Summary
Değişmez doğal öldürücü T (iNKT) hücrelerini fare dalağını zenginleştirmek ve in vitro ve in vivo çalışmalar için uygun sayılara genişletmek için hızlı ve sağlam bir protokol açıklıyoruz.
Abstract
Değişmez Doğal Öldürücü T (iNKT) hücreleri, polimorfik olmayan MHC sınıfı I ile ilişkili molekül CD1d. Preklinik ve klinik çalışmalar kanser, otoimmünite ve bulaşıcı hastalıklarda iNKT hücreleri için bir rolü desteklemektedir. iNKT hücreleri türler boyunca çok korunmuş ve cd1d eksikliği veya iNKT eksikliği olan fareler de dahil olmak üzere fare modelleri tarafından araştırılmıştır ve yarı sabit TCR'ye özgü CD1d tetramerleri veya mAb'leri olan farelerde ve erkeklerde bunları kesin olarak tespit etme imkanı. Bununla birlikte, iNKT hücreleri nadirdir ve herhangi bir çalışma için yönetilebilir sayılara ulaşmak için genişletilmeleri gerekir. Birincil fare iNKT hücre hattı in vitro'nun üretimi zor olduğu kanıtlandığı için, iNKT hücrelerinin 30 kat daha sık olduğu iVα14-Jα18 transgenik farelerden (iVα14Tg) dalak iNKT hücrelerini arındırmak ve genişletmek için sağlam bir protokol kurduk. Burada birincil dalak iVα14Tg iNKT hücrelerinin immünomanyetik bir ayırma işlemi ile zenginleştirilerek yaklaşık% 95-98 saf iNKT hücresi elde edilebileceğini gösteriyoruz. Saflaştırılmış iNKT hücreleri anti-CD3/CD28 boncuklar artı IL-2 ve IL-7 ile uyarılır ve bu da kültürün %85-99 saflığı ile +14 gün boyunca 30 kat genişlemeye neden olur. Genişletilmiş iNKT hücreleri kolayca genetik olarak manipüle edilebilir, aktivasyon ve fonksiyon in vitro mekanizmalarını parçalamak için paha biçilmez bir araç sağlar ve daha da önemlisi, in vivo olarak benimsenen transfer üzerine.
Introduction
Değişmez Doğal öldürücü T hücreleri (iNKT hücreleri), MHC sınıfı I ile ilgili molekül CD1d2tarafından sunulan lipid antijenleri için özel olan sınırlı bir dizi farklı Vβ zinciri1ile eşleştirilmiş, farelerde yarı sabit bir αβ T hücre reseptörü (TCR) ifade eden doğuştan gelen T lenfositlerdir. iNKT hücreleri, bir CD4+ ve bir CD4- alt kümesi üreten birkaç olgunlaşma aşaması3,4, ile meydana gelen timusta zaten aktif / doğuştan gelen bir efektör fenotipinin alınmasıyla sonuçlanan bir agonist seçim programına tabidir. Bu program sayesinde, iNKT hücreleri sırasıyla T-bet, GATA3, PLZF ve RORφt transkripsiyon faktörlerinin ifadesiyle tanımlanabilen TH1 (iNKT1), TH2 (iNKT2) ve TH17 (iNKT17)olmaküzere farklı T yardımcı (TH)efektör fenotipleri edinir. iNKT hücreleri bir dizi mikrobiyal lipit tanır, ancak aynı zamanda kanser ve otoimmünite gibi hücre stresi ve doku hasarının patolojik durumları bağlamında güncellenmiş endojen lipitlere karşı kendi kendine reaktiftir2. Aktivasyon üzerine, iNKT hücreleri doğrudan temas ve sitokin üretimi ile diğer doğuştan gelen ve adaptif immün efektör hücrelerin işlevlerini modüleederek 2.
iNKT hücrelerinin araştırılması, CD1d eksikliği veya Jα18 eksikliği olan fareler de dahil olmak üzere fare modelleri ve antijen yüklü CD1d tetramerlerin üretimi ve insan yarı sabit TCR'ye özgü monoklonal antikorların (mAbs) üretimi ile kolaylaştırılmıştır. Ancak, birincil fare iNKT hücre hattının üretimi zor olmuştur. iNKT hücrelerinin antitümör işlevlerini daha iyi karakterize etmek ve bunları benimseyen hücre tedavisi için kullanmak için, iNKT hücrelerinin vahşi tip farelerden 30 kat daha sık olduğu iVα14-Jα18 transgenik farelerin (iVα14Tg)6'nındalak iNKT hücrelerini arındırmak ve genişletmek için bir protokol belirledik.
Genişletilmiş iNKT hücreleri in vitro tahliller için kullanılabilir ve farelere geri transfer edildikten sonra in vivo olarak kullanılabilir. Bu ortamda, örneğin, güçlü anti-tümör etkilerini gösterdik7. Ayrıca, in vitro genişletilmiş iNKT hücreleri, enjeksiyonlarından önce gen transferi veya düzenleme yoluyla fonksiyonel modifikasyonaelverişlidir invivo 8 Moleküler yolların içgörülü fonksiyonel analizine izin vermenin yanı sıra gelişmiş hücre tedavilerinin önünü açmak.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Burada açıklanan prosedürler San Raffaele Bilim Enstitüsü'nde Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) (no. 1048) tarafından gözden geçirilmiş ve onaylanmıştır.
NOT: Tüm işlemler steril koşullarda yapılmalıdır. Kullanılan tüm reaktifler Malzeme Tablosundalistelenmiştir.
1. Dalak işleme
- Kurumsal politikaya göre CO2'yi soluma yoluyla iVα14-Jα18 farelerini ötenazi edin.
NOT: iVα14-Jα18 fareler 8 haftalık veya daha büyük olmalıdır. Hücrelerin in vivo transferinden reddedilmesini önlemek için, dişi farelerden izole edilen hücrelerin hem erkek hem de dişi alıcılarda benimsenebileceğini, erkek farelerden izole edilen hücrelerin ise sadece erkek alıcılarda aktarıldığını düşünün. Tüp bebek deneyleri için cinsiyet önyargısı düşünülmemelidir. Daha fazla hücre elde etmek için daha fazla fare birikebilir. - %2 fetal sığır serumu (FBS) ile 10 mL fosfat tamponlu salin (PBS) içinde tek hücreli süspansiyon elde etmek için fare dalağını parçalara ayırın ve 70 nm hücreli bir süzgeçten geçirin.
- 5 dakika boyunca 300 x g'da santrifüj.
- Eritrosit liziz arabelleği ile inversiyon ve işlem yaparak üstnatant çıkarın. Hücre peletini 1 mL steril ACK (Amonyum-Klorür-Potasyum) Lysing Buffer ile yeniden depolayın, oda sıcaklığında 3 dakika kuluçkaya yatırın ve% 2 FBS ile 5 mL PBS ile bloklayın. 5 dakika boyunca 300 x g'da santrifüj.
NOT: ACK ticari olarak mevcuttur; bidistilled H 2 O, pH 7.2-7.4 çözünmüş 0.15 M NH4Cl,10mM KHCO3ve0.1mM Na 2 EDTA (etileniamintetraacetic asit) çözeltiden oluşur. Ev yapımıysa, 0,22 μm filtre ile filtrasyon ile sterilize edin. - Ters çevrilerek üstnatant kaldırın. Hücre peletini %2 FBS ile 3 mL PBS'de yeniden dürt ve pipetleme ile yağ kalıntılarını giderin. Gerekirse, farklı farelerden gelen hücreleri bir kenara ayırın.
- Hücreleri sayın ve FACS analizi için 50 μL tutun.
2. T hücre zenginleştirme
NOT: Zenginleştirme adımları için hızlı çalışın, hücreleri soğuk tutun ve çözeltileri gece boyunca 4 °C'de önceden soğutulup buzda bekletin
- 5 dakika boyunca 300 x g'da santrifüj.
- Tüm hücreleri% 2 FBS (10 7 hücre için 500 μL) ve Fc bloker (2,5μL x 107 hücre) ile uygun miktarda PBS'de yeniden kullanın; oda sıcaklığında (RT) 15 dakika kuluçkaya yatır.
- 107 toplam hücre başına 1-2 mL MACS ayırma tamponu (MB) ve 10 dakika boyunca 300 x g'da santrifüj ile yıkayın.
NOT: MACS arabelleği ticari olarak kullanılabilir. PBS pH 7.2, %0.5 sığır serum albümini (BSA) ve 2 mM EDTA'dan oluşur. Ev yapımıysa, 0,22 μm filtre ile filtrasyon ile sterilize edin. - Üst kısmı ters çevrilerek çıkarın ve hücreleri CD19-FITC ve H2(IAb)-FITC ile lekeleyin (100 μL MB'de 5 μL x10 7 hücre kullanın). İyice karıştırın ve 4-8 °C'de karanlıkta 15 dakika kuluçkaya yatırın.
- 107 hücre başına 1−2 mL MB ve 10 dakika boyunca 300 x g'da santrifüj ekleyerek hücreleri yıkayın.
- Pipet tamamen üsttan kapalı ve toplam hücre başına 90 μL MB hücre pelet resuspend. Toplam 107 hücre başına 10 μL Anti-FITC MikroBead ekleyin. İyice karıştırın ve 4-8 °C'de karanlıkta 15 dakika kuluçkaya yatırın.
- 107 hücre başına 1−2 mL MB ve 10 dakika boyunca 300 x g'da santrifüj ekleyerek hücreleri yıkayın.
- Pipet tamamen süpernatant kapalı ve MB 500 μL içinde 1.25 x10 8 hücre kadar resuspend.
- Tükenmeye devam etmek için MACS ayırıcısının manyetik alanına bir LD sütunu yerleştirin. Tıkanmasını önlemek için LD sütununa bir ön ayırma filtresi uygulayın ve 2 mL MB ile durulayın.
- Sütun haznesi boş olduğunda, hücre süspansiyonunu filtreye uygulayın. Sütundan geçen etiketsiz hücreleri toplayın.
- Sadece sütun rezervuarı boş olduğunda 1 mL MB ile 3 kez yıkayın. T hücrelerinde zenginleştirilecek toplam atıkyu toplayın ve hücreleri sayın. FACS analizi için her zaman 50 μL tutun.
3. iNKT hücre zenginleştirme
- 5 dakika boyunca 300 x g'da santrifüj ve ters çevrilerek süpernatantı çıkarın.
- 106 hücre başına 50 μL MB antikor titrasyona göre hücreleri CD1d-tetramer-PE (fare PBS57-CD1d-tetramer) ile lekeleyin. İyice karıştırın ve buz üzerinde karanlıkta 30 dakika kuluçkaya yatırın.
NOT: Prosedür ayrıca APC etiketli mCD1d tetramerler ve anti-APC boncukları ile de gerçekleştirilebilir; aşağıdaki boyamada kullanılan florokromların buna göre ayarlanması. Mevcut protokolde NIH tarafından sağlanan fare PBS-57-CD1d-tetramers kullandık. αgalactosylceramide (αGal-Cer), iNKT hücreleri tarafından tanınan prototipik antijendir; PBS-57, gelişmiş çözünürlük9ile αGal-Cer'in bir analogudur; NIH Tetramer Tesisi, CD1d tetramerlere karmaşık PBS-57 ligand sağlar. Bununla birlikte, diğer CD1d dimerler / tetramerler / dektramerler ticari olarak mevcuttur ve αGal-Cer olarak lipidik bir antijen ile yüklenebilir. Protokolleri kullanımları için ayarlama imkanı öngörüyoruz. - 107 hücre başına 1−2 mL MB ve 10 dakika boyunca 300 x g'da santrifüj ekleyerek hücreleri yıkayın.
- Pipet tamamen süpernatant kapalı ve hücre pelet 107 toplam hücre başına MB 80 μL yeniden. Toplam 107 hücre başına 20 μL Anti-PE MikroBead ekleyin. İyice karıştırın ve 4-8 °C'de karanlıkta 15 dakika kuluçkaya yatırın.
- 107 hücre başına 1−2 mL MB ve 10 dakika boyunca 300 x g'da santrifüj ekleyerek hücreleri yıkayın.
- Pipet tamamen süpernatant kapalı ve MB 500 μL içinde10 8 hücreye kadar resuspend. Aksi takdirde, hücreler 108'iaşarsa, sesi buna göre ayarlayın.
- Hücre sayısına göre, MACS ayırıcısının manyetik alanına bir LS(10 8'ekadar) veya MS(10 7'yekadar) sütunu yerleştirin. Sütunu MB ile durulayın (LS için 3 mL, MS için 500 μL).
- Hücre süspansiyonunu sütuna uygulayın.
- Geçen etiketsiz hücreleri toplayın. Yalnızca sütun rezervuarı boş olduğunda uygun miktarda MB (LS sütunu için 3 x 3 mL, MS sütunu için 3 x 500 μL) ekleyerek sütunu 3 kez yıkayın. Toplam atıklar negatif kesirdir.
- Sütunu manyetik alandan çıkarın ve yeni bir toplama tüpüne yerleştirin.
- Sütuna Pipet MB (LS sütunu için 5 mL veya MS sütunu için 1 mL); sağlanan pistonu sütuna itin ve pozitif fraksiyonu (iNKT hücrelerinde zenginleştirilmiş) boşaltın.
- iNKT hücre kurtarmayı daha da artırmak için, negatif kesiri 10 dakika boyunca 300 x g'da santrifüjleyin ve 3,6-3,7 adımlarını yeni bir LS veya MS sütunuyla yineleyin. Pozitif kesirleri bir kenara alıp hücre sayısını belirleyin. FACS analizi için hem pozitif hem de negatif fraksiyonlardan 50 μL tutun.
- PSS analizine göre Saflaştırma adımlarını kontrol edin. Örnekler şunlardır: dalak ex-vivo, T hücre zenginleştirilmiş fraksiyon, iNKT pozitif fraksiyon ve iNKT negatif fraksiyon. Hücreleri şu şekilde lekeleyin: CD19-FITC, IAb-FITC, CD1d-tetramer-PE, TCRβ-APC ve DAPI.
NOT: Bir iVα14-Jα18 fareden beklenen kurtarma 2x106 iNKT hücreleridir.
4. iNKT hücre aktivasyonu ve genişlemesi
- Saflaştırılmış iNKT hücrelerini fare T aktivatör anti-CD3/CD28 manyetik boncuklarla 1:1 oranında etkinleştirin.
- 5 dakika boyunca iNKT hücre pozitif fraksiyonunu 300 x g'da santrifüj edin.
- Bu arada, uygun miktarda anti-CD3/CD28 manyetik boncukları bir tüpe aktarın ve 5 saniye boyunca eşit miktarda PBS, girdap ekleyin. Tüpü 1 dakika boyunca bir mıknatısa yerleştirin ve üstnatant atın.
- Tüpü mıknatıstan çıkarın ve yıkanmış manyetik boncukları tam RPMI (RPMI 1640 ortamı) uygun hacimde yeniden kullanın, %10 ısı inaktive FCS, 1 mM sodyum piruvat, %1 esansiyel olmayan amino asitler, 10 U/ml penisillin ve streptomisin, 50 μM β-Mercaptoethanol) 1 mL'de 5 x10 5 iNKT hücreye sahip olmak. Santrifüjlenmiş iNKT pozitif fraksiyonunu yeniden kullanmak için bu süspansiyonu kullanın.
- Hücre süspansiyonunun plaka 1 mL'si (5 x10 5 iNKT hücresi) ve 20 U/mL IL-2 ile 48 kuyu plakasında anti-CD3/CD28 manyetik boncuklar ve 37 °C'de kuluçkaya yatırın.
- 5 gün sonra, 10 ng/mL IL-7 ekleyin.
- Hücreleri % 80-90 birleştiğinde 1:2 bölün, her zaman 20U / mL IL-2 ve 10 ng / mL IL-7 ekleyin. Bu koşullarda, iNKT hücreleri 15 güne kadar genişletilebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bu yazıda açıklanan protokol, iVa14-Ja18 transgenik farelerin dalağının iNKT hücrelerini Şekil 1A'daözetlenen bir immünmanyetik ayırma işlemi ile zenginleştirmeyi sağlar. Toplam dalak T hücreleri önce B hücreleri ve monositler tükenerek negatif olarak seçilir, ardından PBS-57 lipid antijen yüklü CD1d tetramerler ile iNKT hücre pozitif immünomanyetik sıralama, özellikle sadece iNKT hücrelerini lekelemeyi sağlar. Bu protokol, tek bir iVa14-Ja18 Tg farenin dalağının dalağının yaklaşık 2 x 106'sını% 95-98 saf iNKT hücresi verir. Negatif kesirde hiçbir veya gerçekten az sayıda iNKT hücresi tespit edilebilir (Şekil 1B).
Zenginleştirmeden sonra, iVa14 iNKT hücreleri anti-CD3 / CD28 boncuklar artı IL-2 ve IL-7 (Şekil 2A) ile genişletilebilir, bu da Şekil 2B'degösterildiği gibi kültürün +14 gün boyunca ortalama 30 kat genişleme ile sonuçlanır.
Şekil 3A, genişleme in vitro ve CD4 molekülünün ekspresyonu ile birlikte iNKT hücre saflığını göstermektedir. TCRβ+ CD1d-tetramer+ çift pozitif hücrelerin yüzdesinde bir azalma gözlemledik: anti-CD3 / CD28 boncuklarla güçlü aktivasyon, hücre yüzeyindeki iNKT hücre TCR ekspresyonunun küçültülmesine neden oluyor ve çift negatif popülasyon ortaya çıkıyor. Genişletilmiş iNKT hücrelerinin çoğunluğu CD4- . Şekil 3B, genişlemeden 0 ve 14 gün sonra zenginleştirilmiş iNKT hücrelerinde soyuna özgü transkripsiyon faktörleri PLZF ve RORφt'un ekspresyonunun bir karakterizasyonunu göstermektedir. Bu boyama, NKT1 (PLZFdüşük RORφt-), NKT2 (PLZFyüksek RORφt-) ve NKT17 (PLZFint RORφt+) fenotiplerini tanımlamayı sağlar. Çoğunlukla NKT1 ve NKT2 olan zenginleştirilmiş iNKT hücreleri TH0 benzeri efektör fenotipi gösterir. Bu fenotip, Şekil 3C'degösterilen PMA / İyonomisinin stimülasyonundan sonra hem IFN-γ hem de IL-4 salgılanması ile doğrulanan 14 günlük genişlemeden sonra korunur.
Şekil 1: iNKT hücre zenginleştirme. A) İmmünomanyetik ayırma protokolünün şematik gösterimi. B)Her zenginleştirme adımının akış sitometri analizi. T hücre frekanslarının yüzdesi, canlı lenfositler üzerinde kapılı üst arsalarda gösterilir. Her adım boyunca iNKT hücre frekanslarının yüzdesi, uygulanabilir CD19- TCRβ+ lenfositler üzerinde kapılı alt arsalarda gösterilirken. UygulanabilirCD19 -TCRβ+ lenfositlerde boşaltılmış CD1d tetramer ile lekeleme, iNKT hücre kapısını doğru bir şekilde çizmeyi sağlar. Temsili bir deney gösterilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: iNKT hücre in vitro genişlemesi. A) iNKT hücre genişlemesi boyunca iNKT hücre sayısı. Üç temsili ve bağımsız deney gösterilmiştir. B)Saflaştırma ve aktivasyondan sonra 7 ve 14. SD'± gösterildiği anlamına gelir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Genişletilmiş iNKT hücre karakterizasyonu. A) Genişleme süresi boyunca iNKT hücre yüzdesi ve CD4 ekspresyonunun akış sitometri analizi. Üst arsalar canlı lenfositler üzerinde kapılıdır. Alt arsalar iNKT hücrelerine (uygulanabilir CD1d-tetramer+ TCRβ+ lenfositler) kapılıdır. B) Zenginleştirilmiş (gün 0) ve genişletilmiş (gün 14) iNKT hücrelerinin fenotipik karakterizasyonu. Arsalar iNKT hücrelerine (uygulanabilir CD1d-tetramer+ TCRβ+ lenfositler) kapılıdır. Hücreler Foxp3 Transkripsiyon Faktörü Boyama Tampon Seti ile transkripsiyon faktörleri için intranükleer olarak lekelendi. NKT1 (PLZFdüşük RORφt-), NKT2 (PLZFyüksek RORφt-) ve NKT17 (PLZFint RORφt+) alt kümeleri tanımlanmıştır, her alt kümenin frekansları yüzde olarak gösterilmiştir. C) 14. günde genişletilmiş iNKT hücreleri tarafından sitokin üretimi. Arsalar iNKT hücrelerine (uygulanabilir CD1d-tetramer+ TCRβ+ lenfositler) kapılıdır. Hücreler, Brefeldin A 10 μg/mL'nin son 2 saati boyunca PMA 25 ng/mL/Ionomicin 1 μg/mL ile 4 saat boyunca uyarıldı. Hücreler daha sonra PFA% 2 ile sabitlendi, Permwash ile permeabilize edildi ve daha sonra sitokin üretimi için hücre içi lekelendi. Gating stratejisi etkinleştirilmemiş kontrol, sol panelde ayarlandı. Temsili bir deney gösterilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada milyonlarca kullanıma hazır iNKT hücresi elde etmek için tekrarlanabilir ve uygulanabilir bir protokol gösteriyoruz. Bu hücrelerin vivo'nun azlığı nedeniyle, onları genişletmek için bir yönteme çok ihtiyaç vardı. Önerdiğimiz protokol ne belirli bir enstrümantasyon ne de yüksek sayıda fare gerektiriyor. İşlem için gerekli fare sayısını azaltmak için iVα14-Jα18 transgenik farelerden bilerek yararlandık.
iVα14-Jα18 transgenik farelerden iNKT hücre genişletme için başka bir başarılı protokol literatürde mevcuttur10. Bu protokol, iNKT hücre saflaştırmadan 6 gün önce, taze kemik iliği türevi dendritik hücrelerin üretilmesini, daha sonra α-galaktosiylceramid ile yüklenmesini ve ışınlanmayı, ayrıca IL-2 ve IL-7'yi içerir. Prosedürde yer alan farelerin sayısının azaltılmasını protokolün büyük bir avantajı olarak görüyoruz. Hücre kültürünün kurulması bir hafta yerine tek bir gün sürdüğünden, zaman ayırıcıdır. Mevcut protokolün tekrarlanabilirliğinin olası bir sınırlaması, ticari olarak mevcut olan iVα14-Jα18 transgenik farelerin mevcudiyeti olabilir. Bu farelerin yokluğunda, çok sayıda WT faresi kullanma olasılığını öngörüyoruz, ancak WT farelerindeki iNKT hücrelerinin azlığı nedeniyle protokolün buna göre ayarlanması gerekiyor.
Hücre kültürü sırasında, genellikle genişletilmiş iNKT hücrelerinin saflığını ve fenotipini kontrol ediyoruz. TCRβ+ CD1d-tetramer+ çift pozitif hücrelerin yüzdeslerindeki azalma (Şekil 3A) aktivasyondan sonra hücre yüzeyinden değişmez NKT hücre TCR'nin doğal bir şekilde küçültülmesi ile açıklanabilir. Ayrıca, genişletilmiş iNKT hücrelerinin çoğunluğu CD4'ü ifade etmedi (Şekil 3A): CD4- iNKT hücrelerinin tümör ilerlemesini kontrol etmede en etkili olduğu tespit edildiğinden, bu, benimseyen bir hücre tedavisi bağlamında bir avantaj teşkil edebilir11. Ayrıca, gözlenen TH0 benzeri efektör fenotipi (Şekil 3C) in vitro genişleme ve restimülasyon 8 , 12 , 13,14,15sonra insan iNKT hücrelerinde gözlenen ile tamamen tutarlıdır. Genişletilmiş hücreler in vivo ve in vitro olarak oldukça reaktiftir, bu nedenle iNKT hücre bazlı evlat edinen immünoterapiler bağlamında yararlıdır. Yönetilmeyen veya genişletilmiş iNKT hücrelerinin benimsenen transferi, akut Graft-Versus-Host Hastalığını (aGVHD) önler veya iyileştiricidir ve Graft-Versus-Lösemi etkisini değiştirmeden bırakır16,17,18,19. Benimsenen aktarılan insan iNKT hücreleri αGal-Cer ile in vitro genişletilmiş ksenogeneik aGVHD ve bu etki CD4 tarafından aracılık edilir- ancak CD4+ hücreler20. Ayrıca, iNKT hücrelerinin aGVHD'ye neden olmadığı göz önüne alındığında, TCR'lerinin silinmesine gerek kalmadan CAR immünoterapi için ideal hücreleri oluştururlar ve vivo8,15'teuzun süreli antitümör aktiviteye sahip olduklarını kanıtladılar. iNKT hücreleri şu anda devam eden ve sonuçlanan klinik çalışmalarda21 , 22,23,24'te yararlanmaktadır.
Sonuç olarak, açıklanan protokol hızlı, basittir ve fare dalağının kurtardığı iNKT hücrelerinin sayısında30kat artışa izin verir ( Şekil 3B ). Bu hücreler in vitro tanıma tahlilleri, ortak kültür sistemleri veya preklinik çalışmalarda benimseyen hücre tedavisi için kolayca kullanılabilir. iNKT hücreleri gerçekten de tümör immün gözetim, bulaşıcı hastalıklar ve otoimmünitede kritik bir rol oynar. Bu bağlamda, iNKT hücreleri, MHC kısıtlamasından yoksun geleneksel T hücrelerine çekici bir alternatif olan güçlü bir aracı temsil edebilir. Bu hücrelerin büyük miktarlarda hızlı bir şekilde üretilmesi ve onları in vitro olarak daha fazla manipüle etme olasılığı, benzeri görülmemiş terapötik stratejilerin gelişmesine yol açabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
Paolo Dellabona ve Giulia Casorati'ye makalenin bilimsel desteği ve eleştirel okuması için teşekkür ederiz. Nih Tetramer Çekirdek Tesisi'ne fare CD1d tetramer için de teşekkür ederiz. Çalışma Fondazione Cariplo Grant 2018-0366 (M.F.'ye) ve İtalyan Kanser Araştırmaları Derneği (AIRC) bursu 2019-22604 (G.D.'ye) tarafından finanse edildi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ammonium-Chloride-Potassium (ACK) solution | in house | 0.15M NH4Cl, 10mM KHCO3, 0.1mM EDTA, pH 7.2-7.4 | |
| anti-FITC Microbeads | Miltenyi Biotec | 130-048-701 | |
| anti-PE Microbeads | Miltenyi Biotec | 130-048-801 | |
| Brefeldin A | Sigma | B6542 | |
| CD19 -FITC | Biolegend | 115506 | clone 6D5 |
| CD1d-tetramer -PE | NIH tetramer core facility | mouse PBS57-Cd1d-tetramers | |
| CD4 -PeCy7 | Biolegend | 100528 | clone RM4-5 |
| Fc blocker | BD Bioscience | 553142 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Euroclone | ECS0186L | heat-inactivated and filtered .22 before use |
| FOXP3 Transcription factor staining buffer | eBioscience | 00-5523-00 | |
| H2 (IAb) -FITC | Biolegend | 114406 | clone AF6-120.1 |
| hrIL-2 | Chiron Corp | ||
| Ionomycin | Sigma | I0634 | |
| LD Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-901 | |
| LS Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| MACS buffer (MB) | in house | 0.5% Bovine Serum Albumin (BSA; Sigma-Aldrich) and 2Mm EDTA | |
| MS Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | |
| Non-essential amino acids | Gibco | 11140-035 | |
| Penicillin and streptomycin (Pen-Strep) | Lonza | 15140-122 | |
| PermWash | BD Bioscience | 51-2091KZ | |
| PFA | Sigma | P6148 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | EuroClone | ECB4004L | |
| PMA | Sigma | P1585 | |
| Pre-Separation Filters (30 µm) | Miltenyi Biotec | 130-041-407 | |
| Recombinat Mouse IL-7 | R&D System | 407-ML-025 | |
| RPMI 1640 with glutamax | Gibco | 61870-010 | |
| sodium pyruvate | Gibco | 11360-039 | |
| TCRβ -APC | Biolegend | 109212 | clone H57-597 |
| αCD3CD28 mouse T activator Dynabeads | Gibco | 11452D | |
| β-mercaptoethanol | Gibco | 31350010 |
References
- Bendelac, A., Savage, P. B., Teyton, L.
- Brennan, P. J., Brigl, M., Brenner, M. B. Invariant natural killer T cells: an innate activation scheme linked to diverse effector functions. Nature Reviews: Immunology. 13 (2), 101-117 (2013).
- Pellicci, D. G., et al. A natural killer T (NKT) cell developmental pathway iInvolving a thymus-dependent NK1.1(-)CD4(+) CD1d-dependent precursor stage. Journal of Experimental Medicine. 195 (7), 835-844 (2002).
- Benlagha, K., Kyin, T., Beavis, A., Teyton, L., Bendelac, A. A thymic precursor to the NK T cell lineage. Science. 296 (5567), 553-555 (2002).
- Lee, Y. J., Holzapfel, K. L., Zhu, J., Jameson, S. C., Hogquist, K. A. Steady-state production of IL-4 modulates immunity in mouse strains and is determined by lineage diversity of iNKT cells. Nature Immunology. 14 (11), 1146-1154 (2013).
- Griewank, K., et al. Homotypic interactions mediated by Slamf1 and Slamf6 receptors control NKT cell lineage development. Immunity. 27 (5), 751-762 (2007).
- Cortesi, F., et al. Bimodal CD40/Fas-Dependent Crosstalk between iNKT Cells and Tumor-Associated Macrophages Impairs Prostate Cancer Progression. Cell Reports. 22 (11), 3006-3020 (2018).
- Heczey, A., et al. Invariant NKT cells with chimeric antigen receptor provide a novel platform for safe and effective cancer immunotherapy. Blood. 124 (18), 2824-2833 (2014).
- Liu, Y., et al. A modified alpha-galactosyl ceramide for staining and stimulating natural killer T cells. Journal of Immunological Methods. 312 (1-2), 34-39 (2006).
- Chiba, A., et al. Rapid and reliable generation of invariant natural killer T-cell lines in vitro. Immunology. 128 (3), 324-333 (2009).
- Crowe, N. Y., et al. Differential antitumor immunity mediated by NKT cell subsets in vivo. Journal of Experimental Medicine. 202 (9), 1279-1288 (2005).
- de Lalla, C., et al. Production of profibrotic cytokines by invariant NKT cells characterizes cirrhosis progression in chronic viral hepatitis. Journal of Immunology. 173 (2), 1417-1425 (2004).
- Tian, G., et al. CD62L+ NKT cells have prolonged persistence and antitumor activity in vivo. Journal of Clinical Investigation. 126 (6), 2341-2355 (2016).
- Gaya, M., et al. Initiation of Antiviral B Cell Immunity Relies on Innate Signals from Spatially Positioned NKT Cells. Cell. 172 (3), 517-533 (2018).
- Rotolo, A., et al. Enhanced Anti-lymphoma Activity of CAR19-iNKT Cells Underpinned by Dual CD19 and CD1d Targeting. Cancer Cell. 34 (4), 596-610 (2018).
- Schneidawind, D., et al. Third-party CD4+ invariant natural killer T cells protect from murine GVHD lethality. Blood. 125 (22), 3491-3500 (2015).
- Schneidawind, D., et al. CD4+ invariant natural killer T cells protect from murine GVHD lethality through expansion of donor CD4+CD25+FoxP3+ regulatory T cells. Blood. 124 (22), 3320-3328 (2014).
- Schneidawind, D., Pierini, A., Negrin, R. S. Regulatory T cells and natural killer T cells for modulation of GVHD following allogeneic hematopoietic cell transplantation. Blood. 122 (18), 3116-3121 (2013).
- Leveson-Gower, D. B., et al. Low doses of natural killer T cells provide protection from acute graft-versus-host disease via an IL-4-dependent mechanism. Blood. 117 (11), 3220-3229 (2011).
- Coman, T., et al. Human CD4- invariant NKT lymphocytes regulate graft versus host disease. Oncoimmunology. 7 (11), 1470735 (2018).
- Xu, X., et al. NKT Cells Coexpressing a GD2-Specific Chimeric Antigen Receptor and IL15 Show Enhanced In vivo Persistence and Antitumor Activity against Neuroblastoma. Clinical Cancer Research. 25 (23), 7126-7138 (2019).
- Heczey, A., et al. Anti-GD2 CAR-NKT cells in patients with relapsed or refractory neuroblastoma: an interim analysis. Nature Medicine. 26 (11), 1686-1690 (2020).
- Exley, M. A., et al. Adoptive Transfer of Invariant NKT Cells as Immunotherapy for Advanced Melanoma: A Phase I Clinical Trial. Clinical Cancer Research. 23 (14), 3510-3519 (2017).
- Wolf, B. J., Choi, J. E., Exley, M. A. Novel Approaches to Exploiting Invariant NKT Cells in Cancer Immunotherapy. Frontiers in Immunology. 9, 384 (2018).
