Summary
Her præsenterer vi en brugervenlig co-kulturanalyse til at analysere glioblastoma (GBM) migration på mønstrede neuroner. Vi udviklede en makro i FiJi-software for nem kvantificering af GBM-cellemigration på neuroner og observerede, at neuroner ændrer GBM-celle invasiv kapacitet.
Abstract
Glioblastomas (GBMs), grade IV ondartede gliomer, er en af de dødeligste typer af kræft hos mennesker på grund af deres aggressive egenskaber. På trods af betydelige fremskridt i genetik af disse tumorer, hvordan GBM celler invadere den sunde hjerne parenchyma er ikke godt forstået. Især har det vist sig, at GBM-celler invaderer det peritumorale rum via forskellige ruter; hovedinteressen i dette papir er ruten langs hvide stof skrifter (WMTs). Samspillet mellem tumorceller med peritumoralnervecellekomponenterne er ikke godt karakteriseret. Heri er der beskrevet en metode, der evaluerer neuronernes indvirkning på GBM-celleinvasion. Dette papir præsenterer en avanceret co-kultur in vitro assay, der efterligner WMT invasion ved at analysere migration af GBM stamceller på neuroner. GBM-cellers opførsel i nærværelse af neuroner overvåges ved hjælp af en automatiseret sporingsprocedure med open source- og friadgangssoftware. Denne metode er nyttig til mange applikationer, især til funktionelle og mekanistiske undersøgelser samt til analyse af virkningerne af farmakologiske midler, der kan blokere GBM-cellemigration på neuroner.
Introduction
Primære ondartede gliomer, herunder GBMs, er ødelæggende tumorer, med en medium overlevelsesrate på 12 til 15 måneder rapporteret for GBM patienter. Nuværende terapi er afhængig af store tumor masse resektion og kemoterapi kombineret med strålebehandling, som kun udvider overlevelsesraten med få måneder. Terapeutiske fejl er tæt forbundet med dårlig levering af lægemidler på tværs af blod-hjerne barrieren (BBB) og til invasiv vækst i perivascular rum, meninges, og langs WMTs1. Perivascular invasion, også kaldet vaskulær co-option, er en godt studeret proces, og de molekylære mekanismer er begyndt at blive belyst; processen med GBM-celleinvasion langs WMT'er er imidlertid ikke godt forstået. Tumorceller migrere ind i den sunde hjerne langs Scherer sekundære strukturer2. For næsten et århundrede siden beskrev Hans-Joachim Scherer de invasive ruter for GBM, som nu omtales som perineuronal satellitose, perivascular satellitose, subpiel spredning og invasion langs WMT (Figur 1A).
Nogle kemokiner og deres receptorer, såsom stromal celle-afledt faktor-1α (SDF1α) og C-X-C motiv kemokin receptor 4 (CXCR4), men ikke vaskulær endotel vækstfaktor (VEGF), synes at være impliceret i WMT invasion3. For nylig har en transcellulær NOTCH1-SOX2-akse vist sig at være en vigtig vej i WMT-invasion af GBM-celler4. Forfatterne beskrev, hvordan GBM stamceller invadere hjernen parenchyma på delvist unmyelinated neuroner, hvilket tyder på ødelæggelse af myelin kapper af GBM celler. En milepæl blev nået i 2019, da tre artikler blev foreløbigt offentliggjort i Nature-tidsskriftet, der understreger den elektriske aktivitets rolle i gliomudvikling5,6. Skelsættende arbejde af Monje og samarbejdspartnere kaste lys over den centrale rolle elektrisk aktivitet i udskillelsen af neuroligin-3, som fremmer gliom udvikling.
Winkler og samarbejdspartnere beskrev forbindelser mellem GBM-celler (mikrorør) som afgørende i invasive trin, og på det seneste har interaktioner mellem GBM-celler og neuroner via nyligt beskrevne neurogliomasynapser. Disse strukturer favoriserer glutamatergisk stimulation af α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolpropionsyre (AMPA) receptorer placeret på GBM cellemembranen, som fremmer tumor udvikling og invasion. Tumorcelleinvasion er en central proces i udbredelsen af metastaser eller fjerne sekundære foci, som observeret hos GBM-patienter. Flere faktorer er blevet identificeret som vigtige i GBM invasion såsom thrombospondin-1, en transformerende vækstfaktor beta (TGFβ-reguleret matricellulært protein, eller kemokin receptor CXCR3)7,8.
