Summary
Denne protokollen, som opprinnelig ble rapportert av Fernandez-Godino et al. i 20161, beskriver en metode for effektivt å isolere og kulturmus RPE-celler, som danner en funksjonell og polarisert RPE monolayer innen en uke på Transwell-plater. Prosedyren tar ca. 3 timer.
Abstract
Øyesykdommer påvirker millioner av mennesker over hele verden, men den begrensede tilgjengeligheten av humant vev hindrer studien deres. Musemodeller er kraftige verktøy for å forstå patofysiologien til okulære sykdommer på grunn av deres likheter med menneskelig anatomi og fysiologi. Endringer i retinal pigment epitel (RPE), inkludert endringer i morfologi og funksjon, er vanlige funksjoner som deles av mange okulære lidelser. Imidlertid er vellykket isolasjon og kultur av primære mus RPE-celler svært utfordrende. Denne artikkelen er en oppdatert audiovisuell versjon av protokollen som tidligere ble publisert av Fernandez-Godino et al. i 2016 for effektivt å isolere og dyrke primære mus RPE-celler. Denne metoden er svært reproduserbar og resulterer i robuste kulturer av svært polariserte og pigmenterte RPE monolayers som kan opprettholdes i flere uker på Transwells. Denne modellen åpner nye veier for studiet av molekylære og cellulære mekanismer som ligger til grunn for øyesykdommer. Videre gir det en plattform for å teste terapeutiske tilnærminger som kan brukes til å behandle viktige øyesykdommer med udekkede medisinske behov, inkludert arvelige netthinneforstyrrelser og makuladegenerasjoner.
Introduction
Denne protokollen, som opprinnelig ble rapportert av Fernandez-Godino et al. i 20161, beskriver en metode for effektivt å isolere og kultur mus retinal pigment epitel (RPE) celler, som danner en funksjonell og polarisert RPE monolayer innen en uke på Transwell plater. RPE er en monolayer som ligger i øyet mellom nevral netthinnen og Bruchs membran. Dette enkeltlaget består av svært polariserte og pigmenterte epitelceller forbundet med tette veikryss, og viser en sekskantet form som ligner en honningkake2. Til tross for denne tilsynelatende histologiske enkelheten, utfører RPE et bredt spekter av funksjoner som er kritiske for netthinnen og den normale visuelle syklusen2,3,4. Hovedfunksjonene til RPE monolayer inkluderer lysabsorpsjon, næring og fornyelse av fotoreseptorer, fjerning av metabolske sluttprodukter, kontroll av ion homeostase i subretinal plass og vedlikehold av blod-retinal barriere2,3. RPE har også en viktig rolle i lokal modulering av immunsystemet i øyet5,6,7,8,9,10,11. Degenerasjon og/eller dysfunksjon av RPE er vanlige trekk som deles av mange okulære lidelser som retinitis pigmentosa, Leber medfødt amaurose, albinisme, diabetisk retinopati og makuladegenerasjon12,13,14,15. Dessverre er tilgjengeligheten av menneskelig vev begrenset. Gitt deres høyt bevarte genetiske homologi med mennesker, representerer musemodeller et passende og nyttig verktøy for å studere okulære lidelser16,17,18,19. Videre gir bruk av kultiverte primære RPE-celler fordeler som genetisk manipulasjon og legemiddeltesting som kan akselerere utviklingen av nye terapier for disse synstruende lidelsene9,11.
Eksisterende metoder tilgjengelig for mus RPE isolasjon og kultur mangler reprodusert og ikke rekapitulere RPE funksjoner in vivo med nok pålitelighet. Celler har en tendens til å miste pigmentering, sekskantet form og transepithelial elektrisk motstand (TER) innen få dager i kultur13,20. Siden etableringen av disse primære RPE-cellekulturene fra mus er en utfordrende prosess, er denne optimaliserte protokollen opprettet basert på andre protokoller for å isolere RPE-celler fra rotte og menneskelige øyne21,22,23 for å dissekere museøyne, samle RPE og kultur musen RPE celler in vitro.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Retningslinjene i ARVO-erklæringen for bruk av dyr i oftalmisk og visjonsforskning ble fulgt.
