Summary
Vi beskriver en hurtig og robust protokol til at berige invariant naturlige dræber T (iNKT) celler fra musen milt og udvide dem in vitro til egnede tal for in vitro og in vivo undersøgelser.
Abstract
Invariante Natural Killer T (iNKT) celler er medfødte-lignende T lymfocytter udtrykker en bevaret semi-invariant T-celle receptor (TCR) specifikke for selv eller mikrobielle lipid antigener præsenteret af ikke-polymorfe MHC klasse I-relaterede molekyle CD1d. Prækliniske og kliniske undersøgelser understøtter en rolle for iNKT celler i kræft, autoimmunitet og smitsomme sygdomme. iNKT-celler er meget konserverede i hele arterne, og deres undersøgelse er blevet lettet af musemodeller, herunder CD1d-mangelfulde eller iNKT-mangelfulde mus, og muligheden for utvetydigt at opdage dem hos mus og mænd med CD1d tetramers eller mAbs, der er specifikke for den semi-invariante TCR. Men, iNKT celler er sjældne, og de skal udvides for at nå håndterbare tal for enhver undersøgelse. Fordi dannelsen af primær mus iNKT cellelinje in vitro har vist sig vanskeligt, har vi oprettet en robust protokol til at rense og udvide milt iNKT celler fra iVα14-Jα18 transgene mus (iVα14Tg), hvor iNKT celler er 30 gange hyppigere. Vi viser her, at primære milt iVα14Tg iNKT-celler kan beriges gennem en immunmagnetisk adskillelsesproces, hvilket giver omkring 95-98% rene iNKT-celler. De rensede iNKT-celler stimuleres af anti-CD3/CD28 perler plus IL-2 og IL-7, hvilket resulterer i 30 gange ekspansion af dag +14 af kulturen med 85-99% renhed. De udvidede iNKT-celler kan let genetisk manipuleres, hvilket giver et uvurderligt værktøj til at dissekere aktiverings- og funktionsmekanismer og endnu vigtigere også ved adoptivoverførsel in vivo.
Introduction
Invariant Naturlige dræber T-celler (iNKT-celler) er medfødte T-lymfocytter, der udtrykker en semi-invariant αβ T-celle receptor (TCR), dannet i mus af en invariant Vα14-Jα18 kæde parret med et begrænset sæt af forskellige Vβ kæder1, som er specifik for lipid antigener præsenteret af MHC klasse I-relaterede molekyle CD1d2. iNKT-celler gennemgår et agonistisk udvælgelsesprogram, hvilket resulterer i erhvervelse af en aktiveret /medfødt effektor fænotype, der allerede er i thymusen, hvilket sker gennem flere modningsstadier3,4, der producerer en CD4+ og en CD4- delmængde. Gennem dette program, iNKT celler erhverve forskellige T hjælper (TH)effektor fænotyper, nemlig TH1 (iNKT1), TH2 (iNKT2) og TH17 (iNKT17), identificerbare ved udtryk for transskription faktorer T-bet, GATA3, PLZF, og RORγt, henholdsvis5. iNKT-celler genkender en række mikrobielle lipider, men er også selvreaktive mod endogene lipider, der er opreguleret i forbindelse med patologiske situationer med cellestress og vævsskader, såsom kræft og autoimmunitet2. Ved aktivering modulerer iNKT-celler funktionerne i andre medfødte og adaptive immuneffektorceller via direkte kontakt og cytokinproduktion2.
Undersøgelserne af iNKT-celler er blevet lettet af musemodeller, herunder CD1d-mangelfulde eller Jα18-mangelfulde mus, og af produktionen af antigenindlæste CD1d tetramers plus dannelsen af monoklonale antistoffer (mAbs), der er specifikke for den menneskelige semi-invariant TCR. Men dannelsen af primær mus iNKT celle linje har vist sig vanskeligt. For bedre at karakterisere antitumorfunktionerne i iNKT-celler og bruge dem til adoptivcelleterapi opretter vi en protokol til at rense og udvide milt iNKT-celler af iVα14-Jα18 transgene mus (iVα14Tg)6, hvor iNKT-celler er 30 gange hyppigere end i vilde mus.
