Summary
ヘルムホルツ・ツェントルムベルリンでの結晶学的断片スクリーニングは、専用の複合ライブラリ、結晶処理ツール、高速データ収集機能、および大部分が自動化されたデータ分析を含むワークフローを使用して行われます。提示されたプロトコルは、下流の構造ベースのリガンド設計の有望な出発点を提供するために、このような実験の出力を最大化することを意図しています。
Abstract
フラグメントスクリーニングは、リガンド設計の有望な出発点を特定するのに役立つ技術です。標的タンパク質の結晶が利用可能であり、再現的に高解像度のX線回折特性を示していることを考えると、結晶学はその感度のために断片スクリーニングのための最も好ましい方法の一つです。さらに、フラグメントの結合モードの詳細な3D情報を提供する唯一の方法であり、その後の合理的な化合物の進化に不可欠である。この方法の日常的な使用は、適切なフラグメントライブラリの可用性、多数のサンプルを処理するための専用手段、高速回折測定のための最先端のシンクロトロンビームライン、および結果の分析のための大部分の自動化されたソリューションに依存します。
ここでは、ヘルムホルツ・ツェントルム・ベルリン(HZB)で結晶学的断片スクリーニング(CFS)を実施する方法に関する完全な実用的なワークフローと付属のツールを紹介します。このワークフローに先行して、結晶浸漬条件とデータ収集戦略は、再現可能な結晶学的実験に最適化されています。次いで、通常、1〜2日間の手順で、乾燥済みの使用可能なプレートとして提供される96メンバーのCFSに焦点を当てたライブラリを採用して192個の結晶を浸し、次いで個別にフラッシュ冷却します。最終的な回折実験は、ベルリン・アドラーショフ(ドイツ)のHZBが操作するBESSY II電子貯蔵リングのロボット取り付け対応ビームラインBL14.1およびBL14.2で1日以内に行うことができます。結晶構造データの処理、タンパク質構造の改良、ヒット識別は、専用サーバー上の専用のソフトウェアパイプラインを使用して迅速かつ大部分が自動化され、ユーザー入力がほとんど必要とされません。
HZBでCFSワークフローを使用すると、定期的なスクリーニング実験が可能になります。これは、より強力な結合剤を開発するための出発点としてフラグメントヒットの同定に成功する可能性を高めます, 薬理学的または生化学的なアプリケーションに有用.
Introduction
医薬品開発の最初のステップは、目的のターゲットに対する化合物のスクリーニングです。従来、100,000-1,000,000エントリの順に大規模な化合物ライブラリは、製薬業界でハイスループット生化学アッセイに使用されています。この戦略は、フラグメントベースの薬物設計(FBDD)によって補完され、過去20年間に急激な上昇を取り、その方法1のいくつかの固有の利点のために高品質のリード候補を生成する主流の戦略となった新しい方法である。「断片」という用語は、典型的には20未満の非水素または重原子(HA)未満を含む小さな有機分子を指す。したがって、断片は、従来のハイスループットスクリーニングで検討された薬物または鉛様分子(通常は30 H未満)よりも有意に小さい。断片は弱親和性結合剤である。しかし、より大きな分子に比べて、断片はより汎用性が高く、それらの小さなコレクションでさえも同じサイズ2の分子のそれぞれの化学的空間をよりよく表すことができるので。また、リード分子へのフラグメントスクリーニングヒットの進化は、すでに大きな分子2、3、4、5を最適化するよりもかなり効果的です。つまり、検出の十分な感度を保留して、フラグメントのスクリーニングを効率的に採用し、更なる化合物進化のための高品質な出発点を生み出すことができる。いくつかの生物物理学的方法は、核磁気共鳴、X線結晶学、表面プラズモン共鳴および熱シフトアッセイである最も一般的な断片スクリーニングに適用することができる。これらの方法は、ヒットに対する信頼度を高め、それぞれ偽陽性または偽陰性の数を減らすことを目的として、並列または連続的に使用されます。しかし、最近実施された比較研究6は、異なる方法間の重複が少ないため、逐次スクリーニングカスケードを避けるべきであることを示唆した。
X線結晶学は原子の細部での構造決定のための十分に確立された方法であるが、最近はまた、スクリーニング目的のためのツールとして開発された7、8。タンパク質結晶は高い断片濃度(例えば、100 mM)を許容するので、結晶学的断片スクリーニング(CFS)は、断片をスクリーニングするための他の生物物理学的方法と競合したり、第1段階スクリーニング方法6、9としてそれらを上回ったりすることができる。しかし、CFSの重要な前提条件は、回折特性を持つ結晶をかなり高い分解能で再現的に送達する標的タンパク質の検証された結晶化システムであり、典型的には2Åより優れている。
他のすべてのフラグメントスクリーニング方法論と比較してCFSの排他的な利点は、同定された断片の結合モードに関する詳細な3D情報を提供することです。この構造情報は、より親和性の高い結合剤に対するフラグメントヒットの合理的な最適化にとって絶対に重要です。確立された精緻化戦略は、フラグメントヒットの増加、マージ、リンクのヒット 5.これにより、比較的高いリガンド効率が最初から提供され、不必要なまたは空間的に適さない基の導入が回避され、化学合成コストを削減できる。全体として、CFSは医薬品設計の開始戦略として比類のない利点を持っています。
