Summary
Ici, nous présentons un test de co-culture facile à utiliser pour analyser la migration du glioblastome (GBM) sur des neurones à motifs. Nous avons développé une macro dans le logiciel FiJi pour une quantification facile de la migration des cellules GBM sur les neurones, et avons observé que les neurones modifient la capacité invasive des cellules GBM.
Abstract
Les glioblastomes (GBM), gliomes malins de grade IV, sont l’un des types les plus mortels de cancer humain en raison de leurs caractéristiques agressives. En dépit des avances significatives dans la génétique de ces tumeurs, comment les cellules de GBM envahissent le parenchyme sain de cerveau n’est pas bien comprise. Notamment, on lui a montré que les cellules de GBM envahissent l’espace peritumoral par différentes voies ; l’intérêt principal de cet article est la route le long des étendues de matière blanche (WMTs). Les interactions des cellules tumorales avec les composants peritumoral nerveux de cellules ne sont pas bien caractérisées. Ici, une méthode a été décrite qui évalue l’impact des neurones sur l’invasion cellulaire gbm. Ce document présente une analyse in vitro avancée de co-culture qui imite l’invasion de WMT en analysant la migration de GBM tige-comme des cellules sur des neurones. Le comportement des cellules GBM en présence de neurones est surveillé à l’aide d’une procédure de suivi automatisée avec un logiciel open source et en accès libre. Cette méthode est utile pour de nombreuses applications, en particulier, pour des études fonctionnelles et mécanistes ainsi que pour l’analyse des effets des agents pharmacologiques qui peuvent bloquer la migration cellulaire GBM sur les neurones.
Introduction
Les gliomes malins primaires, y compris gbms, sont des tumeurs dévastatrices, avec un taux de survie moyen de 12 à 15 mois rapportés pour des patients de GBM. La thérapie courante se fonde sur la grande résection de masse de tumeur et la chimiothérapie couplées avec la radiothérapie, qui prolonge seulement le taux de survie de quelques mois. Les échecs thérapeutiques sont intimement liés à une mauvaise administration de médicaments à travers la barrière hémato-encéphalique (BHE) et à la croissance invasive dans les espaces périvasculaires, les méninges et le long desTMM 1. L’invasion périvasculaire, également appelée co-option vasculaire, est un processus bien étudié, et les mécanismes moléculaires commencent à être élucidés ; cependant, le processus de l’invasion de cellules gbm le long de WMTs n’est pas bien compris. Les cellules tumorales migrent dans le cerveau sain le long des structures secondaires de Scherer2. En effet, il y a près d’un siècle, Hans-Joachim Scherer a décrit les voies invasives de la GBM, qui sont maintenant appelées satellitosis périnéuronal, satellitosis périvasculaire, propagation subpial, et invasion le long de la WMT (Figure 1A).
Certaines chimiokines et leurs récepteurs, tels que le facteur 1α dérivé des cellules stromales (SDF1α) et le récepteur 4 des chimiokines à motif C-X-C (CXCR4), mais pas le facteur de croissance endothélial vasculaire (VEGF), semblent être impliqués dans l’invasion WMT3. Plus récemment, un axe transcellulaire NOTCH1-SOX2 s’est avéré être une voie importante dans l’invasion WMT des cellules GBM4. Les auteurs ont décrit comment les cellules souches gbm envahissent le parenchyme de cerveau sur des neurones partiellement unmyelinated, suggérant la destruction des gaines de myelin par des cellules de GBM. Une étape importante a été franchie en 2019 lorsque trois articles ont été publiés de manière concluante dans la revue Nature, soulignant le rôle de l’activité électrique dans le développement du gliome5,6. Les travaux fondateurs de Monje et de ses collaborateurs ont mis en lumière le rôle central de l’activité électrique dans la sécrétion de neuroligine-3, qui favorise le développement du gliome.
Winkler et ses collaborateurs ont décrit les connexions entre les cellules GBM (microtubes) étant cruciales dans les étapes invasives, et dernièrement, les interactions entre les cellules GBM et les neurones via les synapses de neurogliome nouvellement décrites. Ces structures favorisent la stimulation glutamatergique des récepteurs de l’acide α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic acid (AMPA) situés à la membrane cellulaire gbm, qui favorise le développement et l’invasion de tumeur. L’invasion de cellules de tumeur est un processus central dans la diffusion des métastases ou des foyers secondaires éloignés, comme observé dans des patients de GBM. Plusieurs facteurs ont été identifiés comme étant importants dans l’invasion du GBM tels que la thrombospondine-1, un facteur de croissance transformant bêta (protéine matricellulaire régulée par TGFβ, ou le récepteur de chimiokine CXCR3)7,8.