MERK: Denne metoden har vist seg å være vellykket med mus med forskjellig genetisk bakgrunn, inkludert C57BL/6J, B10. D2-Hco H2d H2-T18c/oSnJ, og albinomus, i ulike aldre. Bruk helst 8 til 12 uker gamle mus for å få RPE-celler. RPE-celler fra eldre mus sprer seg mindre i kultur, og yngre mus har færre og mindre celler, noe som krever at samlende øyne fra forskjellige dyr har levedyktige kulturer.
1. Tilberedning av reagenser og membraninnlegg
- Forbered følgende reagenser.
- Forbered HBSS-H− (HBSS uten kalsium, uten magnesiumbuffer + 10 mM HEPES): Tilsett 1 ml 1 M HEPES til 99 ml HBSS- (uten Ca/Mg)-buffer. Oppbevars ved 4 °C i opptil 1 måned.
- Forbered HBSS-H+ (HBSS med kalsium, med magnesiumbuffer + 10 mM HEPES): Tilsett 1 ml 1 M HEPES til 99 ml HBSS+ (med Ca/Mg)-buffer. Oppbevars ved 4 °C i opptil 1 måned.
- Tilbered hyaluronidaseoppløsning (1 mg/ml): Tilsett 10 mg hyaluronidase til 10 ml HBSS-H− og filtrer det med et 0,4 μm sterilt sprøytefilter ved hjelp av en 10 ml sprøyte. Forbered deg frisk før bruk og la den stå ved romtemperatur (RT; 20-25 °C).
- Forbered FBS-løsning: Bland 20% FBS med HBSS-H +. Tilsett 2 ml FBS til 8 ml HBSS-H+. Forbered deg frisk før bruk.
- Forbered RPE medium: N1 Medium Supplement 1/100 (v/v), glutamin 1/100 (v/v), penicillin-streptomycin 1/100 (v/v) og unødvendig aminosyreoppløsning 1/100 (v/v), hydrokortison (20 μg/L), taurin (250 mg/l) og triiodo-thyronin (0,013 μg/L) i alfa MEM + 5 % FBS eller uten FBS1,23,24. Om ønskelig kan FBS varmeinaktiveres; ingen forskjeller er observert. Forbered deg på RPE-isolasjon. Oppbevars ved 4 °C i opptil 1 måned for vedlikehold av cellekulturen.
- Forbered trypsin-EDTA: Forbered små engangs aliquots (~ 8 ml) ferske trypsin-EDTA (0,25%) og frys dem ved -20 oC. Tine dem ved RT før hver bruk. Unngå fryse-tine sykluser.
- Klargjør membraninnsatsene (f.eks. Transwell-innsatser).
- Likevekt 6,5 mm membraninnsatsene med RPE-medium i minst 30 min ved 37 °C, i en 5 % CO2-luftetinkubator. Bruk en membraninnsats til å frø RPE-celler fra to museøyne.
- Etter inkubasjon, bytt ut mediet av det nedre rommet med 700 μL PBS.
- Fjern mediet fra det øverste rommet og belegge membraninnsatsen med 100 μL 10 μg/ml mus laminin (i PBS) i minst 2 timer ved RT (kortere inkubasjoner kan føre til dårlig festing av cellene til innsatsen).
- Belegge en ekstra membraninnsats som skal brukes som blank for TER-målinger.
2. Disseksjon og enucleation av museøyne
- Avlive musene ved CO2-kvelning ved å plassere dem i et CO2-kammer og sakte slippe ut CO2 med en fyllingshastighet på 30-70% av kammervolumet per minutt.
- Plasser de vinklede, taggete spissene av mikro-tang på hver side av museøyet og trykk forsiktig for å proptose øyebollet (enucleation).
- Lukk tangene som er plassert rundt øyebollet. Trekk deretter forsiktig mens du beveger deg fremover og bakover for å løsne hele øyet med synsnerven fra okulære muskler, og sørg for at ingen bindevev forblir festet til scleraen.
- Skyll det enuslede øyebollet i 70 % etanol før du legger dem i en brønn på en seksbrønnsplate med 3 ml HBSS-H− på is.
- Gjenta trinn 2.2 til 2.4 for å fjerne det andre øyet på musen. Fortsett med de neste trinnene innen 30 minutter.
MERK: Det anbefales å bare enuksere/dissekere to øyne om gangen til noe erfaring er anskaffet.
3. Innsamling av RPE
MERK: Utfør følgende trinn under sterile forhold i en laminær strømningshette. For å unngå utvidede inkubasjoner på is, noe som kan føre til RPE-celledød, må du ikke samle mer enn to øyne om gangen.
