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Biology

प्राथमिक माउस रेटिना वर्णक एपिथेलियल कोशिकाओं की कुशल विच्छेदन और संस्कृति

Published: February 10, 2021 doi: 10.3791/62228
Automatic Translation
1, 1, 1
1Ocular Genomics Institute of Massachusetts Eye and Ear, Harvard Medical School

Summary

यह प्रोटोकॉल, जिसे मूल रूप से फर्नांडीज-गोडिनो एट अल द्वारा2016 1में सूचित किया गया था, कुशलतापूर्वक अलग-थलग करने और माउस आरपीई कोशिकाओं को संस्कृति देने की विधि का वर्णन करता है, जो ट्रांसवेल प्लेटों पर एक सप्ताह के भीतर एक कार्यात्मक और ध्रुवीकृत आरपीई मोनोलेयर बनाते हैं। प्रक्रिया में लगभग 3 घंटे लगते हैं।

Abstract

नेत्र विकार दुनिया भर में लाखों लोगों को प्रभावित करते हैं, लेकिन मानव ऊतकों की सीमित उपलब्धता उनके अध्ययन में बाधा डालती है । माउस मॉडल मानव शरीर रचना विज्ञान और शरीर विज्ञान के साथ उनकी समानताओं की वजह से नेत्र रोगों के रोगविज्ञान को समझने के लिए शक्तिशाली उपकरण हैं। रेटिना वर्णक एपिथेलियम (आरपीई) में परिवर्तन, जिसमें आकृति विज्ञान और कार्य में परिवर्तन शामिल हैं, कई नेत्र विकारों द्वारा साझा की जाने वाली आम विशेषताएं हैं। हालांकि, सफल अलगाव और प्राथमिक माउस आरपीई कोशिकाओं की संस्कृति बहुत चुनौतीपूर्ण है। यह पेपर पहले फर्नांडीज-गोडिनो एट अल द्वारा प्रकाशित प्रोटोकॉल का एक अद्यतन ऑडियोविजुअल संस्करण है। 2016 में प्राथमिक माउस आरपीई कोशिकाओं को कुशलतापूर्वक अलग-थलग करने और संस्कृति देने के लिए। यह विधि अत्यधिक पुन: उत्पन्न होती है और इसके परिणामस्वरूप अत्यधिक ध्रुवीकृत और वर्णक आरपीई मोनोलेयर की मजबूत संस्कृतियों में परिणाम होता है जिसे ट्रांसवेल्स पर कई हफ्तों तक बनाए रखा जा सकता है। यह मॉडल नेत्र रोगों में अंतर्निहित आणविक और सेलुलर तंत्र के अध्ययन के लिए नए रास्ते खोलता है । इसके अलावा, यह चिकित्सीय दृष्टिकोणों का परीक्षण करने के लिए एक मंच प्रदान करता है जिसका उपयोग विरासत में मिले रेटिना विकारों और मैकुलर डिजनरेशन सहित अपूरित चिकित्सा जरूरतों के साथ महत्वपूर्ण नेत्र रोगों के इलाज के लिए किया जा सकता है।

Introduction

यह प्रोटोकॉल, जिसे मूल रूप से फर्नांडीज-गोडिनो एट अल द्वारा2016 1में सूचित किया गया था, कुशलतापूर्वक अलग-थलग करने और संस्कृति माउस रेटिना वर्णक एपिथेलियम (आरपीई) कोशिकाओं का वर्णन करता है, जो ट्रांसवेल प्लेटों पर एक सप्ताह के भीतर एक कार्यात्मक और ध्रुवीकृत आरपीई मोनोलेयर बनाते हैं। आरपीई एक मोनोलेयर है जो तंत्रिका रेटिना और ब्रुच की झिल्ली के बीच आंख में स्थित है। इस एकल परत में अत्यधिक ध्रुवीकृत और वर्णक एपिथेलियल कोशिकाएं होती हैं जो तंग जंक्शनों से जुड़ी होती हैं, जो एक हेक्सागोनल आकार का प्रदर्शन करती हैं जो एक शहद2जैसा दिखता है। इस स्पष्ट हिस्टोलॉजिकल सादगी के बावजूद, आरपीई रेटिना और सामान्य दृश्य चक्र2,3,4के लिए महत्वपूर्ण विभिन्न प्रकार के कार्य करता है। आरपीई मोनोलेयर के मुख्य कार्यों में हल्के अवशोषण, पोषण और फोटोरिसेप्टर का नवीकरण, मेटाबोलिक एंड उत्पादों को हटाना, सबरेटिनल स्पेस में आयन होगोस्टेसिस का नियंत्रण और रक्त-रेटिना बैरियर2,3का रखरखाव शामिल है। आंखों में प्रतिरक्षा प्रणाली के स्थानीय मॉडुलन में आरपीई की भी महत्वपूर्ण भूमिका है, 5,6, 7,8,9,10,11. आरपीई की पतन और/या शिथिलता कई नेत्र विकारों जैसे रेटिनाइटिस पिगमेंटोसा, लेबर जन्मजात अमौरोसिस, एल्बिनिज्म, मधुमेह रेटिनोपैथी, और मैकुलर डिजनरेशन12,13, 14,15द्वारा साझा की गई सामान्य विशेषताएं हैं। दुर्भाग्य से, मानव ऊतकों की उपलब्धता सीमित है। मनुष्यों के साथ उनके अत्यधिक संरक्षित आनुवंशिक होमोलॉजी को देखते हुए, माउस मॉडल नेत्र विकारों 16,17, 18,19का अध्ययन करने के लिए एक उपयुक्त और उपयोगी उपकरण का प्रतिनिधित्व करते हैं। इसके अलावा, सुसंस्कृत प्राथमिक आरपीई कोशिकाओं का उपयोग आनुवंशिक हेरफेर और दवा परीक्षण जैसे लाभ प्रदान करता है जो इन दृष्टि-धमकी वाले विकारों9,11के लिए नए उपचारों के विकास में तेजी ला सकता है।

