Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

डायमंड लाइट सोर्स पर फिक्स्ड टारगेट सीरियल डेटा कलेक्शन

Published: February 26, 2021 doi: 10.3791/62200
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 2, 1,3, 1,4, 5, 2, 1
1Diamond Light Source, Harwell Science and Innovation Campus, 2School of Life Sciences, University of Essex, 3X-ray Science Division, Argonne National Laboratory, 4European Molecular Biology Laboratory, Hamburg Outstation c/o DESY, 5Biological Sciences, Institute for Life Sciences, University of Southampton

Summary

हम डायमंड बीमलाइन I24 में धारावाहिक सिंक्रोट्रॉन क्रिस्टलोग्राफी के लिए निश्चित लक्ष्य नमूना तैयारी, डेटा संग्रह और डेटा प्रसंस्करण के लिए एक व्यापक गाइड प्रस्तुत करते हैं।

Abstract

सीरियल डेटा संग्रह सिंक्रोट्रॉन उपयोगकर्ताओं के लिए एक अपेक्षाकृत नई तकनीक है। I24 पर निश्चित लक्ष्य डेटा संग्रह के लिए एक उपयोगकर्ता मैनुअल, डायमंड लाइट स्रोत को चिकनी डेटा संग्रह के लिए विस्तृत कदम-दर-कदम निर्देश, आंकड़े और वीडियो के साथ प्रस्तुत किया जाता है।

Introduction

सीरियल सिंक्रोट्रॉन क्रिस्टलोग्राफी (एसएसएक्स) डेटा संग्रह की एक उभरती हुई विधि है जो एक्स-रे मुक्त इलेक्ट्रॉन लेजर (एक्सफेल)1,2,3से प्रेरित थी। एक XFEL में, एक एकल विवर्तन पैटर्न आमतौर पर बहुत छोटे प्रोटीन क्रिस्टल से दर्ज किया जाता है, इससे पहले कि क्रिस्टल बेहद उज्ज्वल एक्स-रे पल्स द्वारा नष्ट हो जाता है। इसका मतलब है, आम तौर पर, कि एक नया क्रिस्टल एक्स-रे बीम में पेश किया जाना चाहिए एक और विवर्तन पैटर्न4प्राप्त करने के लिए । क्रिस्टल को लगातार भरने की आवश्यकता है, जिसने कई धारावाहिक नमूना वितरण तकनीकों के विकास को प्रेरित किया है5.

सिंक्रोट्रॉन में, क्लासिक (गैर-धारावाहिक) रोटेशन क्रिस्टलोग्राफी विधियों को व्यापक रूप से लागू किया जाता है, जो एक बड़े क्रिस्टल का शोषण करता है जिसे संरचना समाधान 6 के लिए एक पूर्ण डेटासेट एकत्र करने के लिए गोनियोमीटर का उपयोग करके एक्स-रे बीम में घुमायाजाताहै। क्रिस्टल के जीवनकाल को बढ़ाने के लिए ताकि एक पूर्ण डेटासेट7,8एकत्र किया जा सके, और शिपिंग और स्वचालित नमूना हस्तांतरण की सुविधा के लिए, डेटा संग्रह के लिए क्रिस्टल ~ 100 K तक क्रायोकोल किए जाते हैं। तीव्र माइक्रोफोकस बीमलाइंस में, बहु-क्रिस्टल रणनीतियों को अक्सर नियोजित किया जाता है क्योंकि विकिरण क्षति एकक्रिस्टल9,10,11से पूर्ण डेटासेट के संग्रह को प्रतिबंधित कर सकती है। विकिरण क्षति द्वारा लगाए गए सीमाओं के बावजूद, उपयोग किए गए क्रिस्टल की संख्या अपेक्षाकृत मामूली बनी हुई है और उपयोग किया जाने वाला दृष्टिकोण अनिवार्य रूप से एकल क्रिस्टल प्रयोग के समान है।

दूसरी ओर, SSX, एक पूर्ण डेटासेट उत्पन्न करने के लिए हजारों बेतरतीब ढंग से केंद्रित क्रिस्टल से एकल अभी भी विवर्तन पैटर्न प्राप्त करने के लिए सीरियल नमूना वितरण का उपयोग करता है। यह ध्यान दिया जाता है कि क्रिस्टल रोटेशन को शामिल करने वाली धारावाहिक तकनीकें विकास12,13 के तहतहैं,हालांकि हम अभी भी शून्य रोटेशन, दृष्टिकोण पर ध्यान केंद्रित करते हैं। विभिन्न फायदों और नुकसान के साथ नमूना वितरण प्रणालियों की एक विस्तृत विविधता है14,एक प्रवाह केंद्रित/चिपचिपा जेट15, 16, 17,माइक्रोफ्लुइडिक चिप 18,19,या एक नक़्क़ाशी वाला सिलिकॉन चिप20, 21 जैसे एक निश्चित लक्ष्य पर क्रिस्टल में क्रिस्टल की एक धारा देने से लेकर . आमतौर पर, क्रिस्टल कमरे के तापमान पर आयोजित किए जाते हैं, जिससे अधिक अनुरूप विविधता देखी जा सकती है और अधिक शारीरिक रूप से प्रासंगिक वातावरण प्रदान कियाजाताहै। SSX बहुत कम खुराक डेटासेट23के संग्रह को सक्षम बनाता है, क्योंकि डेटासेट की कुल खुराक एक क्रिस्टल के एक छोटे एक्स-रे एक्सपोजर के बराबर है। एक अन्य प्रमुख लाभ SSX प्रदान करता है समय-हल तरीकों के माध्यम से प्रोटीन गतिशीलता का अध्ययन, लेजर लाइट24, 25,26,27के संपर्क में आने से शुरू हुई प्रतिक्रियाओं के साथ या क्रिस्टल और लिगांड/सब्सट्रेट28, 29के मिश्रण से। छोटे क्रिस्टल का उपयोग करने का मतलब है लेजर प्रकाश क्रिस्टल की संपूर्णता में प्रवेश कर सकता है, समान रूप से विभिन्न समय बिंदुओं पर लिए गए विवर्तन डेटा के लिए अच्छी तरह से परिभाषित प्रतिक्रिया मध्यवर्ती प्रदान करने के लिए मल्टीफोटो अवशोषण के बिना प्रतिक्रिया शुरू कर सकता है27। बड़े क्रिस्टल और रोटेशन-आधारित डेटा संग्रह विधियों का उपयोग डेटा स्वीप के भीतर सीमित लेजर प्रवेश गहराई, गैर-वर्दी या मल्टीफोटोन सक्रियण, विकिरण क्षति और यांत्रिक ओवरहेड समय से ग्रस्त है, जिसके परिणामस्वरूप प्रतिक्रिया मध्यवर्ती का मिश्रण होता है जो तेज प्रतिक्रिया गति पर व्याख्या करने के लिए मुश्किल या असंभव साबित हो सकता है। छोटे क्रिस्टल प्रयोगों को मिलाने में समान लाभ प्रदान करते हैं, क्योंकि लिगांड पूरे क्रिस्टल में तेजी से और अधिक समान रूप से फैलाना कर सकते हैं, फिर से परिभाषित प्रतिक्रिया मध्यवर्ती को अलग-अलग समय पर दर्ज करने की अनुमति देते हैं30,31,32।

डायमंड के माइक्रोफोकस बीमलाइन I24 में पारंपरिक रोटेशन और एसएसएक्स दोनों प्रयोग किए जा सकते हैं। यहां आई24 पर निश्चित लक्ष्यों का उपयोग करके SSX नमूना तैयारी और डेटा संग्रह के लिए एक व्यापक प्रोटोकॉल और डायमंड में सीरियल डेटा के डेटा विश्लेषण के लिए प्रोटोकॉल प्रस्तुत किए जाते हैं। जबकि पांडुलिपि और साथ वाले वीडियो उपयोगकर्ताओं को I24 पर एक सफल SSX प्रयोग करने की अनुमति चाहिए, यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि यह एक तेजी से विकासशील क्षेत्र है और दृष्टिकोण लगातार विकसित हो रहे हैं। यह भी ध्यान दिया जाना चाहिए कि धारावाहिक विधियां अन्य सिंक्रोट्रॉन स्रोतों पर उपलब्ध हैं, जिनमें पेट्रा III (पी 14-ट्रेक्सी), मैक्स चतुर्थ (बायोमैक्स)33,एसएलएस (पीएक्सआई और पीएक्सआई)34और एनएसएल (एफएमएक्स)35तक सीमित नहीं है। जबकि धारावाहिक डेटा संग्रह और प्रसंस्करण की बारीकियों स्रोतों के बीच अलग होगा, मूल सिद्धांतों ही रहेगा । नीचे दिए गए प्रोटोकॉल को एक प्रारंभिक बिंदु और आधार शिविर के लिए एक मार्ग का प्रतिनिधित्व करने के बजाय क्या हासिल किया जा सकता है के शिखर संमेलन देखा जाना चाहिए ।

