Summary
Detta protokoll presenterar ett snabbt och användbart verktyg för att utvärdera rollen av ett protein med okarakteriserad funktion i alternativ splitsreglering efter kemoterapeutisk behandling.
Abstract
mRNA-bearbetning innebär flera samtidiga steg för att förbereda mRNA för översättning, såsom 5'capping, poly-A tillägg och splitsning. Förutom konstituerande splitsning tillåter alternativ mRNA splitsning uttryck av multifunktionella proteiner från en gen. Eftersom interactomestudier i allmänhet är den första analysen för nya eller okända proteiner, är associeringen av beteproteinet med splitsfaktorer en indikation på att det kan delta i mRNA-skarvningsprocess, men att avgöra i vilket sammanhang eller vilka gener som regleras är en empirisk process. En bra utgångspunkt för att utvärdera denna funktion är att använda det klassiska minigeneverktyget. Här presenterar vi adenoviral E1A minigene användning för utvärdering av alternativa splitsning förändringar efter olika cellulära stress stimuli. Vi utvärderade skarvningen av E1A minigene i HEK293 stabilt överuttryckande Nek4 protein efter olika stressande behandlingar. Protokollet omfattar E1A minigene transfection, cell behandling, RNA extraktion och cDNA syntes, följt av PCR och gel analys och kvantifiering av E1A skarvade varianter. Användningen av denna enkla och väletablerade metod i kombination med specifika behandlingar är en tillförlitlig utgångspunkt för att belysa cellulära processer eller vilka gener som kan regleras genom mRNA-splitsning.
Introduction
Splitsning är bland de viktigaste stegen i eukaryota mRNA-bearbetning som sker samtidigt till 5'mRNA-kapning och 3'mRNA polyadenylation, bestående av intronborttagning följt av exon junction. Erkännandet av skarvplatserna (SS) av skapliceosomen, ett ribonukleoproteinkomplex som innehåller små ribonukleoproteiner (snRNP U1, U2, U4 och U6), små RNAs (snRNAs) och flera regulatoriskaproteiner 1 är nödvändigt för skarvning.
Förutom intronborttagning (konstituerande skarvning), i eukaryoter, kan introner behållas och exoner kan uteslutas, vilket konfigurerar processen som kallas mRNA-alternativ splitsning (AS). Den alternativa för-mRNA splitsning utökar kodningskapaciteten för eukaryotic genom som möjliggör produktion av ett stort och varierat antal proteiner från ett relativt litet antal gener. Det uppskattas att 95-100% av mänskliga mRNAs som innehåller mer än en exon kan genomgå alternativskarvning 2,3. Detta är grundläggande för biologiska processer som neuronal utveckling, apoptosaktivering och cellulärstressrespons 4, vilket ger organismalternativen för att reglera cellens funktion med samma repertoar av gener.
De maskiner som är nödvändiga för alternativ skarvning är desamma som används för konstituerande skarvning och användningen av SS är den viktigaste avgörande faktorn för alternativ skarvförekomst. Konstituerande skarvning är relaterad till användningen av starka skarvningsplatser, som vanligtvis är mer lika konsensusmotiv för skapliceosomigenkänning5.
Alternativa exoner känns vanligtvis igen mindre effektivt än konstituerande exons en gång dess cis-reglerande element, sekvenserna i 5'SS och 3'SS flankering dessa exons, visar en sämre bindande kapacitet till skarveosome. mRNA innehåller också regioner som kallas förstärkare eller ljuddämpare i exoner (exonic skarv förstärkare (EES) och exonic skarv ljuddämpare (ESSs)) och introner (intronic skarv förstärkare (ISE) och intronic splitsande ljuddämpare (ISSs)) som förbättrar eller undertrycker exon användning,respektive 5. Dessa sekvenser känns igen av transreglerande element eller splitsfaktorer (SF). SFs representeras huvudsakligen av två familjer av proteiner, serin/arginin rika splitsfaktorer (SRSFs) som binder till EES och familjen heterogena nukleära ribonukleoproteiner (hnRNPs) som binder till ESSssekvenser 5.
Alternativ splitsning kan moduleras genom fosforylering/ defosforylering av transfaktorer som ändrar interaktionspartners och cellulär lokalisering av skarvfaktorer6,7,8. Att identifiera nya tillsynsmyndigheter för skarvningsfaktorer kan ge nya verktyg för att reglera skarvning och följaktligen vissa cancerbehandlingar.