माउस आरपीई अलगाव और संस्कृति के लिए उपलब्ध मौजूदा तरीकों में पुन: पेश की कमी है और पर्याप्त विश्वसनीयता के साथ वीवो में आरपीई सुविधाओं का पुनर्मूल्यांकन नहीं करते हैं। कोशिकाएं संस्कृति13,20में कुछ दिनों के भीतर पिगमेंटेशन, षट्कोणीय आकार और ट्रांसेपिथेलियल इलेक्ट्रिकल रेजिस्टेंस (टीईआर) खो देती हैं। चूहों से इन प्राथमिक आरपीई सेल संस्कृतियों की स्थापना के बाद से एक चुनौतीपूर्ण प्रक्रिया है, इस अनुकूलित प्रोटोकॉल अन्य प्रोटोकॉल के आधार पर चूहे और मानव आंखों से आरपीई कोशिकाओं को अलग करने के लिए बनाया गया है21,22,23 माउस आंखों विच्छेदन करने के लिए, आरपीई और संस्कृति माउस आरपीई कोशिकाओं को विट्रो में इकट्ठा करें।

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Protocol

नेत्र और दृष्टि अनुसंधान में पशुओं के उपयोग के लिए एआरवीओ वक्तव्य के दिशा-निर्देशों का पालन किया गया ।

नोट: यह विधि C57BL/6J, B10 सहित विभिन्न आनुवंशिक पृष्ठभूमि के चूहों के साथ सफल साबित हुई है। D2-Hco H2d H2-T18 c/oSnJ, और एल्बिनो चूहों, विभिन्न उम्र में। अधिमानतः आरपीई कोशिकाओं को प्राप्त करने के लिए 8 से 12 सप्ताह पुराने चूहों का उपयोग करें। पुराने चूहों से RPE कोशिकाओं संस्कृति में कम पैदा होता है और छोटे चूहों कम और छोटे कोशिकाओं है, जो विभिंन जानवरों से आंखें पूलिंग के लिए व्यवहार्य संस्कृतियों की आवश्यकता है ।