特定の生物学的ターゲットが結晶質に関するCFSの高い要件を満たしていることを考えると、そのようなスクリーニングキャンペーンの成功の可能性を最大化するいくつかの主な要因があります。それは使用される断片ライブラリの質、回折実験の前に実験を行うための効率的なワークフロー、十分な自動化およびデータ収集速度を有するシンクロトロンビームライン、ならびに大部分が自動化されたデータ処理および分析のための方法および手段に依存する。ここでは、結晶浸漬実験からヒット識別までの完全なワークフローが提示され、BESSY IIの高分子結晶学ビームラインで正常に確立される方法で(図1)。この施設は、共同研究のために、学術および産業のユーザーに開放されています。さらに、ドイツ国外のEU諸国の学術ユーザーは、iNEXT Discoveryプロジェクトを通じて簡単に資金を申請することができます。
CFSキャンペーンを開始し、この作業で概説されているプロトコルを実施するために不可欠な前提条件があります:標的タンパク質の十分に拡散結晶は、再現的に大量に成長することができ、周囲温度で安定であり、揮発性の高い成分のない結晶カクテルを使用して成長しました。もう一つの前提条件は、実験のための結晶格子の適合性です。適切な格子では、標的タンパク質の興味深い部位を溶媒チャネルに向けて露出させ、したがってアクセス可能としなければならない。CFS キャンペーンのワークフローで成功を収めるために、オプションですが、それでもなお、その他の手順は実験の浸漬条件の最適化です。重要なベンチマーク統計は、結晶の回折力と、データスケーリング手順の間に決定される関連するデータ品質指標です。最適化する代表的な要因としては、DMSO耐性、緩衝液濃度、凍結保護剤があります。さらに以下に詳述する厳密な前提条件ではないが、DMSOを共溶媒として、フラグメント可溶化を増加させるのに役立つ。一般的なテストには、一晩で 0、3、6、または 10% (v/v) DMSO の浸漬を含める必要があります。バッファー濃度を 200 mM または 300 mM に増加させることで、使用する高いフラグメント濃度から生じる時折の pH シフト効果による回折品質の損失を防ぐことができます。最後に、どの追加の凍結保護剤が必要かどうか、そしてそれがすでに浸漬状態に含むことができるかどうかを調べるのが決定的です。しかし、DMSO自体が凍結保護剤として機能する可能性があるため、多くの場合、追加の凍結保護剤は必要ありません。その場合、最終的な実験で 1 つの処理ステップが保存されます。ほとんどの結晶は、適切なサイズのループでフラッシュ冷却した場合、クライオプロテクタントを少なくする必要があります。しかし、まれに、フラッシュ冷却時の結晶の損傷を防ぐために、母液の層が実際に必要です。
CFSキャンペーンで得られるヒット数は、標的タンパク質の薬剤の可否や結晶格子の適合性(上記参照)に依存するだけでなく、ライブラリの品質にも依存します。ライブラリの品質は、2つの側面を含む:ライブラリのための化合物の選択と化合物の菓子、(すなわち、実験のために提示される物理的な形態)。複合選択のために異なる戦略を採用することができます。ほとんどのライブラリ設計には、フラグメントの化学的多様性の最大化が含まれます。戦略的な焦点は、例えばDiamond-SGC-iNEXTの構図10に適用されたフォローアップ設計のための断片の化学的トラトラビリティを含むことができる。さらに、ライブラリ設計のもう一つの戦略的焦点は、HZB11で開発されたF2Xライブラリによって例示されているように、形状およびファーマコフォアベースのクラスタリングによって、商業的に入手可能な断片の化学空間の表現を最大化することである可能性がある。具体的には、F2Xエントリー画面と呼ばれる初期CFSキャンペーン用の1103メンバーのF2X-ユニバーサルライブラリおよび代表的な96-複合サブセットが開発され、F2Xエントリー画面が正常に検証されました11.F2Xエントリー画面は、HZBでのCFSキャンペーンの主要な選択肢です。その後、F2X-ユニバーサルライブラリまたはHZBでも提供されている1056メンバーのEU-OPENSCREENフラグメントライブラリ12 を使用して、より大きなキャンペーンを実施することができます。現在、これらのライブラリは、コラボレーション契約に基づいてベルリンのBESSY IIシンクロトロンの高分子結晶ビームラインのユーザーのために利用可能です。これは、iNEXT ディスカバリー提案を使用したユーザーにも適用されます。さらに、F2X-Entry画面は、物質移転契約に基づいて、すべての興味のある科学者が利用できます。
ライブラリの物理的な表示に関しては、一般的に2つのアプローチが採用されています:断片はDMSOストック溶液として使用されるか、または断片が乾燥してすぐに使用できるプレートに固定化される。HZBでは、F2XエントリースクリーンとF2X-ユニバーサルライブラリの不揮発性化合物の両方が、3レンズ96ウェルMRCロープロファイル結晶板で乾燥した化合物として提示されます。結晶板に固定化された断片の提示は2つの重要な利点を有する:第1に、スクリーニングプレートのユーザーのホームラボへの輸送を可能にする。したがって、ここで示すワークフローの浸漬および結晶処理のステップ(ステップ1〜3)はどこでも行うことができます。第二に、DMSOフリーの溶液を採用することができる。DMSOに敏感なターゲットは、主に予想ヒット率11を保持し、簡単にスクリーニングすることができます。しかし、DMSOはフラグメント溶解性を高めるため、上記で概説したように、選択した結晶系のDMSO耐性を事前にチェックする価値があります。