- Bruk et dissekerende stereomikroskop, Dumont #5 tang og vinklet saks for å forsiktig rense bort alt bindevev, blod og muskler som er igjen festet til øyebollet uten å gjøre noen kutt i scleraen. Endre 3 ml HBSS-H-buffer regelmessig etter behov for å holde øyet friskt og rent, og unngå forurensning av RPE-kulturene.
- Bruk synsnerven som håndtak for å holde øyebollet og lage et hull i midten av hornhinnen med et skarpt karbonstålblad #11.
- Bruk Dumont #5 saks til å lage tre snitt i hornhinnen gjennom det nevnte hullet, og sørg for at det er tilstrekkelig plass til å fjerne linsen.
- Hold synsnerven og legg et lite trykk på ora serrataen med bunnen av den vinklede saksen til linsen kommer helt ut. La iris epitelet være på plass for å forhindre løsrivelse av nevral netthinnen og RPE under inkubasjon. Plasser øyet i HBSS-H-buffer.
- Gjenta trinn 3.1-3.4 for å dissekere det andre øyet.
- Inkuber øynene uten linser i hyaluronidase-oppløsning i en 12-brønnsplate ved 37 °C i 45 minutter i en 5 % CO2-luftetinkubator (1,5 ml/brønn) for å løsne den nevrale netthinnen fra RPE.
- Plasser hvert øye i en ny brønn og inkuber det på is i 30 min med 1,5 ml kald HBSS-H + buffer per brønn for å stoppe hyaluronidaseaktiviteten. Ikke utvid inkubasjonen i mer enn 45 min.
- Vask og legg hvert øye i en 35 mm kulturrett med fersk HBSS-H + buffer og kutt hornhinnen gjennom de opprinnelige snittene til du når ora serrata ved hjelp av 8 cm Vannas saks. Klipp deretter under ora serrata for å fjerne iris epitel og hornhinne.
- Hold øyemuskekanten/ora serrataen med buede pinsett, og trekk bort den nevrale netthinnen ved hjelp av vinklede mikrostyrker, og sørg for at RPE-laget ikke kuttes. Klipp deretter det indre vedlegget til synsnerven. Hvis noen RPE-celler forblir festet til nevral netthinnen, forlenge inkubasjonstiden, men ikke overstige 45 min totalt.
- Klipp synsnerven og overfør hver øyecup til en annen 12-brønns plate som inneholder 1,5 ml fersk trypsin-EDTA per brønn. Pass på at øyemuspene forblir åpne og helt nedsenket i trypsin. Inkuber øyeklokkene ved 37 °C i 45 minutter i en 5 % CO 2-inkubator.
- Samle hver øyecup sammen med eventuelle RPE ark løsrevet under trypsin inkubasjon og overføre dem til en 12-brønns plate som inneholder 1,5 ml FBS-løsning per brønn. Hvis RPE-arkene forblir i trypsinløsningen, bruk en mikropipette for å overføre dem til brønnen med FBS-løsning.
4. Isolering av primære mus RPE celler
- Hold hver øyeklokke ved synsnerven og rist den med forsiden ned i 12-brønnsplaten som inneholder 1,5 ml 20% FBS i HBSS-H + til fullstendig løsrivelse av RPE-arkene er oppnådd.
- Samle eventuelle RPE-ark og RPE-klynger med en mikropipette og legg dem i et 15 ml rør. Unngå hvite biter av sclera eller choroid, noe som kan forurense kulturene. Basseng to øyne fra samme mus i ett rør.
- Sentrifuger blandingen på 340 x g i 2 min ved RT og kast supernatanten.
- Resuspend RPE-pelletsen forsiktig i 1 ml trypsin-EDTA (0,25 %) og inkuber blandingen i 1 min i et vannbad ved 37 °C for å dele opp RPE-arkene i enkeltceller. Etter inkubasjon, forsiktig pipet opp og ned 10x med en mikropipette, unngå bobledannelse under pipettering.
- Tilsett 9 ml nylaget RPE-medium for å fortynne og inaktivere trypsin og sentrifuger blandingen ved 340 x g i 2 minutter ved RT.
- Aspirer den supernatante og forsiktig resuspend cellepellet i 150 μL RPE medium med 5% FBS ved hjelp av en mikropipette, slik at cellene er homogent resuspendert og unngå bobledannelse mens pipettering.