Anufrieva et al.9, i en mRNA microarray genuttryck profil, observerade konsekventa förändringar i nivåerna av skarveosomal komponenter i 101 cellinjer och efter olika stress villkor (platina-baserade läkemedel, gamma bestrålning, topoisomerashämmare, tyrosin kinashämmare och taxaner). Förhållandet mellan splitsmönster och kemoterapi effekt har redan visats i lungcancer celler, som är kemoterapi resistenta, visar förändringar i caspase-9 varianter hastighet10. HEK293 celler behandlade med kemoterapeutiska panelen visar förändringar i splitsning med en ökning av pro-apoptotiska varianter. Gabriel et al.11 observerade förändringar i minst 700 händelser av skarvning efter cisplatin behandling i olika cellinjer, påpekar att skarvvägar är cisplatin-drabbade. Splitsande modulatorer har redan visat anti-tumoral aktivitet, visar att splitsning är viktigt för tumoral utveckling och, främst, kemoterapi svar12. Därför är det mycket viktigt att karakterisera nya proteiner som reglerar splitsning efter cellulära stressfaktorer, som kemoterapeuter, för att upptäcka nya behandlingsstrategier.
Ledtrådarna till alternativ splitsreglering från interactome-studier, särskilt viktiga för att karakterisera funktioner hos nya eller okarakteriserade proteiner, kan kräva ett mer allmänt och enkelt tillvägagångssätt för att verifiera proteinets verkliga roll i AS. Minigener är viktiga verktyg för analys av den allmänna rollen av ett protein som påverkar splitsreglering. De innehåller segment från en gen av intresse som innehåller alternativt skarvade och flankerande genomiska regioner13. Med hjälp av ett minigeneverktyg kan analysen av skarv in vivo med flera fördelar såsom längden på minigenen som är liten och därför inte är en begränsning av förstärkningsreaktionen; Samma minigen kan utvärderas i olika cellinjer. Alla cellulära komponenter, huvudsakligen deras reglerande post-translationella modifiering (fosforylering och förändringar i cellutrymmen) finns och kan behandlas13,14. Dessutom kan förändringar i alternativa splitsmönster observeras efter cellulär stress och, användning av ett minigene-system, gör det möjligt att identifiera den väg som moduleras av olika stimuli.
Det finns flera minigene-system som redan beskrivs som är specifika för olika typer av skarvningshändelser13,14, men som en preliminär analys är minigenen E1A15 ett mycket väletablerat alternativt skarvreportersystem för studier av 5:s SS-urval in vivo. Från endast en gen, E1A, produceras fem mRNAs genom alternativ skarvning baserat på val av tre olika 5′ skarvplatser och av en större eller en mindre 3′ skarvplats16,17,18. Uttrycket av E1A-varianter ändras beroende på perioden för Adenoviral infektion19,20.
Vi har tidigare visat att både Nek4-isoformer interagerar med splitsfaktorer som SRSF1 och hnRNPA1 och medan isoform 2 ändrar minigene E1A alternativ skarvning, har isoform 1 ingen effekt i det21. Eftersom isoform 1 är den vanligaste isoformen och förändrar kemoterapiresistens och DNA-skaderespons utvärderar vi om det kan förändra minigen E1A alternativ splitsning i ett stresstillstånd.
Minigene-analys är en enkel, billig och snabb metod, eftersom den bara behöver RNA-extraktion, cDNA-syntes, förstärkning och agarosgelanalyser, och kan vara ett användbart verktyg att utvärdera eftersom en möjlig effekt på alternativ skarvning av ett protein av intressen tills effekten av olika behandlingar på cellulära alternativa splitsmönster.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Plätera celler
OBS: I detta beskrivna protokoll användes HEK293 stabila cellinjer, som tidigare genererats för stabilt inducerbart uttryck av Nek4,21, men samma protokoll är lämpligt för många andra cellinjer, såsom HEK29322, HeLa23,24,25,26, U-2 OS27, COS728, SH-SY5Y29. Uttrycksmönstret för minigene E1A-isoformer under basala förhållanden varierar mellan dessa celler och bör karakteriseras för varje tillstånd. Det här protokollet är inte begränsat till stabila cellinjer. Det vanligaste tillvägagångssättet vid utvärdering av kandidatprotein är genom övergående samtransfection av att öka sin mängd med fast mängd av minigen. Samma protokoll är lämpligt för knockoutceller.
- Plåtceller med hänsyn till fordon, oövers smittade och GFP-kontroller.
- Kultur HEK293 celler med stabil uttryck för genen av intresse för Dulbeccos modifierade örn medium (DMEM) kompletteras med 10% av fetala nötkreatur serum (FBS), 4,5 g/L glukos, 4 mM L-glutamin och bibehålla med 100 μg/ml hygromycin B, på vävnadskulturbehandlade plattor vid 37 °C i 5% CO2 och en fuktad atmosfär.
- Dela celler med 0,25% trypsin-EDTA. Plätera 3 x 105 celler i 6-brunnsplattor och inkubera dem i 24 h vid 37 °C i 5% CO2.
OBS: För transfektion måste cellerna vara 70-80% konfluenta för att minska celldöden efter transfekten.