यह प्रोटोकॉल मानता है कि उपयोगकर्ताओं के पास प्रोटीन या छोटा अणु क्रिस्टल सिस्टम है, जिसमें से 0.5-2.0 एमएल के क्रम पर माइक्रोक्रिस्टल घोल का उत्पादन किया गया है। क्रिस्टल स्लरी प्राप्त करने के लिए प्रोटोकॉल पहले 36वर्णित किए गए हैं . कई अलग-अलग प्रकार के निश्चित लक्ष्य उपलब्ध हैं, जो आमतौर पर I24 पर उपयोग किया जाता है, ठीक परिभाषित सिलिकॉन चिप का उपयोग करता है। अन्य चिप लेआउट से अंतर करने के लिए, नीचे और बीमलाइन इंटरफेस में इसे 'ऑक्सफोर्ड चिप' के रूप में जाना जाता है। जैसा कि पहले बताया गया है कि ऑक्सफोर्ड चिप लेआउट में 8×8 'सिटी ब्लॉक' शामिल हैं, जिनमें से प्रत्येक में कुल 25,600 एपर्चर 20,21के लिए20×20एपर्चर हैं।

Protocol

1. तैयारी और एक चिप लोड हो रहा है

नोट: यह प्रक्रिया प्रोटीन क्रिस्टल को सूखने से रोकने के लिए आमतौर पर 80% और 90% या उच्च सापेक्ष आर्द्रता के बीच आर्द्रता नियंत्रित वातावरण(चित्रा 1)के भीतर होती है। एक बार लोड और सील होने के बाद, क्रिस्टल 24 घंटे के ऊपर तक जीवित रह सकते हैं। हालांकि, यह क्रिस्टल सिस्टम के बीच बहुत भिन्न हो सकता है। कक्ष के भीतर एक कम संचालित वैक्यूम पंप एक सिलिकॉन चिप(चित्रा 1),एक सिलिकॉन चिप, पॉलिएस्टर पन्नी(चित्रा 2),एक p200 पिपेट, २०० μL पिपेट युक्तियां, चिमटी, फिल्टर पेपर और प्रोटीन क्रिस्टल घोल के साथ एक चिप धारक पकड़ करने के लिए एक लोडिंग चरण से जुड़ी पंप की आवश्यकता होती है ।

  1. चिप होल्डर तैयार करें।
    1. पॉलिएस्टर पन्नी की दो चादरें लगभग 6 सेमी x 6 सेमी वर्गों में काटें।
    2. दो बेस प्लेटों (बड़े और छोटे) पर पॉलिएस्टर शीट्स बिछाएं।
    3. धातु सीलिंग के छल्ले का उपयोग करके जगह में पॉलिएस्टर शीट्स को ठीक करें।
    4. ध्यान से अतिरिक्त पॉलिएस्टर पन्नी पर खींचने के लिए किसी भी क्रीज को हटाने के लिए कल्पना और बाद में आसान नमूने केंद्रित करने के लिए ।
  2. क्रिस्टल के आकार के सापेक्ष उचित आकार के एपर्चर (7-30 माइक्रोन) के साथ एक सिलिकॉन चिप का चयन करें।
  3. ग्लो 0.39 mBar पर 25 सेकंड के लिए चिप का निर्वहन और चिप पर माइक्रो क्रिस्टल के आसान प्रसार को सक्षम करने के लिए 15 एमए की धारा का उपयोग कर।
  4. नीचे का सामना करना पड़ सलाखों के साथ चिमटी का उपयोग कर चिप लोडिंग मंच पर सिलिकॉन चिप रखें ।
  5. एक पिपेट का उपयोग करके चिप के फ्लैट साइड में माइक्रो-क्रिस्टल घोल के 200 μL लागू करें।
  6. चिप के सभी "शहर-ब्लॉक" को कवर करने के लिए क्रिस्टल घोल फैलाएं।
  7. यदि चिप क्षतिग्रस्त हो जाती है, तो किसी भी छेद को पॉलिएस्टर फॉयल या फिल्टर पिपेट टिप के एक छोटे से टुकड़े के साथ कवर करें ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि एक भी वैक्यूम लागू किया जा सकता है।
  8. एक कोमल वैक्यूम तब तक लागू करें जब तक कि चिप के माध्यम से सभी अतिरिक्त तरल चूसा न जाए।
  9. चिमटी के साथ चिप लोडिंग स्टेज से चिप निकालें।
  10. अतिरिक्त तरल को हटाने के लिए फिल्टर पेपर के साथ चिप के नीचे सावधानी से दाग दें।
  11. गाइड के निशान फ्लैट साइड के बीच चिप धारक के बड़े आधे पर लोडेड चिप को नीचे रखें।
  12. चिप होल्डर के छोटे आधे हिस्से को ऊपर रखकर चिप को सील कर दें।
    1. चिप धारक के दो हिस्सों जगह में तस्वीर होगी । यदि दूसरा हाफ फ्लश नहीं बैठता है, तो चुंबक को ठीक से संरेखित करने के लिए धारक को 180 ° स्पिन करें।
  13. जगह में सुरक्षित रूप से चिप को ठीक करने के लिए हेक्स बोल्ट के साथ बंद चिप धारक पेंच।
    नोट: वैकल्पिक रूप से, एक "चिपलेस" चिप को इसी तरह के फैशन में लोड किया जा सकता है, जिसमें चिप धारक 37में पॉलिएस्टर फॉयल की दो परतों के बीच सैंडविच क्रिस्टल स्लरी (~ 15 माइक्रोन) की एक छोटी मात्रा होती है, या एक छोटी मात्रा 50 माइक्रोन मोटी डबल-तरफा चिपकने वाला स्पेसर का उपयोग करके लोड की जा सकती है जो पहले वर्णित पॉलिएस्टर फॉइल पर सीधे लागू होती है . चिपकने वाले स्पेसर्स का उपयोग प्रत्येक चिपलेस चिप पर कई नमूनों (या लिगांड सोख जैसे नमूनों के वेरिएंट) को लोड करने की अनुमति देता है। सिलिकॉन चिप्स लोड करने के लिए ध्वनिक ड्रॉप रिजेक्शन (एडीई) का शोषण करने वाला एक पूरक लोडिंग दृष्टिकोण भी डायमंड39में उपयोग किया जा सकता है। ADE चिप्स पिपेट लोडिंग की तुलना में क्रिस्टल घोल की छोटी मात्रा का उपयोग कर लोड करने के लिए अनुमति देता है । यह एक विशेष रूप से उपयोगी तकनीक है जब नमूने दुर्लभ हैं, हालांकि रसायन संरचना और घोल की चिपचिपाहट को ध्यान में रखा जाना चाहिए ।

2. जीयूआई और बीमलाइन पर सेटअप

  1. एक साधारण EPICS डिस्प्ले मैनेजर (ईडीएम) ग्राफिकल यूजर इंटरफेस (जीयूआई)(चित्र 3ए)के माध्यम से डेटा संग्रह के लिए सभी चिप अलाइनमेंट और सेटअप करें। यह बीमलाइन इंस्ट्रूमेंटेशन के लिए एक पॉइंट-एंड-क्लिक इंटरफेस प्रदान करता है और पायथन-आधारित डेटा संग्रह के लिए इनपुट पैरामीटर प्रदान करता है। उप खिड़कियां एक नमूना धारक(चित्रा 3b)या लेजर/एलईडी पंप-जांच प्रयोगों(चित्रा 3c)के उप क्षेत्रों से एकत्र करने के लिए अतिरिक्त नियंत्रण प्रदान करते हैं ।