Udvidede iNKT-celler kan udnyttes til in vitro-analyser og in vivo ved overførsel tilbage til mus. I denne indstilling har vi for eksempel vist deres potente anti-tumor effekter7. Desuden er in vitro udvidede iNKT-celler modtagelige for funktionel modifikation via genoverførsel eller redigering forud for deres injektion in vivo8, hvilket giver indsigtsfuld funktionel analyse af molekylære veje samt baner vejen for avancerede celleterapier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
De procedurer, der er beskrevet her, blev gennemgået og godkendt af Den Institutionelle Komité for Dyrepleje og Anvendelse (IACUC) (nr. 1048) på San Raffaele Scientific Institute.
BEMÆRK: Alle procedurer skal udføres under sterile forhold. Alle anvendte reagenser er angivet i materialetabellen.
1. Miltbehandling
- Aflive iVα14-Jα18 mus ved indånding af CO2 i henhold til den institutionelle politik.
BEMÆRK: iVα14-Jα18-mus skal være 8 uger gamle eller ældre. For at undgå afvisning af cellerne fra in vivo-overførslen af cellerne skal du overveje, at celler isoleret fra hunmus kan overføres adoptivt både hos mandlige og kvindelige modtagere, mens celler isoleret fra hanmus kun kan overføres hos mandlige modtagere. For in vitro eksperimenter, må ingen køn bias overvejes. Flere mus kan samles for at få flere celler. - Dissekere musen milt og smadre det gennem en 70 nm celle si for at opnå en enkeltcellet suspension i 10 mL af fosfat buffered saltvand (PBS) med 2% føtalt kvæg serum (FBS).
- Centrifuge ved 300 x g i 5 min.
- Fjern supernatanten ved inversion og proces med erythrocyte lysis buffer. Resuspend cellepillen med 1 mL steril ACK (Ammonium-Chlorid-Kalium) Lysing Buffer, inkubation i 3 min ved stuetemperatur, og blok med 5 mL PBS med 2% FBS. Centrifuge ved 300 x g i 5 min.
BEMÆRK: ACK er kommercielt tilgængelig; den består af en opløsning på 0,15 M NH4Cl, 10 mM KHCO3og 0,1 mM Na2EDTA (ethylendiamintetraacetic syre) opløst i bidistilled H2O, pH 7,2-7,4. Hvis hjemmelavet, steriliseres ved filtrering med et 0,22 μm filter. - Fjern supernatanten ved inversion. Brug cellepillen i 3 mL PBS med 2% FBS og fjern fedtrester ved pipettering. Hvis det er nødvendigt, pool cellerne, der kommer fra forskellige mus.
- Tæl cellerne og hold 50 μL til FACS-analyse.
2. T-celleberigelse
BEMÆRK: For berigelse trin, arbejde hurtigt, holde cellerne kolde og bruge opløsninger forkølet ved 4 ° C natten over og derefter holdes på is
- Centrifuge ved 300 x g i 5 min.
- Brug alle cellerne i den relevante mængde PBS igen med 2% FBS (500 μL for 107 celler) og Fc blocker (2,5 μL x 107 celler); inkubere i 15 min ved stuetemperatur (RT).
- Vask med 1-2 mL MACS separationsbuffer (MB) pr. 107 samlede celler og centrifuge ved 300 x g i 10 min.
BEMÆRK: MACS-buffer er kommercielt tilgængelig. Den består af PBS pH 7,2, 0,5% kvæg serum albumin (BSA) og 2 mM EDTA. Hvis hjemmelavet, steriliseres ved filtrering med et 0,22 μm filter. - Supernatanten fjernes ved inversion, og plet cellerne med CD19-FITC og H2(IAb)-FITC (brug 5 μL x 107 celler i 100 μL MB). Bland godt og inkuber i 15 min i mørke ved 4-8 °C.
- Vask cellerne ved at tilsætte 1−2 mL MB pr. 107 celler og centrifuge ved 300 x g i 10 min.
- Pipette helt supernatanten og genbruge cellepillen i 90 μL MB pr. 107 samlede celler. Der tilsættes 10 μL anti-FITC mikroperler pr. 107 samlede celler. Bland godt og inkuber i 15 min i mørke ved 4-8 °C.
- Vask cellerne ved at tilsætte 1−2 mL MB pr. 107 celler og centrifuge ved 300 x g i 10 min.
- Pipette fra supernatanten helt og genbruges op til 1,25 x 108 celle i 500 μL MB.