以下に概説するプロトコルは、F2X入力画面のような96複合スクリーンを用いた典型的な実験を説明する。そのためには、約250個の結晶を新しく使用するのに間に合うように準備する必要があります。重複するすべての96化合物の浸漬を準備することは非常に推奨されます。これは推奨されますが、オプションで、後でヒット識別13のためのパンデータ密度分析(PanDDA)アプローチを使用してデータ分析に役立つ追加のモックソークを準備します。Mock-soaksは、同じインキュベーション時間に浸漬する断片と同じ浸漬溶液を使用してタンパク質結晶に浸漬実験と定義されるが、断片は存在しない。浸漬溶液が結晶化条件と等しい場合、結晶は結晶板から直接収穫され得る。
ロボットサンプルチェンジャの機能に応じて、異なるパック形式を使用する必要があります。現時点では、HZBが動作するビームラインBL14.1のサンプルはユニパック形式で用意する必要があります。このプロトコルでは、Unipuck 形式での準備が想定されます。
Protocol
1.水晶を浸す
- スクリーニングプレート(ここではF2X入力スクリーンプレート、 図2)を-20°C冷凍庫から取り出し、ベンチ/テーブルに約30分間置いて室温に予熱し、凝縮水分を避けます。
- 2つの密接に配置された顕微鏡と必要なすべてのツールで作業場所を配置します(図3A)。これらの資料は、 材料表にリストされています。
- 浸す結晶の転送に適したサイズの3-4ループを選択し、顕微鏡の近くに置きます。
- ガラススポットプレートキャビティに脱イオンまたは蒸留水を充填します。
- 浸漬液5 mLを準備します。
- スクリーニングプレートの袋を切り開き、予め温め、室温にします。
- プレートをベンチ/テーブルに置いたまま、蓋とホイルをスクリーニングプレートから取り外します。
- 試薬貯留槽内の浸漬液の5 mLをデカントする。
- 12チャンネルピペットを使用して、96個の各リザーバに40 μLの浸漬液を充填します。
- スクリーニングプレートの上にEasyAccessフレームを置き、デバイスの左右にスライドさせて、付属のクランプで固定します。
メモ:イージーアクセスフレームは、HZB14で開発された複数の結晶を扱うための特別なデバイスです。それは蒸発から他の井戸を保護しながら移動可能なタイルをシフトすることによって、各井戸への容易なアクセスを可能にする。 - スクリーニングプレート(EasyAccessフレームを含む)を第1の顕微鏡の下に置き、第2の顕微鏡で浸す結晶を含む結晶化板を配置します。
- 簡単アクセスフレームのアクリルガラスタイルを指または付属のペンツールで動かして、スクリーニングプレートのA1をスライドさせます。
- 新鮮なピペットチップを使用して、貯蔵所からよく含まれる断片(左上レンズ)に0.4 μLの浸漬溶液を追加します。顕微鏡を通して、ドロップが乾燥した断片を覆っていることを確認して、溶解することができます。
注:このステップは、EasyAccessフレームの組み立て前にピペットロボットを使用して行うことができます。このようにして、すべての井戸の浸漬滴を1つの自動手順に配置することができます。しかし、著者らは、断片がゆっくりと結晶の存在下で可溶化することを確実にするために、記載されているように浸漬ステップの直前に浸漬溶液を追加することを推奨している。これは、結晶が高い断片濃度のドロップに移ると突然の衝撃を経験することを避ける。 - 第2顕微鏡下で、対象結晶を含むウェルの1つで結晶化板のシール箔を切開する。
- 結晶杖に取り付けられた適切なサイズのループを用いて2つの結晶を第1の顕微鏡下でスクリーニングプレートのウェルA1に移す。
- 準備したガラススポットプレートでループを洗い、組織にそっと触れて乾燥させます。浸漬溶液を含む断片との交差汚染を避けるために、すべての転送後にこれを行います。
- 顕微鏡を使用して、結晶が適切に配置されていることを確認します。
- 次の井戸(例えば、B1)に移動します。
- 各浸漬ドロップに2つの結晶が含まれるまで、スクリーニングプレートのすべての96ウェルでステップ1.13-1.18を繰り返します。
- 顕微鏡下からスクリーニングプレート(イージーアクセスフレームを含む)を取り外し、ベンチ/テーブルに置きます。
- スクリーニングプレートからイージーアクセスフレームを取り外します。
- スクリーニングプレートをシールホイルで密封し、結晶が成長した結晶化インキュベーターまたは食器棚にそれぞれ置きます。
- 最適化された浸漬時間のためにインキュベート。一晩は通常便利です。
- (オプション)約40個のアポ結晶の調製(すなわち、模擬浸漬)
- MRC 3レンズ96ウェル低プロファイルの結晶化プレートを取り、12チャンネルピペットを使用して、ウェルあたり40 μLの浸漬溶液で2つのカラムを充填します。
- EasyAccess フレームを結晶化プレートの上に置き、付属のクランプでデバイスの左右にスライドさせて固定します。
- よくA1のアクリルガラスタイルを開いてスライド。
- ウェルの左レンズ2枚に0.4μLの浸漬液を入れる。
- 各ドロップに2〜3結晶を転送します。各移送後、準備したガラススポットプレートでループを洗い、組織にそっと触れて乾燥させます。
- 次のウェル(例えば、B1)に移動します。
- 約40個の結晶がインキュベーションの準備ができるまで、ステップ1.24.4-1.24.6を繰り返します。
- 顕微鏡下からベンチ/テーブルに結晶化プレート(イージーアクセスフレームを含む)を取り外し、EasyAccessフレームを取り外します。
- シールホイルで結晶板を密封し、前述の結晶化インキュベーターまたは食器棚に入れる。
- スクリーニングプレートと同時にインキュベートする。
2.結晶の収穫
- インキュベーターまたは食器棚からインキュベートプレートを取り出します。
- 1つの顕微鏡と必要なすべてのツールで作業場所を配置します(図3B)。材料は、材料表にリストされています。