2. Celltransfektion
OBS: 1-2 μg pMTE1A minigene plasmid användes här, men DNA-mängden, liksom uttryckstiden, måste hållas minimal för att undvika toxicitet. Till exempel observerades hög toxicitet i HeLa-celler efter 30 h transfection med 1 μg pMTE1A DNA. För den transfection som beskrivs här användes ett lipidbaserat transfection reagens
- Kontrollera cellkonfluensen 24 timmar efter plätering och transfektera HEK293 stabila celler endast när 70-80% sammanflöde.
- Ta försiktigt bort cellkulturmediet med en pipett i stället för att använda ett vakuumpumpsystem. Tillsätt sedan försiktigt 2 ml komplett DMEM-medium utan antibiotika och lägg tillbaka plattan i inkubatorn.
- Förbered ett rör med transfectionbufferten (200 μL/brunn), tillsätt 2 μg pMTE1A DNA, virvel och tillsätt sedan 2 μL transfection reagens. Virvel igen och inkubera i 10 min vid rumstemperatur.
- Ta bort plattorna från inkubatorn och tillsätt försiktigt transfectionblandningen droppvis.
- Till HEK293 stabila celler, tillsätt tetracyklin (0,5 μg/ml) för Nek4 uttryck induktion 6 h efter transfection. Medelförändring är inte nödvändigt.
OBS: Volymer/belopp som beskrivs i det här avsnittet är för en brunn. Förbered blandningen för alla brunnar som används i experimentet i samma rör. - Förbered en brunn för att transfektera med EGFP, eller en annan fluorofor som uttrycker plasmid för att uppskatta transfection effektivitet. Bättre resultat kan observeras med transfection effektivitet på minst 40%, men goda prestanda med lägre transfection effektivitet observerades tidigare.
- Vid användning av samtransfektion (intresseprotein och minigene) håll en brunn med icke-transfekterade celler för att undvika att få resultat från endogen mRNA. När det gäller E1A uttrycker HEK293-celler redan E1A-genen30.
3. Förbereda drogerna
OBS: Tid och koncentration av behandling valdes baserat på litteraturresultat, som pekar på förändringar i alternativ splitsning för vissa gener.
- Utför en dosresponskurva innan du påbörjar analysen för att bestämma den minimala koncentrationen till alternativ splitsinduktion utan effekt i cellens livskraft.
- Förbered en Paklitaxel-stamlösning vid 5 mM koncentration i etanol. Den slutliga koncentrationen är 1 μM. Håll vid -20 °C. Använd 0,02 % etanol som fordonsstyrning.
- Bered en cisplatinlösning genom att späda i 0,9% NaCl vid cirka 0,5 mg/ml (1,66 mM). Skydda mot ljus, virvel och inkubera i ett termalbad, 37 °C i 30 min. Den slutliga koncentrationen är 30 μM. Förbered färsk eller förvara vid 2-10 °C i tills en månad.
OBS: Alla droger måste skyddas från ljuset.
4. Cellbehandling och insamling
OBS: HEK293 stabila celler samlades in 48 h efter transfection och för detta behandlades 24 h efter transfection eftersom den högsta Nek4 uttryck nivå uppnås inom 48 h. Höga nivåer av 13S isoform uttryck (fram till 90%) observerades dock vid denna tidpunkt. För att minska andelen 13S isoform, försök att behandla och samla celler 30 h efter transfection maximalt.
- Använd RNA/DNase gratis tips och rör. Utför total RNA-extraktion med fenol-kloroform reagens enligt tillverkarens rekommendation.
- 24 timmar efter transfektionen, kontrollera cellmorfologi och transfektionseffektivitet med hjälp av ett fluorescerande mikroskop.
- Ta bort cellkulturmediet, använd helst en pipett istället för ett vakuumpumpsystem. Lägg sedan till cellodlingsmediet med kemoterapeuterna i den tidigare beskrivna slutliga koncentrationen.
- Inkubera vid 37 °C, 5% CO2 för 18 - 24 h.
- Samla RNA genom att kassera cellkulturmediet i en behållare och tillsätt 0,5 - 1 ml RNA-extraktionsreagens direkt till brunnen. Om brunnar är mycket konfluenta, använd 1 ml RNA-extraktionsreagens för att förbättra RNA-kvaliteten.
- Homogenisera med pipetten och överför till ett 1,5 ml centrifugeringsrör. Vid denna tidpunkt kan protokollet pausas genom att lagra prover vid -80 °C eller omedelbart gå vidare till RNA-extraktionen.
VARNING: Det fenolbaserade reagenset för RNA-extraktion är giftigt och alla procedurer bör utföras i en kemisk rökhuv och restprodukterna kasseras på rätt sätt.
