filamentos fluorescentes de actina, para garantir que filamentos de ato longo possam ser anexados à superfície (20-30 μm ou mais). Uma alternativa eficaz é cortar o cone de uma ponta de pipeta padrão.
   11. Lave com 10 μL de 150 mM MB com 1 mM DTT. Repita esta lavagem mais duas vezes.
   12. Flua em 10 μL da solução de minosina não moída 2b (aproximadamente 30 nM) e espere por 1 min.
   13. Lave com 10 μL de 150 MB com 1 mM DTT. Repita esta lavagem mais duas vezes.
   14. Flua em 30 μL de Buffer Final, depois carregue imediatamente no microscópio TIRF e registre após encontrar o foco ideal para a modalidade de imagem TIRF. Os tempos de exposição entre 100-200 ms são apropriados a 1,4 mW de potência laser para a mosina actina e gfp. O tempo de aquisição adequado para análise de velocidade é de 3 minutos.

4. Análise de imagem

1. Análise de imagem para ensaio de filamento de actina de deslizamento
   NOTA: As imagens podem ser analisadas utilizando o software e os manuais vinculados na Lista de Materiais. É importante notar que o programa descrito aqui requer pilhas de TIFF para análise. O processo de análise do ensaio de filamento de planagem é o seguinte⁵⁰.
   1. Carregue pilhas de filmes brutos em uma estrutura de pasta especificada e insira o diretório mais alto das pastas de filme no programa.
      NOTA: O programa analisa os arquivos ao longo deste diretório e subdiretórios, tratando os diretórios de nível mais baixo como replicação. Serão produzidas estatísticas médias para cada grupo de réplicas. Neste caso, um único filme foi usado para cada minosina. Ao caracterizar uma nova miose ou investigar uma nova condição experimental, recomenda-se analisar filmes de três campos de vista (FOV) por câmara para um total de três câmaras e repetir este fluxo de trabalho para três preparações da miosina que estão sendo investigadas.
   2. Use o script "stack2tifs" em conjunto com a taxa de quadros inserida pelo usuário para converter cada pilha TIFF em uma pasta contendo uma série de arquivos TIFF individuais e um arquivo de metadados correspondente.txt contendo o tempo de início de cada quadro. Para dados que não estão no formato de pilha TIFF, uma conversão deve ser aplicada primeiro usando softwares como os listados na Tabela de Materiais.
      NOTA: Este script é a parte do pacote de software. As informações do roteiro podem ser encontradas aqui: "https://github.com/turalaksel/FASTrack/blob/master/bin/stack2tifs"
   3. Use o parâmetro -px, que é o tamanho do pixel (em nm) durante a aquisição. Neste caso, o tamanho do pixel é de 130 nm. Use os parâmetros -xmax e -ymax para dimensionar os eixos para as saídas de gráficos de dispersão. Estes correspondem ao maior comprimento de filamento plotado e à velocidade máxima plotada (em nm/s).
      NOTA: Estes são valores estimados e podem ser definidos em valores acima do esperado para garantir que os dados estejam contidos na parcela. Após a análise, os dados brutos também podem ser exportados para uso em outros softwares estatísticos ou gráficos para visualização e análise.
   4. Use o parâmetro -minv, que é um parâmetro de corte de velocidade mínima, para definir os filamentos que não estão se movendo e podem, portanto, ser excluídos da análise. Para uma minosina lenta como o NM2b, este parâmetro deve ser baixo (neste exemplo, 5 nm/s) para evitar cortar movimentos de deslizamento verdadeiros. Para uma mosina rápida como m5a, este parâmetro pode ser maior (neste exemplo, 100 nm/s) para aplicar um filtro mais rigoroso, mantendo a verdadeira distribuição de velocidade de deslizamento.
   5. Use o parâmetro de corte -pt para identificar o movimento suave. Para cada janela de amostragem, um valor é calculado equivalente a 100 x Velocidade De desvio padrão/velocidade média. Faixas com valores mais elevados do que o corte, têm velocidades mais variáveis e são excluídas de análises posteriores. Neste exemplo, foi utilizado um valor de corte de 33. Faixas com valores mais elevados têm velocidades mais variáveis e são excluídas de análises posteriores.
   6. Use -maxd para definir uma distância máxima permitida de ligação entre os quadros. Trata-se de uma distância calculada de quadro a quadro movida pelo centroid do filamento em unidades de nm. Pode ser útil para excluir movimentos esporádicos ou ligação incorreta entre filamentos. Nos exemplos aqui, o parâmetro foi deixado no valor padrão de 2.000 nm.
2. Análise de imagem para ensaio de microscopia TIRF
   NOTA: O processo de análise do ensaio tirf de molécula única no software de imagem especificamente listado no Tabela de Materiais é o seguinte²⁹.
   1. Clique e arraste o vídeo de microscopia gravado para o espaço de trabalho do software para abri-lo⁵¹. Então, dividir os canais de aquisição. Clique em Imagem > Cores > Canais Divididos.
      NOTA: No caso de avelrecido deriva de estágio durante a aquisição, as imagens devem ser estabilizadas para corrigir a deriva instrumental no plano de imagem. Neste caso, nenhuma compensação pela deriva do eixo Z foi utilizada, pois o microscópio utilizado para obter esses dados estabiliza bem o foco Z. Para estabilizar a imagem no programa de análise de imagens, instale o plug-in estabilizador apropriado que está ligado na Lista de Materiais. O estabilizador de imagem assume posições fixas para os objetos na imagem e usa uma média de rolamento dos quadros anteriores como referência. O procedimento recomendado é, portanto, começar com o canal contendo imagens de actina rotulada, uma vez que esta é em uma posição fixa.
   2. Clique em Plugins, e encontre estabilizador de imagem; certifique-se de que a tradução está selecionada e mantenha as configurações padrão. Verifique a caixa ao lado dos Coeficientes de Transformação de Log. A aplicação desta etapa log permite que os parâmetros de turno calculados sejam aplicados ao outro canal na próxima etapa. Permita que o processo seja concluído.
   3. Em seguida, abra o canal com minosina rotulada e aplique a estabilização clicando em Plugins > Aplicador de Registro estabilizador de imagem. Se as imagens de actin não puderem ser adquiridas durante a mesma aquisição devido a um requisito para imagens de taxa mais alta em um único canal, a deriva estabilizará a pilha de imagens selecionando uma região que contém objetos estáticos, como um marcador fiduciário biotinína ou fluoroforos ligados não especificamente à superfície biotin-PEG. Esta região pode ser cortada da pilha original e estabilizada, seguida pela aplicação dos valores de mudança resultantes para a pilha original.
      NOTA: Na prática, a deriva observada nos experimentos de motilidade será insignificante em relação ao movimento das miosinas que se movem a várias centenas de nm/s, mas para as miosinas mais lentas isso se torna uma consideração importante.
   4. Em seguida, abra TrackMate, clique em Plugins; em seguida, em seu menu suspenso clique em Rastreamento e, finalmente, no TrackMate. Neste ponto, a análise da imagem está sujeita à otimização com base nos parâmetros do fluorohore e das condições de ensaio. No entanto, parâmetros de partida ideais são os seguintes.
      1. Configurações de calibração: mantenha todos os valores padrão.
      2. Detector: Detector de log.
      3. Diâmetro estimado da bolha: 0,5-1,0 míc bilhão.
      4. Limiar: 25-200. (Isso pode ser determinado clicando em Visualização depois de escolher um número para ver se as manchas detectadas correspondem ao filme e ajustando adequadamente.)
      5. Limiar inicial: não definido.
      6. Vista: HyperStack Displayer.
      7. Coloque filtros nas manchas: não definidos.
      8. Rastreador: Rastreador de LAP simples.
         NOTA: Estes dependem da taxa de quadros e da velocidade da miosina e devem ser grandes o suficiente para conectar posições subsequentes, excluindo conexões indesejadas entre diferentes partículas.
      9. Ligação máxima: 1,0 mícd.
      10. Distância máxima de fechamento de lacunas: 1,0 míccro.
      11. Lacuna máxima de fechamento de lacunas: 1.
      12. Definir filtros nas faixas: Deslocamento de faixa (>0.39-para incluir apenas pontos movendo mais de 3 pixels), pontos nas faixas (>3-para incluir apenas faixas com pelo menos 3 pontos). Outros filtros como o Minimal Velocity podem ser introduzidos para excluir pontos que param por longos períodos. Os resultados da filtragem devem ser verificados por inspeção visual das faixas para garantir que as faixas espúrias (ou seja, o movimento da miosina no fundo que não esteja ao longo de uma pista de actina) sejam removidas mantendo as faixas associadas à actina.
   5. Uma vez que a tela Opções de exibição apareça, clique em Análise para obter as saídas relevantes. Salve as três tabelas produzidas (Track Statistics, Links em Estatísticas de Faixas e Pontos em Estatísticas de Faixas). A tabela Track Statistics conterá os dados de velocidade e deslocamento que podem ser posteriormente analisados para caracterizar uma nova proteína ou os efeitos de uma determinada condição experimental, por exemplo.