- 3つのUnipuckのふた(例えば、サンプルエンクロージャ)でユニパックフォームデュワーを準備し、液体窒素(LN2)でそれを満たす。
注:LN2 を操作するための適切な安全対策を遵守してください(すなわち、安全ゴーグルを着用し、適切な保護具を使用してください)。LN2 ストレージ缶の水凝縮を避けるために、セッション中に数回新鮮な LN2 を取得することをお勧めします。以下の手順全体を通して、泡デュワーのLN2 レベルが常にデュワーの上端に達していることを確認してください。また、LN2 が氷を含まないことも確認してください。頻繁にLN2( 例えば、45分に一度)を交換するか、氷が蓄積し始める場合は最新。その後、第二の泡のデュワーを記入し、それにユニパックを転送します。凍った泡デュワーを空にし、ブロードライヤーで残留氷と水分を取り除きます。 - スクリーニングプレートからホイルを取り外し、イージーアクセスフレームを上に置きます。
- スライドは、よく開きます A1.
- 落下から2つの結晶を収穫し、LN2 に速い垂直移動で突っ込み、適切なパック位置にサンプルを挿入することによって、LN2(1 つずつ)でそれらをフラッシュクールします。サンプル追跡シートに関連するメモを取ります。
- 凍結保護ステップ(ターゲット結晶に必要な場合)。このような場合は、2.6 ではなくこの手順を実行します。
- ウェルの左下レンズにクライオプロテクションを含む浸漬液を0.4μL置きます。
- 左上レンズの落下からゆっくりと左下レンズの溶液を通して、ループをループに入れてループを引き、次にLN2でフラッシュクールにします。この方法で2つの結晶を収穫します。
注:手順2.6と2.7では、結晶がループ中で空気にさらされる時間が非常に短く保たれていることを確認してください。急落(すなわち、LN2-充填されたデュワーにおけるサンプルの垂直落下)は、できるだけ速く行われるべきである。これにより、データ内の高いサンプル品質と氷リングの防止が保証されます。サンプルを追跡し(すなわち、結晶に損傷がある場合は注意してください)、次のX線測定のために重複する方に優先順位を付けるために、そのテンプレートを使用します。水晶にひび割れ、染み込みによる「毛」などの欠陥があっても、使用することができ、常に収穫する必要があります。結晶がいくつかの部分に分割された場合は、最大/最高の見た目の作品の2つを収穫する必要があります。 図5 は、このような結晶がどのように見えるかの例を示しています。示されたすべての結晶は、それぞれのキャンペーン11でまだ有用なデータセットを与え、たとえ実質的な形態学的変化が起こったとしても、浸漬処理後に結晶を収穫する価値があることを強調した。
- 次の井戸に移動し、3つのパックがすべて満たされるまでステップ2.5 - 2.6./2.7を繰り返します。
- LN2で事前に冷却した後、蓋の上にユニパック ベースを追加します。
- ユニパックは、輸送用のデュワーまたはストレージデュワーのストレージラックに保管してください。
- スクリーニングプレートのすべてのウェルが処理されるまで、上記の手順を繰り返します。
- (オプション)模擬浸した結晶を調製した場合は、事前に説明したように同様の方法で収穫してください。
注:スクリーニングプレートの96の条件のそれぞれに対して2つの結晶をフラッシュ冷却できる場合、32個の模擬アポ結晶のためのスペースがあり、14のユニパックを埋めることができます。 - 測定までLN2 でユニパックを保管してください。
3.データ収集
- ユニパックをビームライン BL14.1 に転送します。SPINE パックがステップ 2 で使用されている場合は、ビームライン BL14.2 に転送します。
- 以下に示す特定の推奨事項を使用して、ビームライン上で標準測定を実行します。施設と実験制御プログラムMXCuBE2に関する詳細は、以前に15,16を提示されています。図4はビームラインBL14.1およびBL14.2の実験ハッチの内部およびビームラインBL14.1のMXCuBE2制御ソフトウェアの例のスクリーンショットを示す。
- 時間効率とスループットを最大化するには、テスト イメージのコレクションをスキップします。サンプルから検出器までの距離は、以前の実験で決定された結晶系の上限に適した値に固定されます。データ収集戦略が事前に最適化されていない場合は、1 枚の画像につき 0.1 秒の露出時間で、0.2 度の画像を収集します。
- 理想的には、モック浸しのアポ結晶を使用して、以前の実験でデータ収集戦略をテストします。より高い対称空間グループの場合、1200個の画像または900画像(それぞれ240°または180°)は、データ収集の開始角度に関係なく、良好な統計量を持つ完全なデータセットをすでに提供します。
注:高い冗長性と細かいスライスは、優れたデータ品質17を得ることができます。しかし、ここで提案されたこの「十分だがそれ以上ではない」戦略を使用することは、品質、データ収集時間、および後で分析するための計算要件の間の優れたトレードオフです。説明方法では、ビームラインBL14.1およびBL14.2では24時間で200のデータ収集が可能です。それにもかかわらず、サンプルは優先順位付けされるべきです。 - まず、ステップ 2.6./2.7 の優先順位付けに基づいて、フラグメント条件ごとに 1 つのサンプルの回折データセットを収集します (つまり、優先順位が高い重複のデータを収集します)。
- 3.2.3でデータ収集が失敗した実験では、回折が失われたか、または激しい氷輪が発生し、それぞれのフラグメント条件の2番目の重複サンプルのデータを収集する。
- アポ結晶の回折データセットを収集します(ステップ1.24と2.12に従って準備されている場合)。