Ici, un modèle biomimétique simplifié a été décrit pour l’étude de l’invasion gbm, dans lequel les neurones sont modelés sur des pistes de laminine, et les cellules GBM sont ensemencées dessus, comme des cellules uniques ou comme des sphéroïdes (Figure 1B). Les deux décors expérimentaux visent à récapituler l’invasion sur les neurones, qui est observée dans GBM9,10,11. De tels modèles ont été développés dans le passé sous forme de biomatériaux en nanofibres alignés (électrofilage noyau-coquille) qui permettent d’étudier la migration cellulaire en modulant les propriétés mécaniques ou chimiques12. Le modèle de co-culture décrit dans cet article permet de mieux comprendre comment les cellules GBM s’échappent sur les neurones en définissant de nouvelles voies moléculaires impliquées dans ce processus.
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Protocol
Le consentement écrit éclairé a été obtenu de tous les patients (de l’hôpital Haukeland, Bergen, Norvège, conformément aux règlements du comité d’éthique local). Ce protocole suit les directives des comités d’éthique de la recherche humaine et animale de l’Université de Bordeaux. Des rats gravides ont été logés et traités dans l’installation animalier de l’Université de Bordeaux. L’euthanasie d’une rate enceinte chronométré e18 a été réalisée en utilisant le CO2. Toutes les procédures relatives aux animaux ont été effectuées conformément aux directives de l’établissement et approuvées par le comité d’éthique local. Tous les produits commerciaux sont référencés dans la table des matières.
1. Préparation des diapositives à motifs
- Préparation de substrat pour le micropatterning
- Traiter les lamelle circulaires en verre de 18 mm par activation air/plasma pendant 5 min. Placer les lamelles dans une chambre fermée avec 100 μL de (3-aminopropyl) triéthoxysilane dans un dessicateur pendant 1 h.
- Incuber avec 100 mg/mL de valérate de poly (éthylène glycol)-succinimidyle (poids moléculaire 5 000 (Peg-SVA)) dans un tampon de carbonate de 10 mM, pH > 8, pendant 1 h. Rincer abondamment à l’eau ultrapure et sécher sous une hotte chimique.
NOTA: À ce stade, l’échantillon peut être conservé à 4 °C dans l’obscurité pour une utilisation ultérieure. - Ajouter le photoinitiateur, le chlorure de 4-benzoylbenzyl-triméthylammonium (PLPP), à 14,7 mg/mL dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS).
REMARQUE: Une forme concentrée de PLPP, un gel PLPP, peut également être utilisée. Il en résulte un temps d’éclairage ultraviolet (UV) plus court nécessaire pour dégrader la brosse PEG (100 mJ/mm2).
- Dépôt de gel photoinitiateur
- Préparer un mélange de 3 μL de gel PLPP et de 50 μL d’éthanol absolu à déposer au centre de la lame. Placer l’échantillon sous une hotte chimique jusqu’à évaporation complète de l’éthanol absolu.
NOTA: À ce stade, l’échantillon peut être conservé à 4 °C dans l’obscurité pour une utilisation ultérieure.
- Préparer un mélange de 3 μL de gel PLPP et de 50 μL d’éthanol absolu à déposer au centre de la lame. Placer l’échantillon sous une hotte chimique jusqu’à évaporation complète de l’éthanol absolu.
- Micropatternage de lames de verre
- Montez la lame de couverture dans une chambre Ludin et placez-la sur l’étage motorisé d’un microscope équipé d’un système de mise au point automatique.
- Chargez des images correspondant aux micropatterns envisagés dans le logiciel. Appliquer ces paramètres : réplication 4 x 4 fois, espacement de 200 μm, dose UV de 1 000 mJ/mm2. Après la séquence d’éclairage UV automatique, rincez le PLPP avec plusieurs lavages PBS.
REMARQUE: Si du gel PLPP a été utilisé, retirez-le par des lavages approfondis à l’eau désionisée, séchez dans un courant deN2et conservez-le à 4 °C. - Incuber avec de la laminine (50 μg/mL dans du PBS) pendant 30 min. Laver abondamment avec du PBS.
REMARQUE : Une solution fluorescente de protéine fluorescente verte purifiée (GFP, 10 μg/mL dans le PBS) peut être mélangée à de la laminine pour visualiser les micropatterns par microscopie à fluorescence.