5. RNA-extraktion och cDNA-syntes
- Tina proverna i en rökhuv och inkubera i 5 minuter vid rumstemperatur. Tillsätt 0,1 -0,2 ml kloroform och omrör kraftigt.
- Inkubera i 3 minuter vid rumstemperatur.
- Centrifugera i 15 min vid 12 000 x g och 4 °C.
- Samla den övre vattenfasen och överför till ett nytt 1,5 ml centrifugeringsrör. Samla in cirka 60% av den totala volymen; Samla dock inte in DNA eller den organiska (nedre) fasen.
- Tillsätt 0,25 - 0,5 ml isopropanol och agitera genom inversion 4 gånger. Inkubera i 10 minuter vid rumstemperatur.
- Centrifug vid 12 000 x g i 10 min, vid 4 °C och kassera supernaten.
- Tvätta RNA-pelleten två gånger med etanol (75% i diethylpyrocarbonat (DEPC)-behandlat vatten). Centrifug vid 7 500 x g i 5 min och kassera etanolen.
- Ta bort överflödig etanol genom att vända röret på ett handdukspapper och lämna sedan röret öppet inuti en rökhuv för att delvis torka pelleten i 5 - 10 min.
- Återanvänd RNA-pelleten i 15 μL DEPC-behandlat vatten.
- Kvantifiera totalt RNA med hjälp av absorbans vid 230 nm, 260 nm och 280 nm för att verifiera RNA-kvalitet.
- För att verifiera den totala RNA-kvaliteten, kör en 1% agarosgel förbehandlad med 1,2% (v/v) av en 2,5% natriumhypokloritlösning i 30 min31.
- Utför cDNA-syntes med 1-2 μg totalt RNA.
- Pipett RNA, 1 μL oligo-dT (50 μM), 1 μL dNTP (10 mM) och utgör volymen till 12 μL med nukleasfritt vatten. Inkubera i termocyklisten i 5 min vid 65 °C.
- Ta bort prover från termocyklisten för att svalna och förbereda reaktionsblandningen: 4 μL omvänd transkriptasbuffert, 2 μL dithiothreitol (DTT) och 1 μL ribonukleashämmare. Inkubera vid 37 °C i 2 min.
- Tillsätt 1 μL termostabil omvänd transkriptas. Inkubera vid 37 °C i 50 min och inaktivera enzymet vid 70 °C i 15 minuter.
OBS: CDNA kan förvaras vid -20 °C i flera veckor. Utför en icke-omvänd transkription (NRT) kontroll för genomisk förorening från förmodade intron-retention händelser diskriminering.
6. pMTE1A minigene PCR
- Utför PCR med reaktionskompositionen (1,5 mM MgCl2,0,3 mM dNTP-blandning, 0,5 μM av varje primer, 2,5 U av en varmstartad Taq-polymeras och 150 ng cDNA) med följande förhållanden:
94 °C i 2 min, 29 cykler på: 94 °C i 1 min, 50 °C i 2 min, 72 °C i 2 min, 72 °C i 10 min. - Ladda 20-25 μL pcr-produkten i en 3% agarosgel som innehåller nukleinsyrafläck och kör vid 100 V i cirka 1 timme.
7. Analys av gelén med hjälp av en bildbehandlings- och analysprogramvara32
- Efter körningen, fotografera gelén (med hjälp av ett gelavbildningssystem) och undvik eventuell bandmättnad och kvantifiera banden med hjälp av en bildbehandlingsprogramvara.
- För kvantifiering överväga banden på ~ 631 bp, ~ 493 bp och ~ 156 bp för att motsvara isoformerna 13S, 12S respektive 9S.
- Öppna bildfilen som hämtats från bildförvärvssystemet på programvarans Arkiv-meny. Konvertera till gråskala, justera ljusstyrka och kontrast och ta bort avvikande ljud om det behövs.
- Rita en rektangel runt det första körfältet med verktyget Rektangelmarkering och markera den via | Geler | Välj kommandot First Lane eller genom att trycka på kortkommandot för det.
- Använd musen för att klicka och hålla ned i mitten av rektangeln på det första körfältet och dra den över till nästa körfält. Gå till Analysera | Geler | Välj Nästa körfälteller tryck på den tillgängliga genvägen. Upprepa det här steget till alla återstående körfält.
- När alla körfält har markerats och numrerats går du till Analysera | Geler | Plot Lanes för att rita en profil tomt i varje körfält.
- Med markeringsverktyget för rak linje ritar du en linje över basen för varje topp som motsvarar varje band och lämnar bakgrundsljudet borta. När alla toppar, från varje körfält, har stängts av väljer du trollstavsverktyget och klickar inuti varje topp. För varje topp som markeras bör mätningar dyka upp i resultatfönstret som visas.
- Summera intensiteten från alla tre banden för varje prov och beräkna procentsatsen för varje isoform i förhållande till totalsumman.
- Rita procentsatserna för varje isoform eller skillnaderna i procent i förhållande till obehandlade prover.
OBS: Se till att summan av tre E1A-varianter måste vara lika med 100%.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En 5' skarv platser analys med hjälp av E1A minigene utfördes för att utvärdera förändringar i splitsning profil i celler efter kemoterapi utställning. Nek4 - isoform 1 i AS reglering i HEK293 stabila celler efter paklitaxel eller cisplatin behandling utvärderades.
Adenoviral E1A-regionen ansvarar för produktionen av tre huvudsakliga mRNAs från en RNA föregångare på grund av användningen av olika skarv givare. De delar vanliga 5' och 3' termini men skiljer sig åt i storleken på sina strukna introner. Adenoviral E1A mRNAs namnges enligt deras sedimenteringskoefficienter, 13S, 12S och 9S. Under den tidiga fasen av adenovirusinfektion (cirka 7 h) produceras proteiner som är viktiga för att förbereda den infekterade cellen för viral DNA-replikation (13S - 723 aa och 12S - 586 aa) och i den sena fasen (cirka 18 h) förutom dessa produceras ett litet protein (9S -249 aa)20. Med hjälp av en plasmid som innehåller minigen från E1A kan effekten på alternativ skarvning observeras i celler efter transfekten som utvärderar andelen mRNA från varje producerad isoform: 13S: 631 bp, 12S: 493 bp och 9S 156 bp (Figur 1A och B).
Basalt uttryck för E1A isoforms varianter beror på cellinje och tid för E1A uttryck. Det observerades att HEK293-stabil cellinje (HEK293-Flag) eller HEK293 rekombinas innehållande plats (HEK293-FRT - den ursprungliga cellinjen) visar ett högre uttryck på 13S i jämförelse med HeLa-celler (HeLa-PLKO) som visar liknande nivåer på 13S och 12S isoformer efter 48 h E1A-uttryck (Figur 1C och D).
Den höga nivån av 13S uttryck observeras i HEK293 stabila celler minskas avsevärt under kortare tider av E1A uttryck (cirka 30 h). Andelen (%) på 13S:12S:9S vid 30 h respektive 48 h är 60:33:7 respektive 80:15:5 (icke-representerade data). Av denna anledning är det viktigt att karakterisera den basala cellulära minigene E1A-skarvprofilen innan experimenten påbörjas.
Celler som exponerats för cisplatin visade en förändring i 5 SS skarvning urval gynnar 12S uttryck (en ökning med cirka 15% jämfört med obehandlade celler). Denna effekt observerades i HEK293 stabilt uttrycker Flagga tom vektor samt isoform 1 av Nek4. När större förändringar observeras i uttrycksprocenten representerar ett diagram med procentsatser tydligt resultaten (figur 2).
När man jämför två villkor (Flag och Nek4 överuttryck) som svarar på en behandling, vanligtvis det bästa sättet att representera data är att rita skillnaderna på ett diagram, eftersom den basala uttrycksnivån kan vara annorlunda, och procentsatserna kommer inte att återspegla den verkliga effekten av behandlingen. Detta kan observeras i figur 3. Förändringar i AS efter paklitaxel behandling var mycket diskret, men anvisningarna för ändringarna var motsatsen i Flag och Nek4 uttrycker celler.
Trots små förändringar efter behandlingen var resultaten konsekventa, vilket indikerar att paklitaxelbehandlingen leder till en minskning av 13S-isoform, med en ökning av 12S och 9S i Flag som uttrycker celler, medan, å andra sidan, i Nek4 uttrycker celler, observeras motsatt effekt.