- 各フラグメント条件の残りの重複の回折データセットを収集します。
- MXCuBE2プログラムでは、CFSキャンペーンのデータセット識別子を次のパターンに一致させます: <プロテイン>-<ライブラリ>-[abcDEFGH][0123456789][ab](例えば、MyProtein-F2XEntry-B05a、例えば、「B05」は井戸を表します(すなわち、画面内のフラグメント条件)
4.データ処理
- CFSキャンペーンのデータ分析には、ウェブベースのソリューションであるFragMAXappを使用して、CFSデータ18の自動精製およびPanDDAヒット評価(Lima et al. FragMAXapp、未公開データ)のマルチプレックス分析を制御します。HZB で展開されている FragMAXapp バージョンでは、次のプログラム/パイプラインが利用可能です: XDSAPP19、Xia2-DIALS と Xia2-XDS20、fspipeline7、DIMPLE21、フェニックス LigFit22、PanDDA13、23。自動精製の入力としてターゲットタンパク質の精製された入力モデルを使用します。それ以外の場合は、キャンペーン中に収集された1つの高解像度モック浸し結晶の細心の注意を払って洗練を行います。
注: ヒット識別の重要な要素は PanDDA です。詳細は、それぞれの出版物13,23で説明されています。簡単に言うと、PanDDA は CFS キャンペーンでデータセットの電子密度マップを自動的に計算します。これらは、非結合フラグメント条件として想定され、いわゆる地上状態モデルを生成するために平均化される。次に、地盤状態モデルを使用して、ボクセル関連の Z スコアを使用して、各電子密度マップと地表状態マップの間の局所的な不一致を導き出します。そして、高いZスコアの領域に対して、いわゆるPanDDAマップは、それぞれのマップからの地表状態密度の微調整された減算によって作成される。これにより、フラグメント バインディング イベントの可視性が大幅に向上します。 - PanDDA の結果を最大化するには、2 段階のアプローチを使用します。まず、PanDDA 実行(pandda.analyse)を標準設定で実行します。たとえモック浸した結晶が収集されたとしても、PanDDAによる地上状態モデルの偏りのない生成を可能にするために、そのアイデンティティはパラメータとして含まれません( それにもかかわらず可能です)、すべての利用可能なデータから得られます。その後、出力データは、ユーザがクート24のいわゆるPanDDA検査を介して評価される。ここでは、比較的高い信頼度を持つヒットが注目されるべきであり、最初のステップを締結する。
- 次に、-exclude_from_characterisation=<"バインドされたデータセット ID のリスト>"コマンド ライン オプションを使用して、地上状態モデルから予備ヒット (最初のステップで決定) を除外する pandda.analyse ステップを再実行します。詳細は、PanDDA ヘルプページ (https://pandda.bitbucket.io/) で説明されています。このようにすると、明確なヒットを示すデータセットが含まれている場合は地表状態モデルがあいまいになる場合は無視されます。これにより、地表状態モデルが改善され、全体的な結果が改善されます。最後に、徹底的なPanDDA検査が行われ、ヒット識別が完了します。
注: FragMAXapp には、モデル化されたバインド状態を保存したり、PDB 提出用のデータ https://fragmax.github.io/ を準備するための出力オプションも含まれています。
Representative Results
F2Xエントリースクリーン11の以前に報告された検証キャンペーンの一環として、MAX IVのBioMAXビームラインで3つのキャンペーンが行われ、HZBのビームラインBL14.1で1つのキャンペーンが行われました。後者のキャンペーンでは、DMSOを含まない浸漬条件を用いたF2Xエントリースクリーン条件の特定のセットを、酵母Aar2のタンパク質複合体および酵母Prp8(AR)のRNaseH様ドメインに対してスクリーニングした。選択された条件のセットは、DMSO11を含む浸漬条件でARに対するF2Xエントリー画面の以前のキャンペーンで発見されたヒットを含む(すなわち、HZBで行われたキャンペーンでは、それらのヒットはDMSOの不在時に再スクリーンされた)。 図7 は、処理のためのXDSAPPのFragMAXappの組み合わせ、自動改良のためのfspipeline、およびPanDDAを使用したその後のヒット検索でデータを分析した後に得られたヒットの概要を示しています。
図1: ヘルムホルツ・ツェントルムベルリンの特殊環境に焦点を当てた結晶学的フラグメントスクリーニング(CFS)実験のワークフローの模式図を表現しています。