1. रिएजेंट्स और झिल्ली आवेषण की तैयारी

  1. निम्नलिखित अभिकर् ता तैयार करें।
    1. एचबीएसएस-एच−(एचबीएसएस बिना कैल्शियम, बिना मैग्नीशियम बफर + 10 एमएम एचईपीई): एचबीएसएस के 99 एमएल में 1 एम एचईपी के 1 एमएल जोड़ें- (सीए/एमजी के बिना) बफर। 1 महीने तक 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
    2. एचबीएसएस-एच+ (कैल्शियम के साथ एचबीएसएस, मैग्नीशियम बफर + 10 एमएम एचईपी के साथ): एचबीएसएस + (सीए/एमजी के साथ) बफर के 99 एमएल में 1 एम एचईपीई का 1 एमएल जोड़ें। 1 महीने तक 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
    3. हायल्यूरोनिडेस सॉल्यूशन (1 मिलीग्राम/एमएल): एचबीएसएस-एच के 10 एमएल में 10 मिलीग्राम हायलुरोनिडेस जोड़ें और 10 एमएल सिरिंज का उपयोग करके 0.4 माइक्रोन बाँझ सिरिंज फिल्टर के साथ इसे फ़िल्टर करें। उपयोग से पहले ताजा तैयार करें और इसे कमरे के तापमान (आरटी; 20-25 डिग्री सेल्सियस) पर छोड़ दें।
    4. एफबीएस समाधान तैयार करें: एचबीएसएस-एच+के साथ 20% एफबीएस मिलाएं। एचबीएसएस-एच+के 8 एमएल में एफबीएस का 2 एमएल जोड़ें। उपयोग से पहले ताजा तैयार करें।
    5. आरपीई माध्यम तैयार करें: N1 मध्यम अनुपूरक 1/100 (v/v), ग्लूटामाइन 1/100 (v/v), पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन 1/100 (v/v) और गैरजरूरी अमीनो एसिड समाधान 1/100 (v /v), हाइड्रोकॉर्टिसोन (20 माइक्रोग्राम/एल), टॉरिन (२५० मिलीग्राम/एल) और ट्राइयोडो-थाइरोनिन (०.०१३ माइक्रोन/एल) अल्फा एमईएम + 5% एफबीएस में या बिना एफबीएस1,23,24। यदि वांछित है, तो एफबीएस गर्मी-निष्क्रिय हो सकता है; कोई मतभेद नहीं देखा गया है । आरपीई अलगाव के लिए ताजा तैयार करें। सेल कल्चर मेंटेनेंस के लिए 1 महीने तक 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
    6. ट्रिप्सिन-ईडीटीए तैयार करें: ताजा ट्राइप्सिन-ईडीटीए (0.25%) के छोटे एकल-उपयोग वाले एलिकोट्स (~ 8 एमएल) तैयार करें और उन्हें -20 ओसी पर फ्रीज करें। प्रत्येक उपयोग से पहले उन्हें आरटी पर गल। फ्रीज-गल चक्र से बचें।
  2. झिल्ली आवेषण (जैसे, ट्रांसवेल आवेषण) तैयार करें।
    1. 5% सीओ 2 -वातित इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर कम से कम 30 मिनट के लिए आरपीई माध्यम के साथ6.5 मिमीझिल्ली आवेषण को बराबर करें। दो माउस आंखों से बीज आरपीई कोशिकाओं के लिए एक झिल्ली डालने का प्रयोग करें।
    2. इनक्यूबेशन के बाद, निचले डिब्बे के माध्यम को पीबीएस के 700 माइक्रोन से बदलें।
    3. ऊपर के डिब्बे से माध्यम निकालें और 10 μg/mL माउस लैमिनिन (पीबीएस में) के 100μL के साथ झिल्ली डालने को कोट करें आरटी में कम से कम 2 घंटे के लिए (छोटे ऊष्मायन डालने के लिए कोशिकाओं की खराब लगाव का कारण बन सकते हैं)।
    4. टीईआर माप के लिए खाली के रूप में उपयोग करने के लिए एक अतिरिक्त झिल्ली डालें कोट करें।

2. माउस आंखों का विच्छेदन और परमाणु

  1. सीओ2 एस्फिक्सेशन द्वारा चूहों को सीओ2 कक्ष में रखकर इच्छामृत्यु दें और धीरे-धीरे प्रति मिनट कक्ष मात्रा के 30-70% की भरो दर पर सीओ2 को जारी करें।
  2. माउस की आंख के प्रत्येक तरफ माइक्रो-संदंश के कोण, दांतेदार युक्तियां रखें और आंखों की पुतली (परमाणु) को सहारा देने के लिए धीरे-धीरे दबाएं।
  3. आंखों की पुतली के चारों ओर रखे संदंश को बंद करें। फिर, नेत्र मांसपेशियों से ऑप्टिक तंत्रिका के साथ पूरी आंख को अलग करने के लिए आगे और पीछे बढ़ते हुए धीरे-धीरे खींचें, यह सुनिश्चित करना कि कोई कनेक्टिव ऊतक स्क्लेरा से जुड़ा हुआ न रहे।
  4. बर्फ पर एचबीएसएस-एच− के 3 एमएल के साथ छह-अच्छी प्लेट के एक कुएं में रखने से पहले 70% इथेनॉल में ईन्यूक्लिड आईबॉल को कुल्ला करें।
  5. माउस की दूसरी आंख को हटाने के लिए चरण 2.2 से 2.4 दोहराएं। 30 मिनट के भीतर अगले चरणों के साथ आगे बढ़ें।
    नोट: यह सिफारिश की है enucleating/एक समय में केवल दो आंखों विच्छेदन जब तक कुछ अनुभव प्राप्त किया है ।

3. आरपीई का संग्रह

नोट: एक लैमिनार प्रवाह हुड में बाँझ परिस्थितियों में निम्नलिखित चरणों का प्रदर्शन करें। बर्फ पर विस्तारित ऊष्मायनों से बचने के लिए, जिसके परिणामस्वरूप आरपीई सेल मौत हो सकती है, एक समय में दो से अधिक आंखें एकत्र न करें।