Bild 1:Minigene E1A skarvmönster beror på cellinjen. A) Schematisk representation av minigene E1A splitsplatser. Pilarna anger primer glödgning regionen för minigene E1A isoforms förstärkning. B) Isoformer som genereras av alternativ skarvning av minigene E1A. C) HEK293 stabilt uttrycker Flagga tom vektor (HEK293 -Flag), HeLa transfected med PLKO vektor (HeLa - PLKO) eller, HEK293 rekombinas-innehållande platser (från vad HEK293 stabilt uttrycker Flagga eller Nek4.1 genererades - HEK293-FRT) transfected med pMTE1A plasmid. 48h efter transfection totala RNA isolerades och E1A isoformer separerades i agarose gel (D). Diagram som jämför andelen 13S-, 12S- och 9S-isoform i HEK293-Flag- och HeLa-PLKO-celler under basala förhållanden. Data från tre oberoende experiment. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 2: Effekt av Cisplatinbehandling i minigene E1A skarvmönster. HEK293 stabilt uttrycker Flagga tom vektor (Flagga) eller Nek4.1 Flagga taggen smält, transfected med pMTE1A plasmid. Sex timmar efter transfection tetracyklin lades till proteiner uttryck induktion. 24 h till 48 h ersattes cellkulturmediet för medium som innehåller 30 μM Cisplatin. Efter 24 h inkubation extraherades totala RNA och produkterna av PCR separerades vid 3% agarose gel. A) Dominerande minigene E1A isoformer avbildas. Diagram B-D representerar % av varje isoform i förhållande till summan av tre varianter (13S, 12S och 9S). I Epresenteras skillnaden i uttrycksprocent för varje isoform i förhållande till fordonets (medel) kontroll. Grafer presenteras som medelvärdet och SEM för tre oberoende experiment. * p< 0,05, ** p<0,01 i oparat t-test. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 3:Effekt av Paklitaxelbehandling i minigene E1A skarvmönster. HEK293 stabilt uttrycker Flagga tom vektor (Flagga) eller Nek4.1 Flagga smält, transfected med pMTE1A plasmid. Sex timmar efter transfection tetracyklin lades till proteiner uttryck induktion. 24 timmar till 48 timmar ersattes cellkulturmediet med medium som innehöll 1 μM Paklitaxel eller etanol (0, 02%) som används som fordonsstyrning. Efter 24 h inkubation extraherades totala RNA och produkterna av PCR separerades vid 3% agarose gel. A) Dominerande isoformer avbildas. Diagram B-D representerar % av varje isoform i förhållande till summan av tre varianter (13S, 12S och 9S). I Epresenteras skillnaden i uttrycksprocenten för varje isoform i förhållande till fordonets (etanol)kontroll. Grafer presenteras som medelvärdet och SEM för tre oberoende experiment. * p< 0,05 i oparat t-test. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Minigener är viktiga verktyg för att bestämma effekterna i globala alternativa skarvningar in vivo. Adenoviral minigene E1A har använts framgångsrikt i årtionden för att utvärdera proteinernas roll genom att öka mängden av dessa icellen 13,14. Här föreslår vi minigene E1A användning för utvärdering av alternativ splitsning efter kemoterapeutisk exponering. En stabil cellinje som uttrycker Nek4 isoform 1 användes, undvika artefakter av överuttryck orsakas av övergående transfection. Isoform 1 av Nek4 visade inte effekt i minigen E1A alternativ splitsning i basala förhållanden21, men har många skarv relaterade interactorer, därför, så att vi kan utvärdera den specifika effekten av kemoterapeutisk behandling i E1A alternativ splitsning i dessa celler.
Trots sin låga känslighet, främst jämfört med radioaktiva metoder, är den metod som beskrivs här enkel och kräver inte speciella reagenser eller laboratorieförhållanden. Det är dock viktigt att notera att minigen E1A är en global reporter av 5 SS-val, även om 3: s SS-val kan utvärderas med detta protokoll måste den specifika minigene-reporternanvändas 14,33,34. Dessutom kan resultaten påverkas av cellinjen och bör utvärderas noggrant för att undvika feltolkning på grund av den basala alternativa skarvprofilen.
Vanligtvis observeras stora skillnader i minigene E1A skarvmönster endast när man ändrar uttrycket av splitsfaktorer. Andra förändringar är mindre uppenbara på grund av det stora antalet proteiner som modulerar aktiviteten hos dessa faktorer. Därför bör man föredra det klassiska tillvägagångssättet, baserat på ökande mängder av detta kandidatprotein, när man påbörjar studier för en indirekt kandidat. När viss effekt observeras kan behandlingarna utföras för att undersöka om förordningen kan vara specifik för en viss cellulär stimulans.
Efter ett preliminärt positivt resultat kan standardiseringen av tid och läkemedelskoncentration utföras för att optimera experimentet.
Detta enkla protokoll är en preliminär analys, en startpunkt som kan svara på om proteinet av intresse visar en effekt vid alternativ skarvning och även, när viss effekt i alternativ skarvreglering redan är känd, kan rikta studierna till den mer konsekventa vägen där proteinet spelar en roll som reglerar alternativ skarvning i kemoterapirespons.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande ekonomiska intressen.