2. Préparation des neurones et des cellules GBM pour la co-culture
- Culture de neurones embryonnaires de l’hippocampe du rat
- Disséquer l’hippocampe des rats embryonnaires (E18), et transférer le tissu dans un Hank' solution de sel équilibrée de s (HBSS)/1 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES)/penicillin-streptomycin solution dans un tube de 15 ml. Enlever l’excès de solution sans sécher l’hippocampe.
- Ajouter 5 mL d’acide tétraacétique trypsine-éthylènediamine (EDTA) complété par de la pénicilline (10 000 unités/mL)/streptomycine (10 000 μg/mL) et du HEPES de 1 mM, et incuber pendant 15 min à 37 °C. Laver 2x avec la solution HBSS/HEPES/pénicilline-streptomycine, et laisser le tissu rester dans cette solution pendant 2-3 min.
- Dissociez le tissu à l’aide de deux pipettes Pasteur polies à la flamme, en pipetant de haut en bas 10x avec chaque tissu, en prenant soin de minimiser la formation de mousse. Comptez les cellules et évaluez la viabilité de la suspension cellulaire. Plaquer les neurones sur des lamelle micropatterned comme indiqué ci-dessous.
REMARQUE: Le taux de viabilité cellulaire est de 85-90% après extraction.
- Culture cellulaire pour neurones sur des lamelle de couverture micropatterned
- Réhydratez les lames de verre micropatterned avec du PBS, et incuber le milieu complet de culture cellulaire neuronale.
- Ensemencez les neurones de l’hippocampe obtenus à partir de rats E18 Sprague-Dawley directement sur la lame de couverture en verre micropatterned à une densité de 50 000 cellules parcm2 en milieu neurobasal (NBM) enrichi avec 3% de sérum de cheval. Placer les neurones micropatterned dans l’incubateur (37 °C, 5%CO2)pendant 48 h.
REMARQUE: Après ~ 6 h, neurones de l’hippocampe primaire peut être vu adhérant aux micropatterns de laminine.
- Co-culture de cellules souches humaines de type GBM sur des neurones
REMARQUE: Pour cette étude, des cellules GBM Membranaires GFP-positives et nucléaires-dérivées du patient-tomate ont été cultivées selon les protocoles édités précédents10.- Au fur et à mesure que les cellules en forme de sphéroïde se développent en suspension, centrifugez la suspension pendant 5 min à 200 × g. Laver les sphéroïdes avec 5 mL de PBS et incuber les cellules avec 0,5 mL du réactif de dissociation cellulaire (voir le tableau des matériaux)pendant 5 min à 37 °C.
- Ajouter 4,5 mL de NBM complet (complété par un supplément de B27, de l’héparine, un facteur de croissance des fibroblastes 2, de la pénicilline et de la streptomycine, comme décrit précédemment8),et compter les cellules à l’aide d’une technique de comptage automatique.
- Ensemencez 1 000 cellules GBM au-dessus de la culture neuronale micropatterned en NBM enrichie avec du sérum de cheval de 3%. Incuber la plaque à 37 °C, 5 % deCO2et 95 % d’humidité.
3. Imagerie cellulaire vivante
- Immédiatement après l’ensemencement des cellules GBM, placez l’échantillon sur la scène d’un microscope inversé équipé d’une chambre thermostatée. Effectuez l’imagerie à cellules vivantes sur le microscope équipé d’un étage motorisé pour enregistrer plusieurs positions en utilisant une boîte à outils d’acquisition multidimensionnelle dans le logiciel. Acquérir des images GFP/Tomate en champ lumineux et en épifluorescence toutes les 5 minutes sur 12 h avec un objectif 20x dans un environnement à température (37 °C) et à gaz contrôlé (5 %co2).
4. Analyse d’image
REMARQUE: À l’aide de Fidji, la pile d’images bidimensionnelles (2D) a été semi-automatiquement prétraitée ou traitée à l’aide d’un outil fait maison et convivial (disponible à cette adresse : https://github.com/Guyon-J/Coculture_Gliomas-Neurons/blob/main/README.md), qui est écrit en langage de macro IJ1 (Figure 2A). Le flux de travail et les procédures automatisés sont résumés à la figure 2B.
- Analyse de réseau neuronal (Figure 2Bi)
- Sélectionnez une image de la pile. Faites un clic droit sur l’outil Réseau pour ouvrir la boîte de dialogue Options correspondante et ajuster les paramètres (par exemple, Seuil = Triangle, Li, Huang..., Flou gaussienet Filtres médians = 1, 2, 3...) pour produire une segmentation précise des images. Ensuite, cliquez sur OK.
- Cliquez avec le bouton gauche sur l’outil Réseau pour activer automatiquement la procédure suivante.