図2:F2Xエントリー画面の配合とパッケージング96-コンパウンドスクリーンはホイルと真空パックで密封された3レンズ96ウェルMRCロープロファイルプレートで利用できます。画面の96化合物は、各ウェルの3つのレンズのうちの2つのDMSO溶液から乾燥される。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3:HZB準備ラボにおけるCFSワークベンチの撮影A)浸漬とB)結晶収穫に必要なツールのアセンブリが表示されます。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図4: データ収集端末と制御ソフトウェア)HZB-MXビームラインBL14.1(左)とBL14.2(右)15の実験ハッチの写真。B)回折データ収集のためにBL14.1で使用されるMXCuBE2実験制御インタフェース16のスクリーンショット。BL14.2では、非常によく似たインターフェイスが使用されます。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図5:データ収集前の極低温環境における結晶性サンプルの写真スナップショット これは、フラグメント浸漬および結晶収穫を行った後の結晶の形態の変動を示す。写真は、F2Xエントリー画面検証11の一部として収集されたARサンプル用BioMAXビームライン(MAX IVシンクロトロン、ルンド、スウェーデン)で撮影されました。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図6:便利なデータ分析のために、HZBにインストールされたFragMaxApp18 のスクリーンショット。 リマら、FragMAXapp、未発表のデータの詳細。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図7: CFS キャンペーン F2X-エントリ対AR (DMSO なし) の結果の概要 ARタンパク質複合体は漫画のビューで示され、Aar2は灰色で着色され、RNaseH様ドメインはPrp8の青色で着色されています。キャンペーンのフラグメントヒットは、要素の色(C - 黄色、O - 赤、N - 青、S - オレンジ、Cl - ライトシアン)で着色されています。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
Discussion
CFS キャンペーンを成功させるには、説明されている前提条件に従う必要があります ( はじめにを参照)。多くの拡散結晶の再現性に優れた成長のためには信頼性の高い結晶化システムが必要であり、自動化された改良のための入力アポモデルとして、よく洗練された構造が必要です。また、タンパク質上の標的部位(活性部位、または界面領域)が結晶格子の断片にアクセス可能であることを確認することも重要です。浸漬が結晶品質を著しく劣化させないようにするために、事前に浸漬条件を最適化することが重要です。これらの側面を無視すると、最適でない実験につながる可能性が非常に高く、使用が限られており、最悪の場合、実験全体の繰り返しが必要になります。
上記のプロトコルは、標準の CFS キャンペーン中に実行される手順の概要を示しています。すべての前提条件が満たされている場合、浸した結晶の少なくとも90%が回折実験で高分解能に回折を表示する必要があります。もしそうでなかった場合、浸漬時間は数時間または数分に短縮される可能性があります。ほとんどの断片の溶解性が良好なため、これはまともな占有値を得るのに十分なはずです。また、一般的なCFSキャンペーンでは、約10%以上のヒット率が得られます。F2Xエントリー画面検証キャンペーン11 と同じライブラリを持つ進行中のユーザーキャンペーンのヒット率がさらに高いことが観察されています(20%以上、データは表示されません)。
結晶学的断片スクリーニングの一般的な注意点は、結晶学的接触部位の存在である。これらは、 既知 の既知のアクティブサイトを閉塞させるか(スクリーニング前にチェックする、上記を参照)、またはこれらの接触部位はまた、しばしば断片が結合することができるポケットおよびホットスポットを提供する。このようなフラグメントヒットは、結晶化格子のアーチファクトであり、溶液中のタンパク質に結合しない可能性が高い。これらの事象は、共結晶化実験よりも浸漬実験でより頻繁に起こる傾向がある(おそらく、浸漬実験で用いられる断片濃度が高いため)。しかし、以前の経験によると、彼らは一般的に得られたヒットのほんの一部を構成します。例えば、Pp8RNaseH およびAar2(AR)の内科ペプシン(EP)およびスプライセオソームタンパク質複合体(AR)を用いたF2Xエントリースクリーン検証キャンペーンでは、ヒットの大部分は有望な部位11で発生した。EPに関しては、37の観察された結合事象のうち27個が活性部位(すなわち、このプロテアーゼのペプチド裂け目)に位置していた。10個のリモート結合イベントは、2つの溶媒曝露結合イベントと8つの結晶接触結合イベント(5つのユニークヒットに対応)で構成されます。これらのクリスタルコンタクトヒットを除外すると、EPキャンペーンの全体的な24%のユニークなヒット率が反映されます。また、既知の活性部位(結晶接触結合剤を除く)の結合事象も潜在的に興味深い(例えば、タンパク質の新しいホットスポットまたはアロステリックサイトを明らかにする)可能性があることに注意することも重要です。ARキャンペーン(同じ出版物)では、23の観察された結合事象のうち、7つは結晶接点に位置し、1つは2つのタンパク質の直接界面に位置し、7つは、より大きな生物学的文脈の他の結合パートナーとの既知のタンパク質タンパク質相互作用部位(したがって、スプライセソーサムの異なる組み立て段階)に位置し、8つの結合事象はAR上の2つのホットスポットを明らかにし、1つはRnaPの溶媒表面にある。したがって、結晶接触およびPrp8RnaseH シングルトンでの事象を除くと、潜在的に有用な結合事象の数は15(14のユニークヒットに相当)であるため、ヒット率は15.6%である。これらのヒットは、タンパク質とタンパク質相互作用モジュレーターの設計や、発見された2つのAar2ホットスポットを探索することを目的としたツール化合物の設計の出発点とすることができます。まとめると、実施されたユーザーキャンペーンにも沿って、多くの場合、結晶学的断片スクリーニングにおけるヒットのほんの一部のみをアーティファクトとして無視する必要があります。ただし、これは主にターゲット依存です。