Her er en forenklet biomimetisk model blevet beskrevet for at studere GBM-invasion, hvor neuroner er mønstret på spor af laminin, og GBM-celler er seedet på det, som enkeltceller eller som sfæroider (Figur 1B). De to eksperimentelle indstillinger har til formål at opsummere invasion på neuroner, som observeres i GBM9,10,11. Sådanne modeller er tidligere blevet udviklet som justerede nanofiberbiomaterialer (core-shell elektrospinning), der gør det muligt at studere cellemigration ved at modulere mekaniske eller kemiske egenskaber12. Den co-kulturmodel, der er beskrevet i denne artikel, giver en bedre forståelse af, hvordan GBM-celler undslipper på neuroner ved at definere nye molekylære veje, der er involveret i denne proces.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Informeret skriftligt samtykke blev indhentet fra alle patienter (fra Haukeland Hospital, Bergen, Norge, i henhold til lokale etiske komité regler). Denne protokol følger retningslinjerne fra Bordeaux University human and animal research etiske komitéer. Gravide rotter blev opstaldet og behandlet i dyrefaciliteten på Bordeaux University. Aktiv dødshjælp af en E18-timet gravid rotte blev udført ved hjælp af CO2. Alle dyreforsøg er udført i overensstemmelse med de institutionelle retningslinjer og godkendt af den lokale etiske komité. Alle kommercielle produkter er opført i materialeoversigten.
1. Forberedelse af de mønstrede dias
- Substratpræparat til mikromaling
- Der skal behandles 18 mm cirkulære glasovertræk ved luft-/plasmaaktivering i 5 min. Dækslet anbringes i et lukket kammer med 100 μL triethoxysilane (3-aminopropyl) i en ekssikkator i 1 time.
- Inkuber med 100 mg/mL poly (ethylenglycol)-succinimidyl valerat (molekylvægt 5.000 (Peg-SVA)) i 10 mM karbonatbuffer, pH-> 8, i 1 time. Skyl meget med ultrapure vand, og tør under en kemisk hætte.
BEMÆRK: På dette stadium kan prøven opbevares ved 4 °C i mørke til videre brug. - Fotoinitiatoren, 4-benzoylbenzyl-trimethylammoniumchlorid (PLPP), tilsættes ved 14,7 mg/mL i fosfatbufferet saltvand (PBS).
BEMÆRK: Der kan også anvendes en koncentreret form af PLPP, en PLPP gel. Det resulterer i en kortere ultraviolet (UV) belysningstid, der kræves for at forringe PEG-børsten (100 mJ/mm2).
- Fotoinitiator gel deposition
- Der fremstilles en blanding af 3 μL PLPP gel og 50 μL absolut ethanol, som skal deponeres i midten af diaset. Prøven anbringes under en kemisk emhætte, indtil den absolutte ethanol er fuldstændig fordampet.
BEMÆRK: På dette stadium kan prøven opbevares ved 4 °C i mørke til videre brug.
- Der fremstilles en blanding af 3 μL PLPP gel og 50 μL absolut ethanol, som skal deponeres i midten af diaset. Prøven anbringes under en kemisk emhætte, indtil den absolutte ethanol er fuldstændig fordampet.
- Mikromaling af glasrutsjebane
- Monter coverlip i en Ludin kammer, og læg den på motoriseret fase af et mikroskop udstyret med en auto-fokus system.
- Indlæs billeder, der svarer til de forestillede mikropatterner, i softwaren. Anvend disse parametre: replikering 4 x 4 gange, afstand på 200 μm, UV-dosis på 1.000 mJ/mm2. Efter den automatiske UV-belysningssekvens skylles PLPP væk med flere PBS-vaske.
BEMÆRK: Hvis PLPP-gelen blev anvendt, skal den fjernes ved omfattende vask med deioniseret vand, tørres i en strøm af N2og opbevares ved 4 °C. - Inkuber med laminin (50 μg/mL i PBS) i 30 min. Vask i vid udstrækning med PBS.
BEMÆRK: En fluorescerende opløsning af renset grønt fluorescerende protein (GFP, 10 μg/ml i PBS) kan blandes med laminin for at visualisere mikropatternerne ved fluorescensmikroskopi.
2. Forberedelse af neuroner og GBM-celler til co-kultur
- Kultur af embryonale rotte hippocampal neuroner
- Disseker hippocampus af embryonale (E18) rotter, og overfør vævet til en Hanks afbalancerede saltopløsning (HBSS)/1 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonsyre (HEPES)/penicillin-streptomycin opløsning i et 15 ml rør. Fjern overskydende opløsning uden at tørre hippocampus.
- Der tilsættes 5 ml trypsin-ethylendiaminmethansyre (EDTA) suppleret med penicillin (10.000 enheder/ml)/streptomycin (10.000 μg/ml) og 1 mM HEPES og inkuberes i 15 min ved 37 °C. Vask 2x med HBSS/HEPES/penicillin-streptomycin opløsningen, og lad vævet forblive i denne opløsning i 2-3 min.