- Dupliquez l’image sélectionnée et divisez-la en trois couches de couleur (rouge-gris-vert).
- Sélectionnez le canal gris (champ clair) et effectuez une amélioration de l’étirement du contraste (CSE) pour améliorer la séparation entre les différentes zones. Utilisez le détecteur de bord Sobel (SED) pour effectuer l’opération de convolution de traitement du signal 2D déjà regroupée sous la commande Rechercher un bord.
- Pour le double filtrage (F), appliquez un flou gaussien et un filtre médian pour réduire le bruit et lisser le signal de l’objet. Convertir en masque (CM) en exécutant des algorithmes de seuil adaptés pour obtenir une image binaire (bin-gris) avec des pixels noirs (zone de cellule) et des pixels blancs (arrière-plan). Squelettez (Sk) la zone de cellule en un réseau simple (NET) et filtrez les particules (EP) dans une image NET en supprimant les petites particules non en réseau.
- Pour les canaux rouges et verts (noyau et membrane), effectuez un double filtrage, convertissez-les en masque à l’aide de la méthode de seuillage adaptée et autorisez BIN-green à déterminer la morphologie des cellules à l’aide de la commande Analyser les particules.
- Fusionnez tous les canaux à l’aide de leur région d’intérêt (ROI) avec l’opérateur OR (combine) et réajustez leur couleur initiale en une simple image RVB.
- Analyse de la motilité unicellulaire( Figure 2Bii)
- Cliquez avec le bouton droit sur l’outil Suivi de cellule unique pour ouvrir la boîte de dialogue Options correspondante et ajuster les paramètres (par exemple, Type de piste = Noyau ou membrane, Seuil = Triangle, Li, Huang..., Projection Z = Intensité maximale, Tranches de somme..., Flou gaussien et Filtres médians = 1, 2, 3...) pour produire une segmentation précise des images. Ensuite, cliquez sur OK.
- Cliquez avec le bouton gauche sur l’outil de suivi de cellule unique pour activer automatiquement la procédure suivante.
- Retirez le canal gris. Appliquez une projection Z sur la pile, qui génère une image correspondant à une pile d’images en fonction de l’heure (T-stack). Double filtrez et convertissez-les en Masque les traînées laissées par les cellules. Retirez les petites particules de l’image BIN-rouge/verte.
- À l’aide du retour sur investissement, sélectionnez chaque contour de la trace de cellule et cochez la case Ignorer la détection de bord dans la boîte de dialogue Options pour ignorer cette étape de prétraitement pour les étapes suivantes.
- Isolez le canal rouge(Trail type = Nucleus) sur la pile d’origine. Sélectionnez un retour sur investissement et supprimez la zone extérieure. Double filtrez toutes les images et convertissez-les en masque (BIN-rouge). Déterminer la position X/Y du centroïde de chaque noyau binarisé.
- À l’aide d’une macro déjà publiée pour le tableur13,calculez le déplacement carré moyen, le rapport de directionnalité et la vitesse moyenne de cette cellule.
- Analyse de suivi à cellules multiples( Figure 2Biii)
- Faites un clic droit sur l’outil De suivi pour ouvrir la boîte de dialogue Options correspondante et ajuster les paramètres (par exemple, Seuil = Triangle, Li, Huang..., Flou gaussien et Filtres médians = 1, 2, 3...) pour produire une segmentation précise des images. Ensuite, cliquez sur OK.
- Cliquez avec le bouton gauche de la souris sur l’outil de suivi pour activer automatiquement la procédure suivante.
- Retirez le canal gris.
- Divisez les canaux rouges et verts, double filtrez et convertissez-les en masque.
- Fusionner les canaux à l’aide de la calculatrice d’images... commande avec l’opérateur AND, ne laissant que le signal de noyau trouvé dans les membranes.
REMARQUE: Plusieurs plugins à Fidji peuvent être utilisés pour déterminer la position X / Y de plusieurs cellules dans cette image prétraitée binaire en même temps (voir la table des matériaux).
- À l’aide d’une macro13décrite précédemment, calculez le tracé de trajectoire, le déplacement carré moyen, le rapport de directionnalité et la vitesse moyenne de ces cellules.
- Migration sphéroïde sur le tapis neural( Figure 2Biv)
- Faites un clic droit sur l’outil Migration pour ouvrir la boîte de dialogue Options correspondante et ajuster les paramètres (par exemple, Seuil = Triangle, Li, Huang..., Flou gaussien et Filtres médians = 1, 2, 3...) pour produire une segmentation précise des images. Ensuite, cliquez sur OK.