- Ta lamininbelagt membraninnsats fra trinn 1.2, fjern PBS fra bunnkammeret og tilsett 700 μL RPE-medium.
- Fjern lamininet fra det øvre kammeret i membraninnsatsen og fordel RPE-celleopphenget dråpevis og jevnt til midten av kammeret, og unngå bobledannelse under pipettering.
- Plasser membraninnsatsen i en 5% CO2 inkubator ved 37 °C og la den stå uforstyrret i minst 24 timer.
- Etter 24 timer kontrollerer du membraninnsatsen under mikroskopet for å sikre at de fleste RPE-celler er festet til innsatsen og at samløpet er minst 50 % (figur 1A). Det er viktig å ikke bytte medium i løpet av de første 72 timer.
5. Kultur av polariserte RPE monolayers
- Oppretthold de isolerte RPE-cellene i kultur i minst 72 timer før du oppdaterer RPE-mediet for å tillate cellevedlegg. En cellesamfluens på 50% eller mer ved såing er grunnleggende for dannelsen av en egnet polarisert RPE-monolayer.
- Endre kulturmediet to ganger i uken ved hjelp av ferskt og forvarmet RPE-medium (trinn 1.1.5) etter at cellene er festet. Serum kan fjernes fra kulturmediet etter de første 72 timer.
MERK: Etter en uke i kulturen skal cellene være sammenfølende, sekskantede, bi-nukleerte, pigmenterte og polariserte (Figur 1B), med forventede celletall som er rundt 50.000 celler per 6,5 mm Transwell-innsats. Etter to uker i kultur observeres RPE-monolayers bestående av friske celler. RPE-kulturer viser apikale mikrovilli-, basale infoldinger og tette veikryss (Figur 1C).
6. TER-måling
MERK: Utfør TER-målinger av RPE-cellene etter minst 4 dager i kulturen for å sikre god integritet og polarisering av RPE-monolayeren.
- Rengjør elektrodene på voltohmmeteret med 70% etanol og tørk dem forsiktig.
- Ta transwells fra inkubatoren og utfør TER-måling innen 3 min for å unngå endringer på grunn av temperatursvingninger. For å måle TER, senk den korte elektroden til voltohmmeteret i det øvre kammeret og den lange elektroden i bunnkammeret på membraninnsatsen. Unngå kontakt med RPE-monolayeren for å forhindre celleavløsning.
- For å beregne TER, trekk verdien av det tomme (membraninnsats belagt med laminin uten celler) fra prøven. Deretter multipliserer du den oppnådde verdien (i ohm) med overflaten av membraninnsatsen (0,33 cm2 i tilfelle 6,5 mm membraninnsats). Produktet skal være minst 200 Ω x cm2 etter 72 timer i kultur. TER-verdier skal måle over 400 Ω x cm2 etter to uker. Kast RPE-kulturer med lave TER-verdier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Denne protokollen har blitt brukt til å isolere og dyrke RPE-celler fra genetisk modifiserte mus1. Det er ikke observert forskjeller mellom musestammer eller kjønn. Resultatene har bidratt til å forstå noen viktige aspekter av mekanismen som ligger til grunn for okulære sykdommer som aldersrelatert makuladegenerasjon, som er den vanligste årsaken til synstap blant eldre9. RPE-celler isolert etter denne protokollen var helt festet til membraninnsatsen 24 timer etter sådd og viste den typiske RPE-størrelsen, morfologien og pigmenteringen etter 72 h1. Etter en uke ble en svært polarisert RPE monolayer dannet av sekskantede pigmenterte RPE-celler med to kjerner forbundet med tette veikryss som uttrykker ZO-1 (Figur 1C, 2). Transmisjonselektronmikrografer avslører tilstedeværelsen av apikale mikrovilli- og basale infoldinger (figur 1C). Polariseringen av RPE-monolageren ble bekreftet av TER-verdier med gjennomsnittlig høyere enn 200 Ω x cm2, som holdt seg stabil over tid (figur 2).
Funksjonell validering av denne metoden ble utført gjennom fagocytoseanalyser. Mus RPE-celler ble dyrket på membraninnlegg og matet med FITC-merket bovine POS. POS-engulfment og fordøyelse ble demonstrert ved fluorescerende mikroskopi (Figur 3).