3. चिप संरेखित करना

  1. काइनेमेटिक माउंट का उपयोग करके बीमलाइन (चित्रा 4aमें दिखाया गया) पर XYZ चरण पर लोडेड चिप रखें।
    1. यात्रा की अपनी दिशा के साथ चरणों को खींचने से बचने के लिए ध्यान रखें। काइनेमेटिक माउंट में मैग्नेट काफी मजबूत होते हैं इसलिए इसे दुर्घटना से काफी आसानी से किया जा सकता है।
    2. जब माउंट आ रहा है, चिप धारक एक मामूली कोण (±30 °) पर आयोजित किया जाना चाहिए । जब मैग्नेट संपर्क करते हैं तो चिप धारक को फर्श (0 डिग्री) के समानांतर घुमाने की अनुमति देते हैं और चिप धारक जगह में क्लिककरेगा (चित्रा 4b)।
    3. एक चिप उतारते समय एक रिवर्स रास्ता पीछा करें। चिप धारक को दूर खींचने से पहले चिप को चरणों से दूर घुमाएं और कोण करें।
  2. बीमलाइन के ऑन-एक्सिस व्यूइंग सिस्टम और चिप अलाइनमेंट जीयूआई का उपयोग करके, चिप के शीर्ष बाएं प्रत्ययी का पता लगाएं। फिड्यूशियल तीन वर्ग हैं, दो छोटे और एक बड़े, एक दूसरे के लिए सही कोण पर(चित्रा 5a)। चिप वापस प्रबुद्ध है तो चिप सफेद वर्गों के रूप में एपर्चर के साथ अंधेरा दिखाई देगा ।
  3. एक्स, वाई, और जेड(चित्रा 5b)में प्रत्ययी शून्य पर केंद्र। क्रमशः बाएं/दाएं और ऊपर/नीचे ले जाकर एक्स और वाई को संरेखित करें । चिप को फोकस में और बाहर ले जाकर जेड को संरेखित करें।
  4. क्लिक करें सेट फिड्यूशियल जीरो।
  5. एक्स-रे बीम के साथ सभी फिड्यूशियल को संरेखित करने के लिए प्रत्ययी एक (शीर्ष दाएं, चित्रा 5c)और प्रत्ययी दो (नीचे बाएं, चित्रा 5d)के लिए चरण 3.2 दोहराएं।
  6. समन्वय प्रणाली बनानेके लिए दबाकर एक समन्वय मैट्रिक्स उत्पन्न करें, यह चिप समन्वय फ्रेम में किए जाने वाले चरणों के सापेक्ष चिप के ऑफसेट, पिच, रोल और याव की गणना करता है।
  7. क्लिक करें ब्लॉक चेक दृश्य पुष्टि के लिए प्रत्येक शहर ब्लॉक के पहले कुएं में XYZ चरण को स्थानांतरित करने के लिए कि चिप अच्छी तरह से गठबंधन किया गया है।
  8. यदि एक्स-रे क्रॉसहेयर एपर्चर के साथ लाइनों चिप गठबंधन किया है । यदि नहीं, तो 3.2-3.3 चरणों को दोहराएं।
    नोट्स: कठिनाई संरेखण (टूटे हुए प्रत्ययी) के मामले में, चिप पर विभिन्न एपर्चर का उपयोग "संरेखण प्रकार" पुल-डाउन मेनू का उपयोग करके संरेखण के लिए किया जा सकता है। फिक्स्ड टारगेट डेटा कलेक्शन के लिए कई अलग-अलग प्रकार की चिप उपलब्ध हैं। विभिन्न चिप प्रकारों को 'चिप प्रकार' पुल-डाउन मेनू के उपयोग के माध्यम से समायोजित किया जाता है। I24 में उपयोग किए जाने वाले सबसे आम चिप प्रकार 'ऑक्सफोर्ड' और 'कस्टम' चिप्स हैं। चिप पर एपर्चर और फिड्यूशियल की संख्या और अंतर को पुल-डाउन मेनू के माध्यम से परिभाषित चिप शब्दकोश से पढ़ा जाता है। कस्टम चिप एपर्चर स्पेसिंग को ऑन-द-फ्लाई परिभाषित करने की अनुमति देती है, जो पतली-फिल्म शीट-ऑन-शीट या अन्य 'चिपलेस' प्रकार के चिप्स के लिए विशेष रूप से उपयोगी है जहां क्रिस्टल बेतरतीब ढंग से धारक37में स्थित होते हैं। एक नया अजगर जीयूआई, मूव-ऑन-क्लिक कार्यक्षमता और स्वचालित चिप संरेखण की पेशकश वर्तमान में विकास के अधीन है, लेकिन इस पांडुलिपि के लेखन के समय नियमित उपयोग के लिए अभी तक तैयार नहीं है।

4. डेटा संग्रह की स्थापना

नोट: डेटा संग्रह सेटअप सिस्टम का अध्ययन किए जाने और प्रयोग किए जाने पर निर्भर करेगा। यह सबसे सरल SSX प्रयोग से लेकर, कम खुराक संरचना एकत्र करने, लेजर या रैपिड मिक्सिंग का उपयोग करके एक समय-हल किए गए प्रयोग तक हो सकता है, जिसमें प्रतिक्रिया शुरू करने के लिए कई पूर्ण डेटासेट की आवश्यकता होगी। डेटा संग्रह स्थापित करने के लिए निम्नलिखित मापदंडों को परिभाषित करने की आवश्यकता है।

  1. प्रायोगिक चर: फ़ोल्डर, फाइलनेम, एक्सपोजर समय, ट्रांसमिशन, डिटेक्टर दूरी और प्रति एपर्चर शॉट्स की संख्या को उचित रूप में भरें।
  2. चिप प्रकार: जैसा कि ऊपर वर्णित है, उपयोग में चिप के लिए चिप प्रकार मैच ।
    1. यदि एक पतली फिल्म या 'चिपलेस' चिप का उपयोग किया जा रहा है, तो चिप प्रकार को किसी को भी सेट करें।
    2. जीयूआई में एक्स और वाई दोनों में चरणों और चरणों की संख्या को परिभाषित करें।
  3. मानचित्र प्रकार सेट करें: यह डेटा संग्रह(चित्र 3बी)के लिए एक चिप के उपधाराओं की अनुमति देता है। 'कोई नहीं' का मतलब है डेटा एक चिप पर हर एपर्चर से एकत्र कर रहे हैं। 'लाइट' का मतलब है कि चिप(चित्रा 3b)पर चयनित शहर ब्लॉकों से डेटा एकत्र किया जाता है। यह उपयोगी हो सकता है यदि, उदाहरण के लिए, एक चिप का एक क्षेत्र खराब लोड या खाली होने के लिए जाना जाता है। 'पूर्ण' डेटा संग्रह के लिए व्यक्तिगत एपर्चर का चयन करने की अनुमति देता है। इस मामले में एक सही ढंग से स्वरूपित पाठ फ़ाइल प्रदान की जानी चाहिए। विवरण और एक टेम्पलेट बीमलाइन स्टाफ से प्राप्त किया जा सकता है।
  4. पंप-जांच: पंप जांच प्रयोग के प्रकार और वांछित समय देरी का चयन करें। पंप (आमतौर पर एक एलईडी या लेजर) का ट्रिगर अक्सर किसी विशेष प्रयोग के लिए विशिष्ट होता है, इसलिए यहां विस्तार से वर्णित नहीं किया जाएगा।
    1. 'लघु' देरी प्रयोगों को संदर्भित करती है जब पंप और जांच के बीच प्रत्येक एपर्चर पर एक वास है (यानी, पंप, जांच, 'अगले नमूने में जाएं। देरी आम तौर पर 1 सेकंड या मिलीसेकंड के दसियों के आदेश पर कर रहे हैं ।
    2. लंबे समय की देरी एक उत्तेजित और फिर से यात्रा (EAVA) रणनीति है, जहां एपर्चर दो बार दौरा कर रहे हैं, यात्राओं के बीच एक निर्धारित समय देरी के साथ देखें (यानी, पंप, कदम, पंप, कदम, जांच, कदम, जांच, आदि) का उल्लेख है । समय में देरी की गणना की जाती है और एक्स-रे एक्सपोजर समय(चित्रा 3 सी)और यह आमतौर पर ~ 1 सेकंड या उससे अधिक होता है।

5. सामान्य डेटा संग्रह विधियों

नोट: निम्नलिखित प्रमुख पैरामीटर हैं जो किए जा रहे प्रयोग के प्रकार को परिभाषित करते हैं। इस अनुभाग में माना गया है कि प्रोटोकॉल 3 "सेटिंग अपिंग अपिंग डेटा संग्रह" से अन्य सेटिंग्स को परिभाषित किया गया है।