  1. स्क्लेरा में कोई कटौती किए बिना आंखों की पुतली से जुड़े सभी संयोजी ऊतक, रक्त और मांसपेशियों को ध्यान से साफ करने के लिए एक विच्छेदन स्टीरियोमाइक्रोस्कोप, ड्यूमोंट #5 संदंश, और कोण कैंची का उपयोग करें। आंखों को ताजा और साफ रखने और आरपीई संस्कृतियों के प्रदूषण से बचने के लिए एचबीएसएस-एच−बफर के 3 एमएल को नियमित रूप से बदलें।
  2. आंखों की पुतली को पकड़ने और तेज कार्बन-स्टील #11 ब्लेड के साथ कॉर्निया के केंद्र में छेद करने के लिए ऑप्टिक तंत्रिका का उपयोग एक हैंडल के रूप में करें।
  3. उपरोक्त छेद के माध्यम से कॉर्निया में तीन चीरे बनाने के लिए ड्यूमोंट #5 कैंची का उपयोग करें, यह सुनिश्चित करते हुए कि लेंस को हटाने के लिए पर्याप्त जगह है।
  4. ऑप्टिक तंत्रिका पकड़ो और कोण कैंची के आधार के साथ ओरा सेराटा के लिए मामूली दबाव लागू जब तक लेंस पूरी तरह से बाहर आता है । इनक्यूबेशन के दौरान तंत्रिका रेटिना और आरपीई की टुकड़ी को रोकने के लिए आईरिस एपिथेलियम को जगह में छोड़ दें। आंख को एचबीएसएस-एच-बफर में रखें।
  5. दूसरी आंख को विच्छेदन करने के लिए चरण 3.1-3.4 दोहराएं।
  6. आरपीई से तंत्रिका रेटिना को अलग करने के लिए 5% सीओ 2 -वातित इनक्यूबेटर (1.5 एमएल/वेल) में 45 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर12डिग्री सेल्सियस पर हाइलुरोनिडेस समाधान में लेंस के बिना आंखों को इनक्यूबेट करें।
  7. प्रत्येक आंख को एक नए कुएं में रखें और हाइलुरोनिडास गतिविधि को रोकने के लिए प्रति अच्छी तरह से ठंडे एचबीएसएस-एच + बफर के 1.5 एमएल के साथ 30 मिनट के लिए बर्फ पर इसे इनक्यूबेट करें। इनक्यूबेशन को 45 मिनट से अधिक समय तक न बढ़ाएं।
  8. धो लें, और प्रत्येक आंख को ताजा एचबीएसएस-एच + बफर के साथ 35-मिमी संस्कृति पकवान में रखें और 8-सेमी वन्नास कैंची का उपयोग करके ओरा सेराटा तक पहुंचने तक मूल चीरों के माध्यम से कॉर्निया काट लें। फिर, आईरिस एपिथेलियम और कॉर्निया को हटाने के लिए ओरा सेरेटा के नीचे काटें।
  9. घुमावदार चिमटी के साथ आईकप एज/ओरा सेरेटा को पकड़ें और कोणीय माइक्रोफोर्स का उपयोग करके, तंत्रिका रेटिना को यह सुनिश्चित करते हुए दूर खींचें कि आरपीई परत में कटौती न हो । इसके बाद ऑप्टिक नर्व से इंटरनल अटैचमेंट को काट लें। यदि कुछ आरपीई कोशिकाएं तंत्रिका रेटिना से जुड़ी रहती हैं, तो इनक्यूबेशन समय बढ़ाएं लेकिन कुल 45 मिनट से अधिक न करें।
  10. ऑप्टिक तंत्रिका को काटें और प्रत्येक आईकप को एक अलग 12-अच्छी तरह से प्लेट में स्थानांतरित करें जिसमें 1.5 एमएल ताजा ट्राइपसिन-ईडीटीए शामिल है। सुनिश्चित करें कि आईकप खोला गया है और ट्राइप्सिन में पूरी तरह से डूबे हुए हैं। 5% सीओ2 इनक्यूबेटर में 45 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर आईकप को इनक्यूबेट करें।
  11. ट्रिप्सिन इनक्यूबेशन के दौरान अलग किए गए किसी भी आरपीई शीट के साथ प्रत्येक आईकप को इकट्ठा करें और उन्हें 12-अच्छी तरह से प्लेट में स्थानांतरित करें जिसमें 1.5 एमएल एफबीएस समाधान शामिल है। यदि आरपीई शीट ट्राइप्सिन समाधान में रहते हैं, तो उन्हें एफबीएस समाधान के साथ अच्छी तरह से स्थानांतरित करने के लिए माइक्रोपिपेट का उपयोग करें।