Representative Results

A purificação da minosina pode ser avaliada pela realização da redução do sulfato-poliacrilamida do de sódio (SDS-PAGE) gel-eletroforese como mostrado na Figura 2. Embora este número represente a miosina final, pós-dialisada, o SDS-PAGE pode ser realizado em alíquotas das várias etapas do procedimento de purificação para identificar quaisquer produtos perdidos para o supernante. Myosin 5a HMM tem uma banda na faixa de 120-130 kDa e a mísampara não-hísmo 2b tem uma banda na faixa de 200-230 kDa, correspondendo às cadeias pesadas^29,44. O myosin 5a também tem uma banda perto da marca de 17 kDa, marcando calmodulin. O myosin nonmuscle 2b tem uma banda de aproximadamente 17 kDa, denotando o ELC. Como um RLC com marca GFP está presente nesta preparação NM2b, o RLC aparece a aproximadamente 47 kDa; no entanto, um RLC não rotulado estará presente em aproximadamente 20 kDa se não for marcado com um GFP.

O ensaio de filamento de actin de planagem mostrado no Vídeo 1 e Figura 3 representa as características de um filme ideal e rastreável. Este ensaio de filamento de actina deslizante apresenta o movimento suave de filamentos actin rotulados. A lavagem de actin preto garante que as cabeças de miosina morta sejam removidas do campo de medição, contribuindo ainda mais para o movimento geral suave dos filamentos de actina. Os filamentos fluorescentes rotulados são curtos o suficiente para que um único filamento não se cruze sobre si mesmo, o que é mais ideal para o programa de rastreamento. Filamentos actinais que são muito longos atravessarão outros filamentos, que podem apresentar dificuldades para o programa de rastreamento de ensaios de filamentos de planagem. Este problema pode ser evitado por pipetar para cima e para baixo 10-20 vezes para cortear os filamentos de actina antes de carregar no deslizamento de tampas.

No caso do NM2b, o uso de metilcelulose pode melhorar significativamente a qualidade dos filmes gravados, pois reduz a difusão do actin longe da superfície de imagem. Isso não é necessário para m5a porque sua maior relação de dever permite um apego mais forte da actina à superfície revestida de mosina. Se o metilcelulose for usado, é necessário passar a solução pela câmara para garantir que a solução flua. Como mostrado no Vídeo 2, quando todas as outras condições são idênticas, exceto pela exclusão da metilcelulose, os filamentos de actina não permanecem tão intimamente associados à superfície revestida de miosina.

Por outro lado, o objetivo do ensaio de motilidade invertida mostrado no Vídeo 3 e Na Figura 4 é introduzir filamentos fluorescentes fluorescentes com tethered superfície sobre os quais o movimento da mosina pode ser observado. Um requisito importante do ensaio invertido é garantir que o movimento da miosina seja consistentemente observado em todo o FOV, como mostrado. O uso de uma mistura de DTT, glicose, catalase e glicose oxidase pode minimizar o fotobleaching para permitir medições mais longas⁵². Além disso, se a taxa de aquisição do ensaio for baixa, fechar a luz de iluminação entre a aquisição de quadros pode ajudar com o excesso de fotobleaching. O obturamento da luz de excitação pode ser feito através de um obturador mecânico, ou um filtro tunable acousto-óptico (AOTF).