Figur 1. RPE-celler på forskjellige tidspunkter. (A) 10x brightfield mikrografer av RPE celler 24 h post seeding på membranen innsatser, og (B) etter en uke. (C) Transmisjonselektronmikrografer viser apikale mikrovilli-, basale infoldinger og melaninpigmenter (svarte flekker) av RPE dyrket på membraninnsatsene i to uker. Skalastenger: A, B: 100 μm, C: 2 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2. TER over tid. Den transepitheliale elektriske motstanden (TER) av ~60 primærmus RPE cellekulturer på membraninnlegg ble målt etter 0,5 (n = 33), 1 (n = 58), 1,5 (n = 54) og 2 (n = 60) uker. TER når over 200 Ω x cm2 med 72 timer og forblir stabil i minst to uker. Data representert som enkeltverdier med gjennomsnittlig ± SD. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3. Fagocytoseanalyser. 40x fluorescerende mikrografer av primærmus RPE kulturer matet med FITC-merket bovine POS (grønn) i to timer og festet med metanol25. Mindre fragmenter tilsvarer fordøyd POS inne i cellens cytoplasma. Visualisering av tette veikryss (rød) ble tilrettelagt ved immunstaining med antistoffer anti-ZO1 som tidligere beskrevet1,9. DAPI (blå) ble brukt til å flekke kjerner. Typiske mus RPE celler med to kjerner kan observeres i midten av bildet. Skalalinje: 50 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Mens flere metoder for mus RPE celleisolasjon og kultur hadde blitt utviklet før1,13,20,22,26,27, Fernandez-Godino metode først brukt membran innsatser slik at effektiv vekst av RPE celler i kultur i uke1,9. En annen stor endring i deres protokoll1,9 var bruk av enzymatiske løsninger i stedet for mekanisk peeling for å fjerne RPE-cellene1,13,20,26. Linsene ble fjernet gjennom et snitt i hornhinnen, slik at irisepitelet var intakt og bevarte netthinnens integritet under den første inkubasjonen. Den milde isolasjonen av RPE-cellene kombinert med bruk av membraninnlegg og spesifikt RPE-medium23 resulterer i en forbedret celleoverlevelse, noe som forbedrer dannelsen av et funksjonelt sammenfallende monolayer som etterligner de fysiologiske forholdene til RPE innen få dager i kultur2. Vanligvis viser primære mus RPE-celler dyrket med denne metoden sekskantet morfologi, polarisering, pigmentering, barriereegenskaper og spredning. Videre kan RPE dyrkes i fravær av serum fra dag tre til flere uker, noe som er viktig for å studere komplementrelaterte RPE-patologier9.
En begrensning i denne protokollen er at primære RPE-celler for mus som dyrkes på membraninnlegg, ikke kan utvides. Passivering av primære mus RPE-celler med enzymatiske løsninger eller dyrking av dem i lang tid resulterer i tap av pigmentering, de-differensiering og redusert TER, og dermed mister egenskapene som ligner in vivo-funksjoner. Den begrensede mengden RPE-celler hentet fra ett dyr forplikter seg til å samle prøver fra forskjellige dyr for transkripsjons- og proteomiske analyser, der relativt store mengder startmateriale er nødvendig. Det anbefales ikke å skalere opp RPE-kulturene ved å samle flere øyne i en større membraninnsats, da det kan føre til en høyere prosentandel av celledød og flerlags RPE-kulturer.