- Placer en LD-kolonne i MACS-separatorens magnetfelt for at fortsætte til udtømningen. For at undgå tilstopning skal du anvende et filter til separation på LD-kolonnen og skylles med 2 MB.
- Når kolonnebeholderen er tom, skal celleaffjedringen påføres filteret. Saml de umærkede celler, der passerer gennem kolonnen.
- Vask 3 gange med 1 MB, kun når søjlebeholderen er tom. Saml det samlede spildevand, som vil blive beriget i T-celler, og tælle cellerne. Hold altid 50 μL til FACS-analyse.
3. iNKT celleberigelse
- Centrifuge ved 300 x g i 5 min og fjern supernatanten ved inversion.
- Plette cellerne med CD1d-tetramer-PE (mus PBS57-CD1d-tetramer), i henhold til antistof titrering i 50 μL MB pr 106 celler. Bland godt og inkuber i 30 minutter i mørket på is.
BEMÆRK: Proceduren kan også udføres med APC-mærkede mCD1d tetramers og anti-APC perler; justering af de fluorokrom, der anvendes i følgende farvning i overensstemmelse hermed. I den nuværende protokol brugte vi mus PBS-57-CD1d-tetramers leveret af NIH. αgalactosylceramid (αGal-Cer) er det prototypiske antigen, der genkendes af iNKT-celler; PBS-57 er en analog af αGal-Cer med forbedret opløselighed9; NIH Tetramer-anlægget leverer PBS-57 ligand, der er komplekst til CD1d tetramers. Andre CD1d dimers/tetramers/dextramers er dog kommercielt tilgængelige og kan lastes med et lipidisk antigen som αGal-Cer. Vi forestiller os muligheden for at justere protokollen til deres anvendelse. - Vask cellerne ved at tilsætte 1−2 mL MB pr. 107 celler og centrifuge ved 300 x g i 10 min.
- Pipette helt af supernatanten og genbruge cellepillen i 80 μL MB pr. 107 samlede celler. Der tilsættes 20 μL anti-PE mikroperler pr. 107 samlede celler. Bland godt og inkuber i 15 min i mørke ved 4-8 °C.
- Vask cellerne ved at tilsætte 1−2 mL MB pr. 107 celler og centrifuge ved 300 x g i 10 min.
- Pipette helt af supernatanten og genbruges op til 108 celler i 500 μL MB. Ellers hvis cellerne overstiger 108, skal du justere lydstyrken i overensstemmelse hermed.
- I henhold til celletællingen skal du placere en LS-kolonne (op til 108) eller MS (op til 107) i magnetfeltet på MACS-separatoren. Skyl kolonnen med MB (3 mL for LS, 500 μL for MS).
- Anvend celleaffjedringen på kolonnen.
- Saml umærkede celler, der passerer igennem. Vask kolonnen 3 gange ved kun at tilføje den passende mængde MB (3 x 3 mL for LS-kolonne, 3 x 500 μL for MS-kolonne), når kolonnebeholderen er tom. Det samlede spildevand er den negative brøk.
- Fjern kolonnen fra magnetfeltet, og placer den på et nyt opsamlingsrør.
- Pipette MB på kolonnen (5 mL for LS kolonne eller 1 mL for MS kolonne); skubbe det medfølgende stempel ind i kolonnen og skylle den positive fraktion ud (beriget med iNKT-celler).
- For yderligere at øge iNKT-cellegendannelsen centrifugeres den negative fraktion ved 300 x g i 10 min og gentag trin 3,6-3,7 med en ny LS- eller MS-kolonne. Pulje de positive brøker og bestemme celletælling. Hold 50 μL af både positive og negative fraktioner til FACS-analyse.
- Kontroller rensningstrinnene ved FACS-analyse. Prøverne omfatter: milt ex-vivo, T celle beriget brøk, iNKT positiv brøk og iNKT negativ brøk. Plet cellerne med: CD19-FITC, IAb-FITC, CD1d-tetramer-PE, TCRβ-APC og DAPI.
BEMÆRK: Den forventede opsving fra en iVα14-Jα18 mus er 2x106 iNKT celler .
4. aktivering og udvidelse af iNKT-celler
- Aktiver rensede iNKT-celler med mus T-aktivator anti-CD3/CD28 magnetiske perler i et 1:1-forhold.
- Centrifugere iNKT celle positiv brøk ved 300 x g i 5 min.