  1. परिदृश्य 1: कम खुराक डेटा संग्रह। नमूना धारक पर हर चयनित एपर्चर से एक ही विवर्तन छवि का संग्रह।
    1. 1 को प्रति एपर्चर शॉट्स की संख्या निर्धारित करें ।
    2. किसी को भीपंप जांच सेट करें ।
  2. परिदृश्य 2: एक खुराक श्रृंखला, नमूना धारक पर हर चयनित एपर्चर से क्रमिक रूप से एन छवियों का संग्रह। चिप प्रत्येक एपर्चर पर स्थिर है, जबकि एन छवियों के प्रत्येक सेट एकत्र किया जाता है ।
    1. प्रति एपर्चर शॉट्स की संख्या'एन'सेट करें। ध्यान दें कि यदि एन= 5, 10, 20 या 10 में से अन्य कई हैं तो प्रसंस्करण को सरल बनाया गया है। अगर एन 5 < तो रुझान स्थापित करना मुश्किल है । यह एक चिप को कवर करने के लिए आवश्यक कुल समय और एन वृद्धि होने पर उत्पादित छवि फ़ाइलों की संख्या पर विचार करने के लिए उपयोगी है।
    2. किसी को भीपंप जांच सेट करें ।
  3. परिदृश्य 3: पंप-जांच के तरीके
    1. लेजर एक्सीशन कंट्रोल सेंटर खोलने के लिए पंप प्रोब पुल-डाउन मेनू से एक विधि का चयन करें।
    2. एक पंप जांच प्रयोग के लिए प्रत्येक एपर्चर विकल्प पर लेजर निवास में भरें।
    3. ईएवीए के लिए प्रत्येक अपर्चर और एक्स-रे एक्सपोजर पर लेजर निवास में भरें और गणना पर क्लिक करें।
    4. वांछित देरी समय के लिए ईडीएम जीयूआई पंप प्रोब ड्रॉप-डाउन मेनू में उपयुक्त दोहराने विकल्प का चयन करें।
    5. यदि प्रयोग लेजर 2 निवास अनुभाग में एक पूर्व रोशनी कदम भरने की आवश्यकता है।
    6. सभी प्रयोगात्मक चर के बाद प्रेस सेट मापदंडोंको परिभाषित कर रहे हैं और छोटी सूची बनाते हैं। यह जियोब्रिक नियंत्रक पर प्रयोगात्मक चर लोड करता है। इसके बाद शुरू करने के बाद डिटेक्टर में, बैकलाइट बाहर ले जाएगा, और डेटा संग्रह शुरू करते हैं । डेटा संग्रह स्थापित करने में सभी बिंदुओं पर एक टर्मिनल विंडो खुली होना उपयोगी है जहां प्रत्येक चरण की स्थिति और परिणाम पर प्रतिक्रिया मुद्रित की जाती है।

6. डेटा प्रोसेसिंग

नोट: मोटे तौर पर बोलने वाले डेटा प्रोसेसिंग को उस तात्कालिकता के आधार पर तीन समूहों में विभाजित किया जा सकता है जिसके साथ प्रतिक्रिया की आवश्यकता होती है। तेजी से प्रतिक्रिया दिखाने के लिए अगर क्रिस्टल मौजूद है और विवर्तन की आवश्यकता है, और यदि हां, तो क्या संख्या में । यह डेटा संग्रह के साथ रखना चाहिए। डेटा इंडेक्सिंग और एकीकरण का प्रदर्शन करना जो धीमा हो सकता है लेकिन फिर भी डेटा संग्रह के साथ तुलनीय समय तराजू पर किया जाना चाहिए। संरचना समाधान के लिए एक एमजेड फ़ाइल में प्रतिबिंब तीव्रता का विलय और स्केलिंग और इलेक्ट्रॉन घनत्व मानचित्रों की पीढ़ी अंतिम चरण का प्रतिनिधित्व करती है और अभी भी धीमी हो सकती है। यहां पहले दो चरणों के लिए I24 पर पाइपलाइनों शुरू केवल चर्चा की जाएगी, क्योंकि वे आपके प्रयोग का मार्गदर्शन करने के लिए वास्तविक समय की प्रतिक्रिया के लिए आवश्यक हैं, हालांकि ध्यान दें कि हिट-रेट और स्केलिंग आंकड़े जैसे मीट्रिक इलेक्ट्रॉन घनत्व का निरीक्षण करने का विकल्प नहीं हैं, जो केवल पुष्टि प्रदान कर सकते हैं कि एक लिगांड बाध्य है, या एक प्रतिक्रिया हुई है, क्रिस्टलो में.

  1. तेजी से प्रतिक्रिया
    1. डेटा प्रोसेसिंग मॉड्यूल लोड करने के लिए मॉड्यूल लोड i24-ssx किसी भी बीमलाइन वर्कस्टेशन पर टर्मिनल में।
    2. हिट-फाइंडिंग एनालिसिस टाइप i24-ssx/path/to/visit/निर्देशिका/टर्मिनल में चलाने के लिए: i24-ssx/dls/i24/data/2020/mx12345-6/
      नोट: यह तीन टर्मिनल खिड़कियां खोलता है और, एक बार डेटा डिस्क करने के लिए लिखा गया है, उन्नत प्रकाश स्रोतों (DIALS) ४०, ४१(चित्रा 6a)के लिए विवर्तन एकीकरण से स्पॉट खोजने के परिणामों का एक चित्रमय प्रतिनिधित्व ।
      1. डिफ़ॉल्ट सेटिंग्स हर 10वीं छवि स्कोर और कम्प्यूटेशनल लोड को कम करने के लिए हर कुछ सेकंड ताज़ा ।
      2. ऊपर दिए गए आदेश के अंत में तर्क जोड़कर डिफ़ॉल्ट बदलें। उदाहरण के लिए, 'i24-ssx/dls/i24/data/2020/mx12345-6 2' i24-ssx हर दूसरे छवि पर हिट खोज चलेंगे। हालांकि, यह क्लस्टर (एक साझा संसाधन!) पर अनुचित दबाव डाल सकता है और प्रसंस्करण के समय को धीमा कर सकता है। ग्राफ सफल अनुक्रमण की संभावना के आधार पर कोडित रंग है, लाल शो कम से कम 15 ब्रैग स्पॉट पाए गए हैं (इंडेक्सिंग का अच्छा मौका), नीला कोई उपयोगी विवर्तन के लिए थोड़ा दिखाता है।
      3. स्पॉट फाइंडर इंटरफेस पर स्पॉट पर क्लिक करके DIALS छवि दर्शक में रुचि के विवर्तन छवियों को देखें।
  2. इंडेक्सिंग और इंटीग्रेशन फीडबैक
    नोट: dials.still_process फ़ंक्शन 40,41का उपयोग करके डायल्स के साथ विवर्तन डेटा का इंडेक्सिंग और एकीकरण किया जाता है। जैसे, आपके क्रिस्टल (अपेक्षित क्रिस्टल स्पेस ग्रुप, यूनिट सेल और एक प्रयोग ज्यामिति) से संबंधित विशिष्ट जानकारी को .phil टेक्स्ट फाइल में रखा जाना चाहिए।
    1. एक टर्मिनल में मॉड्यूल लोड डायल टाइप करके डायल मॉड्यूल लोड करें।
    2. एक डेटासेट प्रकार dials.still_process/path/to/images///pathto/phil-file.phil कोप्रोसेस करना शुरू करना । सभी अभी भी प्रसंस्करण डेटासेट की प्रगति monitor_stills_process.py टाइप करके stills_monitor स्क्रिप्ट चलाकर निगरानी की जा सकती है (मॉड्यूल लोड i24-ssx प्रदर्शन करने और वर्तमान यात्रा के लिए निर्देशिका बदलने के बाद)(चित्रा 6b)।
    3. अनुक्रमित विवर्तन डेटा(चित्रा 7ए)के यूनिट सेल वितरण की निगरानी ctbx.xfel.plot_uc_cloud_from_experiments/पाथ/टू/डायल/आउटपुट/* रिफाइंड.एक्सपिट combine_all_input = सच यह विशेष रूप से यूनिट सेल पॉलीमॉर्फ की पहचान और समाधान करने के लिए उपयोगी है जैसा कि पहले चर्चा की गई थी ४२।
    4. ' विजुअलज़ी ' अगर, और कैसे, यह वितरण कमांड पायथन pacman.py/विजिट/प्रोसेसिंग/_hit_finding/chip.inका उपयोग करके 2डी प्लॉट(चित्रा 7b)का उत्पादन करके एक निश्चित लक्ष्य में बदलता रहता है ।
    5. एचकेएल = 0,0,1 expand_to_P 1 = ट्रू/पाथ/टू/डायल/आउटपुट/* रिफाइंड.एक्सप्ट dials.stereographic_projectionडायल्स कमांड का उपयोग करके सभी अनुक्रमित विवर्तन डेटा(चित्रा 7c)के स्टीरियोग्राफिक अनुमानों का उत्पादन करें ।
      नोट: यह एक आम विकृति है जब क्रिस्टल से स्टिल्स डेटा को संसाधित करता है जहां ब्रावेस जाली की समरूपता अंतरिक्ष समूह समरूपता से अधिक होती है जो विलय किए गए डेटा को एक आदर्श जुड़वां के रूप में दिखाई देती है। इस विकृति को हल करने के लिए डेटा प्रोसेसिंग एल्गोरिदम विकसित हुए हैं 43,44,45, 46 लेकिन उपयोगकर्ताओं को अपने डेटा को संसाधित करते समय इस बात का ध्यान रखना चाहिए।