4. प्राथमिक माउस आरपीई कोशिकाओं का अलगाव

  1. ऑप्टिक तंत्रिका द्वारा प्रत्येक आईकप पकड़ो और इसे 12-अच्छी तरह से एचबीएसएस-एच + में 20% एफबीएस के 1.5 एमएल युक्त प्लेट में नीचे चेहरा जब तक आरपीई शीट की पूरी टुकड़ी हासिल नहीं की जाती है।
  2. माइक्रोपिपेट के साथ किसी भी आरपीई शीट और आरपीई क्लस्टर एकत्र करें और उन्हें 15-एमएल ट्यूब में रखें। स्क्लेरा या कोरॉइड के किसी भी सफेद टुकड़े से बचें, जो संस्कृतियों को दूषित कर सकता है। एक ट्यूब में एक ही माउस से दो आंखें पूल।
  3. आर टी में 2 मिनट के लिए 340 x ग्राम पर मिश्रण को सेंट्रलाइज करें और सुपरनेट को त्यागें।
  4. धीरे से ट्रिप्पसिन-EDTA (0.25%) और 37 डिग्री सेल्सियस पर पानी के स्नान में 1 मिनट के लिए मिश्रण को इनक्यूबेट करें ताकि आरपीई शीट को एकल कोशिकाओं में अलग किया जा सके। इनक्यूबेशन के बाद, धीरे-धीरे माइक्रोपिपेट के साथ 10x ऊपर और नीचे पाइप, पिपिंग करते समय बुलबुला गठन से बचते हैं।
  5. ट्रिप्पसिन को पतला और निष्क्रिय करने के लिए ताजा तैयार आरपीई माध्यम के 9 एमएल जोड़ें और आरटी में 2 मिनट के लिए 340 x ग्राम पर मिश्रण को अपकेंद्रित्र करें।
  6. एक माइक्रोपिपेट का उपयोग करके 5% एफबीएस के साथ आरपीई माध्यम के 150 माइक्रोएल में अलौकिक और सावधानीपूर्वक सेल पेलेट को पुन: उत्पन्न करें, यह सुनिश्चित करते हुए कि कोशिकाएं सजातीय रूप से पुनः निलंबित हैं और पिपटिंग करते समय बुलबुला गठन से बच रही हैं।
  7. कदम 1.2 से लैमिनिन-लेपित झिल्ली डालें, नीचे कक्ष से पीबीएस को हटा दें और आरपीई माध्यम के 700 माइक्रोन जोड़ें।
  8. झिल्ली डालने के ऊपरी कक्ष से लेमिनिन निकालें और आरपीई सेल निलंबन ड्रॉपवाइज और समान रूप से कक्ष के केंद्र में वितरित करें, जबकि पिपटिंग करते समय बुलबुला गठन से बचते हैं।
  9. झिल्ली को 37 डिग्री सेल्सियस पर 5% सीओ2 इनक्यूबेटर में रखें और कम से कम 24 घंटे के लिए अशान्त छोड़ दें।
  10. 24 घंटे के बाद, माइक्रोस्कोप के नीचे झिल्ली डालने की जांच करें ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि अधिकांश आरपीई कोशिकाएं डालने से जुड़ी हुई हैं और संगम कम से कम 50%(चित्रा 1A)है। यह महत्वपूर्ण है कि पहले ७२ घंटे के दौरान मीडिया को बदलने के लिए नहीं है ।

5. ध्रुवीकृत आरपीई मोनोलेयर्स की संस्कृति

  1. कोशिका लगाव की अनुमति देने के लिए आरपीई माध्यम को ताज़ा करने से पहले कम से कम 72 घंटे के लिए संस्कृति में अलग आरपीई कोशिकाओं को बनाए रखें। सीडिंग में 50% या उससे अधिक का सेल संगम एक उपयुक्त ध्रुवीकृत आरपीई मोनोलेयर के गठन के लिए मौलिक है।
  2. कोशिकाओं के जुड़े होने के बाद ताजा और पूर्व-गर्म आरपीई माध्यम (चरण 1.1.5) का उपयोग करके सप्ताह में दो बार संस्कृति माध्यम बदलें। पहले 72 घंटे के बाद सीरम को कल्चर मीडियम से हटाया जा सकता है।
    नोट: संस्कृति में एक सप्ताह के बाद, कोशिकाओं को 6.5 मिमी ट्रांसवेल डालने के लिए लगभग 50,000 कोशिकाओं के आसपास होने की उम्मीद सेल संख्या के साथ, हेक्सागोनल, द्वि-नाभिकित, पिगमेंटेड और ध्रुवीकृत(चित्रा 1 बी)होना चाहिए। संस्कृति में दो सप्ताह के बाद, स्वस्थ कोशिकाओं को शामिल आरपीई मोनोलेयर मनाया जाता है। आरपीई संस्कृतियां एपिकल माइक्रोविली, बेसल इनफोल्डिंग्स और टाइट जंक्शनों(चित्रा 1C) कोप्रदर्शित करती हैं।

6. टीईआर माप

नोट: आरपीई मोनोलेयर की एक अच्छी अखंडता और ध्रुवीकरण सुनिश्चित करने के लिए संस्कृति में न्यूनतम 4 दिनों के बाद आरपीई कोशिकाओं के TER माप का प्रदर्शन करें।