Acknowledgments
Vi tackar Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP, genom Grant Temático 2017/03489-1 till JK och stipendie till FLB 2018/05350-3) och Conselho Nacional de Desenvolvimento Cientifico e Tecnológico (CNPq) för finansiering av denna forskning. Vi vill tacka Dr Adrian Krainer för att ha tillhandahållit pMTE1A-plasmiden och Zerler och kollegor för deras arbete inom E1A-kloning. Vi tackar också prof. Dr. Patrícia Moriel, Prof. Dr. Wanda Pereira Almeida, Prof. Dr. Marcelo Lancellotti och Prof. Dr. Karina Kogo Cogo Müller så att vi kan använda deras laboratorieutrymme och utrustning.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 pb DNA Ladder | Invitrogen | 15628-050 | |
| 6 wells plate | Sarstedt | 833920 | |
| Agarose | Sigma | A9539-250G | |
| Cisplatin | Sigma | P4394 | |
| DEPC water | ThermoFisher | AM9920 | |
| DMEM | ThermoFisher | 11965118 | |
| dNTP mix | ThermoFisher | 10297-018 | |
| Fetal Bovine Serum - FBS | ThermoFisher | 12657029 | |
| Fluorescent Microscope | Leica | DMIL LED FLUO | |
| Gel imaging acquisition system - ChemiDoc Gel Imagin System | Bio-Rad | ||
| GFP - pEGFPC3 | Clontech | ||
| HEK293 stable cells - HEK293 Flp-In | Generated from Flp-In™ T-REx™ 293 - Invitrogen and described in ref 21 | ||
| Hygromycin B | ThermoFisher | 10687010 | Used for Flp-In cells maintenemant |
| Image processing and analysis software - FIJI software | ref. 32 | ||
| Lipid- based transfection reagent - jetOPTIMUS Polyplus Reagent | Polyplus | 117-07 | |
| Oligo DT | ThermoFisher | 18418020 | |
| Paclitxel | Invitrogen | P3456 | |
| Plate Reader/ UV absorbance | Biotech | Epoch Biotek/ Take3 adapter | |
| pMTE1A plasmid | Provided by Dr. Adrian Krainer | ||
| pMTE1A F | Invitrogen | 5’ -ATTATCTGCCACGGAGGTGT-3 | |
| pMTE1A R | Invitrogen | 5’ -GGATAGCAGGCGCCATTTTA-3’ | |
| Refrigerated centrifuge | Eppendorf | F5810R | |
| Reverse Transcriptase - M-MLV | ThermoFisher | 28025013 | |
| Reverse transcriptase - Superscript IV | ThermoFisher | 18090050 | |
| Ribunuclease inhibitor RNAse OUT | ThermoFisher | 10777-019 | |
| RNA extraction phenol-chloroform based reagent - Trizol | ThermoFisher | 15596018 | |
| SybrSafe DNA gel stain | ThermoFisher | S33102 | |
| Taq Platinum | Thermo | 10966026 | |
| Tetracyclin | Sigma | T3383 | Used for Flag empty or Nek4- Flag expression induction |
| Thermocycler Bio-Rad | Bio-Rad | T100 | |
| Trypsin | Sigma | T4799 |
References
- Ule, J., Blencowe, B. J. Alternative Splicing Regulatory Networks: Functions, Mechanisms, and Evolution. Molecular Cell. 76 (2), 329-345 (2019).
- Pan, Q., Shai, O., Lee, L. J., Frey, B. J., Blencowe, B. J. Deep surveying of alternative splicing complexity in the human transcriptome by high-throughput sequencing. Nature Genetics. 40 (12), 1413-1415 (2008).
- Nilsen, T. W., Graveley, B. R. Expansion of the eukaryotic proteome by alternative splicing. Nature. 463 (7280), 457-463 (2010).
- Stamm, S. Signals and their transduction pathways regulating alternative splicing: a new dimension of the human genome. Human Molecular Genetics. 11 (20), 2409-2416 (2002).
- Kornblihtt, A. R., et al. Alternative splicing: a pivotal step between eukaryotic transcription and translation. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 14 (3), 153-165 (2013).
- Zhong, X. -Y., Ding, J. -H., Adams, J. A., Ghosh, G., Fu, X. -D. Regulation of SR protein phosphorylation and alternative splicing by modulating kinetic interactions of SRPK1 with molecular chaperones. Genes & Development. 23 (4), 482-495 (2009).
- Misteli, T., Cáceres, J. F., Clement, J. Q., Krainer, A. R., Wilkinson, M. F., Spector, D. L. Serine Phosphorylation of SR Proteins Is Required for Their Recruitment to Sites of Transcription In Vivo. Journal of Cell Biology. 143 (2), 297-307 (1998).
- Kanopka, A., et al. Regulation of adenovirus alternative RNA splicing by dephosphorylation of SR proteins. Nature. 393 (6681), 185-187 (1998).
- Anufrieva, K. S., et al. Therapy-induced stress response is associated with downregulation of pre-mRNA splicing in cancer cells. Genome Medicine. 10 (1), 49 (2018).
- Shultz, J. C., et al. SRSF1 Regulates the Alternative Splicing of Caspase 9 Via A Novel Intronic Splicing Enhancer Affecting the Chemotherapeutic Sensitivity of Non-Small Cell Lung Cancer Cells. Molecular Cancer Research. 9 (7), 889-900 (2011).