- Cliquez avec le bouton gauche sur l’outil de migration pour activer automatiquement la procédure suivante.
- Retirez le canal rouge.
- Divisez les canaux vert et gris.
- Pour le canal gris, dessinez manuellement le contour du tapis neuronal et mesurez sa surface.
- Pour le canal vert, double filtrez la pile et convertissez-la en Masque. Supprimez la zone située à l’extérieur du motif (BIN) et déterminez la zone de cellule binarisée pour chaque image.
REMARQUE: Les paramètres décrits ci-dessus sont calibrés en modifiant leurs valeurs en cliquant avec le bouton gauche sur l’icône d’intérêt. Ce traitement peut être effectué manuellement. Cependant, pour un grand nombre d’images (environ une centaine par acquisition), de canaux (généralement 3 canaux) et d’étapes de traitement, un outil automatisé ou semi-automatisé serait préférable.
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Representative Results
Des neurones modelés co-cultivés avec les cellules fluorescentes de GBM ont été préparés comme décrit dans la section de protocole, et des expériences de suivi ont été exécutées. Les cellules GBM ont rapidement modifié leur forme lors de la migration sur les neurones(Figure 1B: panneau 6 et Vidéo 1). Les cellules ont migré le long des extensions neuronales, dans un mouvement aléatoire (Vidéo 1). Les cellules GBM fluorescentes et les neurones non fluorescents peuvent être facilement distingués, ce qui a permis le suivi des mouvements cellulaires à l’aide de la macro Fidji, comme décrit dans la section protocole(Figure 2). Fiji est un logiciel à licence ouverte qui facilite le traitement et l’analyse des images. Les procédures manuelles qui prennent relativement de temps pour l’analyse de nombreuses images peuvent être automatisées dans une macro. Les images sont importées par glisser-déposer, traitées et quantifiées, générant des données qui sont disponibles à l’aide d’un gestionnaire de retour sur investissement.
Lorsqu’il est déposé dans le dossier Fiji.app | macros | des ensembles d’outils, l’outil Gliomas-Neurons était disponible dans le menu Autres outils et affichait plusieurs icônes(Figure 2A). Un flux de travail du traitement de l’image, obtenu en cliquant sur les icônes, est illustré à la figure 2B (i-iv). La forme de la cellule peut être analysée sur le réseau neuronal (Figure 2B, i). Plusieurs paramètres du suivi cellulaire peuvent être obtenus pour une(Figure 2B,ii)ou plusieurs cellules(Figure 2B,iii)en utilisant deux processus d’image distincts. La vitesse de récupération par les cellules GBM sphéroïdes sur les neurones peut également être analysée(figure 2B,iv). Les cellules ensemencées sur les neurones présentaient une forme allongée avec de multiples saillies suivant les voies neuronales(figure 3A,i),mais avaient une forme ronde lorsqu’elles étaient cultivées directement sur de la laminine(figure 3A,ii). Les cellules cultivées sur des neurones ont efficacement modifié leur forme, bien qu’elles n’aient pas été allongées lorsqu’elles étaient cultivées sur de la laminine (Figure 3A, iii-v). De fines saillies, liant parfois deux cellules, ont été observées dans des cellules co-cultivées avec des neurones à des stades ultérieurs (Vidéo 1).
La capacité migratrice des cellules GBM ensemencées sur les neurones a été comparée aux cellules directement ensemencées sur la laminine. Les cellules ensemencées sur les neurones avaient de plus grandes capacités migratoires que sur la laminine seule (Figure 3B, i, ii). Le mouvement aléatoire des cellules P3 a été détecté dans les deux conditions, avec une plus grande distance pour les cellules P3 sur les neurones, comme le montre le diagramme de trajectoire (Figure 3B, i, ii). La motilité cellulaire a été quantitativement estimée par le déplacement carré moyen (MSD), et sa représentation logarithme a été munie d’une fonction linéaire14 (figure 3B,iii). La directionnalité et la vitesse moyenne ont également été calculées pour les deux conditions(figure 3B,iv,v). La migration cellulaire des sphéroïdes P3 a également été suivie par la détection de la zone fluorescente au fil du temps sur les neurones et comparée à la migration sur la laminine seule(Figure 3C,i,ii et Vidéo 2). La moitié du modèle avec des neurones a été couverte de cellules de GBM après minute 500 dans un profil linéaire ; cependant, les sphéroïdes n’ont pas adhéré au motif de laminine(Figure 3D,iii et Vidéo 2).
Figure 1: Configuration expérimentale de cellules de glioblastome migrant sur des neurones à motifs. (A) Représentation des cellules de glioblastome envahissant l’hémisphère contralatéral par le calleux de corpus. (B) Configuration expérimentale. A l’étape 1, la surface de la plaque est recouverte d’une couche de PEG antisalissure. Le photoinitiateur est ajouté à l’étape 2, couvrant l’ensemble du revêtement. À l’étape 3, une image UV widefield est projetée à travers l’objectif du microscope, qui active localement les molécules photoinitiatrices. Le photoinitiateur activé fend localement les molécules de PEG et permet l’adsorption ultérieure de la laminine. À l’étape 5, les neurones sont ensemencés et adhèrent sur les réseaux de laminine. Les cellules du glioblastome P3 (GFP/Tomatonuclear)sont ensuite déposées sur le schéma neuronal, et des images sont acquises (étape 6). Abréviations : PEG = polyéthylène glycol; UV = ultraviolets; GFP = protéine fluorescente verte. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2: Flux de travail de présentation et d’analyse de l’outil Fidji. (A) L’outil appelé Gliomas-Neurons est disponible dans le menu Plus d’outils lorsque la macro est ajoutée à Fiji.app dossier | macros | ensembles d’outils (panneau de gauche). Il est composé de plusieurs outils d’action décrits ci-dessous (panneau de droite). (B) i. Outil réseau : traitement d’image, qui est utilisé pour dessiner le réseau neuronal et les cellules gliomes dans une représentation simplifiée. ii. Outil de suivi unicellulaire: traitement d’image, qui est utilisé pour dessiner et sélectionner la zone de mouvement de la cellule pour analyser le déplacement de cellules individuelles. iii. Outil de suivi: étapes de prétraitement d’image pour l’utilisation de plugins de suivi Fidji préinstallés. iv. Outil de migration relative : traitement d’image, qui est utilisé pour déterminer la migration relative des cellules sur un motif sélectionné manuellement. Certains paramètres peuvent être calibrés avec un clic gauche sur le bouton de l’outil. Abréviations : CSE = Contrast Stretch Enhancement; SED = Détecteur de bords Sobel; F = double filtrage; CM = Convertir en masque; Sk = Squelettiser; EP = Élimination des particules; OR (combine) = Opérateur d’union sur les ROIs sélectionnés; AND = Opérateur de conjonction sur les ROIs sélectionnés. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3: Comparaison de cellules P3 ou de sphéroïdes sur des neurones à motifs par rapport au revêtement de laminine. (A) Descripteurs de forme des cellulesnucléaires P3 GFP/Tomate dissociées sur les neurones ou sur la laminine. Exemple de réseaux traités de cellules P3 sur i. neurones à motifs ou sur ii. revêtement de laminine. Barre d’échelle = 50 μm. iii. Surface cellulaire moyenne sur les neurones à motifs ou sur la laminine. iv. Le facteur de forme est le rapport de la circonférence à la zone normalisée en cercle, fournissant des paramètres sur l’allongement et la ramification des cellules. c. Les proportions sont le rapport entre le grand axe et le petit axe de la cellule. Dans iii, iv,et v,15 cellules ont été analysées par champ ; 4 modèles indépendants; les données sont représentées sous la forme d'± S.E.M.(B)Analyse de suivi des cellules P3 dissociées. Un diagramme représentatif des cellules sur (i) les neurones à motifs et (ii) sur le revêtement de laminine. iii. MSD des cellules P3 migrant sur les neurones ou sur le revêtement de laminine. Les valeurs X/Y sont dans des échelles logarithmiques. iv. Rapport de directionnalité. c. Migration moyenne de la vitesse cellulaire. Dans iii, iv,et v,15 cellules ont été analysées par champ ; 4 modèles indépendants; les données sont représentées sous la forme d’une moyenne ± analyse de la migration de S.E.M.(C)des sphéroïdes P3 GFP. Images représentatives à différents points de temps des sphéroïdes P3 sur(i)les neurones à motifs ou sur(ii)le revêtement de laminine. Barre d’échelle = 100 μm. iii. Migration sphéroïde représentée par la confluence de modèle ; 4 modèles indépendants; les données sont représentées sous la forme d’une moyenne ± S.E.M. Abréviations : GFP = protéine fluorescente verte; S.E.M. = erreur type de la moyenne; MSD = Déplacement moyen du carré. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Vidéo 1: Cellules P3 sur les neurones ou laminine enregistrées sur 8 h (iimage toutes les 5 minutes). La vidéo montre la migration monocellulaire P3 sur les neurones (à gauche) et sur le revêtement de laminine (à droite). Les cellules ont exprimé la protéine fluorescente verte (GFP, couleur verte) et la tomate nucléaire (couleur rouge). Bar = 50 μm. Veuillez cliquer ici pour télécharger cette vidéo.
Vidéo 2: Sphéroïdes P3 sur les neurones ou la laminine enregistrés sur 8 h (image toutes les 5 minutes). La vidéo montre la migration des sphéroïdes P3 sur les neurones (à gauche) et sur le revêtement de laminine (à droite). Les cellules ont exprimé la protéine fluorescente verte (GFP, couleur verte). Bar = 100 μm. Veuillez cliquer ici pour télécharger cette vidéo.
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Discussion
Les glioblastomes envahissent largement le parenchyme en utilisant différents modes: cooptation des vaisseaux sanguins environnants, invasion interstitielle ou invasion sur wmts18. Ce dernier mode n’est pas bien caractérisé dans la littérature en raison de la difficulté à trouver des modèles in vitro ou in vivo appropriés liés à l’invasion de WMT. Ici, un modèle simplifié a été proposé dans lequel les neurones de rongeurs cultivés ont été modelés sur des surfaces recouvertes de laminine, et des cellules souches de GBM fluorescentes ont été ensemencées sur les neurones. Un modèle de grille-forme a été employé dans cette étude pour améliorer l’analyse de l’attachement, de l’invasion, et de la prolifération de cellules de tumeur. Les cellules GBM ont migré plus efficacement au-dessus des neurones que directement sur la matrice, qui était laminine dans ces expériences. La forme de la cellule a changé tout au long du processus d’enregistrement, et la surface de la cellule a augmenté en même temps. Les cellules souches GBM sont susceptibles d’être attirées par les tractus neuronaux via l’activation de voies de signalisation spécifiques (c’est-à-dire NOTCH2 / SOX2)4 ou des facteurs et signaux sécrétés par les neurones eux-mêmes. Ce système est bien adapté pour analyser les échanges moléculaires entre les cellules GBM et les neurones, qui peuvent inclure des métabolites, des neurotransmetteurs ou des cytokines.
Récemment, Venkatesh et ses collaborateurs ont décrit la formation d’une synapse neurogliome dans laquelle le glutamate active son récepteur, AMPAR6. Des processus similaires sont-ils impliqués lors de l’invasion WMT des cellules GBM ? Cela peut être étudié avec ce système expérimental en utilisant l’inhibition pharmacologique ou des approches génétiques.
Il convient de noter les points critiques suivants. Tout d’abord, pendant les étapes de PEGylation, le substrat ne doit pas être laissé sécher pour éviter d’affecter l’intégrité du revêtement anti-adhésif. Il est à noter qu’il est possible de laver abondamment la solution PEG-SVA avec de l’eau ultrapure et de la sécher sous un jet d’azote avant de la stocker à 4 °C dans l’obscurité. Deuxièmement, la macro développée pour analyser la migration des cellules GBM sur les neurones est en mode open-access et est compatible avec le logiciel FiJi. Bien que cette macro et ses mises à jour soient disponibles sur GitHub, elle nécessite un étalonnage approprié pour détecter les cellules. Par conséquent, il peut être utile de vérifier les échantillons manuellement en tant que contrôle de la qualité lors du démarrage de l’analyse. La flexibilité du système utilisé ici permet différentes formes du motif, avec des lignes parallèles séparant les neurones à différentes degrés. Avec cette approche, la forme de plusieurs structures cérébrales peut être imitée, comme observé dans le callosum de corpus - la plus grande structure de matière blanche dans le cerveau humain - où l’invasion de WMT est principalement observée. Alternativement, il a été démontré que le même appareil de projection de lumière UV structure des hydrogels non adhésifs sensibles aux UV d’une manière contrôlée par z15, permettant la normalisation de la formation des sphéroïdes.