  1. वोल्टोममीटर के इलेक्ट्रोड को 70% इथेनॉल से साफ करें और उन्हें ध्यान से सुखाएं।
  2. इनक्यूबेटर से ट्रांसवेल लें और तापमान में उतार-चढ़ाव के कारण परिवर्तन से बचने के लिए 3 मिनट के भीतर टीईआर माप करें। टीईआर को मापने के लिए, ऊपरी कक्ष में वोल्टोममीटर के छोटे इलेक्ट्रोड और झिल्ली डालने के नीचे कक्ष में लंबे इलेक्ट्रोड को विसर्जित करें। सेल टुकड़ी को रोकने के लिए आरपीई मोनोलेयर के संपर्क से बचें।
  3. टीईआर की गणना करने के लिए, नमूने से खाली (झिल्ली डालने वाले बिना कोशिकाओं के लेमिनिन के साथ लेपित) के मूल्य को घटाएं। फिर झिल्ली डालने के सतह क्षेत्र (6.5-मिमी झिल्ली डालने के मामले में0.33 सेमी 2) द्वारा प्राप्त मूल्य (ओम में) गुणा करें। उत्पाद संस्कृति में 72 घंटे के बाद कम से कम 200 Ω एक्स सेमी2 होना चाहिए। TER मानों दो सप्ताह के बाद 400 Ω x सेमी2 से ऊपर उपाय करना चाहिए। कम TER मूल्यों के साथ आरपीई संस्कृतियों को त्यागें।

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Representative Results

इस प्रोटोकॉल का उपयोग आनुवंशिक रूप से संशोधित चूहों से आरपीई कोशिकाओं को अलग और संस्कृति में करने के लिए किया गयाहै 1. माउस उपभेदों या लिंग के बीच कोई अंतर नहीं देखा गया है। परिणामों ने उम्र से संबंधित मैकुलर अध: पतन जैसे नेत्र रोगों में अंतर्निहित तंत्र के कुछ महत्वपूर्ण पहलुओं को समझने में मदद की है, जोबुजुर्गों केबीच दृष्टि हानि का सबसे आम कारण है 9 । इस प्रोटोकॉल के बाद अलग-थलग आरपीई कोशिकाओं को पूरी तरह से सीडिंग के 24 घंटे बाद झिल्ली डालने से जोड़ा गया था और 72 एच1के बाद ठेठ आरपीई आकार, आकृति विज्ञान और पिगमेंटेशन दिखाया गया था। एक सप्ताह के बाद, एक अत्यधिक ध्रुवीकृत आरपीई मोनोलेयर का गठन षट्कोणीय पिगमेंटेड आरपीई कोशिकाओं द्वारा किया गया था जिसमें दो नाभिक जेडओ-1(आंकड़े 1C, 2)व्यक्त करते हुए तंग जंक्शनों से जुड़े हुए थे। ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोग्राफ एपिकल माइक्रोविली और बेसल इनफोल्डिंग्स(चित्रा 1C) कीउपस्थिति का पता चलता है । आरपीई मोनोलेयर के ध्रुवीकरण की पुष्टि टीईआर मूल्यों द्वारा की गई थी, जो औसत से 200 Ω एक्स सेमी2से अधिक था, जो समय के साथ स्थिर रहा(चित्रा 2)।

इस विधि का कार्यात्मक सत्यापन किया गया था, हालांकि फागोसिटोसिस परखता है। माउस आरपीई कोशिकाओं को झिल्ली आवेषण पर सुसंस्कृत किया गया था और फिटसी-लेबल वाले गोजातीय पीओएस के साथ खिलाया गया था। फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी(चित्रा 3)द्वारा पीओएस चपेट और पाचन का प्रदर्शन किया गया था।

Figure 1
चित्रा 1। अलग-अलग समय-बिंदुओं पर आरपीई कोशिकाएं। (A)आरपीई कोशिकाओं के 10x ब्राइटफील्ड माइक्रोग्राफ झिल्ली आवेषण पर 24 घंटे के बाद सीडिंग, और(ख)एक सप्ताह के बाद । (ग)ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोग्राफ दो सप्ताह के लिए झिल्ली आवेषण पर सुसंस्कृत आरपीई के एपिकल माइक्रोविली, बेसल इनफोल्डिंग्स और मेलेनिन पिगमेंट (काले धब्बे) प्रदर्शित करते हैं । स्केल बार: ए, बी: 100 माइक्रोन, सी: 2 माइक्रोन। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्रा 2। समय के साथ TER। झिल्ली आवेषण पर ~ 60 प्राथमिक माउस आरपीई सेल संस्कृतियों के ट्रांसेपिथेलियल इलेक्ट्रिकल रेजिस्टेंस (टीईआर) को 0.5 (एन = 33), 1 (एन = 58), 1.5 (एन = 54), और 2 (एन = 60) सप्ताह के बाद मापा गया था। TER 72 घंटे तक 200 Ω एक्स सेमी2 तक पहुंचता है और कम से कम दो सप्ताह तक स्थिर रहता है। औसत ± एसडी के साथ एकल मूल्यों के रूप में दर्शाया गया डेटा । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3। फागोसिटोसिस परखता है। प्राथमिक माउस आरपीई संस्कृतियों के 40x फ्लोरोसेंट माइक्रोग्राफ को फिटक-लेबल वाले गोजातीय पीओएस (ग्रीन) के साथ दो घंटे के लिए खिलाया गया और मेथनॉल25के साथ तय किया गया। छोटे टुकड़े कोशिका के साइटोप्लाज्म के अंदर पचा पीओएस के अनुरूप होते हैं। तंग जंक्शनों (लाल) के दृश्य को एंटीबॉडी एंटी-जेडओ 1 के साथ इम्यूनोसटेनिंग द्वारा सुविधा प्रदान की गई थी जैसा कि पहले1,9वर्णित था। दापी (नीला) का उपयोग नाभिक को दागने के लिए किया जाता था। दो नाभिक के साथ विशिष्ट माउस आरपीई कोशिकाओं को छवि के केंद्र में देखा जा सकता है। स्केल बार: 50 माइक्रोन. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