ヒット率が著しく低い場合、これは標的タンパク質に関連する以下のいずれかの問題を示す可能性がある。例えば、ウイルス性システインプロテアーゼに対するCFSキャンペーンでは、ヒット率はわずか3%しか観察されなかった(データは示されていない)。使用されるタンパク質は、その活性部位で化学的に修飾された可能性が高いことが判明した。このような場合、異なるタンパク質調製物が問題を解決してもよい。結晶が非常にDMSO不耐症である場合、結果はある程度異なる場合がありますが、F2Xエントリー画面はDMSOなしでも使用することができます。DMSOの存在下で得られたヒットのほとんどは、その不在時にも現れる。また、DMSOが存在しない場合でも、観察できないヒットもあります。そして最後に、DMSOが存在しない場合にのみ現れるものがあります。
最も深刻な困難は、タンパク質が物質結合時に誘発適合運動を受けた場合に起こる。ほとんどの場合、結晶格子はタンパク質の動きを許容せず、結晶は崩壊します。このような場合、唯一の選択肢は、タンパク質とフラグメントの共結晶化に頼る。しかし、これは新しい結晶形態につながる可能性があります。したがって、プロセス全体の自動化の多くは、もはや効率的に動作しません。幸いなことに、これまでのHZBで行われたほとんどのCFSキャンペーンでは、この種の問題は発生していません。フラグメントの結合が弱いということは、タンパク質運動を誘導するのに十分なエネルギーを与えない、特に結晶圧入力によって結晶化された立体構造が安定化される場合によい。
著者がこれまでに遭遇した方法のもう一つの深刻な制限は、結晶化カクテル(したがって、浸漬溶液)が揮発性化合物を含んでいる場合である。その後、すべての結晶処理を意味のある方法で実行することは不可能に近くなります。
異なるタンパク質は、多かれ少なかれ薬物部位を含んでいてもよい。例えば、タンパク質とタンパク質の相互作用は、通常、標的化が困難な拡張平らな表面によって媒介される。したがって、フラグメント結合ヒット率は、タンパク質の分子表面の構造に依存する可能性が高い。極端な場合、タンパク質には、フラグメント結合の標的部位として機能する適切な表面ホットスポットが含まれていない可能性があります。したがって、綿密に行われた実験にもかかわらず、スクリーニングから断片ヒットは生じないだろう。しかし、著者たちは今のところそのような状況に遭遇していない。
原則として、上記のプロトコルを使用して、CFSキャンペーンの結晶浸漬と収穫の部分は、結晶取り扱いのために装備されている任意の実験室で行うことができます。これにより、他の CFS 設備と HZB の方法論が区別され、場合によっては利点があります。例えば、別の場所でクリスタルを簡単に再生成できない場合や、実験者の走行が限られている場合(例えば、世界的なパンデミックの状況では)、HZBのユーザーはポータブルセットとして機器全体(パック、ツール、EasyAccessフレーム、サンプルホルダーなど)を提供します。
しかし、多数のサンプルホルダと極低温ストレージ容量の要件は、CFS専用施設でより便利に満たされています。さらに、多くの回折データセットの収集の必要性は、高いサンプルスループットに向けたビームラインに近いこれらの施設をローカライズすることを強く提唱しています。この例としては、ダイヤモンド光源のビームラインI04-1と英国8、25、フランスのESRF26のMASSIFビームライン、スウェーデン18のMAX IVのBioMAXビームラインのFragMAX施設の関連XChem施設があります。
将来的には、結晶処理を完全に必要とせずにCFS実験を設計することが想定される可能性があります。この方向への最初の進歩が報告されています。例えば、音響液体移動により、結晶含有溶液とフラグメント溶液の両方をメッシュ型試料ホルダー27上に直接混合することを可能にする。別のアプローチは、XFELベースのリガンドスクリーニングに使用された。原理実証実験では、結晶スラリーをバッチで調製し、シリコン固定ターゲットチップ28上で浸漬および回折データ収集を行った。しかし、これらのアプローチはまだ開発中であり、幅広いタンパク質標的に適用されることや、CFS施設に対してルーチンとして実現可能とは程遠い。
この作業のプロトコルでは、HZB(および他の場所)でCFSキャンペーンを直接実行するための詳細な指示が概説されており、成功の可能性が高い実験を準備し、実施する際の一般的なガイダンスと有用な実践的なヒントが与えられています。最終的には、CFSスクリーニングにおけるより良いオッズと成功率は、ツール化合物または薬剤候補の下流開発の出発点を効率的に提供することに大きく貢献します。
Disclosures
イージーアクセスフレームに関する特許出願は、ドイツ特許商標庁にヘルムホルツ・ツェントルムベルリンから登録番号DE 10 2018 111 478.8を提出しました。また、ドイツ特許の優先権を利用したPCTルートを経由した国際特許出願が出願されている。
Acknowledgments
我々は、HZBでCFSキャンペーンを行った多数のユーザーグループに感謝します。彼らのフィードバックは、私たちのワークフローの段階的な改善につながりました。私たちは、マールブルク大学の薬物設計グループとMAX IVのFragMAXグループに感謝したいと考えています。私たちは、プロジェクトFrag2XtalとFrag4Lead(番号05K13M1と05K16M1)を介して、ドイツ連邦教育科学省(BMBF)の支援に感謝しています。欧州委員会のHorizon 2020プログラムが資金を提供するプロジェクト番号871037であるiNEXT-Discoveryを通じた支援に感謝しています。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 µL pipet | Eppendorf | EP3123000012 | |