- I mellemtiden overføre den passende mængde af anti-CD3/CD28 magnetiske perler til et rør og tilføje en lige stor mængde PBS, vortex i 5 sekunder. Placer røret på en magnet i 1 minut og kassér supernatanten.
- Fjern røret fra magneten og genbrug de vaskede magnetiske perler i den korrekte mængde af komplet RPMI (RPMI 1640 medium, 10% varmeinaktiveret FCS, 1 mM natrium pyruvat, 1% Ikke-essentielle aminosyrer, 10 U /ml penicyllin og streptomycin, 50 μM β-Mercaptoethanol) at have 5 x 105 iNKT celler i 1 ml. Brug denne suspension til at genbruge den centrifugerede iNKT-positive brøk.
- Plade 1 mL af celleaffjedringen (5 x 105 iNKT-celler) og anti-CD3/CD28 magnetiske perler i en 48 brøndplade med 20 U/mL IL-2 og inkuberes ved 37 °C.
- Efter 5 dage skal du tilføje 10 ng/mL IL-7.
- Split cellerne 1:2, når de når 80-90% sammenløb, altid tilføje 20U/mL IL-2 og 10 ng/mL IL-7. Under disse forhold kan iNKT-celler udvides i op til 15 dage.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den protokol, der er beskrevet i dette manuskript, gør det muligt at berige iNKT-celler fra milten af transgene mus iVa14-Ja18 gennem en immunomagnetisk separationsproces opsummeret i figur 1A. Samlede milt T-celler vælges først negativt ved udtømning af B-celler og monocytter, efterfulgt af iNKT-cellepositiv immunmagnetisk sortering med PBS-57 lipidantigenindlæste CD1d tetramers, der gør det muligt specifikt kun at plette iNKT-celler. Denne protokol giver omkring 2 x 106 af 95-98% rene iNKT-celler fra milten af en enkelt iVa14-Ja18 Tg mus. Ingen eller virkelig få iNKT-celler kan detekteres i den negative brøk (Figur 1B).
Efter berigelse kan iVa14 iNKT-celler udvides med anti-CD3/CD28-perler plus IL-2 og IL-7 (Figur 2A), hvilket resulterer i 30 gange udvidelse i gennemsnit efter dag +14 i kulturen som vist i figur 2B.
Figur 3A viser iNKT-cellerenhed sammen med ekspansion in vitro og udtrykket af CD4-molekylet. Vi observerede en formindskelse i procentdelen af TCRβ+ CD1d-tetramer+ dobbelt positive celler: den stærke aktivering med anti-CD3/CD28 perler fremkalder nedreguleringen af iNKT-celle TCR-udtrykket på celleoverfladen, og en dobbelt negativ population vises. De fleste udvidede iNKT-celler var CD4-. Figur 3B viser en karakteristik af udtrykket af slægtsspecifikke transskriptionsfaktorer PLZF og RORγt på berigede iNKT-celler på dag 0 og 14 dage efter udvidelsen. Denne farvning gør det muligt at identificere NKT1 (PLZFlav RORγt-), NKT2 (PLZFhøj RORγt-) og NKT17 (PLZFint RORγt+) fænotyper. At være for det meste NKT1 og NKT2, de berigede iNKT celler viser en TH0-lignende effektor fænotype. Denne fænotype bevares efter 14 dages ekspansion som bekræftet af udskillelsen af både IFN-γ og IL-4 efter PMA/Ionomycin stimulation vist i figur 3C.