जबकि माउस आरपीई सेल अलगाव और संस्कृति के लिए कई तरीके 1 ,13,20, 22,26,27से पहले विकसित किए गएथे,फर्नांडीज-गोडिनो की विधि ने पहले झिल्ली आवेषण का उपयोग किया जिससे संस्कृति में आरपीई कोशिकाओं के कुशल विकास को1, 9सप्ताह तकचलायाजासके। उनके प्रोटोकॉल 1 , 9 में एक और बडा परिवर्तन आरपीई कोशिकाओं1,13, 20 , 26को अलग करने के लिए यांत्रिक छीलने के बजाय एंजाइमेटिक समाधानों का उपयोग करना था । लेंस को कॉर्निया में चीरा के माध्यम से हटा दिया गया था, जिससे आईरिस एपिथेलियम बरकरार रहा और पहली इनक्यूबेशन के दौरान रेटिना की अखंडता को संरक्षित किया गया। झिल्ली आवेषण और विशिष्ट आरपीई माध्यम23 के उपयोग के साथ संयुक्त आरपीई कोशिकाओं का कोमल अलगाव एक बेहतर कोशिका अस्तित्व में परिणाम देता है, जो एक कार्यात्मक कॉन्फ्लूंट मोनोलेयर के गठन को बढ़ाता है जो संस्कृति2में दिनों के भीतर आरपीई की शारीरिक स्थितियों की नकल करता है। आमतौर पर, प्राथमिक माउस आरपीई कोशिकाओं को इस विधि के साथ सुसंस्कृत हेक्सागोनल आकृति विज्ञान, ध्रुवीकरण, पिगमेंटेशन, बाधा गुण, और प्रसार प्रदर्शित करता है। इसके अलावा, आरपीई को तीन दिन से कई हफ्तों तक सीरम की अनुपस्थिति में सुसंस्कृत किया जा सकता है, जो पूरक-संबद्ध आरपीई विकृतियों का अध्ययन करने के लिए महत्वपूर्ण है9।

इस प्रोटोकॉल की एक सीमा यह है कि झिल्ली आवेषण पर सुसंस्कृत प्राथमिक माउस आरपीई कोशिकाओं का विस्तार नहीं किया जा सकता है। एंजाइमेटिक समाधानों के साथ प्राथमिक माउस आरपीई कोशिकाओं को पासिंग करना या उन्हें लंबे समय तक खेती करने से पिगमेंटेशन, डी-विभेदन और कम टीईआर की हानि होती है, जिससे वीवो सुविधाओं में समान गुण खो जाते हैं। एक जानवर से प्राप्त आरपीई कोशिकाओं की सीमित मात्रा ट्रांसक्रिप्टोमिक और प्रोटेओमिक विश्लेषण के लिए विभिन्न जानवरों से नमूनों को पूल करने के लिए बाध्य करती है, जहां अपेक्षाकृत बड़ी मात्रा में प्रारंभिक सामग्री की आवश्यकता होती है। एक बड़ी झिल्ली डालने में अधिक आंखों को पूल करके आरपीई संस्कृतियों को बढ़ाने की सिफारिश नहीं की जाती है, क्योंकि इसके परिणामस्वरूप सेल मृत्यु और बहुस्तरीय आरपीई संस्कृतियों का प्रतिशत अधिक हो सकता है।