- Dissociere vævet ved hjælp af to flammepolerede Pasteur pipetter, ved pipetter op og ned 10x med hvert væv, idet man sørger for at minimere skumning. Tæl cellerne, og vurder celleaffjedringens levedygtighed. Plade neuronerne på mikropatterned coverslips som angivet nedenfor.
BEMÆRK: Celle levedygtighed sats er 85-90% efter ekstraktion.
- Cellekultur for neuroner på mikropatterned coverslips
- Rehydrere mikropatterned glas dias med PBS, og inkubere komplet neuronal cellekultur medium.
- Frø hippocampal neuroner opnået fra E18 Sprague-Dawley rotter direkte over micropatterned glas coverlip ved en tæthed på 50.000 celler per cm2 i neurobasal medium (NBM) beriget med 3% hest serum. Mikropatternerne i inkubatoren (37 °C, 5% CO2)anbringes i 48 timer.
BEMÆRK: Efter ~ 6 h, primære hippocampal neuroner kan ses at overholde laminin mikropatterns.
- Co-kultur af menneskelige GBM stamceller på neuroner
BEMÆRK: Til denne undersøgelse blev membran GFP-positive og kernetomat patient-afledte GBM-celler dyrket i henhold til tidligere offentliggjorte protokoller10.- Efterhånden som de sfæroidformede celler vokser i suspension, centrifuge suspensionen i 5 min ved 200 × g. Spheroiderne vaskes med 5 mL PBS, og cellerne inkuberes med 0,5 mL reagens til celledesaltning (se materialetabellen)i 5 min ved 37 °C.
- Tilsæt 4,5 ml komplet NBM (suppleret med B27-supplement, heparin, fibroblastvækstfaktor 2, penicillin og streptomycin, som beskrevet tidligere8), og tæl cellerne ved hjælp af en automatisk optællingsteknik.
- Frø 1.000 GBM celler over mikropatterned neuronal kultur i NBM beriget med 3% hest serum. Pladen inkuberes ved 37 °C, 5% CO2og 95% fugtighed.
3. Levende cellebilleddannelse
- Umiddelbart efter GBM-cellesåning placeres prøven på scenen i et omvendt mikroskop udstyret med et termostatkammer. Udfør live-celle billeddannelse på mikroskopet udstyret med en motoriseret scene til optagelse af flere positioner ved hjælp af en flerdimensional anskaffelsesværktøjskasse i softwaren. Anskaf billeder af lysfelt og epifluorescens pr. 5. minut over 12 timer med et mål på 20x ved en temperatur (37 °C) og gaskontrolleret (5% CO2)miljø.
4. Billedanalyse
BEMÆRK: Ved hjælp af Fiji blev todimensionel (2D) billedstak semi-automatisk forbehandlet eller behandlet ved hjælp af et hjemmelavet og brugervenligt værktøj (tilgængeligt på denne adresse: https://github.com/Guyon-J/Coculture_Gliomas-Neurons/blob/main/README.md), som er skrevet på IJ1-makrosprog (Figur 2A). Den automatiserede arbejdsgang og de automatiserede procedurer er opsummeret i Figur 2B.
- Analyse af neuronale netværk (Figur 2Bi)
- Vælg ét billede af stakken. Højreklik på netværksværktøjet for at åbne den tilsvarende dialogboks Indstillinger og justere indstillingerne (f.eks. Tærskel = Trekant, Li, Huang..., Gaussian Blurog Medianfiltre = 1, 2, 3...) for at producere en præcis segmentering af billeder. Klik derefter på OK.
- Venstreklik på netværksværktøjet for automatisk at aktivere følgende procedure.
- Dupliker det markerede billede, og opdel det i tre farvekanaler (Rød-grå-grøn).
- Vælg den grå kanal (brightfield), og udfør CSE (Contrast Stretch Enhancement) for at forbedre adskillelsen mellem forskellige områder. Brug SED (Sobel Edge Detector) til at udføre den 2D-signalbehandlingskonvolutionshandling, der allerede er grupperet under kommandoen Find kant.
- For dobbeltfiltrering (F) skal du anvende en gaussisk sløring og medianfilter for at reducere støj og udjævne objektsignalet. Konverter til maske (CM) ved at udføre tilpassede tærskelalgoritmer for at få et binært billede (BIN-grå) med sorte pixel (celleområde) og hvide pixel (baggrund). Skeletter (Sk) celleområdet til et simpelt netværk (NET) og filtrerer partikler (EP) i et NET-billede ved at fjerne små, ikke-netværkspartikler.
- For røde og grønne kanaler (kerne og membran) skal du udføre dobbeltfiltrering, konvertere til Mask ved hjælp af den tilpassede tærskelmetode og tillade BIN-grøn at bestemme cellemorfologi med kommandoen Analyser partikler.
