Summary
Detta protokoll, som ursprungligen rapporterades av Fernandez-Godino et al. 20161, beskriver en metod för att effektivt isolera och odla mus RPE-celler, som bildar en funktionell och polariserad RPE monolayer inom en vecka på Transwell-plattor. Proceduren tar cirka 3 timmar.
Abstract
Ögonsjukdomar påverkar miljontals människor över hela världen, men den begränsade tillgången på mänskliga vävnader hindrar deras studie. Musmodeller är kraftfulla verktyg för att förstå patofysiologin hos okulärsjukdomar på grund av deras likheter med mänsklig anatomi och fysiologi. Förändringar i retinal pigment epitel (RPE), inklusive förändringar i morfologi och funktion, är vanliga funktioner som delas av många okulär störningar. Framgångsrik isolering och kultur av primära mus RPE-celler är dock mycket utmanande. Detta dokument är en uppdaterad audiovisuell version av protokollet som tidigare publicerades av Fernandez-Godino m.fl. 2016 för att effektivt isolera och odla primära mus RPE-celler. Denna metod är mycket reproducerbar och resulterar i robusta kulturer av högpolariserade och pigmenterade RPE monolager som kan bibehållas i flera veckor på Transwells. Denna modell öppnar nya vägar för studier av de molekylära och cellulära mekanismerna bakom ögonsjukdomar. Dessutom ger det en plattform för att testa terapeutiska metoder som kan användas för att behandla viktiga ögonsjukdomar med ouppfyllda medicinska behov, inklusive ärvda näthinnesjukdomar och makuladegenerationer.
Introduction
Detta protokoll, som ursprungligen rapporterades av Fernandez-Godino et al. 20161, beskriver en metod för att effektivt isolera och odla mus näthinnepigmentepiteler (RPE) celler, som bildar en funktionell och polariserad RPE monolayer inom en vecka på Transwell plattor. RPE är ett monoskikt som ligger i ögat mellan neurala näthinnan och Bruchs membran. Detta enda lager består av mycket polariserade och pigmenterade epitelceller förenade av snäva korsningar, som uppvisar en sexkantig form som liknar enbikake 2. Trots denna uppenbara histologiska enkelhet utför RPE en mängd olika funktioner som är kritiska för näthinnan och den normala visuella cykeln2,3,4. RPE-monoskiktets huvudfunktioner inkluderar ljusabsorption, näring och förnyelse av fotoreceptorer, avlägsnande av metabola slutprodukter, kontroll av jonhomeostas i subretinalutrymmet och underhåll av blodretinalbarriären2,3. RPE har också en viktig roll i lokal modulering av immunsystemet i ögat5,6,7,8,9,10,11. Degeneration och/eller dysfunktion av RPE är vanliga funktioner som delas av många okulär störningar såsom retinitis pigmentosa, Leber medfödd amauris, albinism, diabetiker retinopati och makuladegeneration12,13,14,15. Tyvärr är tillgången på mänskliga vävnader begränsad. Med tanke på deras mycket bevarade genetiska homologi med människor representerar musmodeller ett lämpligt och användbart verktyg för att studera okulär störningar16,17,18,19. Dessutom ger användningen av odlade primära RPE-celler fördelar som genetisk manipulation och läkemedelstestning som kan påskynda utvecklingen av nya terapier för dessa synhotande sjukdomar9,11.
Befintliga metoder för mus RPE-isolering och kultur saknar reproducerbart och rekapitulerar inte RPE-funktionerna in vivo med tillräcklig tillförlitlighet. Celler tenderar att förlora pigmentering, sexkantig form och transepithelial elektrisk resistans (TER) inom några dagar i kultur13,20. Sedan dessa primära RPE-cellkulturer från möss etableras är en utmanande process, har detta optimerade protokoll skapats baserat på andra protokoll för att isolera RPE-celler från råtta och mänskliga ögon21,22,23 för att dissekera musögonen, samla RPE och odla musens RPE-celler in vitro.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Riktlinjerna i ARVO:s uttalande om användning av djur inom oftalmisk forskning och synforskning följdes.
OBS: Denna metod har visat sig framgångsrik med möss med olika genetisk bakgrund, inklusive C57BL/6J, B10. D2-Hco H2d H2-T18c/oSnJ och albino möss, i olika åldrar. Använd helst 8 till 12 veckor gamla möss för att få RPE-celler. RPE-celler från äldre möss förökar sig mindre i kulturen och yngre möss har färre och mindre celler, vilket kräver att man slår samman ögon från olika djur för att ha livskraftiga kulturer.
1. Beredning av reagenser och membraninsatser
- Förbered följande reagenser.
- Förbered HBSS-H− (HBSS utan kalcium, utan magnesiumbuffert + 10 mM HEPES): Tillsätt 1 ml 1 M HEPES till 99 ml HBSS- (utan Ca/Mg) buffert. Förvara vid 4 °C upp till 1 månad.