Representative Results

कम खुराक डेटा संग्रह और श्रृंखला
कम खुराक (चरण 5.1: परिदृश्य 1) और खुराक श्रृंखला (चरण 5.2: परिदृश्य 2) डेटा I24 पर तांबे नाइट्राइट रिडक्टेज माइक्रो क्रिस्टल पर एकत्र किए गए थे और पहले 42प्रकाशित किए गए हैं। सभी नमूनों को चरण 1 में वर्णित, चरण 3, 4 और 5 के अनुसार एकत्र किए गए डेटा तैयार किए गए थे, और चरण 6 में तरीकों का उपयोग करके संसाधित किया गया था। इस काम में एक ताजा नमूने में जाने से पहले प्रत्येक एपर्चर (यानी, एन= 20 ऊपर दिखाए गए डेटा संग्रह जीयूआई में) पर ली गई 20 विवर्तन छवियों के साथ एक रैपिड डोज श्रृंखला एकत्र की गई थी। इन आंकड़ों से अंतरिक्ष समूह पी 21 3में इकाई कोशिकाओं के एक द्विमॉडल वितरण की पहचान की गई थी (एक = बी = सी = 97.25 Å, और एक = b = c = 96.38 Å)। प्रसंस्करण के लिए इन यूनिट-सेल बहुरूपियों की पहचान और उन्हें अलग करने से डेटा गुणवत्ता संकेतकों में उल्लेखनीय सुधार हुआ और सभी डेटा को एक साथ संसाधित करते समय मिश्रित राज्य के बजाय अवशेषों 189-193 के बीच एक लचीले लूप में दो अलग-अलग संरचनाओं का पता चला। इस तरह के बहुरूपियों की पहचान एक नाजुक समय से हल संरचनात्मक अध्ययन में सभी अंतर कर सकता है जहां केवल छोटे संरचनात्मक परिवर्तन की उम्मीद है । इसके अलावा, एकत्र की गई खुराक श्रृंखला ने क्रिस्टल में एक खुराक निर्भर इकाई सेल परिवर्तन का खुलासा किया, जिसमें बड़ी इकाई-कोशिका के पक्ष में आबादी को स्थानांतरित करने वाली खुराक में वृद्धि हुई।

इसी तरह का काम इब्राहीम एट अल (2019)47द्वारा किया गया था, जहां एक खुराक श्रृंखला (चरण 5.2: परिदृश्य 2) को एसएसएक्स (चरण 5.1: परिदृश्य 1) से कम खुराक संरचनाओं की तुलना करने के लिए SSX (चरण 5.1: परिदृश्य 1) से कम खुराक संरचनाओं की तुलना करने के लिए स्ट्रेप्टोमाइसेंस्स से एक डाई-प्रकार के हेम पेरोक्सिडेस से एकत्र किया गया था। एसएफएक्स डेटा 10 फेमटोसेकंड की पल्स लंबाई और 30 हर्ट्ज की पुनरावृत्ति दर के साथ SACLA Beamline BL2 EH3 में एकत्र किए गए थे । 10 femtosecond पल्स अवधि यह सुनिश्चित करता है कि खुराक निर्भर प्रभाव SFX डेटा में मौजूद नहीं हैं । एसएफएक्स डेटा की तुलना बीमलाइन I24 पर एकत्र किए गए SSX डेटा से की गई थी, जहां प्रत्येक नमूना स्थिति (यानी, एन= 10) पर 10 अनुक्रमिक 10 मिलीसेकंड एक्सपोजर मापा गया था। लोहे से दूर एक हीम लोहे के समन्वित पानी के अणु की खुराक निर्भर प्रवास देखा गया था, साथ ही एसएसएक्स खुराक श्रृंखला में हेम प्रोप्रोवेशन समूहों में से एक में एक अनुरूप परिवर्तन भी देखा गया था। हालांकि एसएफएक्स संरचना की तरह नुकसान मुक्त नहीं है, खुराक श्रृंखला ने शून्य-खुराक डेटासेट (फेरिक हेम) की फे-ओ बॉन्ड लंबाई को एक्सट्रपलेटेड होने की अनुमति दी, इसके साथ एसएफएक्स से प्राप्त मूल्य के साथ प्रयोगात्मक त्रुटि के भीतर सहमत हो गया।

यहां वर्णित धारावाहिक क्रिस्टलोग्राफी डेटा संग्रह विधियों को भी आसानी से नए नमूना वातावरण प्रदान करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है, उदाहरण के लिए, कमरे के तापमान पर अवायवीय प्रोटीन संरचनाओं का अध्ययन करें। जैसा कि राबे एट अल 2020 48में उल्लिखित है, एक एरोबिक चैंबर में विभिन्न सीलिंग फिल्मों के साथ 'शीट-ऑन-शीट' नमूना, या 'चिपलेस चिप' लोड करने से डाइक्सिजन-संवेदनशील नमूनों से संरचनात्मक डेटा का कमरा तापमान संग्रह सक्षम होता है।

पंप जांच
हालांकि निम्नलिखित प्रतिनिधि परिणाम डायमंड बीमलाइन I24 में एकत्र नहीं किए गए थे, इन तरीकों को सीरियल क्रिस्टलोग्राफी विधि विकास में मानक विधियों की दिशा में काम करने के लिए iNEXT कार्यक्रम में सुविधाओं के बीच घनिष्ठ सहयोग से विकसित किया गया है। बीमलाइन I24 प्रदान करता है, या जल्द ही ऊपर प्रोटोकॉल में वर्णित तरीकों का उपयोग करके इस तरह के प्रयोगों को करने के लिए नीचे वर्णित लोगों के लिए समकक्ष संग्रह विधियों की पेशकश करेगा।

पंप जांच: रैपिड मिक्सिंग
फिक्स्ड टारगेट पर प्रतिक्रियाएं शुरू करने के लिए एक पीजो चालित ड्रॉपलेट इंजेक्टर का उपयोग करके मेहराबी एट अल (2019) 28 द्वारा पेट्रा III में बीमलाइन टी-आरईएक्स में रैपिड मिक्सिंग एसएसएक्स का प्रदर्शन किया गया है। यह काम चिप मिश्रण प्रयोग बाध्यकारी GlcNac3से lysozyme माइक्रोक्रिस्टल पर सिद्धांत का एक सबूत प्रस्तुत करता है, एक ७५ पीएल ड्रॉप के ५० एमएस के भीतर होने वाली बाध्यकारी के साथ नमूना करने के लिए लागू किया जा रहा है । इस अध्ययन के बाद एक 7 संरचना समय के साथ किया गया था जाइलोज आइसोमेरास गतिविधि की श्रृंखला हल, 15 एमएस के भीतर ग्लूकोज बाध्यकारी प्रदर्शन और एक ६० दूसरी बार देरी के बाद ग्लूकोज अणु में एक खुली अंगूठी संरचना के गठन । ड्रॉपलेट इंजेक्शन के लिए एक समकक्ष सेटअप वर्तमान में I24 पर उपयोग के लिए विकास के तहत है।