Dans ce contexte, des neurosphères 3D pourraient être générées pour tester l’invasion gbm. Cette technique peut également être appliquée pour modeler d’autres cellules cérébrales, telles que les cellules endothéliales cérébrales, pour reproduire la forme en forme de vaisseau ou imiter des cellules microgliales ou d’autres cellules immunitaires. Ainsi, des effets synergiques ou inhibiteurs des cellules cérébrales peuvent être observés lorsqu’ils sont co-cultivés avec des cellules GBM. Une limite de cette étude est l’utilisation de neurones embryonnaires de rat en co-culture avec des cellules gbm humaines, qui peuvent ne pas imiter de vraies conditions physiologiques. Une façon de surmonter cet inconvénient serait d’utiliser des neurones dérivés de cellules souches pluripotentes induites par l’homme pour éviter la réactivité croisée des espèces16. Cependant, les cellules GBM adhèrent rapidement et migrent efficacement sur les neurones du rat, comme le montrent ces expériences. Il a également été démontré que les cellules cérébrales de rat (cellules de Schwann) pourraient être efficacement co-cultivées avec des neurones humains17. D’autres méthodes incluent l’utilisation de nanofibres 3D, qui offrent un bon modèle pour étudier la migration cellulaire du gliome12, mais limitent le contact cellule-cellule car les nanofibres sont considérées comme des structures non vivantes.
De plus, les cultures 2D sont réductionnistes, simplifient l’observation des processus cellulaires, et peuvent limiter leur validité pour le contexte in vivo 10. Ainsi, les co-cultures 3D de cellules et de neurones GBM sont de meilleurs représentants de la situation in vivo. Des organoïdes cérébraux complexes, tels que les mini-cerveaux18,ont été utilisés dans des essais d’invasion de culture de confrontation19. Le principal avantage de la stratégie décrite ici est la reproductibilité de l’approche de co-culture, c’est-à-dire que les neurones primaires sont géométriquement contraints sur des micropatterns contrôlés par taille, et l’interaction avec les cellules GBM injectées ne peut pas se produire ailleurs. En outre, l’organisation spatiale des neurones peut être réglée en raison de la polyvalence du système de projection UV, ce qui permet une optimisation supplémentaire. En fin de compte, le développement et la validation de telles approches biomimétiques pourraient également contribuer à réduire le nombre de modèles animaux utilisés dans la recherche biomédicale.
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Disclosures
Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas de conflit d’intérêts.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par la Fondation ARC 2020, ligue contre le cancer (Comite de la Gironde), ARTC, Plan Cancer 2021, INCA PLBIO. Alveole est soutenu par l’Agence Nationale de la Recherche (Grant Labex BRAIN ANR-10-LABX-43). Joris Guyon est boursier du CHU Toulouse.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| (3-aminopropyl) triethoxysilane | Sigma | 440140-100ML | The amino group is useful for the bioconjugation of mPEG-SVA |
| 96-well round-bottom plate | Sarstedt | 2582624 | Used to prepare spheroids |
| Accutase | Gibco | A11105-01 | Stored at -20 °C (long-term) or 4 °C (short-term), sphere dissociation enzyme |
| B27 | Gibco | 12587 | Stored at -20 °C, defrost before use |
| Basic Fibroblast Growth Factor | Peprotech | 100-18B | Stored at -20 °C, defrost before use |
| Countess Cell Counting ChamberSlides | Invitrogen | C10283 | Used to cell counting |
| Coverslips | Marienfeld | 111580 | Cell culture substrate |
| Dessicator cartridges | Sigma | Z363456-6EA | Used to reduce mosture during (3-aminopropyl) triethoxysilane treatment |
| DPBS 10x | Pan Biotech | P04-53-500 | Stored at 4 °C |
| Fiji software, MTrack2 macro | ImageJ | Used to analyze pictures | |
| Flask 75 cm² | Falcon | 10497302 | |
| HBSS | Sigma | H8264-500ML | |
| Heparin sodium | Sigma | H3149-100KU | Stored at 4 °C |
| Laminin | 114956-81-9 | Promotes neuronal adhesion | |
| Leonardo software | loading of envisioned micropatterns | ||
| MetaMorph Software | Molecular Devices LLC | NA | Microscopy automation software |
| Methylcellulose | Sigma | M0512 | Diluted in NBM for a 2% final concentration |
| Neurobasal medium | Gibco | 21103-049 | Stored at 4 °C |
| Nikon TiE (S Fluor, 20x/0.75 NA) | inverted microscope equipped with a motorized stage | ||
| Penicillin - Streptomycin | Gibco | 15140-122 | Stored at 4 °C |
| PLPP | Alveole | PLPPclassic_1ml | Photoinitiator used to degrade the PEG brush |
| Poly(ethylene glycol)-Succinimidyl Valerate (mPEG-SVA) | Laysan Bio | VA-PEG-VA-5000-5g | Used as an anti-fouling coating |
| PRIMO | Alveole | PRIMO1 | Digital micromirror device (DMD)-based UV projection apparatus |
| Trypan blue 0.4% | ThermoFisher | T10282 | Used for cell counting |
| Trypsin-EDTA | Sigma | T4049-100ML | Used to detach adherent cells |
References
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