| 12 channel pipet, 100 µL | Eppendorf | EP4861000791 | |
| Blow dryer | TH-Geyer | 9.106 788 | |
| Crystal containing crystallization plates | Contains crystals to be soaked | ||
| Crystallization incubator | Providing constant temperature for crystallization experiment, at HZB: 20°C | ||
| Dual Thickness MicroLoops (LD) of different aperture sizes | MiTeGen | various, e.g. M5-L18SP-75LD |
250 loops in the appropiate size needed for the protocol, can be provided by HZB |
| EasyAccess Frame | HZB | The EasyAccess Frame is a special device for handling multiple crystals, which was developed at the HZB (Barthel et al., 2021). | |
| F2X-Entry Screen plate | HZB | Developed F2X-Entry Screen (Wollenhaupt et al., 2020) | |
| Glas spot plate | VWR | MARI1406506 | |
| Liquid nitrogen | At least a filled up 5 L can | ||
| Liquid nitrogen storage can | n.a. | n.a. | |
| Magentic crystal wand | MiTeGen | M-R-1013198 | |
| Microscopes | Leica | n.a. | |
| MRC 3-lens 96-well low profile crystallization plate | SwissCI | 3W96TLP-UVP | For mock-soaked crystals (optional) |
| Reagent reservoir | Carl Roth | EKT6.1 | 25 ml volume |
| Sample tracking template | https://www.jove.com/files/ftp_upload/62208/TemplateCFSHZBSampleTracking. xlsx |
||
| Scalpel | B. Braun | BA825SU | |
| Sealing foil for microtiter plates | GreinerBioOne | 676070 | |
| Shelved puck shipping canes (for Unipucks) | MiTeGen | M-CP-111-065 | 2 canes made of aluminum; can be provided by the HZB |
| Soaking solution | At least 5 ml are needed | ||
| Soaking solution including cryo-protectant, 150µL | Only needed if soaking solution is not cryo-protectant already | ||
| Tissues | Roth (Kimberly Clark Professional) | AA64.1 | |
| Transport dewar (Whartington dry shipper) | MiTeGen | TW-CX100 | 2 Travel dewars for storage of the 2 unipuck canes, alternatively a storage dewar of type VHC35 or similar could be used. |
| Unipuck foam dewars with lid | MiTeGen | M-CP-111-022 | two foam dewars especially suited for unipuck handling described in the protocol if SPINE pucks are used, different foam dewars might have to be applied. |
| Unipuck starter set | MiTeGen | M-CP-UPSK001 | Can be provided by the HZB |
| Unipucks | MiTeGen | M-CP-111-021 | 14 unipucks; can be provided by the HZB |
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