प्रोटोकॉल के लिए कुछ महत्वपूर्ण कदम भी हैं । जब तक कुछ अनुभव को अधिक नहीं किया जाता है, तब तक दो से अधिक आंखों को एक ही समय में काटा जाना चाहिए, क्योंकि लंबे समय तक विच्छेदन समय के परिणामस्वरूप सेल मृत्यु का उच्च प्रतिशत होता है। ऑप्टिक तंत्रिका को ट्राइप्सिन के साथ इनक्यूबेशन से पहले ही काट दिया जाना चाहिए। आरपीई कोशिकाओं को परेशान किए बिना आईकप को संभालना महत्वपूर्ण है, लेकिन ऑप्टिक तंत्रिका ट्राइप्सिन द्वारा पचती है, जिससे आरपीई संस्कृतियों में अशुद्धियों की ओर जाता है। नेत्र मांसपेशियों को छीलने को सावधानी के साथ किया जाना चाहिए। यदि स्क्लेरा छिद्रित है और तंत्रिका रेटिना बाहर चबूतरे, आंख को छोड़ दिया जाना चाहिए क्योंकि RPE कोशिकाओं को क्षतिग्रस्त हो जाएगा और जीवित नहीं होगा । लेंस को हटाने के लिए न्यूनतम दबाव लागू किया जाना चाहिए। एक बड़ा कॉर्नियल चीरा करना बेहतर है। यह महत्वपूर्ण है कि आईकप खुला है और ट्रिप्पसिन में पूरी तरह से जलमग्न है ताकि सभी आरपीई कोशिकाएं समाधान के संपर्क में आ जाएं। आरपीई कोशिकाओं को आईकप के कोमल झटकों के माध्यम से एकत्र किया जाना चाहिए, और कभी भी मीडिया को छिड़ककर या यांत्रिक रूप से छीलने से नहीं।

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Disclosures

लेखकों की घोषणा है कि वे कोई प्रतिस्पर्धी वित्तीय हितों की है ।

Acknowledgments

इस काम को मैसाचुसेट्स आई एंड इयर में ऑकुलर जीनोमिक्स इंस्टीट्यूट ने सपोर्ट किया ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10 ml BD Luer-Lok tip syringe, disposable BD Biosciences 309604
15 ml centrifuge tube VWR International 21008-103
50 ml centrifuge tube VWR International 21008-951
Alpha Minimum Essential Medium Sigma-Aldrich M4526-500ML
Angled micro forceps WPI 501727
Bench-top centrifuge any
CO2 incubator Thermo HERA VIOS 160I CO2 SST TC 120V
Dissecting microscope Any
Dulbecco’s Phospate Buffered Saline no Calcium, no Magnesium Gibco 14190144
Dumont #5 45° Medical Biology tweezers, 0.05 x 0.01 mm tip, 11 cm length WPI 14101
Ethanol Sigma-Aldrich E7023-500ML
Falcon Easy-Grip Clear Polystyrene Cell Culture Dish, 35mm BD Biosciences 353001
Fetal Bovine Serum Hyclone SH30071.03 Heat inactivated.
Hank’s Balanced Salt Solution plus Calcium and Magnesium, no Phenol Red Life Technologies 14175095
Hank’s Balanced Salt Solution plus Calcium and Magnesium, no Phenol Red B6 Life Technologies 14025092
HEPES 1M Gibco 15630106
Hyaluronidase Sigma-Aldrich H-3506 1G
Hydrocortisone Sigma-Aldrich H-0396
Laminar flow hood Thermo CLASS II A2 4 115V PACKAGECLA
Laminin 1mg/ml Sigma-Aldrich L2020-1 MG Dilute in PBS at 37C to 1mg/ml
McPherson-Vannas Micro Scissors 8 cm long WPI 503216
Non-essential amino acids 100X Gibco 11140050
N1 Supplement 100X Sigma-Aldrich N6530-5ML
Penicillin-Streptomycin Gibco 15140-148
Sterile Bard-Parker Carbon steel surgical blade size 11 Fisher-Scientific 08-914B
Taurine Sigma-Aldrich T-0625
Tissue culture treated 12-well plates Fisher-Scientific 08-772-29
Tissue culture treated 6-well plates Fisher-Scientific 14-832-11
Transwell supports 6.5 mm Sigma-Aldrich CLS3470-48EA
Triiodo-thyronin Sigma-Aldrich T-5516
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red Gibco 25200056
Tweezer, Dumont #5 Medical Biology 11 cm, curved, stainless steel 0.02 x 0.06 mm Mod tips WPI 500232
Vannas Scissors 8cm long, stainless steel WPI 501790
Whatman Puradisc 25mm Syringe Filters 0.45μm pore size Fisher-Scientific 6780-2504

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References

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जीव विज्ञान अंक 168 माउस आरपीई प्राथमिक आरपीई आरपीई संस्कृतियों आरपीई अलगाव नेत्र विकार ध्रुवीकृत आरपीई ट्रांसवेल पर आरपीई माउस नेत्र विच्छेदन
प्राथमिक माउस रेटिना वर्णक एपिथेलियल कोशिकाओं की कुशल विच्छेदन और संस्कृति
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Chinchilla, B., Getachew, H.,… More

Chinchilla, B., Getachew, H., Fernandez-Godino, R. Efficient Dissection and Culture of Primary Mouse Retinal Pigment Epithelial Cells. J. Vis. Exp. (168), e62228, doi:10.3791/62228 (2021).

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