- Gabriel, M., et al. Role of the splicing factor SRSF4 in cisplatin-induced modifications of pre-mRNA splicing and apoptosis. BMC Cancer. 15, (2015).
- Lee, S. C. -W., Abdel-Wahab, O.
- Cooper, T. A. Use of minigene systems to dissect alternative splicing elements. Methods. 37 (4), 331-340 (2005).
- Stoss, O., Stoilov, P., Hartmann, A. M., Nayler, O., Stamm, S. The in vivo minigene approach to analyze tissue-specific splicing. Brain Research Protocols. 4 (3), 383-394 (1999).
- Zerler, B., et al. Adenovirus E1A coding sequences that enable ras and pmt oncogenes to transform cultured primary cells. Molecular and Cellular Biology. 6 (3), 887-899 (1986).
- Gattoni, R., Schmitt, P., Stevenin, J. In vitro splicing of adenovirus E1A transcripts: characterization of novel reactions and of multiple branch points abnormally far from the 3' splice site. Nucleic Acids Research. 16 (6), 2389-2409 (1988).
- Stephens, C., Harlow, E. Differential splicing yields novel adenovirus 5 E1A mRNAs that encode 30 kd and 35 kd proteins. The EMBO journal. 6 (7), 2027-2035 (1987).
- Ulfendahl, P. J., et al. A novel adenovirus-2 E1A mRNA encoding a protein with transcription activation properties. The EMBO journal. 6 (7), 2037-2044 (1987).
- Berk, A. J., Sharp, P. A. Structure of the adenovirus 2 early mRNAs. Cell. 14 (3), 695-711 (1978).
- Svensson, C., Pettersson, U., Akusjärvi, G. Splicing of adenovirus 2 early region 1A mRNAs is non-sequential. Journal of Molecular Biology. 165 (3), 475-495 (1983).
- Basei, F. L., Meirelles, G. V., Righetto, G. L., dos Santos Migueleti, D. L., Smetana, J. H. C., Kobarg, J. New interaction partners for Nek4.1 and Nek4.2 isoforms: from the DNA damage response to RNA splicing. Proteome Science. 13 (1), 11 (2015).
- Zhou, Z., et al. The Akt-SRPK-SR Axis Constitutes a Major Pathway in Transducing EGF Signaling to Regulate Alternative Splicing in the Nucleus. Molecular Cell. 47 (3), 422-433 (2012).
- Caceres, J., Stamm, S., Helfman, D., Krainer, A. Regulation of alternative splicing in vivo by overexpression of antagonistic splicing factors. Science. 265 (5179), 1706-1709 (1994).
- Zhong, X. -Y., Ding, J. -H., Adams, J. A., Ghosh, G., Fu, X. -D. Regulation of SR protein phosphorylation and alternative splicing by modulating kinetic interactions of SRPK1 with molecular chaperones. Genes & Development. 23 (4), 482-495 (2009).
- Naro, C., et al. The centrosomal kinase NEK2 is a novel splicing factor kinase involved in cell survival. Nucleic Acids Research. 42 (5), 3218-3227 (2014).
- Lu, C. -C., Chen, T. -H., Wu, J. -R., Chen, H. -H., Yu, H. -Y., Tarn, W. -Y. Phylogenetic and Molecular Characterization of the Splicing Factor RBM4. PLoS ONE. 8 (3), 59092 (2013).
- Jarnæss, E., et al. Splicing Factor Arginine/Serine-rich 17A (SFRS17A) Is an A-kinase Anchoring Protein That Targets Protein Kinase A to Splicing Factor Compartments. Journal of Biological Chemistry. 284 (50), 35154-35164 (2009).
- Bressan, G. C., et al. Functional association of human Ki-1/57 with pre-mRNA splicing events. FEBS Journal. 276 (14), 3770-3783 (2009).
- Vivarelli, S., et al. Paraquat Modulates Alternative Pre-mRNA Splicing by Modifying the Intracellular Distribution of SRPK2. PLoS ONE. 8 (4), 61980 (2013).
- Russell, W. C., Graham, F. L., Smiley, J., Nairn, R. Characteristics of a Human Cell Line Transformed by DNA from Human Adenovirus Type 5. Journal of General Virology. 36 (1), 59-72 (1977).
- Aranda, P. S., LaJoie, D. M., Jorcyk, C. L. Bleach gel: A simple agarose gel for analyzing RNA quality. Electrophoresis. 33 (2), 366-369 (2012).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Bai, Y. Control of 3' splice site choice in vivo by ASF/SF2 and hnRNP A1. Nucleic Acids Research. 27 (4), 1126-1134 (1999).
- Cote, G. J., Nguyen, N., Lips, C. J. M., Berget, S. M., Gagel, R. F. Validation of an in vitro RNA processing system for CT/CGRP precursor mRNA. Nucleic Acids Research. 19 (13), 3601-3606 (1991).