Figura 1: Preparação de câmaras funcionais de célula de fluxo. (A) Comece com um slide de microscópio limpo, dois pedaços de fita dupla face cortadas para aproximadamente 2 cm, e um deslizamento de cobertura funcionalizado. (B) Adicione a fita ao centro do slide do microscópio. (C) Conecte a mancha de tampa à fita com o revestimento (ou seja, nitrocelulose) voltada para baixo e pressione suavemente as regiões sobrepostas com a fita usando uma ponta de pipeta de plástico para garantir que a mancha de cobertura tenha aderido à câmara. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Eletroforese de gel de poliacrilamida SDS de NM2b expresso e M5a-HMM. (A) Uma imagem de gel SDS PAGE representativa para uma corrente pesada NM2b de comprimento completo (≈230 kDa) e GFP-RLC (≈47 kDa) e ELC (≈17 kDa). Imagem em gel reproduzida e modificada de Melli et al. (2018)²⁹. (B) Uma imagem de gel SDS PAGE representativa para uma cadeia pesada semelhante a M5a-HMM (≈120 kDa) e calmodulin (≈17 kDa). Observe que o gel nesta imagem não tem um GFP inserido na extremidade terminal C. Um GFP inserido na cadeia pesada de miosina aumenta o peso molecular em ≈27 kDa. A imagem em gel reproduzida e modificada foi publicada originalmente no Journal of Biological Chemistry⁴⁴. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Gliding actin filamentos ensaio adquiridos via iluminação TIRF. (A) Exemplo de quadro de um filme mostrando translocação de rhodamina-phalloidina rotulada actina filamentos (em vermelho) em 0,2 μM NM2b na presença de 0,7% metilcelulose a 30 °C. Barra de escala = 10 μm. (B) Saída de imagem de rastreamento de filamento do programa FASTrack para NM2b para o mesmo FOV mostrado em (A) Barra de escala = 10 μm. (C) Histograma representativo da velocidade de deslizamento acto-NM2b, mostrando que esta amostra de NM2b pode gerar uma velocidade de deslizamento de actina de 77 ± 15 nm/s (desvio padrão médio ±; número de faixas = 550). (D) Exemplo de quadro de um filme mostrando translocação de rhodamina-phalloidin rotulado actin filamentos (em vermelho) em 75 nM M5a-HMM. Barra de escala = 10 μm. (E) Saída de imagem de rastreamento de filamento pelo programa FASTrack para M5a-HMM para o mesmo FOV mostrado na barra de escala(D) = 10 μm. (F) Um histograma representativo da velocidade de deslizamento acto-M5a-HMM, mostrando que esta amostra de M5a pode gerar uma velocidade de deslizamento de actina de 515 ± 165 nm/s (desvio padrão ± médio; número de faixas = 25098). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: Resultados de ensaios invertidos adquiridos via iluminação TIRF. (A) Um FOV representativo de uma pilha de imagens fundida de dois canais mostrando o movimento de filamentos NM2b (exibidos em verde) em filamentos de actina biotinínalado rotulados com AF647-phalloidin (exibido em azul) a 30 °C. Filamentos polimerizados de NM2b recombinantemente expressos e purificados co-expressos com ELC e GFP-RLC são observados como as partículas verdes e alongadas no FOV. Barra de escala = 10 μm. (B) Histograma representativo da velocidade dos filamentos NM2b. A análise foi realizada utilizando-se o software de análise de imagens descrito na Tabela de Materiais. Filamentos NM2b únicos têm uma velocidade de 84 ± 22 nm/s (desvio padrão ± médio; número de partículas rastreadas = 133), quando se movem ao longo de filamentos de actina único. (C) Exemplo de kymograph do movimento de filamento NM2b ao longo de um único filamento de actina. Note-se que algumas das regiões da partícula mostram uma "rotação" do filamento NM2b, ao longo do filamento de actin, o que provavelmente representa o momento em que um lado do filamento bipolar NM2b se desprende do filamento de actin, como mostrado anteriormente em Melli et al.²⁹. (D) Um fov representativo do movimento de molécula única M5a-HMM (exibido em verde) em filamentos de actina biotinína rotulados com rhodamina-phalloidina (exibido em vermelho). Barra de escala = 10 μm. (E) Histograma representativo de comprimento de execução de M5a-HMM, apto a um único exponencial. A análise foi realizada utilizando-se o software de análise de imagens descrito na Lista de Materiais. O comprimento característico da corrida é de 1,3 μm com um intervalo de confiança de 95% de 1,23-1,42 μm neste exemplo. (F) Histograma representativo da velocidade M5a-HMM de molécula única em filamentos de actina única. A saída de dados analisada a partir da análise de imagens mostra uma velocidade média de 668 ± 258 nm/s (desvio padrão ± médio; número de partículas rastreadas = 684). (G) Exemplo de kymograph de moléculas únicas de movimento M5a-HMM ao longo de um único filamento de actina. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Vídeo 1: Comparação de NM2b e M5a-HMM planando ensaio de filamento. O ensaio de filamento de planagem NM2b foi realizado na presença de metilcelulose (esquerda; painel de vídeo A) e M5a-HMM na ausência de metilcelulose (à direita; painel de vídeo B) a 30 °C. Observe que o carimbo de tempo avança mais rápido no painel de vídeo NM2b, em comparação com o painel de vídeo M5a-HMM para mostrar o movimento dos filamentos actin rotulados por rhodamina (vermelho) que é aproximadamente o mesmo. Isso ocorre porque a velocidade real de translocação de actin de NM2b é quase 7 vezes mais lenta que a de M5a-HMM (77 nm/s, contra 515 nm/s, respectivamente, extraído do pico gaussiano apto para o histograma na Figura 3). Barra de escala = 10 μm em ambos os painéis de vídeo. Dados NM2b adquiridos a 0,33 quadros por segundo com exposição de 200 ms. Os dados M5a-HMM adquiridos a 5 quadros por segundo com exposição de 200 ms (contínua) e posteriormente para baixo amostrados para 1 quadro por segundo. Os timestamps foram adicionados usando o plugin descrito na Lista de Materiais. Clique aqui para baixar este vídeo.

Vídeo 2: Ensaio de filamento de actina deslizante de NM2b na ausência de metilcelulose. Quando todas as outras condições são as mesmas, exceto pela ausência de metilcelulose, os filamentos de actina às vezes não grudam bem no deslizamento revestido com 0,2 μM NM2b, levando a filmes de baixa qualidade com filamentos de actina "flopping" perto da superfície do clipe revestido NM2b. Barra de escala = 10 μm. Isso pode ser resolvido introduzindo metilcelulose para mostrar o movimento suave dos filamentos de actin, como mostrado no painel de vídeo esquerdo do Vídeo 1 (ensaio de filamento de planagem NM2b). Outra alternativa é aumentar a concentração de NM2b para ≈1 μM. Este filme foi adquirido a 0,33 quadros por segundo com 200 ms de exposição. Clique aqui para baixar este vídeo.

Vídeo 3: Comparação do ensaio de motilidade invertida NM2b e M5a-HMM. O ensaio de motilidade invertida NM2b foi realizado na presença de metilcelulose e gravado a uma taxa de 0,33 quadros por segundo com o uso de um obturador (à esquerda; painel de vídeo A), o painel de vídeo C mostra o mesmo FOV que A, mas com partículas são identificadas e rastreadas usando software de análise de imagem. Da mesma forma, o ensaio de motilidade invertida para M5a-HMM na ausência de metilcelulose foi gravado a uma taxa de 5 quadros por segundo (à direita; painel de vídeo B). O painel de vídeo D mostra o mesmo FOV que B, mas com partículas identificadas e rastreadas usando software de análise de imagem. Barras de escala = 10 μm em todos os painéis de vídeo. Os dois lasers foram alternados para frente e para trás com o uso de uma única câmera para aquisição. Clique aqui para baixar este vídeo.