- Förbered HBSS-H+ (HBSS med kalcium, med magnesiumbuffert + 10 mM HEPES): Tillsätt 1 ml 1 M HEPES till 99 ml HBSS+ (med Ca/Mg) buffert. Förvara vid 4 °C upp till 1 månad.
- Bered hyaluronidaselösning (1 mg/ml): Tillsätt 10 mg hyaluronidase till 10 ml HBSS-H− och filtrera den med ett sterilt sprutfilter på 0,4 μm med en 10 ml spruta. Förbered färsk före användning och lämna den i rumstemperatur (RT; 20-25 °C).
- Förbered FBS-lösningen: Blanda 20% FBS med HBSS-H+. Tillsätt 2 ml FBS till 8 ml HBSS-H+. Förbered färskt före användning.
- Förbered RPE medium: N1 Medium Supplement 1/100 (v/v), glutamin 1/100 (v/v), penicillin-streptomycin 1/100 (v/v) och icke-nödvändig aminosyralösning 1/100 (v/v), hydrokortison (20 μg/L), taurin (250 mg/L) och triiodo-thyronin (0,013 μg/L) i alfa MEM + 5% FBS eller utan FBS1,23,24. Om så önskas kan FBS vara värmeinaktiverat; inga skillnader har observerats. Förbered dig på RPE-isolering. För underhåll av cellkultur, förvara vid 4 °C upp till 1 månad.
- Förbered trypsin-EDTA: Förbered små alikvoter för engångsbruk (~8 ml) färska trypsin-EDTA (0,25 %) och frysa dem vid -20 oC. Tina dem på RT före varje användning. Undvik frys-tina cykler.
- Förbered membraninsatserna (t.ex. Transwell-skär).
- Balansera membraninsatserna på 6,5 mm med RPE-medium i minst 30 minuter vid 37 °C, i en 5% CO2-aereradinkubator. Använd ett membraninlägg för att dirigera RPE-celler från två musögon.
- Efter inkubation, byt ut mediet i det nedre facket med 700 μL PBS.
- Ta bort mediet från det övre facket och täck membraninsatsen med 100 μL 10 μg/ml mus laminin (i PBS) i minst 2 timmar vid RT (kortare inkubationer kan leda till dålig fastsättning av cellerna på insatsen).
- Täck en extra membraninsats för att använda som ett tomrum för TER-mätningar.
2. Dissekering och enucleation av musögonen
- Avliva mössen med CO2-kvävning genom att placera dem i en CO2-kammare och långsamt släppa ut CO2 med en fyllningshastighet på 30-70% av kammarens volym per minut.
- Placera de vinklade, räfflade spetsarna av mikrotångor på varje sida av musögat och tryck försiktigt för att stödja ögongloben (enucleation).
- Stäng tången som placeras runt ögongloben. Dra sedan försiktigt medan du går framåt och bakåt för att lossa hela ögat med synnerven från okulärmusklerna, vilket säkerställer att ingen bindväv förblir fäst vid sclera.
- Skölj den enucleated ögongloben i 70% etanol innan du placerar dem i en brunn av en sex-brunnsplatta med 3 ml HBSS-H− på is.
- Upprepa steg 2.2 till 2.4 för att ta bort musens andra öga. Fortsätt med nästa steg inom 30 minuter.
OBS: Det rekommenderas att man aucleating/ dissekerar endast två ögon i taget tills någon erfarenhet har förvärvats.
3. Insamling av RPE
OBS: Utför följande steg under sterila förhållanden i en laminär flödeshuv. För att undvika förlängda inkubationer på is, vilket kan leda till RPE-celldöd, samla inte in mer än två ögon åt gången.
- Använd ett dissekerande stereomikroskop, Dumont #5 tång och vinklad sax för att noggrant rengöra bort all bindväv, blod och muskler som finns kvar på ögongloben utan att göra några nedskärningar i skleran. Byt 3 ml HBSS-H− buffert regelbundet, efter behov, för att hålla ögat friskt och rent och undvika förorening av RPE-kulturerna.
- Använd synnerven som handtag för att hålla ögongloben och göra ett hål i mitten av hornhinnan med ett skarpt kolstålsblad #11 bladet.
- Använd Dumont #5 sax för att göra tre snitt i hornhinnan genom ovannämnda hål, vilket säkerställer att det finns tillräckligt med utrymme för att ta bort linsen.
- Håll optiknerven och tryck lätt på ora serratan med basen av den vinklade saxen tills linsen kommer ut helt. Lämna iris epitel på plats för att förhindra avlossning av neurala näthinnan och RPE under inkubation. Placera ögat i HBSS-H-bufferten.