Figur 1: iNKT celleberigelse. A) Skematisk repræsentation af protokollen for immunmagnetisk adskillelse. B) Flowcytometrianalyse af hvert berigningstrin. Procentdel af T-cellefrekvenser er vist i de øverste plots, gated på levedygtige lymfocytter. Mens procentdelen af iNKT cellefrekvenser langs hvert trin er vist i de nederste parceller, gated på levedygtige CD19- TCRβ+ lymfocytter. Farvning på levedygtige CD19- TCRβ+ lymfocytter med losset CD1d tetramer gør det muligt at tegne iNKT celleporten korrekt. Der vises et repræsentativt eksperiment. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: iNKT celle in vitro ekspansion. A) iNKT celle tæller langs iNKT celle ekspansion. Der vises tre repræsentative og uafhængige eksperimenter. B) Fold stigning i iNKT celle nummer på dag 7 og 14 efter rensning og aktivering. Midler ± SD er vist. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Udvidet iNKT-cellekarakterisering. A) Flowcytometrianalyse af iNKT-celleprocent og CD4-udtryk langs ekspansionsperioden. Øvre plots er gated på levedygtige lymfocytter. Lavere plots er gated på iNKT celler (levedygtige CD1d-tetramer+ TCRβ+ lymfocytter). B) Fænotypisk karakterisering af beriget (dag 0) og udvidet (dag 14) iNKT celler. Plots er gated på iNKT celler (levedygtige CD1d-tetramer+ TCRβ+ lymfocytter). Celler var intranuklearly farves for transskription faktorer med Foxp3 Transskription Factor farvning Buffer Set. NKT1 (PLZFlav RORγt-), NKT2 (PLZFhøj RORγt-), og NKT17 (PLZFint RORγt+) delmængder blev identificeret, frekvenser af hver delmængde er vist i procent. C) Cytokinproduktion ved ekspanderede iNKT-celler på dag 14. Plots er gated på iNKT celler (levedygtige CD1d-tetramer+ TCRβ+ lymfocytter). Cellerne blev stimuleret i 4 timer med PMA 25 ng/mL/Ionomycin 1 μg/mL, i nærvær i de sidste 2 timer af Brefeldin A 10 μg/mL. Celler blev derefter fastgjort med PFA 2%, permeabilized med Permwash og derefter intracellulært farves til cytokinproduktion. Gating strategi blev sat på den ikke-aktiverede control, venstre panel. Der vises et repræsentativt eksperiment. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Her viser vi en reproducerbar og gennemførlig protokol for at få millioner af brugsklare iNKT-celler. På grund af manglen på disse celler in vivo var der meget brug for en metode til at udvide dem. Den protokol, vi foreslår, kræver hverken en bestemt instrumentering eller et stort antal mus. Vi udnyttede iVα14-Jα18 transgene mus med vilje til at reducere antallet af mus, der var nødvendige for proceduren.
En anden vellykket protokol for iNKT celle ekspansion fra iVα14-Jα18 transgene mus er tilgængelig i litteraturen10. Denne protokol indebærer generering, 6 dage før iNKT cellerensning, af friske knoglemarvs-afledte dendritiske celler, derefter lastet med α-galactosylceramid og bestrålet, plus IL-2 og IL-7. Vi betragter reduktionen af antallet af mus, der er involveret i proceduren, som en stor fordel ved protokollen. Det er også tidsbesparende, da oprettelsen af cellekulturen varer en enkelt dag i stedet for en uge. En mulig begrænsning af reproducerbarheden af den nuværende protokol kunne være tilgængeligheden af iVα14-Jα18 transgene mus, der dog er kommercielt tilgængelige. I mangel af disse mus forestiller vi os muligheden for at bruge et stort antal WT-mus, men protokollen skal oprettes i overensstemmelse hermed på grund af manglen på iNKT-celler i WT-mus.
Under cellekulturen kontrollerer vi normalt renheden og fænotypen af udvidede iNKT-celler. Faldet i procentdelen af TCRβ+ CD1d-tetramer+ dobbelt positive celler (Figur 3A) kan forklares ved en naturlig nedregulering af den invariante NKT-celle TCR fra celleoverfladen efter aktivering. Desuden har de fleste af udvidede iNKT-celler ikke udtrykke CD4 (Figur 3A): Dette kan udgøre en fordel i forbindelse med en adoptivcelleterapi, da CD4- iNKT-celler viste sig at være de mest effektive til at kontrollere tumor progression11. Desuden er den observerede TH0-lignende effektorfænotype (Figur 3C) helt i overensstemmelse med den, der observeres i humane iNKT-celler efter in vitro-ekspansion og restimulation8,12,13,14,15. De udvidede celler er meget reaktive in vivo og in vitro, hvilket er nyttigt i forbindelse med iNKT cellebaserede adoptivimmuni. Adoptivoverførsel af ikke-pulerede eller udvidede iNKT-celler forhindrer eller afhjælper akut Graft-Versus-Host Disease (aGVHD), hvilket efterlader uændret Graft-Versus-Leukæmi-effekten16,17,18,19. Adoptivt overførte menneskelige iNKT-celler udvidet in vitro med αGal-Cer lindre xenogene aGVHD og denne effekt er medieret af CD4- men ikke CD4+ celler20. Da iNKT-celler ikke forårsager aGVHD, udgør de desuden de ideelle celler til CAR-immunterapi uden behov for sletning af deres TCR og viste sig at have langvarig antitumoraktivitet in vivo8,15. iNKT-celler udnyttes i øjeblikket i igangværende og afsluttede kliniske forsøg21,22,23,24.