Det er også noen kritiske trinn i protokollen. Ikke mer enn to øyne bør høstes samtidig til noe erfaring er aquired, siden en lengre disseksjonstid resulterer i en høyere prosentandel av celledød. Synsnerven må bare kuttes bort før inkubasjonen med trypsin. Det er viktig å håndtere øyemuspen uten å forstyrre RPE-cellene, men synsnerven blir fordøyd av trypsin, noe som fører til urenheter i RPE-kulturene. Peeling av okulære muskler må utføres med forsiktighet. Hvis sclera er perforert og den nevrale netthinnen spretter ut, må øyet kastes fordi RPE-cellene blir skadet og ikke vil overleve. Minimalt trykk bør påføres for å fjerne linsene. Det er å foretrekke å utføre et større hornhinnen snitt. Det er kritisk at øyemusken er åpen og helt nedsenket i trypsin slik at alle RPE-cellene blir utsatt for løsningen. RPE-cellene må samles opp gjennom forsiktig risting av øyemuskulalet, og aldri ved å sprøyte medier eller skrelle dem mekanisk.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer at de ikke har konkurrerende økonomiske interesser.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av Ocular Genomics Institute ved Massachusetts Eye and Ear.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 ml BD Luer-Lok tip syringe, disposable | BD Biosciences | 309604 | |
| 15 ml centrifuge tube | VWR International | 21008-103 | |
| 50 ml centrifuge tube | VWR International | 21008-951 | |
| Alpha Minimum Essential Medium | Sigma-Aldrich | M4526-500ML | |
| Angled micro forceps | WPI | 501727 | |
| Bench-top centrifuge | any | ||
| CO2 incubator | Thermo | HERA VIOS 160I CO2 SST TC 120V | |
| Dissecting microscope | Any | ||
| Dulbecco’s Phospate Buffered Saline no Calcium, no Magnesium | Gibco | 14190144 | |
| Dumont #5 45° Medical Biology tweezers, 0.05 x 0.01 mm tip, 11 cm length | WPI | 14101 | |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | E7023-500ML | |
| Falcon Easy-Grip Clear Polystyrene Cell Culture Dish, 35mm | BD Biosciences | 353001 | |
| Fetal Bovine Serum | Hyclone | SH30071.03 | Heat inactivated. |
| Hank’s Balanced Salt Solution plus Calcium and Magnesium, no Phenol Red | Life Technologies | 14175095 | |
| Hank’s Balanced Salt Solution plus Calcium and Magnesium, no Phenol Red B6 | Life Technologies | 14025092 | |
| HEPES 1M | Gibco | 15630106 | |
| Hyaluronidase | Sigma-Aldrich | H-3506 1G | |
| Hydrocortisone | Sigma-Aldrich | H-0396 | |
| Laminar flow hood | Thermo | CLASS II A2 4 115V PACKAGECLA | |
| Laminin 1mg/ml | Sigma-Aldrich | L2020-1 MG | Dilute in PBS at 37C to 1mg/ml |
| McPherson-Vannas Micro Scissors 8 cm long | WPI | 503216 | |
| Non-essential amino acids 100X | Gibco | 11140050 | |
| N1 Supplement 100X | Sigma-Aldrich | N6530-5ML | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-148 | |
| Sterile Bard-Parker Carbon steel surgical blade size 11 | Fisher-Scientific | 08-914B | |
| Taurine | Sigma-Aldrich | T-0625 | |
| Tissue culture treated 12-well plates | Fisher-Scientific | 08-772-29 | |
| Tissue culture treated 6-well plates | Fisher-Scientific | 14-832-11 | |
| Transwell supports 6.5 mm | Sigma-Aldrich | CLS3470-48EA | |
| Triiodo-thyronin | Sigma-Aldrich | T-5516 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Gibco | 25200056 | |
| Tweezer, Dumont #5 Medical Biology 11 cm, curved, stainless steel 0.02 x 0.06 mm Mod tips | WPI | 500232 | |
| Vannas Scissors 8cm long, stainless steel | WPI | 501790 | |
| Whatman Puradisc 25mm Syringe Filters 0.45μm pore size | Fisher-Scientific | 6780-2504 |
References
- Fernandez-Godino, R., Garland, D. L., Pierce, E. A. Isolation, culture and characterization of primary mouse RPE cells. Nature Protocols. 11 (7), 1206-1218 (2016).
- Strauss, O. The retinal pigment epithelium in visual function. Physiological Reviews. 85 (3), 845-881 (2005).
- Konari, K., et al. Development of the blood-retinal barrier in vitro: Formation of tight junctions as revealed by occludin and ZO-1 correlates with the barrier function of chick retinal pigment epithelial cells. Experimental Eye Research. 61 (1), 99-108 (1995).
- Kay, P., Yang, Y. C., Paraoan, L. Directional protein secretion by the retinal pigment epithelium: Roles in retinal health and the development of age-related macular degeneration. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 17 (7), 833-843 (2013).
- Johnson, L. V., Leitner, W. P., Staples, M. K., Anderson, D. H. Complement activation and inflammatory processes in drusen formation and age related macular degeneration. Experimental Eye Research. 73 (6), 887-896 (2001).
- Hageman, G. S., et al. An integrated hypothesis that considers drusen as biomarkers of immune-mediated processes at the RPE-Bruch's membrane interface in aging and age-related macular degeneration. Progress in Retinal and Eye Research. 20 (6), 705-732 (2001).
- Lommatzsch, A., et al. Are low inflammatory reactions involved in exudative age-related macular degeneration. Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 246 (6), 803-810 (2008).