- Flet alle kanaler ved hjælp af deres investeringsafkast (Region of Interest) med operatoren OR (combine), og juster deres oprindelige farve til et simpelt RGB-billede.
- Analyse af enkeltcellemotilitet(figur 2Bii)
- Højreklik på værktøjet Sporing af enkeltceller for at åbne den tilsvarende dialogboks Indstillinger, og juster indstillingerne (f.eks. Trail-type = Kerne eller Membran, Tærskel = Trekant, Li, Huang..., Z-projektion = Maks. intensitet, Sum slices..., Gaussian Blur og Median filtre = 1, 2, 3...) for at producere en præcis segmentering af billeder. Klik derefter på OK.
- Venstreklik på værktøjet Sporing af enkeltceller for automatisk at aktivere følgende procedure.
- Fjern den grå kanal. Anvend en Z-projektion på stakken, som genererer et billede, der svarer til en billedstak i henhold til klokkeslættet (T-stak). Dobbeltfiltrer og konverter til Maske de stier, der efterlades af celler. Fjern små partikler til BIN-rød/grøn billedet.
- Hvis du bruger INVESTERINGSAFKAST, skal du markere hver kontur af cellesporingen og markere afkrydsningsfeltet Spring kantregistrering over i dialogboksen Indstillinger for at springe dette forbehandlingstrin over for efterfølgende trin.
- Isoler den røde kanal (Trail type = Kerne) på den oprindelige stak. Vælg ét investeringsafkast, og fjern det ydre område. Dobbeltfiltrer alle billeder, og konverter til Mask (BIN-rød). Bestem centroid X/Y-positionen for hver binariseret kerne.
- Brug en allerede udgivet makro til regnearkssoftware13, beregn den gennemsnitlige kvadratiske forskydning, retningsforholdet og gennemsnitshastigheden for denne celle.
- Analyse af sporing af flere celler (Figur 2Biii)
- Højreklik på sporingsværktøjet for at åbne den tilsvarende dialogboks Indstillinger og justere indstillingerne (f.eks. Tærskel = Trekant, Li, Huang..., Gaussian Blur og Median filtre = 1, 2, 3...) for at producere en præcis segmentering af billeder. Klik derefter på OK.
- Venstreklik på sporingsværktøjet for automatisk at aktivere følgende procedure.
- Fjern den grå kanal.
- Opdel de røde og grønne kanaler, dobbeltfilter, og konverter til Mask.
- Flet kanalerne ved hjælp af Billedberegner... kommando med AND-operatøren, så der kun efterlades det kernenald, der findes i membranerne.
BEMÆRK: Flere plugins i Fiji kan bruges til at bestemme X / Y-placeringen af flere celler i dette binære forbehandlede billede på samme tid (se materialetabellen).
- Ved hjælp af en tidligere beskrevet makro13skal du beregne baneplottet, middel kvadratisk forskydning, retningsforhold og gennemsnitshastighed for disse celler.
- Sfærisk migration på den neurale måtte (Figur 2Biv)
- Højreklik på overførselsværktøjet for at åbne den tilsvarende dialogboks Indstillinger og justere indstillingerne (f.eks. Tærskel = Trekant, Li, Huang..., Gaussian Blur og Median filtre = 1, 2, 3...) for at producere en præcis segmentering af billeder. Klik derefter på OK.
- Venstreklik på overførselsværktøjet for automatisk at aktivere følgende procedure.
- Fjern den røde kanal.
- Split de grønne og grå kanaler.
- For den grå kanal, tegne manuelt konturen af neuronal måtten, og måle sit område.
- For den grønne kanal skal du dobbeltfiltrere stakken og konvertere til Mask. Fjern området uden for mønsteret (BIN), og fastlæg det binariserede celleområde for hvert billede.
BEMÆRK: Parametre, der er beskrevet ovenfor, kalibreres ved at ændre deres værdier ved at venstreklik på interesseikonet. Denne behandling kan udføres manuelt. Men for et stort antal billeder (ca. hundrede pr. erhvervelser), kanaler (generelt 3 kanaler) og behandlingstrin ville et automatiseret eller halvautomatisk værktøj være at foretrække.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Mønstrede neuroner, der var medkulturerede med fluorescerende GBM-celler, blev udarbejdet som beskrevet i protokolafsnittet, og sporingseksperimenter blev udført. GBM-celler ændrede hurtigt deres form, mens de migrerede på neuronerne (Figur 1B: panel 6 og Video 1). Celler migreret langs neuronale udvidelser, i en tilfældig bevægelse (Video 1). Fluorescerende GBM-celler og ikke-fluorescerende neuroner kan let skelnes, og dette gjorde det muligt at spore cellebevægelser ved hjælp af Fiji-makroen som beskrevet i protokolafsnittet (Figur 2). Fiji er en åben licens software, der letter billedbehandling og analyse. Manuelle procedurer, der er relativt tidskrævende til analyse af mange billeder, kan automatiseres i en makro. Billeder importeres ved hjælp af træk og slip-procedure, behandles og kvantificeres, hvilket genererer data, der er tilgængelige ved hjælp af en ROI Manager.