Nome tampão	Composição	Passos(s) Usados	Comentários
Tampão de extração M5A	0,3 M NaCl	1.1	Mantenha-se no gelo.
	15 mM MOPS, pH 7.2
	15 mM MgCl2
	1,5 mM EGTA
	4,5 mM NaN3
Tampão de extração NM2b	0,5 M NaCl	1.1	Mantenha-se no gelo.
	15 mM MOPS, pH 7.2
	15 mM MgCl2
	1,5 mM EGTA
	4,5 mM NaN3
Tampão A	0,5 M NaCl	2.2	Mantenha-se no gelo.
	MOPS de 10 mM, pH 7.2
	0,1 mM EGTA
	3 mM NaN3
	ATP de 1 mM
	1 mM DTT
	5 mM MgCl2
Tampão B	0,5 M NaCl	2.3	Mantenha-se no gelo.
	MOPS de 10 mM, pH 7.2
	0,1 mM EGTA
	3 mM NaN3
	1 mM DTT
Tampão de eluição	0,5 M NaCl	3.1	Mantenha-se no gelo.
	Peptídeo BANDEIRA de 0,5 mg/mL
	MOPS de 10 mM, pH 7.2
	0,1 mM EGTA
	3 mM NaN3
	pH 7.2
Tampão de diálise M5a	500 mM KCl	4.1	Use dHfrio 2O para trazer volume.
	10 mM MgCl2
	MOPS de 10 mM, pH 7.2
	0,1 mM EGTA
	1 mM DTT
Tampão de diálise NM2b	25 mM NaCl	4.1	Use dHfrio 2O para trazer volume.
	10 mM MgCl2
	MOPS de 10 mM, pH 7.2
	0,1 mM EGTA
	1 mM DTT
Tampão de armazenamento NM2b	0,5 M NaCl	5.1	Mantenha-se no gelo.
	MOPS de 10 mM, pH 7.2
	0,1 mM EGTA
	3 mM NaN3

Tabela 1: Tampões utilizados na purificação de proteínas.

Nome tampão	Composição (M5a)	Composição (NM2b)	Passos(s) Usados (M5a/NM2b)	Comentários
Tampão de motilidade 4X (4X MB)	MOPS de 80 mM, pH 7.2	MOPS de 80 mM, pH 7.2		Filtro de vácuo e armazenar em 4°C
	20 mM MgCl2	20 mM MgCl2
	0,4 mM EGTA	0,4 mM EGTA
	pH 7.4	pH 7.4
Tampão de motilidade salgada de 50 mM (50 mM MB)	25% v/v 4X MB	25% v/v 4X MB		Filtro de vácuo e armazenar em 4°C
	50 mM KCl	50 mM NaCl
	Aumente para o volume com dH2O	Aumente para o volume com dH2O
Tampão de motilidade salgada de 500 mM (500 mM MB)	N/A	25% v/v 4X MB		Filtro de vácuo e armazenar em 4°C
		500 mM NaCl
		Aumente para o volume com dH2O
Miosina	0,05-0.1 μM myosin	0,2 μM myosin	4.2/5.2	Mantenha-se no gelo.
	1 mM DTT	1 mM DTT
	Diluir em 50 mM MB	Diluir em 500 mM MB
1 mg/mL Bovine Serum Albumin (BSA)	1 mg/mL BSA	1 mg/mL BSA	4.3/5.3	Mantenha-se no gelo.
	Diluir em 50 mM MB	Diluir em 500 mM MB
	1 mM DTT	1 mM DTT
5 μM F-actin não rotulado em 50 mM MB (ato preto)	5 μM f-actin sem rótulo	5 μM f-actin sem rótulo	4.5/5.5	Mantenha-se no gelo. Tesoura actin por pipetting para cima e para baixo 5-10 vezes, ou usando uma seringa.
	1 μM calmodulin (CaM)	ATP de 1 mM
	ATP de 1 mM	0,2 mM CaCl2
	Diluir em 50 mM MB	1 μm cam
		1-10 nM myosin cadeia de luz quinase (MLCK)
		Diluir em 50 mM MB
MB com 1 mM DTT e 1 mM ATP	1 mM DTT	1 mM DTT	4.6/5.6	Mantenha-se no gelo.
	ATP de 1 mM	ATP de 1 mM
	Diluir em 50 mM MB	Diluir em 50 mM MB
MB com DTT	1 mM DTT	1 mM DTT	4.4, 4.7, 4.9/5.4, 5.7, 5.9	Mantenha-se no gelo.
	Diluir em 50 mM MB	Diluir em 50 mM MB
20 nM Rhodamine-Phalloidin F-actin (Rh-Actin)	20 nM Rhodamine-fhalloidin F-actin	20 nM Rhodamine-fhalloidin F-actin	4.8/5.8	Mantenha-se no gelo. Não vórtice.
	1 mM DTT	1 mM DTT
	Diluir em 50 mM MB	Diluir em 50 mM MB
Final Buffer	50 mM KCl	0,7% de metilcelulose (opcional)	4.10/5.10	Adicione a glicose, a glicose oxidase e a catalase imediatamente antes de realizar o experimento. Mantenha-se no gelo.
	MOPS de 20 mM, pH 7.2	50 mM NaCl
	5 mM MgCl2	MOPS de 20 mM, pH 7.2
	0,1 mM EGTA	5 mM MgCl2
	ATP de 1 mM	0,1 mM EGTA
	50 mM DTT	ATP de 1 mM
	1 μM calmodulin	50 mM DTT
	2,5 mg/mL de glicose	1-10 nM MLCK
	100 μg/mL glicose oxidase	0,2 mM CaCl2
	Catalase de 40 μg/mL	1 μM calmodulin
		2,5 mg/mL de glicose
		100 μg/mL glicose oxidase
		Catalase de 40 μg/mL

Tabela 2: Tampões usados no ensaio de deslizamento.

Nome tampão	Composição (M5a)	Composição (NM2b)	Passos(s) Usados (M5a/NM2b)	Comentários
Tampão de motilidade 4X (4X MB)	MOPS de 80 mM, pH 7.2	MOPS de 80 mM, pH 7.2		Filtro de vácuo e armazenar em 4°C
	20 mM MgCl2	20 mM MgCl2
	0,4 mM EGTA	0,4 mM EGTA
	pH 7.4	pH 7.4
Tampão de motilidade salgada de 50 mM (50 mM MB)	25% v/v 4X MB	25% v/v 4X MB		Filtro de vácuo e armazenar em 4°C
	50 mM KCl	50 mM NaCl
	Aumente para o volume com dH2O	Aumente para o volume com dH2O
Tampão de motilidade salgada de 150 mM (150 mM MB)		25% v/v 4X MB		Filtro de vácuo e armazenar em 4°C
		150 mM NaCl
		Aumente para o volume com dH2O
Miosina		Myosin 30 nM	Ver Receita "Buffer Final" /4.12	Mantenha-se no gelo.
		1 mM DTT
		Diluir em 150 mM MB
2 mg/mL NeutrAvidin	2 mg/mL NeutrAvidin	2 mg/mL NeutrAvidin	3.5/4.8	Mantenha-se no gelo.
	1 mM DTT	1 mM DTT
	Diluir em 50 mM MB	Diluir em 150 mM MB
1 mg/mL de gânbio bovino albumina (BSA)	1 mg/mL BSA	1 mg/mL BSA	3.3/4.6	Mantenha-se no gelo.
	1 mM DTT	1 mM DTT
	Diluir em 50 mM MB	Diluir em 150 mM MB
200 nM rhodamine-phalloidin biotinylated F-actin (bRh-Actin)	200 nM rhodamina-phalloidin biotinylated F-actin	200 nM rhodamina-phalloidin biotinylated F-actin	3.7/4.10	Evite a tesoura não vórtice ou pipetting para cima e para baixo. Para misturar, inverta suavemente.
	1 mM DTT	1 mM DTT
	Diluir em 50 mM MB	Diluir em 150 mM MB
MB com DTT	50 mM DTT	50 mM DTT	3.2, 3.4, 3.6, 3.8/4.5, 4.7, 4.9, 4.11, 4.13	Mantenha-se no gelo.
	Diluir em 50 mM MB	Diluir em 150 mM MB
Final Buffer	50 mM KCl	0,7% de metilcelulose (opcional)	3.9/4.14	Adicione a glicose, a glicose oxidase e a catalase imediatamente antes de realizar o experimento. Mantenha-se no gelo.
	MOPS de 20 mM, pH 7.2	50 mM NaCl
	5 mM MgCl2	MOPS de 20 mM, pH 7.2
	0,1 mM EGTA	5 mM MgCl2
	ATP de 1 mM	0,1 mM EGTA
	50 mM DTT	ATP de 1 mM
	1 μM calmodulin	50 mM DTT
	2,5 mg/mL de glicose	1-10 nM MLCK
	100 μg/mL glicose oxidase	0,2 mM CaCl2
	Catalase de 40 μg/mL	1 μM calmodulin
	10 nM myosin	2,5 mg/mL de glicose
		100 μg/mL glicose oxidase
		Catalase de 40 μg/mL

Tabela 3: Tampões utilizados no ensaio TIRF.

Discussion

Apresentado aqui é um fluxo de trabalho para a purificação e caracterização in vitro de minosina 5a e minosina não-musal 2b. Este conjunto de experimentos é útil para quantificar as propriedades mecanoquímicas de construções purificadas de miose de forma rápida e reprodutível. Embora as duas minodas aqui mostradas sejam apenas dois exemplos específicos das muitas possibilidades, as condições e técnicas podem ser aplicadas, com alguma alfaiataria, à maioria das miosinas e a muitas outras proteínas motoras.

Os protocolos aqui discutidos estão sujeitos a variações dependendo das necessidades individuais do laboratório e experimentos. Por exemplo, como discutido na seção Expressão e Biologia Molecular, as proteínas utilizadas neste artigo foram geradas a partir de uma co-infecção de dois ou mais vírus; no entanto, a expressão proteica bem-sucedida também pode ser alcançada com vetores de várias expressões, como o vetor de dupla expressão p-FastBac ou o sistema de expressão BiGBac⁵³.

Vários fatores podem dificultar a produção bem sucedida da proteína recombinante. Para evitar a degradação da proteína, é imprescindível que cada etapa da purificação da proteína seja concluída na temperatura apropriada, com todas as etapas de centrifugação ocorrendo a 4 °C e todas as outras etapas sendo realizadas no gelo. Bandas em excesso podem ser aparentes no gel do produto de proteína dialisada. Isso pode ser indicativo de degradação ou contaminação. A purificação subsequente por meio da exclusão de tamanho ou cromatografia de troca iônica pode aumentar a pureza das amostras⁵⁴. Para isso, recomenda-se economizar alíquotas em cada etapa do processo de purificação de proteínas para solução de problemas, caso haja um baixo rendimento de minoina ou suspeita de contaminação de proteínas. Às vezes, pode haver vinculação inadequada do lysate à resina na etapa 1.8, o que pode resultar na perda da mísina para o sobrenatante em centrífugas subsequentes. Isso pode ser resolvido variando a duração da ligação de resina durante esta etapa, mesmo deixando-a para amarrar durante a noite, se necessário. Tempos mais longos de incubação introduzem um maior risco de degradação proteica se as proteases contaminantes não forem suficientemente inibidas, e as mioses com regiões proteolíticos sensíveis serão afetadas adversamente. Além disso, a lavagem inadequada da resina antes e depois do uso pode resultar na eluição de um produto proteico indesejado, por isso é imperativo que os protocolos adequados sejam seguidos antes e depois do uso da resina de afinidade FLAG. Se a resina for lavada imediatamente após o uso e armazenada adequadamente, ela poderá ser reutilizada em até 20 vezes.

É importante notar que a degradação da proteína também ocorre durante o estágio de expressão e o encurtamento dos tempos de expressão pode ser vantajoso em termos de degradação, embora isso possa ser em detrimento do rendimento total. Seguir os procedimentos aqui descritos para monitorar a amostra de proteína em diferentes estágios do protocolo (ou seja, antes, durante e depois da purificação) ajudará a determinar as etapas necessárias para a otimização. Para as mioses que resistem repetidamente à expressão e purificação bem sucedidas, problemas comuns podem ser co-expressão com correntes de luz insuficientes ou inadequadas, bem como dobramento inadequado durante a superexpressão. As cadeias de luz apropriadas devem ser selecionadas com base em interações conhecidas quando possíveis e as relações de baculovírus cadeia pesada para cadeia leve devem ser testadas em experimentos de pequena escala para determinar o ideal. Para miosinas que agregam ou produzem pouco ou nenhum produto ativo solúvel, a co-expressão com acompanhantes pode auxiliar na obtenção com sucesso da proteína ativa^54,55.

Os produtos purificados de minosina contêm inevitavelmente uma pequena população de mose danificada, chamada de "cabeças mortas", que podem ser tratadas de duas maneiras. Um método, descrito neste protocolo, envolve fluir sem rótulo, ou "preto", atuar pela câmara no ensaio de filamento de planagem. Posteriormente, a lavagem com ATP faz com que as miosinas funcionais se dissociem do actin preto, enquanto cabeças mortas permanecerão ligadas a este ato sem rótulo devido à sua incapacidade de hidrolisar ATP e devido à sua alta afinidade. Durante a realização da lavagem de actin preto, uma seringa pode ser usada para esculpir a actina efetivamente. Uma tesoura adicional pode ser realizada por vórtice, desde que quaisquer bolhas resultantes sejam removidas por centrifugação. Um método alternativo é de pelotizar seletivamente as cabeças mortas da amostra de mosina misturando mosina com F-actin e Mg-ATP em concentrações de sal alto (0,5 M) e sedimentando em uma ultracentrifuagem de mesa. As mioses capazes de hidrolise ATP nessas condições não permanecem vinculadas ao actin devido à sua baixa afinidade com o actin sob estas altas condições de sal e são encontradas no supernasce, enquanto as cabeças mortas de minos permanecem ligadas ao actin na pelota⁵⁶. Da mesma forma, uma sedimentação com actina e resuspensão da pelota também pode ser usada para remover miosinas que são incapazes de se vincular à actina na ausência de ATP. Note que uma pequena proporção deste tipo de cabeças mortas terá menos impacto sobre esses tipos de ensaios. Ao fazer uma sedimentação e resuspensão sem nucleotídeos seguidos de uma centrifugação e resuspensão vinculadas ao ATP, as miose que são competentes para a liberação de actin-binding e ATP-dependent da actin podem ser isoladas.

Ensaios de motilidade também podem ser modificados de várias maneiras. Por exemplo, no ensaio de filamento de planina actin para o NM2b, o NM2b é fosforilado na câmara através da adição de MLCK, calmodulin, cálcio e ATP na etapa de actin preto, bem como no Buffer Final. No entanto, o NM2b também pode ser fosfoilado em um tubo, antes de realizar o ensaio. Ao fazer isso, a porcentagem de NM2b fosforilado pode ser quantificada executando um gel nativo com um tampão de amostra contendo ureia ou realizando espectrometria de massa^57,58. O efeito da temperatura na atividade da mosina também pode ser investigado. Isso pode ser feito empregando um sistema de aquecimento objetivo no microscópio ou em um recinto ambiental, para que a célula de fluxo seja mantida em temperatura constante. A força iônica é outra consideração importante. Para muitas mioses, a afinidade com a actina e a atividade enzimática serão aumentadas com menor força iônica; para outros, maior força iônica é necessária⁵⁹. Além de fornecer informações valiosas sobre o mecanismo da miosina, diminuir a força iônica pode aumentar a motilidade e tornar a minosina mais acessível à investigação com muitos ensaios. Em contraste, alguns motores exibirão efeitos de amarração eletrostática, o que diminuirá a motilidade em forças iônicas mais baixas. Finalmente, ao avaliar o movimento dos filamentos NM2b, é crucial manter a força iônica dentro de uma faixa estreita (força iônica de 150-200 mM), aproximando-se daqueles encontrados na maioria dos tipos de células. O uso de forças iônicas mais baixas resulta na agregação dos filamentos de miosina, enquanto os filamentos despomerizam em forças iônicas mais altas.

Com muitas mioses, particularmente aquelas com baixas taxas de imposto, as condições do buffer final dado para M5a resultariam em filamentos de actina fluorescentes rotulados apenas vagamente ligados à superfície ou dissociando completamente. Isso resulta em movimentos erráticos que complicam a quantificação. Um movimento de melhor qualidade pode ser obtido com o uso de metilcelulose (0,7%) no Buffer Final. A metilcelulose é um agente de aglomeração viscoso e força os filamentos de actina a permanecer perto da superfície mesmo quando a densidade dos motores de miosina anexada é^{esparsa 60}. Da mesma forma, observou-se que a inclusão de metilcelulose no tampão final do ensaio de motilidade de filamento único é necessária para observar o movimento com NM2a, e o mesmo fenômeno foi relatado para filamentos de mosina muscular lisa^29,61. Isso também aumenta a processividade dos filamentos NM2b. Um efeito colateral potencialmente indesejado do uso de metilcelulose neste ensaio é que as propriedades do agente de aglomeração podem promover a associação lateral de filamentos de miosina em feixes. Alternativas à metilcelulose quando se resolvem problemas com a falta de movimento ou filamentos de actina soltos ligados no ensaio de filamento de actina de planagem são para diminuir a concentração de sal nos tampões de motilidade ou aumentar a densidade da superfície da miosina. Como dito acima, uma alta força iônica nos buffers de motilidade tem sido demonstrada para diminuir a capacidade de algumas miosinas de se ligarem ao ato em^29,34,62.

Outra variação do ensaio de filamento de actina deslizante é o uso de anticorpos para ancorar a miosina na tampa de vidro. Por exemplo, se um GFP estiver presente na extremidade terminal C da construção da minosina, um anticorpo anti-GFP pode ser usado para fixar o GFP-myosin ao deslizamento^{de tampas 36,63,64}. Isso pode auxiliar na obtenção de motilidade bem sucedida em situações em que a geometria do sistema pode dificultar a translocação actin, como no caso de testar braços artificiais ou de alavanca curta^54,64. Além disso, o efeito da carga sobre as velocidades de translocação pode ser investigado no ensaio de filamento de planagem, utilizando proteínas de ligação de actina, como α-actinina ou utrophin^39,50,65. Tal medida pode ser útil para comparar o efeito da carga em um conjunto de miosinas versus a cinética dependente da carga de uma única minosina que pode ser medida usando um ensaio óptico de trapping^66,67. Isso pode ser feito adicionando quantidades crescentes de uma proteína de ligação de actina, juntamente com a mosina na etapa inicial. A proteína de ligação de actina se liga à superfície e exerce uma carga de fricção nos filamentos de actina que estão sendo movidos por miosinas, o que resulta em uma velocidade classificada à medida que a concentração de proteína de ligação de actina na superfície é aumentada³⁹.

O ensaio de motilidade de molécula/conjunto único também pode ser adaptado para investigar o efeito de várias estruturas de actina no movimento da mosina. Por exemplo, em vez de observar o movimento da mosina em cima de filamentos de actina único, pacotes de actina mediados por fascin ou α-actinin podem ser estudados como uma reconstituição in vitro da rede de filamentos actin encontrada nas células^68,69. O efeito de proteínas de ligação de actina, como a tropomyosina, também pode ser estudado^65,70,71,72.

Destaca-se a versatilidade na escolha de um rótulo para o ensaio de motilidade de molécula/conjunto único. Neste relatório, foi utilizado um rótulo GFP tanto no M5a-HMM quanto no NM2b; no entanto, muitos outros rótulos podem ser usados. Exemplos incluem HaloTag ou SNAP-tag, que pode ser geneticamente fundido à minosina e covalentemente ligar um corante sintético. O benefício da tecnologia HaloTag está em sua versatilidade para várias adaptações experimentais, como rotular com cores diferentes ou adicionar uma tag de afinidade biotina^29,73. Além disso, o uso da tecnologia de ponto quântico pode ser empregado para melhorar a resolução do rastreamento de fluorescência de moléculas únicas, que também aborda a limitação do baixo brilho do GFP e a tendência para fotobleaching⁷⁴. As etiquetas podem ser anexadas com sucesso a correntes leves, bem como à corrente pesada^11,75,76.

Para alcançar o sucesso no ensaio de motilidade TIRF de molécula única, um fator-chave é o uso de uma superfície bem bloqueada e funcionalizada. Um método simples para obter bloqueio moderado é usar biotinilado-BSA ligado a uma superfície de nitrocelulose. Embora isso funcione bem o suficiente para caracterizar muitos motores, incluindo o M5a, o nível de ligação inespecífica em tal superfície é proibitivo para reproduzir movimento limpo com amostras como nM2b. Um avanço fundamental nesse sentido foi a transição para superfícies PEGylated dopadas com biotina-PEG para a funcionalização⁷⁷. As superfícies PEG fornecem um nível muito superior de bloqueio de superfície e uma superfície PEGylated livre de defeitos pode permanecer livre de ligação inespecífica por períodos muito longos de tempo. O protocolo específico aqui detalhado permite a produção de superfícies PEG biotiniladas em questão de horas e, se imediatamente armazenadas como descrito, as superfícies podem ser usadas por várias semanas com apenas um declínio marginal na qualidade.

Uma consideração fundamental antes de coletar dados para rastreamento é a taxa de quadros de aquisição. O movimento entre os quadros subsequentes deve ser grande o suficiente para evitar erros de sobresgastramento. Altas taxas de amostragem produzirão velocidades superestimadas devido à divisão dos erros de localização por um pequeno intervalo de tempo e aumentarão o erro aparente da medição. Nos casos em que os dados brutos são muito bem amostrados, os dados podem ser amostrados pegando cada quadro Nth para criar uma nova pilha e considerando a mudança na taxa de quadros que resulta. Os movimentos do subpixel entre os quadros devem ser evitados e são necessários movimentos de várias centenas de nanômetros para obter valores precisos. Em todos os casos em que uma nova amostra está sendo caracterizada, os resultados gerados pela análise automatizada devem ser comparados a um pequeno conjunto de dados de filamentos rastreados manualmente para consistência.

Ao analisar dados de experimentos de motilidade de molécula única, deve-se tomar cuidado ao escolher quais parâmetros medir, como filtrar dados e como encaixar dados. Como dito acima, a taxa de amostragem pode ser um fator importante na análise de dados de velocidade. Para muitas mioses, as corridas processivas serão curtas e bem aproximadas por uma linha reta. Nesses casos, a distância de ponto final da pista pode fornecer uma boa medida do comprimento da corrida e isso pode ser dividido pela duração da pista para produzir uma boa estimativa de velocidade. Nos casos em que as faixas são muito longas e seguem caminhos curvados em torno de filamentos dobrados, esse tipo de análise produzirá resultados imprecisos e uma distância total percorrida deve ser utilizada, utilizando uma taxa de aquisição que permite que os pontos de localização sucessivos sejam suficientemente bem espaçados para evitar erros de superamostração conforme descrito acima, ao mesmo tempo em que estarmos próximos o suficiente para que a distância de linha reta entre eles permaneça uma boa aproximação da curva entre esses pontos. Além disso, para proteínas motoras com comprimentos de longo prazo em relação ao comprimento da pista, estatísticas adicionais como o estimador Kaplan-Meier devem ser feitas ao calcular os comprimentos de corrida⁷⁸. O mesmo acontece com situações em que o fotobleaching é suficientemente provável de ocorrer antes do fim de uma execução processiva. Outro fenômeno que pode ser observado em estudos de fluorescência de moléculas únicas é o fotoblinking, no qual fluoroforos alternam entre o estado ligado e desligado rapidamente e parecem piscar. Isso normalmente não ocorre nesses experimentos de motilidade; no entanto, se isso ocorrer, a intensidade do laser e os tempos de exposição podem ser diminuídos, o que deve minimizar o efeito. Vários produtos químicos, incluindo β-mercaptoetanol, Trolox, ciclooctateraeno, n-propyl gallate, 4-nitrobenzyl álcool, e 1,4-diazabicyclo[2.2.2]octano podem ser utilizados para mitigar isso também⁷⁹.