- Bandyopadhyay, M., Rohrer, B. Matrix metalloproteinase activity creates pro-angiogenic environment in primary human retinal pigment epithelial cells exposed to complement. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (4), 1953-1961 (2012).
- Fernandez-Godino, R., Garland, D. L., Pierce, E. A. A local complement response by RPE causes early-stage macular degeneration. Human Molecular Genetics. 24 (19), 5555-5569 (2015).
- Fernandez-Godino, R., Bujakowska, K. M., Pierce, E. A. Changes in extracellular matrix cause RPE cells to make basal deposits and activate the alternative complement pathway. Human Molecular Genetics. 27 (1), 147-159 (2018).
- Fernandez-Godino, R., Pierce, E. A. C3a triggers formation of sub-retinal pigment epithelium deposits via the ubiquitin proteasome pathway. Scientific Reports. 8 (1), 1-14 (2018).
- Farkas, M. H., et al. Mutations in Pre-mRNA processing factors 3, 8, and 31 cause dysfunction of the retinal pigment epithelium. American Journal of Pathology. 184 (10), 2641-2652 (2014).
- Geisen, P., Mccolm, J. R., King, B. M., Hartnett, E. Characterization of Barrier Properties and Inducible VEGF Expression of Several Types of Retinal Pigment Epithelium in Medium-Term Culture. Current Eye Research. 31, 739 (2006).
- Schütze, C., et al. Retinal pigment epithelium findings in patients with albinism using wide-field polarization-sensitive optical coherence tomography. Retina. 34 (11), 2208-2217 (2014).
- Samuels, I. S., Bell, B. A., Pereira, A., Saxon, J., Peachey, N. S. Early retinal pigment epithelium dysfunction is concomitant with hyperglycemia in mouse models of type 1 and type 2 diabetes. Journal of Neurophysiology. 113 (4), 1085-1099 (2015).
- Garland, D. L., et al. Mouse genetics and proteomic analyses demonstrate a critical role for complement in a model of DHRD/ML, an inherited macular degeneration. Human Molecular Genetics. 23 (1), 52-68 (2014).
- Fu, L., et al. The R345W mutation in EFEMP1 is pathogenic and causes AMD-like deposits in mice. Human Molecular Genetics. 16 (20), 2411-2422 (2007).
- Greenwald, S. H., et al. Mouse Models of NMNAT1-Leber Congenital Amaurosis (LCA9) Recapitulate Key Features of the Human Disease. American Journal of Pathology. 186 (7), 1925-1938 (2016).
- Gupta, P. R., et al. Ift172 conditional knock-out mice exhibit rapid retinal degeneration and protein trafficking defects. Human Molecular Genetics. 27 (11), 2012-2024 (2018).
- Gibbs, D., Williams, D. S. Isolation and culture of primary mouse retinal pigmented epithelial cells. Advances in Experimental Medicine and Biology. 533, 347-352 (2003).
- Bonilha, V. L., Finnemann, S. C., Rodriguez-Boulan, E. Ezrin promotes morphogenesis of apical microvilli and basal infoldings in retinal pigment epithelium. Journal of Cell Biology. 147 (7), 1533-1547 (1999).
- Nandrot, E. F., et al. Loss of synchronized retinal phagocytosis and age-related blindness in mice lacking αvβ5 integrin. Journal of Experimental Medicine. 200 (12), 1539-1545 (2004).
- Maminishkis, A., et al. Confluent monolayers of cultured human fetal retinal pigment epithelium exhibit morphology and physiology of native tissue. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 47 (8), 3612-3624 (2006).
- Maminishkis, A., Miller, S. S. Experimental models for study of retinal pigment epithelial physiology and pathophysiology. Journal of Visualized Experiments. (45), (2010).
- Brydon, E. M., et al. AAV-Mediated Gene Augmentation Therapy Restores Critical Functions in Mutant PRPF31+/− iPSC-Derived RPE Cells. Molecular Therapy - Methods and Clinical Development. 15, 392-402 (2019).
- Shang, P., Stepicheva, N. A., Hose, S., Zigler, J. S., Sinha, D. Primary cell cultures from the mouse retinal pigment epithelium. Journal of Visualized Experiments. 2018 (133), (2018).
- Bonilha, V. Age and disease-related structural changes in the retinal pigment epithelium. Clinical Ophthalmology. 2 (2), 413 (2008).