पंप-प्रोब: लाइट एक्टिवेशन
एक प्रकाश सक्रिय पंप जांच धारावाहिक प्रयोग Schulz एट अल (२०१८) ४९में प्रस्तुत किया है । फ्लोरोसेटेट डिहाइड्रोजनेस को फोटोकेज्ड फ्लोरोसेटेट से भिगोया गया था और 4 समय बिंदुओं (टी = 0, 30, 752, और 2,052 एमएस) पर संरचनाओं का उत्पादन करने के लिए 320-360 एनएम लेजर प्रकाश के साथ पंप किया गया था। आराम राज्य संरचना (0 एमएस) कुछ पानी के अणुओं के अपवाद के साथ, एक खाली सक्रिय साइट दिखाती है, और दोनों प्रोटीन सबयूनिट के कैप डोमेन के बीच समकक्ष घनत्व। 30 एमएस और 752 एमएस लाइट एक्टिवेशन के बाद सबयूनिट ए के सापेक्ष सबयूनिट बी के कैप डोमेन में इलेक्ट्रॉन घनत्व में काफी कमी देखी जा सकती है। सबयूनिट बी के कैप डोमेन में इलेक्ट्रॉन घनत्व में कमी सबयूनिट ए के सक्रिय स्थल में फ्लोरोसेटेट की उपस्थिति के साथ 752 एमएस पर मेल खाती है। 2,052 एमएस पर अंतिम डेटासेट लिगांड की और संरचनात्मक पुनर्व्यवस्था दिखाता है, जो एसएन2 हमले के लिए सही ज्यामिति को सुविधाजनक बनाने और प्रतिक्रिया में मध्यवर्ती राज्य के संभावित गठन को सुविधाजनक बनाता है। I24 पर, एक पोर्टेबल Pharos लेजर प्रणाली है जो 210-2500 एनएम से tunable है femtosecond दालें प्रदान प्रकाश सक्रियण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । प्रारंभिक प्रयोगों ने 308 एनएम उत्तेजना का उपयोग करके एक फोटोकेज की सफल सक्रियता को लक्षित प्रोटीन के लिए जारी लिगांड के बाध्यकारी के साथ दिखाया। बीमलाइन कार्मिक सुरक्षा प्रणाली में एकीकरण लिखने के समय चल रही है और नियमित उपयोगकर्ता प्रयोगों जल्दी २०२१ में प्रत्याशित हैं । प्रयोगों के लिए जब प्रकाश की कम तीव्र दालों की आवश्यकता होती है, तो टीटीएल नियंत्रित एलईडी के साथ प्रकाश-सक्रियण सफलतापूर्वक किया गया है।

Figure 1
चित्रा 1:डायमंड लाइट स्रोत पर जगह में नमूना लोडिंग उपकरण। सेट-अप में एक वैक्यूम पंप(ए),दस्ताने-बॉक्स(बी),और ह्यूमिडिफायर(सी)होते हैं। दस्ताने-बॉक्स वैक्यूम दबाव के भीतर एक स्टॉपकॉक(जी,नीले तीर) से जुड़े एक दबाव नियामक(एफ,पीले तीर) के माध्यम से, एक नमूना ब्लॉक (डी, हरे तीर) से जुड़े एक नमूना ब्लॉक(डी,हरे तीर) में आयोजित क्रिस्टल घोल से भरी हुई चिप पर कार्य करने के लिए प्रयोग किया जाता है। आर्द्र हवा को ह्यूमिडिफायर(एच)से जुड़े प्लास्टिक ट्यूबिंग के माध्यम से तम्बू में पंप किया जाता है, और एक हाइग्रोमीटर (i) का उपयोग करके मापाजाता है। कंपोनेंट्स को क्लैंप स्टैंड (जे) का उपयोग करके जगह में रखाजाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2:नमूना धारक। वे एक धातु ओ-रिंग(ए)का उपयोग एक शीर्ष(बी)और नीचे(ग)आधे पर पॉलिएस्टर फिल्म को दबाने के लिए करते हैं, जिसमें नीचे आधा स्पोर्टिंग मैग्नेटिक माउंट(डी)होता है जिसका उपयोग नमूना धारक को नमूना चरणों में संलग्न करने के लिए किया जाता है। पॉलिएस्टर फिल्म (6 माइक्रोन(ई)या 3 माइक्रोन(एफ))के साथ-साथ रबर ओ-रिंग्स (सफेद तीर) एक क्रिस्टल-लोडेड चिप को एक नमूना धारक में तेजी से सूखने से रोकती है जो हेक्स बोल्ट(जी)के साथ तंग बंद हो जाती है। चिप्स को डीएच 2 ओ, 1 एम एचसीएल और डीएच2ओ(एच)में अनुक्रमिक 15 मिनट के स्नान का उपयोग करके साफ कियाजाताहै। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3:I24 पर निश्चित लक्ष्य डेटा संग्रह के लिए डेटा संग्रह जीयूआई। (क)चिप्स को संरेखित करने और डेटा संग्रह मापदंडों को परिभाषित करने के लिए उपयोग किए जाने वाले मुख्य इंटरफेस को दिखाता है,(ख)डेटा संग्रह के लिए चिप के उप-क्षेत्रों को परिभाषित करने के लिए उपयोग किया जाने वाला मैपिंग लाइट इंटरफेस है और(c)लेजर रोशनी के लिए मापदंडों को परिभाषित करने के लिए एक इंटरफेस है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4:चरण 3, बिंदु 1 में वर्णित चरणों पर एक चिप धारक को रखने की प्रक्रिया। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 5
चित्रा 5:चिप संरेखण। एक चिप में दिखाया चिप पर तीन प्रत्ययी मार्कर पर क्लिक करके गठबंधन किया है(एक)। बीमलाइन ऑन-एक्सिस व्यूइंग सिस्टम के माध्यम से फिड्यूशियल 0, 1 और 2 के दृश्य(बी),(ग)और(घ)में दिखाए जाते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 6
चित्रा 6:स्टेप 6.1 में वर्णित ऑटो-प्रोसेसिंग परिणाम प्रदर्शित करता है। एक अद्यतन हिट दर साजिश(एक,इनसेट) प्रदर्शित किया जाता है । यदि संबंधित विवर्तन छवि पर 'हिट' क्लिक किया जाता है, तो डायल छवि दर्शक में प्रदर्शित किया जाता है। वर्तमान डेटा संग्रह के लिए हिट-दर (इस उदाहरण में 29.6%) दिखाया गया है। पैनल(ख)एक खिड़की का एक उदाहरण दिखाता है जिसमें यात्रा के दौरान अब तक एकत्र किए गए डेटा के लिए वर्तमान अनुक्रमण और एकीकरण दरों को दिखाया गया है जो वास्तविक समय में अपडेट करता है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 7
चित्र 7:अधिक गहराई से डेटा विश्लेषण। यूनिट सेल मापदंडों का दृश्य बहुरूपी(ए)प्रकट कर सकता है। औसत इकाई सेल मापदंडों की गणना की जाती है; हालांकि, यह अभी तक बहुरूपी के लिए व्यक्तिगत औसत तक विस्तार नहीं करता है। डेटा के एक छोटे सबसेट का दृश्य (दिखाया गया डेटा इब्राहीम एट अल 2019 में वर्णित डेटा से 793 कॉपर नाइट्राइट रिडक्टेज क्रिस्टल का सबसेट है) अक्सर रुझानों को प्रकट करने के लिए पर्याप्त होता है। लोडिंग या निर्जलीकरण प्रभावों के कारण उत्पन्न होने वाले विविधताओं को प्रकट करने के लिए उपयोगी मापदंडों के 2-डी भूखंडों का भी उत्पादन किया जा सकता है जिन्हें आगामी डेटा संग्रह(ख)के लिए संबोधित किया जा सकता है। स्टीरियोग्राफिक अनुमानों की उपस्थिति, या अनुपस्थिति, पसंदीदा झुकाव लोडिंग प्रोटोकॉल(सी)में वापस खिला प्रकट कर सकते हैं । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Discussion

धारावाहिक सिंक्रोट्रॉन डेटा संग्रह एमएक्स बीमलाइंस में अपेक्षाकृत नई तकनीक है, जो वर्तमान में XFELs और पारंपरिक सिंक्रोट्रॉन-आधारित एमएक्स पर किए जा रहे अल्ट्रा-फास्ट डेटा संग्रह के बीच के अंतर को पाटती है। इस पांडुलिपि का उद्देश्य बीमलाइन I24 पर फिक्स्ड टारगेट सीरियल डेटा को सफलतापूर्वक एकत्र करने का अवलोकन करना, कम खुराक के लिए डायमंड लाइट सोर्स, खुराक श्रृंखला और समय-हल किए गए प्रयोगों का अवलोकन करना है। मानक क्रिस्टलोग्राफी के साथ, नमूना तैयारी संरचना समाधान में एक प्रमुख बोतल गर्दन है। SSX अलग नहीं है, और पर्याप्त मात्रा में एक समरूप क्रिस्टल घोल की तैयारी अभी तक अध्ययन और एक बड़े प्रोटीन क्रिस्टल के विकास की तरह शोधन के कई दशकों से लाभ नहीं हुआ है । हालांकि, इन स्लरीज की तैयारी इस पेपर के दायरे से बाहर है और इसेकहींऔर संक्षेप में प्रस्तुत किया गया है । यहां वर्णित दृष्टिकोण में महत्वपूर्ण कदम में चिप लोडिंग (चरण 1) को सूचित करने के लिए जीयूआई इंटरफेस (चरण 3) और स्वचालित डेटा प्रोसेसिंग पाइपलाइन (चरण 6) का उपयोग करने में आसान उपयोग करने के लिए उपलब्ध नमूने का सावधानीपूर्वक उपयोग शामिल है और एक प्रयोग कैसे आगे बढ़ना चाहिए।