Når det deponeres i Fiji.app | makroer | værktøjssæt mappe, Gliomas-Neurons værktøj var tilgængelig i menuen Flere værktøjer og viste flere ikoner (Figur 2A). En arbejdsgang for billedbehandlingen, der opnås ved at klikke på ikonerne, er illustreret i figur 2B (i-iv). Celleform kan analyseres på det neurale netværk(Figur 2B,i). Der kan opnås flere parametre fra cellesporing for en (Figur 2B, ii) eller flere celler ( Figur2B,iii) ved hjælp af to forskellige billedprocesser. Hastigheden af inddrivelse af sfæroide GBM-celler på neuronerne kan også analyseres (Figur 2B, iv). Celler, der er seedet påneuroner,har en langstrakt form med flere fremspring efter neuronkanalen(figur 3A, i ), men havde en rund form, når de dyrkes direkte på laminin ( Figur3A, ii). Celler dyrket på neuroner effektivt ændret deres form, selv om de ikke var langstrakt, når dyrket på laminin (Figur 3A, iii-v). Tynde fremspring, undertiden forbinder to celler, blev set i celler co-dyrket med neuroner på senere stadier (Video 1).
Den migrerende kapacitet AF GBM celler seedet på neuroner blev sammenlignet med celler direkte seedet på laminin. Celler, der var seedet på neuroner, havde større migrationskapacitet end alene på laminin(figur 3B,i,ii). Tilfældig bevægelse af P3-celler blev påvist under begge forhold, med større afstand for P3-celler på neuronerne, som vist i baneområdet (Figur 3B, i,ii). Cellemotiliteten blev kvantitativt anslået ved hjælp af den gennemsnitlige kvadratiske forskydning (MSD), og dens logrepræsentation var udstyret med en lineær funktion14 (Figur 3B, iii). Retningsbestemthed og gennemsnitshastighed blev også beregnet for begge forhold (figur 3B, iv, v). Cellemigration af P3-sfæroider blev også efterfulgt af påvisning af det fluorescerende område over tid på neuronerne og sammenlignet med migration på laminin alene(figur 3C,i,ii og video 2). Halvdelen af mønsteret med neuroner blev dækket med GBM-celler efter 500 minutter i en lineær profil; spheroids overholdt dog ikke lamininmønsteret(figur 3D, iii og video 2).
Figur 1:Eksperimentel opsætning af glioblastoma celler migrere på mønstrede neuroner. (A)Repræsentation af glioblastoma celler invaderer kontralaterale halvkugle gennem corpus callosum. (B) Eksperimentel opsætning. I trin 1 er pladeoverfladen belagt med et antifouling PEG-lag. Fotoinitiatoren tilføjes i trin 2, der dækker hele belægningen. I trin 3 projiceres et UV-widefield-billede gennem mikroskopets mål, som lokalt aktiverer fotoinitiatormolekylerne. Den aktiverede fotoinitiator kløver lokalt PEG-molekyler og tillader efterfølgende adsorption af laminin. I trin 5 er neuroner seedet og klæber på laminin-arrays. P3 (GFP / Tomatnukleare) glioblastoma celler derefter deponeres på neuronal mønster, og billeder er erhvervet (trin 6). Forkortelser: PEG = polyethylenglycol; UV = ultraviolet; GFP = grønt fluorescerende protein. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Præsentation og analyse af fijiværktøj. (A) Værktøjet kaldet Gliomas-Neurons er tilgængeligt i menuen Flere værktøjer, når makroen føjes til Fiji.app mappe | makroer | værktøjssæt (venstre panel). Det består af flere handlingsværktøjer, der er beskrevet nedenfor (højre panel). (B) i. Netværksværktøj: billedbehandling, som bruges til at tegne neurale netværk og gliomceller i en forenklet repræsentation. ii. Enkeltcellesporingsværktøj: billedbehandling, som bruges til at tegne og markere cellebevægelsesområdet til analyse af forskydningen af enkelte celler. iii. Sporingsværktøj: trin til billedforbehandling til brug af forudinstallerede Fiji-sporings-plugins. iv. Relativt overførselsværktøj: billedbehandling, som bruges til at bestemme den relative celleoverførsel på et manuelt valgt mønster. Nogle parametre kan kalibreres med et venstre klik på værktøjsknappen. Forkortelser: CSE = Kontraststrækforbedring; SED = Sobel kant detektor; F = dobbelt filtrering; CM = Konverter til maske; Sk = Skeletter; EP = Eliminering af partikler; OR (mejetærsker) = Eu-operator på udvalgte ROI'er; AND = Sammenkodningsoperator på udvalgte ROI'er. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Sammenligning af P3-celler eller sfæroider på mønstrede neuronervs. lamininbelægning. (A) Form deskriptorer af dissociated P3 GFP/Tomatonukleare celler på neuroner eller på laminin. Eksempel på behandlede netværk af P3-celler på i. mønstrede neuroner eller på ii. laminin belægning. Skalastang = 50 μm. iii. Gennemsnitlig celle område på mønstrede neuroner eller på laminin. iv. Formfaktor er forholdet mellem omkredsen til det normaliserede område til en cirkel, der giver parametre for celleforlængelse og celleforgrening. v. Højde-bredde-forholdet er forholdet mellem den overordnede akse og cellens underordnede akse. I iii, ivog vblev 15 celler analyseret pr. felt. 4 uafhængige mønstre; Data repræsenteres som middelværdi ± S.E.M. (B) Sporingsanalyse af dissociated P3-celler. Et repræsentativt diagramområde af celler på( i) mønstrede neuroner og (ii) på lamininbelægning. iii. MSD af P3-celler, der migrerer på neuroner eller på lamininbelægning. X/Y-værdier er i logaritmiske skalaer. iv. Retningsforhold. v. Gennemsnitlig overførsel af cellehastighed. I iii, ivog vblev 15 celler analyseret pr. felt. 4 uafhængige mønstre; data repræsenteres som middel ± S.E.M. (C) Migrationsanalyse af P3 GFP-sfæroider. Repræsentative billeder på forskellige tidspunkter af P3-sfæroider på (i) mønstrede neuroner eller på (ii) lamininbelægning. Skalastang = 100 μm. iii. Sfærisk migrering repræsenteret ved mønstersammenløbet; 4 uafhængige mønstre; data repræsenteres som middel ± S.E.M. Forkortelser: GFP = grønt fluorescerende protein; S.E.M. = standardfejl i middelværdien; MSD = Gennemsnitlig firkantet forskydning. Klik her for at se en større version af dette tal.
Video 1: P3 celler på neuroner eller laminin optaget over 8 timer (afbildet hver 5 min). Videoen viser P3 enkelt-celle migration på neuroner (venstre) og på laminin belægning (højre). Celler udtrykt grønt fluorescerende protein (GFP, grøn farve) og kernetomat (rød farve). Bar = 50 μm. Klik her for at downloade denne video.
Video 2: P3-sfæroider på neuroner eller laminin optaget over 8 timer (afbildet hvert 5. minut). Videoen viser P3 sfæroid migration på neuroner (venstre) og på laminin belægning (højre). Celler udtrykt grønt fluorescerende protein (GFP, grøn farve). Bar = 100 μm. Klik her for at downloade denne video.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Glioblastomas invaderer i vid udstrækning parenchyma ved hjælp af forskellige tilstande: co-option af omkringliggende blodkar, interstitiel invasion eller invasion på WMTs18. Sidstnævnte tilstand er ikke godt karakteriseret i litteraturen på grund af vanskelighederne med at finde egnede in vitro- eller in vivo-modeller relateret til WMT-invasion. Her er der foreslået en forenklet model, hvor dyrkede gnaverneuroner blev mønstret på lamininbelagte overflader, og fluorescerende GBM-stamceller blev seedet oven på neuronerne. Et gitterformmønster blev brugt i denne undersøgelse til at forbedre analysen af tumorcelletilbehør, invasion og spredning. GBM-celler migrerede mere effektivt oven på neuronerne end direkte på matrixen, som var laminin i disse eksperimenter. Cellefiguren ændrede sig under hele optagelsesprocessen, og celleoverfladearealet steg på samme tid. GBM stamceller vil sandsynligvis blive tiltrukket af neuron skrifter via aktivering af specifikke signalering veje (dvs. NOTCH2/SOX2)4 eller udskilles faktorer og signaler fra neuroner selv. Dette system er velegnet til at analysere de molekylære udvekslinger mellem GBM-celler og neuroner, som kan omfatte metabolittere, neurotransmittere eller cytokiner.
For nylig beskrev Venkatesh og samarbejdspartnere dannelsen af en neuroglioma synapse, hvor glutamat aktiverer sin receptor, AMPAR6. Er lignende processer involveret under WMT invasion af GBM-celler? Dette kan undersøges med dette eksperimentelle system ved hjælp af farmakologisk hæmning eller genetiske tilgange.