Em resumo, este artigo apresenta protocolos detalhados que são robustos em sua capacidade de quantificar propriedades mecanoquímicas, como velocidade de translocação de actin, velocidade de translocação de miosina e comprimento de execução de miosina. Estes ensaios são reprodutíveis e podem ser usados para determinar a qualidade da minosina purificada mesmo em situações em que as características motile não são o objetivo final específico do estudo. Além disso, mudanças como pH, temperatura e reguladores químicos podem ser introduzidas a esses ensaios para examinar como a mecanoquímica da minosina estudada é afetada. Juntos, os ensaios de planagem de actin e motilidade invertida podem permitir uma melhor compreensão do comportamento do conjunto de miosina e variações intermoleculares na mecânica motora molecular e cinética. Os ensaios baseados em microscopia de fluorescência descritos aqui apoiam a abordagem reducionista da pesquisa citoesqueletal e podem ser uma ferramenta poderosa para entender a dinâmica proteína-proteína in vitro. Juntos, os dados coletados desses experimentos altamente controlados podem ser usados para aconselhar mecanobiologistas de comportamentos-chave da actomyosina que podem ser relevantes no nível biológico celular, e além.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 mL Syringe	BD	309628
2 M CaCl2 Solution	VWR	10128-558
2 M MgCl2 Solution	VWR	10128-298
27 Gauge Needle	Becton Dickinson	309623
5 M NaCl Solution	KD Medical	RGE-3270
Acetic Acid	ThermoFisher Scientific	984303
Amyl Acetate	Ladd Research Industries	10825
Anti-FLAG M2 Affinity Gel	Millipore Sigma	A2220	https://www.sigmaaldrich.com/content/dam/sigma-aldrich/docs/Sigma/Bulletin/a2220bul.pdf
ATP	Millipore Sigma	A7699
Biotinylated G-Actin	Cytoskeleton, Inc.	AB07
Bovine Serum Albumin	Millipore Sigma	5470
bPEG-silane	Laysan Bio, Inc	Biotin-PEG-SIL-3400-1g
Bradford Reagent Concentrate	Bio-Rad	5000006
Calmodulin		PMID: 2985564
Catalase	Millipore Sigma	C40
Cell Line (Sf9) in SF-900 II SFM	ThermoFisher Scientific	11496015	http://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/bevtest.pdf https://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/bactobac_man.pdf
Circular Filter Paper - Gliding Assay	Millipore Sigma	WHA1001125
Circular Filter Paper - Inverted Assay	Millipore Sigma	WHA1001090
cOmplete, EDTA-Free Protease Inhibitor Tablets	Millipore Sigma	5056489001	This should be stored at 4 °C. The tablets can be used directly or can be reconstituted as a 25x stock solution by dissolving 1 tablet in 2 mL of distilled water. The resulting solution can be stored at 4 °C for 1-2 weeks or at least 12 weeks at -20 °C.
Concentrating Tubes (100,000 MWCO)	EMD Millipore Corporation	UFC910024	The MWCO of the tube is not necessarily "one size fits all," as long as the MWCO is less than the total molecular weight of the protein being purified. The NM2b herein was concentrated with a 100,000 MWCO tube and the M5a was concentrated with a 30,000 MWCO tube.
Coomassie Brilliant Blue R-250 Dye	ThermoFisher Scientific	20278
Coverslip Rack	Millipore Sigma	Z688568-1EA
Coverslips: Gliding Acting Filament Assay	VWR International	48366-227
Coverslips: Inverted Motility Assay	Azer Scientific	ES0107052
Dialysis Tubing (3500 Dalton MCWO)	Fischer Scientific	08-670-5A	The diameter of the dialysis tube can vary, but the MWCO should be the same. The NM2b used herein was dialyzed in an 18 mm dialysis tube. The tubes can be stored in 20% alcohol solution at 4 °C.
DL-Dithiothreitol	Millipore Sigma	D0632
Double-Sided Tape	Office Depot	909955
DYKDDDDK Peptide	GenScript	RP10586	This can be dissolved in a buffer containing 0.1 M NaCl, 0.1 mM EGTA, 3 mM NaN3, and 10 mM MOPS (pH 7.2) to a final concentration of 50 mg/mL. This can be stored at -20 °C as 300 µL aliquots.
EGTA	Millipore Sigma	E4378
Elution Column	Bio-Rad	761-1550	These can be reused. To clean, rinse the column with 2-3 column volumes of PBS and distilled water. Chill the column at 4° C before use.
Ethanol	Fischer Scientific	A4094
G-actin		PMID: 4254541	G-actin stock can be stored at 200 μM in liquid N2.
Glucose	Millipore Sigma	G8270
Glucose Oxidase	Millipore Sigma	G2133
Glycine Buffer Solution, 100 mM, pH 2-2.5, 1 L	Santa Cruz Biotechnology	sc-295018
HaloTag	Promega	G100A
HCl	Millipore Sigma	320331
KCl	Fischer Scientific	P217-500
Large-Orifice Pipet Tips	Fischer Scientific	02-707-134
Leupeptin Protease Inhibitor	ThermoFisher Scientific	78435
Mark12 Unstained Standard Ladder	ThermoFisher Scientific	LC5677
Methanol	Millipore Sigma	MX0482
Methylcellulose	Millipore Sigma	M0512
Microscope Slides	Fischer Scientific	12-553-10
MOPS	Fischer Scientific	BP308-100
mPEG-silane	Laysan Bio, Inc	MPEG-SIL-2000-1g
Myosin Light Chain Kinase		PMID: 23148220	FLAG-tagged MLCK can be purified the same way that the FLAG-tagged myosin was purified herein.
NaN3	Millipore Sigma	S8032
NeutrAvidin	ThermoFisher Scientific	31050
Nitrocellulose	Ladd Research Industries	10800
NuPAGE 4 to 12% Bis-Tris Mini Protein Gel, 15-well	ThermoFisher Scientific	NP0323PK2
NuPAGE LDS Sample Buffer (4X)	ThermoFisher Scientific	NP0007
Phosphate-Buffered Saline, pH 7.4	ThermoFisher Scientific	10010023
PMSF	Millipore Sigma	78830	PMSF can be made as a 0.1 M stock solution in isopropanol and stored in 4 °C. Isopropanol addition results in crystal precipitation, which can be dissolved by stirring at room temperature. Immediately before use, PMSF can be added dropwise to a rapidly stirring solution to a final concentration of 0.1 mM.
Razor Blades	Office Depot	397492
Rhodamine-Phalloidin	ThermoFisher Scientific	R415	Stock can be diluted in 100% methanol to a final concentration of 200 μM.
Sf9 Media	ThermoFisher Scientific	12658-027	This should be stored at 4° C. Its shelf life is 18 months from the date of manufacture.
Tissue Culture Dish - Gliding Assay	Corning	353025	Each tissue culture dish can hold approximately nine coverslips.
Tissue Culture Dish - Inverted Assay	Corning	353003	Each tissue culture dish can hold approximately four coverslips.
Smooth-sided 200 µL Pipette Tips	Thomas Scientific	1158U38
EQUIPMENT
Centrifuge	ThermoFisher Scientific	75006590
Microscope	Nikon	Model: Eclipse Ti with H-TIRF system with 100x TIRF Objective (N.A. 1.49)
Microscope Camera	Andor	Model: iXon DU888 EMCCD camera (1024 x 1024 sensor format)
Microscope Environmental Control Box	Tokai HIT	Custom Thermobox
Microscope Laser Unit	Nikon	LU-n4 four laser unit with solid state lasers for 405nm, 488nm, 561nm,and 640nm
Mid Bench Centrifuge	ThermoFisher Scientific	Model: CR3i
Misonix Sonicator	Misonix	XL2020
Optima Max-Xp Tabletop Ultracentrifuge	Beckman Coulter	393315
Plasma-Cleaner	Diener electronic GmbH + Co. KG	System Type: Zepto
Sonicator Probe (3.2 mm)	Qsonica	4418
Standard Incubator	Binder	Model: 56
Waverly Tube Mixer	Waverly	TR6E
SOFTWARE
ImageJ FIJI	https://imagej.net/Fiji/Downloads
FAST (Version 1.01)	http://spudlab.stanford.edu/fast-for-automatic-motility-measurements	FAST is available for Mac OSX and Linux based systems.
Image Stabilizer Plugin	https://imagej.net/Image_Stabilizer
ImageJ TrackMate	https://imagej.net/TrackMate
Imaging Software	NIS Elements (AR package)
	http://www.cs.cmu.edu/~kangli/code/Image_Stabilizer.html
	File:TrackMate-manual.pdf
	https://github.com/turalaksel/FASTrack
	https://github.com/turalaksel/FASTrack/blob/master/README.md