फास्ट फीडबैक पाइपलाइन एक शक्तिशाली उपकरण है जो उपयोगकर्ताओं को सफल डेटा संग्रह के लिए बाद में चिप लोडिंग प्रोटोकॉल को सूचित करने के लिए डेटा संग्रह के दौरान प्रारंभिक हिट दरों का आकलन करने की अनुमति देता है। जब कम हिट दर (<5%) का सामना करना पड़ा, तो उपयोगकर्ता अपूर्ण डेटा एकत्र करने और/या अतिरिक्त संग्रह के साथ बीमटाइम बर्बाद करने का जोखिम उठाते हैं । इस मामले में, नमूना पूल किया जा सकता है, कोमल अपकेंद्रित्र द्वारा केंद्रित है, और/या बड़ी मात्रा में कदम १.५ में लोड किया जा सकता है । एक उच्च हिट दर आम तौर पर अनुकूल होती है, हालांकि, कम रिटर्न का एक बिंदु होता है जहां ओवरलोडिंग एक ही कुएं में कई क्रिस्टल की ओर ले जाती है। DIALS बहु जाली विवर्तन डेटा50से निपटने में सक्षम है, लेकिन अनुक्रमण और एकीकरण की तुलना में एक बड़ी चिंता का कारण क्रिस्टल समूह लेजर प्रकाश या सटीक समय हल प्रयोगों के लिए तेजी से मिश्रण द्वारा क्रिस्टल की भी सक्रियण पर हो सकता है। इसलिए समय हल प्रयोगों के लिए ओवरलोडिंग फिक्स्ड टारगेट से बचने के लिए विशेष सावधानी बरती जानी चाहिए ।

अनुक्रमण और एकीकरण प्रसंस्करण कदम बीम दिशा का प्रतिनिधित्व करने वाले केंद्रीय क्रॉस के साथ एक साजिश पैदा करता है, प्रत्येक बिंदु व्यक्तिगत जाली के एचकेएल 001 प्रतिबिंब की दिशा का प्रतिनिधित्व करता है, और बीम धुरी से 90 डिग्री दूर के रोटेशन का प्रतिनिधित्व करने वाला सर्कल का बाहरी अंगूठी। यह दिखाएगा कि आपके क्रिस्टल में पसंदीदा अभिविन्यास है, जो डेटा पूर्णता को प्रभावित कर सकता है और अधिक डेटा एकत्र करने या लोडिंग प्रोटोकॉल में भिन्नता की आवश्यकता को इंगित कर सकता है। चित्रा 7cके बाएं हाथ के पैनल में, HEWL क्रिस्टल के साथ एक चिप ओवरलोडिंग का प्रभाव दिखाया गया है। जैसे ही एपर्चर अधिक क्रिस्टल से भरते हैं, वे यादृच्छिक अभिविन्यास में आधार पर ढलने के बजाय एपर्चर की कोण वाली दीवारों से चिपके रहते हैं। दो ऑर्थोगोनल एलिप्सेस चिप की आंतरिक दीवारों पर पड़े क्रिस्टल का परिणाम हैं जो बीम दिशा में ~ 35 डिग्री पर हैं। यह लोड किए गए क्रिस्टल की मात्रा को कम करता है, हिट दर को कम करता है, और नाटकीय रूप से इन पसंदीदा विमानों में पड़े क्रिस्टल के अंश को कम कर देता है।

यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि अन्य धारावाहिक दृष्टिकोण I24 पर उपलब्ध हैं, जैसे एलसीपी एक्सट्रूडर और माइक्रोफ्लूडिक चिप्स। ये समान जीयूआई का उपयोग करते हैं और उपरोक्त में से बहुत कुछ एक ही प्रसंस्करण पाइपलाइन लागू रहेगी, भले ही एक अलग तकनीक का उपयोग किया जाता है। यहां वर्णित निश्चित लक्ष्य दृष्टिकोण से परे एसएसएक्स और एसएफएक्स दोनों के लिए कई धारावाहिक दृष्टिकोण मौजूद हैं, प्रत्येक के प्रयोग के आधार पर दूसरे पर कुछ फायदे हैं और प्रयोग के लिए उपयोग की जाने वाली बीमलाइन है। चूंकि धारावाहिक दृष्टिकोण तेजी से विकसित हो रहे हैं, इसलिए हाल के अपडेट के लिए बीमलाइन वेबपेज (https://www.diamond.ac.uk/Instruments/Mx/I24.html) की जांच करने और बीमटाइम की योजना बनाते समय यथासंभव शुरुआती चरण में बीमलाइन कर्मचारियों से बात करने की सलाह दी जाती है। मानक और धारावाहिक प्रयोगों के लिए I24 तक पहुंच उपयोग के बिंदु पर मुफ्त है। ब्रिटेन और यूरोपीय संघ के उपयोगकर्ताओं के लिए यात्रा और आवास लागत आंशिक रूप से iNEXT डिस्कवरी के माध्यम से कवर कर रहे हैं ।

Acknowledgments

इस काम को यूरोपीय आयोग के क्षितिज 2020 कार्यक्रम द्वारा वित्त पोषित iNEXT-डिस्कवरी (ग्रांट 871037) द्वारा समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Chip Holders Custom Built N/A In-house custom built metallic chip holders consisting of 2 magnetic base plates, 2 metal rings, and a kinematic mount.
Chipless Chip Spacers SWISCII N/A LCP adhesive sheets available as part of the LCP modular range
Geobrick LV-IMS-II Delta Tau N/A A multi-axis controller/amplifier with a custom Diamond Light Source hardware configuration
Kinematic Mounts ThorLabs KB25/M Square bases with 3 magnets arranged in a triangle affixed to chip holders.
KNF Laboport Vacuum Pump Merck Z262285-1EA Solid PTFE vauum pump, 10 l/min pumping speed.
Mylar Sheets 6 µm Fisher Scientific 15360562 300 ft roll of 6 µm thick mylar XRF film by SPEX SamplePrep
Mylar Sheets 3 µm Fisher Scientific 04-675-4 300 ft roll of 3 µm thick mylar XRF film by SPEX SamplePrep
Pelco easiGlow Glow Discharge System Ted Pella, INC. 91000 A compact stand alone glow discharge system used to produce hydrophillic surfaces
Silicon Chips University of Southampton N/A Custom etched silicon chips with 25,6000 apertures available in a variety of sizes.
Translation Stages Smaract N/A XYZ sample stages are a collaborative design by Diamond Light Source and SmarAct, custom-built by SmarAct using three linear translation 50mm travel stages, precise crossed roller guideways, and an integrated sensor with up to 1 nm resolution
1byOne Humidifier (701UK-0003 ) 1byOne B01DENO0EQ Commercially available 1.3 Litre ultrasonic humidifier