Følgende kritiske punkter skal bemærkes. For det første bør substratet under PEGylation-trinene ikke få lov til at tørre ud for at undgå at påvirke integriteten af den antiklæbende belægning. Bemærk, at peg-SVA-opløsningen kan vaskes grundigt med ultrapurevand og tørres ud under en nitrogenstrøm, før den opbevares ved 4 °C i mørke. For det andet er makroen udviklet til analyse af GBM-cellemigrering på neuroner i en åben adgangstilstand og er kompatibel med FiJi-software. Selvom denne makro og dens opdateringer er tilgængelige på GitHub, kræver den en passende kalibrering til registrering af celler. Derfor kan det være nyttigt at kontrollere prøverne manuelt som en kvalitetskontrol, mens analysen startes. Fleksibiliteten i det system, der anvendes her, tillader forskellige former af mønsteret, med parallelle linjer, der adskiller neuronerne i forskellige omfang. Med denne tilgang kan formen af flere cerebral strukturer efterlignes, som observeret i corpus callosum-den største hvide stofstruktur i menneskelig hjerne - hvor WMT-invasion hovedsagelig observeres. Alternativt har det samme UV-lysprojektionsapparat vist sig at strukturere UV-følsomme ikke-klæbende hydrogeler på en z-kontrolleret måde15, hvilket gør det muligt at standardisere sfæroiddannelse.
I denne sammenhæng kan 3D neurosfærer genereres for at teste GBM invasion. Denne teknik kan også anvendes til at mønstre andre hjerneceller, såsom hjerne endotelceller, til at reproducere karlignende form eller efterligne mikrogliale eller andre immunceller. Således kan synergistiske eller hæmmende virkninger af hjerneceller observeres, når de er co-dyrket med GBM-celler. En begrænsning af denne undersøgelse er brugen af embryonale rotteneuroner i co-kultur med menneskelige GBM-celler, som måske ikke efterligner sande fysiologiske forhold. En måde at overvinde denne ulempe på ville være at bruge menneskeskabte pluripotente stamcelle-afledte neuroner for at undgå arter krydsreaktivitet16. Men GBM-celler klæber hurtigt og migrerer effektivt på rotteneuroner, som vist i disse eksperimenter. Det er også blevet påvist end rotte cerebral celler (Schwann celler) kunne være effektivt co-dyrket med menneskelige neuroner17. Andre metoder omfatter brugen af 3D nanofibre, som tilbyder en god model til at studere gliomcellemigration12, men begrænser cellecellekontakt, da nanofibre betragtes som ikke-levende strukturer.
Desuden er 2D-kulturer reduktionistiske, forenkler observationen af cellulære processer og kan begrænse deres gyldighed for in vivo-konteksten 10. Således er 3D-co-kulturer af GBM-celler og neuroner bedre repræsentanter for in vivo-situationen. Komplekse hjerneorganoider, såsom mini-hjerner18, er blevet brugt i konfrontationskultur invasionsanalyser19. Den største fordel ved den strategi, der er beskrevet heri, er reproducerbarheden af co-culture-tilgangen, dvs. de primære neuroner er geometrisk begrænset på størrelseskontrollerede mikropatterner, og samspillet med de injicerede GBM-celler kan ikke forekomme andre steder. Desuden kan den rumlige organisering af neuroner indstilles på grund af UV-projektionssystemets alsidighed, hvilket giver mulighed for yderligere optimering. I sidste ende kan udviklingen og valideringen af sådanne biomimetiske tilgange også bidrage til at reducere antallet af dyremodeller, der anvendes i biomedicinsk forskning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen interessekonflikter.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af Fondation ARC 2020, Ligue Contre le Cancer (Comite de la Gironde), ARTC, Plan Cancer 2021, INCA PLBIO. Alveole er støttet af Agence Nationale de la Recherche (Grant Labex BRAIN ANR-10-LABX-43). Joris Guyon er modtager af stipendium fra Toulouse University Hospital (CHU Toulouse).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| (3-aminopropyl) triethoxysilane | Sigma | 440140-100ML | The amino group is useful for the bioconjugation of mPEG-SVA |
| 96-well round-bottom plate | Sarstedt | 2582624 | Used to prepare spheroids |
| Accutase | Gibco | A11105-01 | Stored at -20 °C (long-term) or 4 °C (short-term), sphere dissociation enzyme |
| B27 | Gibco | 12587 | Stored at -20 °C, defrost before use |
| Basic Fibroblast Growth Factor | Peprotech | 100-18B | Stored at -20 °C, defrost before use |
| Countess Cell Counting ChamberSlides | Invitrogen | C10283 | Used to cell counting |
| Coverslips | Marienfeld | 111580 | Cell culture substrate |
| Dessicator cartridges | Sigma | Z363456-6EA | Used to reduce mosture during (3-aminopropyl) triethoxysilane treatment |
| DPBS 10x | Pan Biotech | P04-53-500 | Stored at 4 °C |
| Fiji software, MTrack2 macro | ImageJ | Used to analyze pictures | |
| Flask 75 cm² | Falcon | 10497302 | |
| HBSS | Sigma | H8264-500ML | |
| Heparin sodium | Sigma | H3149-100KU | Stored at 4 °C |
| Laminin | 114956-81-9 | Promotes neuronal adhesion | |
| Leonardo software | loading of envisioned micropatterns | ||
| MetaMorph Software | Molecular Devices LLC | NA | Microscopy automation software |
| Methylcellulose | Sigma | M0512 | Diluted in NBM for a 2% final concentration |
| Neurobasal medium | Gibco | 21103-049 | Stored at 4 °C |
| Nikon TiE (S Fluor, 20x/0.75 NA) | inverted microscope equipped with a motorized stage | ||
| Penicillin - Streptomycin | Gibco | 15140-122 | Stored at 4 °C |
| PLPP | Alveole | PLPPclassic_1ml | Photoinitiator used to degrade the PEG brush |
| Poly(ethylene glycol)-Succinimidyl Valerate (mPEG-SVA) | Laysan Bio | VA-PEG-VA-5000-5g | Used as an anti-fouling coating |
| PRIMO | Alveole | PRIMO1 | Digital micromirror device (DMD)-based UV projection apparatus |
| Trypan blue 0.4% | ThermoFisher | T10282 | Used for cell counting |
| Trypsin-EDTA | Sigma | T4049-100ML | Used to detach adherent cells |
References
- Shergalis, A., Bankhead, A., Luesakul, U., Muangsin, N., Neamati, N. Current challenges and opportunities in treating glioblastoma. Pharmacology Reviews. 70, 412-445 (2018).
- Scherer, H. J. The forms of growth in gliomas and their practical significance. Brain. 63, 1-35 (1940).
- Zagzag, D., et al. Hypoxia- and vascular endothelial growth factor-induced stromal cell-derived factor-1α/CXCR4 expression in glioblastomas. American Journal of Pathology. 173, 545-560 (2008).
- Wang, J., et al. Invasion of white matter tracts by glioma stem cells is regulated by a NOTCH1-SOX2 positive-feedback loop. Nature Neurosciences. 22, 91-105 (2019).
- Venkataramani, V., et al. Glutamatergic synaptic input to glioma cells drives brain tumour progression. Nature. 573, 532-538 (2019).
- Venkatesh, H. S., et al. Electrical and synaptic integration of glioma into neural circuits. Nature. 573, 539-545 (2019).
- Boyé, K., et al. The role of CXCR3/LRP1 cross-talk in the invasion of primary brain tumors. Nature Communications. 8, 1571 (2017).
- Daubon, T., et al. Deciphering the complex role of thrombospondin-1 in glioblastoma development. Nature Communications. 10, 1146 (2019).
- Gritsenko, P. G., et al. p120-catenin-dependent collective brain infiltration by glioma cell networks. Nature Cell Biology. 22, 97-107 (2020).
- Guyon, J., et al. A 3D spheroid model for glioblastoma. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (158), (2020).
- Strale, P. O., et al. Multiprotein Printing by Light?Induced Molecular Adsorption. Advanced Materials. , (2015).
- Rao, S. S., et al. Mimicking white matter tract topography using core-shell electrospun nanofibers to examine migration of malignant brain tumors. Biomaterials. 34, 5181-5190 (2013).
- Visweshwaran, S. P., Maritzen, T. A simple 3D cellular chemotaxis assay and analysis workflow suitable for a wide range of migrating cells. MethodsX. 6, 2807-2821 (2019).
- Qian, H., Sheetz, M. P., Elson, E. L. Single particle tracking. Analysis of diffusion and flow in two-dimensional systems. Biophysics Journal. 60, 910-921 (1991).
- Pasturel, A., Strale, P. -O., Studer, V. Tailoring common hydrogels into 3D cell culture templates. Advance Healthcare Materials. 9, 2000519 (2020).
- Dolmetsch, R., Geschwind, D. H. The human brain in a dish: the promise of iPSC-derived neurons. Cell. 145, 831-834 (2011).
- Clark, A. J., et al. Co-cultures with stem cell-derived human sensory neurons reveal regulators of peripheral myelination. Brain. 140, 898-913 (2017).
- Linkous, A., et al. Modeling patient-derived glioblastoma with cerebral organoids. Cell Reports. 26, 3203-3211 (2019).
- Han, M., et al. Interfering with long non-coding RNA MIR22HG processing inhibits glioblastoma progression through suppression of Wnt/β-catenin signalling. Brain. 143, 512-530 (2020).