Afslutningsvis er den beskrevne protokol hurtig, ligetil og giver mulighed for en 30x stigning i antallet af iNKT-celler, der genvindes fra en muse milt (Figur 3B). Disse celler kan let udnyttes til in vitro anerkendelse assays, co-kultur systemer, eller adoptivcelleterapi i prækliniske undersøgelser. iNKT celler faktisk spiller en afgørende rolle i tumor immunovervågning, smitsomme sygdomme og autoimmunitet. I disse sammenhænge kan iNKT-celler repræsentere et kraftfuldt værktøj, der er et tiltalende alternativ til konventionelle T-celler uden MHC-begrænsningen. Den hurtige generering af store mængder af disse celler og muligheden for yderligere at manipulere dem in vitro kan føre til udvikling af hidtil usete terapeutiske strategier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Vi takker Paolo Dellabona og Giulia Casorati for videnskabelig støtte og kritisk læsning af manuskriptet. Vi takker også NIH Tetramer Core Facility for mus CD1d tetramer. Undersøgelsen blev finansieret af Fondazione Cariplo Grant 2018-0366 (til M.F.) og Italian Association for Cancer Research (AIRC) stipendium 2019-22604 (til GDP).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ammonium-Chloride-Potassium (ACK) solution | in house | 0.15M NH4Cl, 10mM KHCO3, 0.1mM EDTA, pH 7.2-7.4 | |
| anti-FITC Microbeads | Miltenyi Biotec | 130-048-701 | |
| anti-PE Microbeads | Miltenyi Biotec | 130-048-801 | |
| Brefeldin A | Sigma | B6542 | |
| CD19 -FITC | Biolegend | 115506 | clone 6D5 |
| CD1d-tetramer -PE | NIH tetramer core facility | mouse PBS57-Cd1d-tetramers | |
| CD4 -PeCy7 | Biolegend | 100528 | clone RM4-5 |
| Fc blocker | BD Bioscience | 553142 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Euroclone | ECS0186L | heat-inactivated and filtered .22 before use |
| FOXP3 Transcription factor staining buffer | eBioscience | 00-5523-00 | |
| H2 (IAb) -FITC | Biolegend | 114406 | clone AF6-120.1 |
| hrIL-2 | Chiron Corp | ||
| Ionomycin | Sigma | I0634 | |
| LD Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-901 | |
| LS Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| MACS buffer (MB) | in house | 0.5% Bovine Serum Albumin (BSA; Sigma-Aldrich) and 2Mm EDTA | |
| MS Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | |
| Non-essential amino acids | Gibco | 11140-035 | |
| Penicillin and streptomycin (Pen-Strep) | Lonza | 15140-122 | |
| PermWash | BD Bioscience | 51-2091KZ | |
| PFA | Sigma | P6148 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | EuroClone | ECB4004L | |
| PMA | Sigma | P1585 | |
| Pre-Separation Filters (30 µm) | Miltenyi Biotec | 130-041-407 | |
| Recombinat Mouse IL-7 | R&D System | 407-ML-025 | |
| RPMI 1640 with glutamax | Gibco | 61870-010 | |
| sodium pyruvate | Gibco | 11360-039 | |
| TCRβ -APC | Biolegend | 109212 | clone H57-597 |
| αCD3CD28 mouse T activator Dynabeads | Gibco | 11452D | |
| β-mercaptoethanol | Gibco | 31350010 |
References
- Bendelac, A., Savage, P. B., Teyton, L.
- Brennan, P. J., Brigl, M., Brenner, M. B. Invariant natural killer T cells: an innate activation scheme linked to diverse effector functions. Nature Reviews: Immunology. 13 (2), 101-117 (2013).
- Pellicci, D. G., et al. A natural killer T (NKT) cell developmental pathway iInvolving a thymus-dependent NK1.1(-)CD4(+) CD1d-dependent precursor stage. Journal of Experimental Medicine. 195 (7), 835-844 (2002).
- Benlagha, K., Kyin, T., Beavis, A., Teyton, L., Bendelac, A. A thymic precursor to the NK T cell lineage. Science. 296 (5567), 553-555 (2002).
- Lee, Y. J., Holzapfel, K. L., Zhu, J., Jameson, S. C., Hogquist, K. A. Steady-state production of IL-4 modulates immunity in mouse strains and is determined by lineage diversity of iNKT cells. Nature Immunology. 14 (11), 1146-1154 (2013).
- Griewank, K., et al. Homotypic interactions mediated by Slamf1 and Slamf6 receptors control NKT cell lineage development. Immunity. 27 (5), 751-762 (2007).
- Cortesi, F., et al. Bimodal CD40/Fas-Dependent Crosstalk between iNKT Cells and Tumor-Associated Macrophages Impairs Prostate Cancer Progression. Cell Reports. 22 (11), 3006-3020 (2018).
- Heczey, A., et al. Invariant NKT cells with chimeric antigen receptor provide a novel platform for safe and effective cancer immunotherapy. Blood. 124 (18), 2824-2833 (2014).
- Liu, Y., et al. A modified alpha-galactosyl ceramide for staining and stimulating natural killer T cells. Journal of Immunological Methods. 312 (1-2), 34-39 (2006).
- Chiba, A., et al. Rapid and reliable generation of invariant natural killer T-cell lines in vitro. Immunology. 128 (3), 324-333 (2009).
- Crowe, N. Y., et al. Differential antitumor immunity mediated by NKT cell subsets in vivo. Journal of Experimental Medicine. 202 (9), 1279-1288 (2005).
- de Lalla, C., et al. Production of profibrotic cytokines by invariant NKT cells characterizes cirrhosis progression in chronic viral hepatitis. Journal of Immunology. 173 (2), 1417-1425 (2004).
- Tian, G., et al. CD62L+ NKT cells have prolonged persistence and antitumor activity in vivo. Journal of Clinical Investigation. 126 (6), 2341-2355 (2016).
- Gaya, M., et al. Initiation of Antiviral B Cell Immunity Relies on Innate Signals from Spatially Positioned NKT Cells. Cell. 172 (3), 517-533 (2018).
- Rotolo, A., et al. Enhanced Anti-lymphoma Activity of CAR19-iNKT Cells Underpinned by Dual CD19 and CD1d Targeting. Cancer Cell. 34 (4), 596-610 (2018).
- Schneidawind, D., et al. Third-party CD4+ invariant natural killer T cells protect from murine GVHD lethality. Blood. 125 (22), 3491-3500 (2015).
- Schneidawind, D., et al. CD4+ invariant natural killer T cells protect from murine GVHD lethality through expansion of donor CD4+CD25+FoxP3+ regulatory T cells. Blood. 124 (22), 3320-3328 (2014).
- Schneidawind, D., Pierini, A., Negrin, R. S. Regulatory T cells and natural killer T cells for modulation of GVHD following allogeneic hematopoietic cell transplantation. Blood. 122 (18), 3116-3121 (2013).
- Leveson-Gower, D. B., et al. Low doses of natural killer T cells provide protection from acute graft-versus-host disease via an IL-4-dependent mechanism. Blood. 117 (11), 3220-3229 (2011).
- Coman, T., et al. Human CD4- invariant NKT lymphocytes regulate graft versus host disease. Oncoimmunology. 7 (11), 1470735 (2018).
- Xu, X., et al. NKT Cells Coexpressing a GD2-Specific Chimeric Antigen Receptor and IL15 Show Enhanced In vivo Persistence and Antitumor Activity against Neuroblastoma. Clinical Cancer Research. 25 (23), 7126-7138 (2019).
- Heczey, A., et al. Anti-GD2 CAR-NKT cells in patients with relapsed or refractory neuroblastoma: an interim analysis. Nature Medicine. 26 (11), 1686-1690 (2020).
- Exley, M. A., et al. Adoptive Transfer of Invariant NKT Cells as Immunotherapy for Advanced Melanoma: A Phase I Clinical Trial. Clinical Cancer Research. 23 (14), 3510-3519 (2017).
- Wolf, B. J., Choi, J. E., Exley, M. A. Novel Approaches to Exploiting Invariant NKT Cells in Cancer Immunotherapy. Frontiers in Immunology. 9, 384 (2018).