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Schlichting, I. Serial femtosecond crystallography: the first five years. IUCrJ. 2 (2), 246-255 (2015).
  2. Diederichs, K., Wang, M. Serial Synchrotron X-Ray Crystallography (SSX). Protein Crystallography: Methods and Protocols. Wlodawer, A., Dauter, Z., Jaskolski, M. , Springer. New York, NY. 239-272 (2017).
  3. Pearson, A. R., Mehrabi, P. Serial synchrotron crystallography for time-resolved structural biology. Current Opinion in Structural Biology. 65, 168-174 (2020).
  4. Chapman, H. N. Structure Determination Using X-Ray Free-Electron Laser Pulses. Protein Crystallography: Methods and Protocols. Wlodawer, A., Dauter, Z., Jaskolski, M. , Springer New York. New York, NY. 295-324 (2017).
  5. Chavas, L. M., Gumprecht, L., Chapman, H. N. Possibilities for serial femtosecond crystallography sample delivery at future light sources. Structural Dynamics. 2 (4), 041709 (2015).
  6. Dauter, Z., Wlodawer, A. Progress in protein crystallography. Protein & Peptide Letters. 23 (3), 201-210 (2016).
  7. Owen, R. L., Rudiño-Piñera, E., Garman, E. F. Experimental determination of the radiation dose limit for cryocooled protein crystals. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (13), 4912-4917 (2006).
  8. Garman, E. F., Weik, M. X-ray radiation damage to biological samples: recent progress. Journal of Synchrotron Radiation. 26, Pt 4 907-911 (2019).
  9. Axford, D., et al. In situ macromolecular crystallography using microbeams. Acta crystallographica. Section D, Biological crystallography. 68, Pt 5 592-600 (2012).
  10. Warren, A. J., Axford, D., Paterson, N. G., Owen, R. L. Exploiting Microbeams for Membrane Protein Structure Determination. Advances in Experimental Medicine and Biology. 922, 105-117 (2016).
  11. Sanishvili, R., Fischetti, R. F. Applications of X-Ray Micro-Beam for Data Collection. Protein Crystallography: Methods and Protocols. Wlodawer, A., Dauter, Z., Jaskolski, M. , Springer New York. New York, NY. 219-238 (2017).
  12. Wierman, J. L., et al. Fixed-target serial oscillation crystallography at room temperature. IUCrJ. 6 (2), 305-316 (2019).
  13. Maeki, M., et al. Room-temperature crystallography using a microfluidic protein crystal array device and its application to protein-ligand complex structure analysis. Chemical Science. 11 (34), 9072-9087 (2020).
  14. Grunbein, M. L., Nass Kovacs, G. Sample delivery for serial crystallography at free-electron lasers and synchrotrons. Acta Crystallographica Section D. 75 (2), 178-191 (2019).
  15. Weierstall, U. Liquid sample delivery techniques for serial femtosecond crystallography. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 369 (1647), 20130337 (2014).
  16. Botha, S., et al. Room-temperature serial crystallography at synchrotron X-ray sources using slowly flowing free-standing high-viscosity microstreams. Acta crystallographica. Section D, Biological crystallography. 71, Pt 2 387-397 (2015).
  17. Kovácsová, G., et al. Viscous hydrophilic injection matrices for serial crystallography. IUCrJ. 4, Pt 4 400-410 (2017).
  18. Monteiro, D. C. F., et al. A microfluidic flow-focusing device for low sample consumption serial synchrotron crystallography experiments in liquid flow. Journal of Synchrotron Radiation. 26 (2), 406-412 (2019).
  19. Monteiro, D. C. F., et al. 3D-MiXD: 3D-printed X-ray-compatible microfluidic devices for rapid, low-consumption serial synchrotron crystallography data collection in flow. IUCrJ. 7, Pt 2 207-219 (2020).
  20. Mueller, C., et al. Fixed target matrix for femtosecond time-resolved and in situ serial micro-crystallography. Structural Dynamics. 2 (5), 054302 (2015).
  21. Owen, R. L., et al. Low-dose fixed-target serial synchrotron crystallography. Acta Crystallographica Section D: Structural Biology. 73, Pt 4 373-378 (2017).
  22. Keedy, D. A., et al. Mapping the conformational landscape of a dynamic enzyme by multitemperature and XFEL crystallography. eLife. 4, (2015).
  23. de la Mora, E., et al. Radiation damage and dose limits in serial synchrotron crystallography at cryo- and room temperatures. Proceedings of the National Academy of Sciences. 117 (8), 4142-4151 (2020).
  24. Barends, T. R., et al. Direct observation of ultrafast collective motions in CO myoglobin upon ligand dissociation. Science. 350 (6259), 445-450 (2015).
  25. Pande, K., et al. Femtosecond structural dynamics drives the trans/cis isomerization in photoactive yellow protein. Science. 352 (6286), 725-729 (2016).
  26. Standfuss, J., Spence, J. Serial crystallography at synchrotrons and X-ray lasers. IUCrJ. 4 (2), 100-101 (2017).
  27. Grünbein, M. L., et al. Illumination guidelines for ultrafast pump-probe experiments by serial femtosecond crystallography. Nature Methods. 17 (7), 681-684 (2020).
  28. Mehrabi, P., et al. Liquid application method for time-resolved analyses by serial synchrotron crystallography. Nature Methods. 16 (10), 979-982 (2019).
  29. Beyerlein, K. R., et al. Mix-and-diffuse serial synchrotron crystallography. IUCrJ. 4, Pt 6 769-777 (2017).
  30. Schmidt, M. Mix and Inject: Reaction Initiation by Diffusion for Time-Resolved Macromolecular Crystallography. Advances in Condensed Matter Physics. , 167276 (2013).
  31. Kupitz, C., et al. Structural enzymology using X-ray free electron lasers. Structural Dynamics. 4 (4), 044003 (2017).
  32. Stagno, J. R., et al. Structures of riboswitch RNA reaction states by mix-and-inject XFEL serial crystallography. Nature. 541 (7636), 242-246 (2017).
  33. Shilova, A., et al. Current status and future opportunities for serial crystallography at MAX IV Laboratory. Journal of Synchrotron Radiation. 27 (5), 1095-1102 (2020).
  34. Huang, C. -Y., et al. In meso in situ serial X-ray crystallography of soluble and membrane proteins. Acta Crystallographica Section D. 71 (6), 1238-1256 (2015).
  35. Gao, Y., et al. High-speed raster-scanning synchrotron serial microcrystallography with a high-precision piezo-scanner. Journal of Synchrotron Radiation. 25 (5), 1362-1370 (2018).
  36. Beale, J. H., et al. Successful sample preparation for serial crystallography experiments. Journal of Applied Crystallography. 52, Pt 6 1385-1396 (2019).
  37. Doak, R. B., et al. Crystallography on a chip - without the chip: sheet-on-sheet sandwich. Acta Crystallographica Section D: Structural Biology. 74, Pt 10 1000-1007 (2018).
  38. Axford, D., Aller, P., Sanchez-Weatherby, J., Sandy, J. Applications of thin-film sandwich crystallization platforms. Acta Crystallographica Section F: Structural Biology Communications. 72, Pt 4 313-319 (2016).
  39. Davy, B., et al. Reducing sample consumption for serial crystallography using acoustic drop ejection. Journal of Synchrotron Radiation. 26 (5), 1820-1825 (2019).
  40. Brewster, A. S., et al. Improving signal strength in serial crystallography with DIALS geometry refinement. Acta Crystallographica Section D. 74 (9), 877-894 (2018).
  41. Winter, G., et al. DIALS: implementation and evaluation of a new integration package. Acta Crystallographica Section D. 74 (2), 85-97 (2018).
  42. Ebrahim, A., et al. Resolving polymorphs and radiation-driven effects in microcrystals using fixed-target serial synchrotron crystallography. Acta Crystallographica Section D. 75 (2), 151-159 (2019).
  43. Brehm, W., Diederichs, K. Breaking the indexing ambiguity in serial crystallography. Acta Crystallographica Section D. 70 (1), 101-109 (2014).
  44. White, T. Processing serial crystallography data with CrystFEL: a step-by-step guide. Acta Crystallographica Section D. 75 (2), 219-233 (2019).
  45. Shi, Y., Liu, H. EM-detwin: A Program for Resolving Indexing Ambiguity in Serial Crystallography Using the Expectation-Maximization Algorithm. Crystals. 10 (7), 588 (2020).
  46. Gildea, R. J., Winter, G. Determination of Patterson group symmetry from sparse multi-crystal data sets in the presence of an indexing ambiguity. Acta Crystallographica Section D. 74 (5), 405-410 (2018).
  47. Ebrahim, A., et al. Dose-resolved serial synchrotron and XFEL structures of radiation-sensitive metalloproteins. IUCrJ. 6 (4), 543-551 (2019).
  48. Rabe, P., et al. Anaerobic fixed-target serial crystallography. IUCrJ. 7 (5), 901-912 (2020).
  49. Schulz, E. C., et al. The hit-and-return system enables efficient time-resolved serial synchrotron crystallography. Nature Methods. 15 (11), 901-904 (2018).
  50. Gildea, R. J., et al. New methods for indexing multi-lattice diffraction data. Acta Crystallographica Section D. 70 (10), 2652-2666 (2014).

Tags

बायोकेमिस्ट्री अंक 168 सीरियल क्रिस्टलोग्राफी स्ट्रक्चरल बायोलॉजी मैक्रोमॉलिकुलर क्रिस्टलोग्राफी
डायमंड लाइट सोर्स पर फिक्स्ड टारगेट सीरियल डेटा कलेक्शन
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Horrell, S., Axford, D., Devenish,… More

Horrell, S., Axford, D., Devenish, N. E., Ebrahim, A., Hough, M. A., Sherrell, D. A., Storm, S. L. S., Tews, I., Worrall, J. A. R., Owen, R. L. Fixed Target Serial Data Collection at Diamond Light Source. J. Vis. Exp. (168), e62200, doi:10.3791/62200 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter