इन विट्रो और वीवो अध्ययन में माउस इनवेरियंट नेचुरल किलर टी सेल का शुद्धिकरण और विस्तार
Summary
हम माउस तिल्ली से अपरिवर्तनीय प्राकृतिक हत्यारा टी (iNKT) कोशिकाओं को समृद्ध करने के लिए एक तेजी से और मजबूत प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं और उन्हें इन विट्रो और वीवो अध्ययनों के लिए उपयुक्त संख्या में इन विट्रो में विस्तारित करते हैं।
Abstract
इनवेरिएंट नेचुरल किलर टी (iNKT) कोशिकाएं जन्मजात होती हैं, जैसे टी लिम्फोसाइट्स एक संरक्षित अर्ध-इनवेरिएटेंट टी सेल रिसेप्टर (टीसीआर) को व्यक्त करते हैं जो गैर-बहुरूपिक एमएचसी वर्ग I-संबंधित अणु CD1d द्वारा प्रस्तुत स्वयं या माइक्रोबियल लिपिड एंटीजन के लिए विशिष्ट है। प्रीक्लिनिकल और नैदानिक अध्ययन कैंसर, ऑटोआईआईयुडिजिट और संक्रामक रोगों में iNKT कोशिकाओं के लिए एक भूमिका का समर्थन करते हैं । iNKT कोशिकाओं को बहुत प्रजातियों में संरक्षित कर रहे है और उनकी जांच सीडी 1d कमी या iNKT कमी चूहों सहित माउस मॉडल द्वारा सुविधा दी गई है, और स्पष्ट रूप से उंहें चूहों और पुरुषों में CD1d tetramers या अर्द्ध अवरक्त TCR के लिए विशिष्ट mAbs के साथ पता लगाने की संभावना है । हालांकि, iNKT कोशिकाओं दुर्लभ है और वे किसी भी अध्ययन के लिए प्रबंधनीय संख्या तक पहुंचने के लिए विस्तार की जरूरत है । क्योंकि विट्रो में प्राथमिक माउस iNKT सेल लाइन की पीढ़ी मुश्किल साबित हुई है, हमने iVα14-Jα18 ट्रांसजेनिक चूहों (iVα14Tg) से प्लीहा iNKT कोशिकाओं को शुद्ध और विस्तारित करने के लिए एक मजबूत प्रोटोकॉल स्थापित किया है, जिसमें iNKT कोशिकाएं 30 गुना अधिक बार होती हैं। हम यहां दिखाते हैं कि प्राथमिक प्लीहा iVα14Tg iNKT कोशिकाओं को इम्यूनोमैग्नेटिक पृथक्करण प्रक्रिया के माध्यम से समृद्ध किया जा सकता है, जो लगभग 95-98% शुद्ध iNKT कोशिकाओं को उत्पीचक करता है। शुद्ध iNKT कोशिकाओं विरोधी CD3/CD28 मोती प्लस IL-2 और आईएल-7 से प्रेरित हैं, जिसके परिणामस्वरूप 85-99% शुद्धता के साथ संस्कृति के दिन + 14 से 30 गुना विस्तार । विस्तारित iNKT कोशिकाओं को आसानी से आनुवंशिक रूप से हेरफेर किया जा सकता है, सक्रियण के तंत्र को विच्छेदन करने के लिए एक अमूल्य उपकरण प्रदान करता है और विट्रो में कार्य करता है और अधिक महत्वपूर्ण बात, वीवो में दत्तक हस्तांतरण पर भी।
Introduction
इनवेरिएंट नेचुरल किलर टी सेल्स (iNKT कोशिकाएं) जन्मजात हैं-जैसे टी लिम्फोसाइट्स जो एक अर्ध-इनवेरेंट α αο T सेल रिसेप्टर (टीसीआर) को व्यक्त करते हैं, जो चूहों में एक अवरिष्क Vα14-Jα18 श्रृंखला द्वारा निर्मित विविध Vα 14-Jα18 श्रृंखला द्वारा गठित विविध Vοजंजीरों 1के एक सीमित सेट के साथ बनती है, जो MHC वर्ग I-से संबंधित अणुओं द्वारा प्रस्तुत लिपिड एंटीजन के लिए विशिष्टहै। iNKT कोशिकाओं को एक एगोनिस्ट चयन कार्यक्रम से गुजरना पड़ता है जिसके परिणामस्वरूप थाइमस में पहले से ही सक्रिय/जन्मजात प्रभावकार फेनोटाइप का अधिग्रहण होता है, जो कई परिपक्वता चरणों3, 4केमाध्यम से होता है, जो सीडी 4+ और सीडी4– सबसेट का उत्पादन करता है। इस कार्यक्रम के माध्यम से, iNKT कोशिकाएं क्रमशः 5 क्रमशः 5 ट्रांसक्रिप्शन कारकों टी-बेट, GATA3, पीएलजेडएफ और RORγt की अभिव्यक्ति से पहचाने जाने वाले अलग टी हेल्पर (टीएच)प्रभावकार फेनोटाइप, अर्थात् टी एच 1 (iNKT1), टी एच 2 (iNKT2) और टीएच17(iNKT17) प्राप्त करती हैं। iNKT कोशिकाएं माइक्रोबियल लिपिड की एक श्रृंखला को पहचानती हैं, लेकिन अंतर्जात लिपिड के खिलाफ आत्म-प्रतिक्रियाशील भी होती हैं जो कोशिका तनाव और ऊतक क्षति की रोगीय स्थितियों के संदर्भ में अपवर्तित होते हैं, जैसे कैंसर और ऑटोनियुसनी2। सक्रियण पर, iNKT कोशिकाएं सीधे संपर्क और साइटोकिन उत्पादन2के माध्यम से अन्य सहज और अनुकूली प्रतिरक्षा प्रभावक कोशिकाओं के कार्यों को मिलाती हैं।
iNKT कोशिकाओं की जांच को माउस मॉडल द्वारा सुविधा प्रदान की गई है, जिसमें CD1d-कमी या Jα18-कमी वाले चूहों, और एंटीजन-लोडेड सीडी 1डी टेट्रामर्स के उत्पादन के साथ-साथ मानव अर्ध-इनवेरिएट टीसीआर के लिए विशिष्ट मोनोक्लोनल एंटीबॉडी (एमएबी) की पीढ़ी शामिल है। हालांकि, प्राथमिक माउस iNKT सेल लाइन की पीढ़ी मुश्किल साबित हुई है। बेहतर iNKT कोशिकाओं के एंटीट्यूमर कार्यों की विशेषता है और उन्हें दत्तक कोशिका चिकित्सा के लिए उपयोग करने के लिए, हम iVα14-Jα18 ट्रांसजेनिक चूहों (iVα14Tg)6,जिसमें iNKT कोशिकाओं को 30 गुना अधिक जंगली प्रकार चूहों की तुलना में अक्सर कर रहे हैं की प्लीहानिक iNKT कोशिकाओं का विस्तार करने के लिए एक प्रोटोकॉल की स्थापना की।
विस्तारित iNKT कोशिकाओं में विट्रो परख के लिए शोषण किया जा सकता है, और वीवो में चूहों में वापस स्थानांतरित करने पर । उदाहरण के लिए, इस सेटिंग में, हमने उनके शक्तिशाली एंटी-ट्यूमर प्रभाव7दिखाए हैं। इसके अलावा, इन विट्रो विस्तारित iNKT कोशिकाएं वीवो 8 में उनके इंजेक्शन से पहले जीन हस्तांतरण या संपादन के माध्यम से कार्यात्मक संशोधन के लिए उत्तरदायी हैं, जिससे आणविकमार्गोंके व्यावहारिक कार्यात्मक विश्लेषण की अनुमति मिलती है, साथ ही उन्नत सेल उपचारों का मार्ग प्रशस्त होता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
यहां हम लाखों रेडी-टू-यूज iNKT कोशिकाओं को प्राप्त करने के लिए एक प्रजनन योग्य और व्यवहार्य प्रोटोकॉल दिखाते हैं। वीवो में इन कोशिकाओं की कमी के कारण, उनका विस्तार करने के लिए एक विधि की अत्यधिक आवश्यकता ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम पांडुलिपि के वैज्ञानिक समर्थन और महत्वपूर्ण पढ़ने के लिए पाओलो डेलाबोना और गिउलिया कैसोरेटी को धन्यवाद देते हैं। हम माउस सीडी 1डी टेट्रामर के लिए एनआईएच टेट्रामर कोर सुविधा का भी धन्यवाद करते हैं। अध्ययन Fondazione Cariplo अनुदान 2018-0366 (M.F.) और इतालवी एसोसिएशन फॉर कैंसर रिसर्च (AIRC) फैलोशिप 2019-22604 (जीडी) द्वारा वित्त पोषित किया गया था ।
Materials
| Ammonium-Chloride-Potassium (ACK) solution | in house | 0.15M NH4Cl, 10mM KHCO3, 0.1mM EDTA, pH 7.2-7.4 | |
| anti-FITC Microbeads | Miltenyi Biotec | 130-048-701 | |
| anti-PE Microbeads | Miltenyi Biotec | 130-048-801 | |
| Brefeldin A | Sigma | B6542 | |
| CD19 -FITC | Biolegend | 115506 | clone 6D5 |
| CD1d-tetramer -PE | NIH tetramer core facility | mouse PBS57-Cd1d-tetramers | |
| CD4 -PeCy7 | Biolegend | 100528 | clone RM4-5 |
| Fc blocker | BD Bioscience | 553142 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Euroclone | ECS0186L | heat-inactivated and filtered .22 before use |
| FOXP3 Transcription factor staining buffer | eBioscience | 00-5523-00 | |
| H2 (IAb) -FITC | Biolegend | 114406 | clone AF6-120.1 |
| hrIL-2 | Chiron Corp | ||
| Ionomycin | Sigma | I0634 | |
| LD Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-901 | |
| LS Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| MACS buffer (MB) | in house | 0.5% Bovine Serum Albumin (BSA; Sigma-Aldrich) and 2Mm EDTA | |
| MS Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | |
| Non-essential amino acids | Gibco | 11140-035 | |
| Penicillin and streptomycin (Pen-Strep) | Lonza | 15140-122 | |
| PermWash | BD Bioscience | 51-2091KZ | |
| PFA | Sigma | P6148 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | EuroClone | ECB4004L | |
| PMA | Sigma | P1585 | |
| Pre-Separation Filters (30 µm) | Miltenyi Biotec | 130-041-407 | |
| Recombinat Mouse IL-7 | R&D System | 407-ML-025 | |
| RPMI 1640 with glutamax | Gibco | 61870-010 | |
| sodium pyruvate | Gibco | 11360-039 | |
| TCRβ -APC | Biolegend | 109212 | clone H57-597 |
| αCD3CD28 mouse T activator Dynabeads | Gibco | 11452D | |
| β-mercaptoethanol | Gibco | 31350010 |
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