- Upprepa steg 3.1-3.4 för att dissekera det andra ögat.
- Inkubera ögonen utan linser i hyaluronidaselösning i en 12-brunnsplatta vid 37 °Ci 45 min i en 5% CO 2-aerated inkubator (1,5 mL/brunn) för att lossa neurala näthinnan från RPE.
- Placera varje öga i en ny brunn och inkubera det på is i 30 min med 1,5 ml kall HBSS-H+ buffert per brunn för att stoppa hyaluronidaseaktiviteten. Förläng inte inkubationen längre än 45 minuter.
- Tvätta och placera varje öga i en 35 mm odlingsform med färsk HBSS-H+-buffert och skär hornhinnan genom de ursprungliga snitten tills du når ora serratan med hjälp av 8 cm Vannas sax. Skär sedan under ora serrata för att ta bort iris epitel och hornhinna.
- Håll ögonlockskanten/ora serratan med böjda pincett och dra med vinklade mikroforceps bort neurala näthinnan och se till att RPE-skiktet inte skärs. Skär sedan den inre fästanordningen på synnerven. Om vissa RPE-celler förblir fästa vid neurala näthinnan, förläng inkubationstiden men överskrid inte totalt 45 min.
- Skär synnerven och överför varje ögonkopp till en annan 12-brunnsplatta som innehåller 1,5 ml färsk trypsin-EDTA per brunn. Se till att ögonkopparna förblir öppna och helt nedsänkta i trypsin. Inkubera ögonkopparna vid 37 °C i 45 min i en 5% CO2 inkubator.
- Samla varje ögonkopp tillsammans med eventuella RPE-ark som lossnar under trypsininkubationen och överför dem till en 12-brunnsplatta som innehåller 1,5 ml FBS-lösning per brunn. Om RPE-ark finns kvar i trypsinlösningen, använd en mikropipett för att överföra dem till brunnen med FBS-lösning.
4. Isolering av primära musens RPE-celler
- Håll varje ögonkrok vid synnerven och skaka den med ansiktet nedåt i 12-brunnsplattan som innehåller 1,5 ml 20% FBS i HBSS-H+ tills den fullständiga lossningen av RPE-arken uppnås.
- Samla alla RPE-ark och RPE-kluster med en mikropipett och placera dem i ett 15 ml-rör. Undvik vita bitar av sclera eller choroid, som kan förorena kulturerna. Slå samman två ögon från samma mus i ett rör.
- Centrifugera blandningen vid 340 x g i 2 min vid RT och kassera supernaten.
- Återanvänd försiktigt RPE-pelleten i 1 ml trypsin-EDTA (0,25 %) och inkubera blandningen i 1 min i ett vattenbad vid 37 °C för att dela upp RPE-arken i enstaka celler. Efter inkubation, rör försiktigt upp och ner 10x med en mikropipett, undvik bubbelbildning under pipetting.
- Tillsätt 9 ml nyberedd RPE-medium för att späda ut och inaktivera trypsin och centrifugera blandningen vid 340 x g i 2 minuter vid RT.
- Aspirera supernatanten och återanvänd försiktigt cellpelleten i 150 μL RPE-medium med 5% FBS med hjälp av en mikropipett, vilket säkerställer att cellerna är homogent återanvända och undviker bubbelbildning under pipetting.
- Ta lamininbelagd membraninsats från steg 1.2, ta bort PBS från bottenkammaren och tillsätt 700 μL RPE-medium.
- Ta bort laminin från membranets övre kammare och fördela RPE-cellupphängningen droppe och jämnt till mitten av kammaren, undvik bubbelbildning under pipetting.
- Placera membraninsatsen i en 5% CO 2-inkubator vid 37 °C och lämna den ostörd i minst 24 timmar.
- Efter 24 timmar, kontrollera membraninsatsen under mikroskopet för att se till att de flesta RPE-celler är fästa vid insatsen och att sammanflödet är minst 50 % (figur 1A). Det är viktigt att inte byta media under de första 72 h.
5. Kultur av polariserade RPE monolayers
- Underhåll de isolerade RPE-cellerna i kultur i minst 72 timmar innan du uppdaterar RPE-mediet för att tillåta celltillbehör. En cellkonfluens på 50% eller mer vid sådd är grundläggande för bildandet av ett lämpligt polariserat RPE monoskikt.
- Byt odlingsmedium två gånger i veckan med färskt och förvärmt RPE-medium (steg 1.1.5) efter att cellerna har fästs. Serum kan avlägsnas från odlingsmediet efter de första 72 h.
OBS: Efter en vecka i kultur bör cellerna vara konfluenta, sexkantiga, bikärnade, pigmenterade och polariserade (Figur 1B), med förväntade cellnummer som är cirka 50 000 celler per 6,5 mm Transwellinsats. Efter två veckor i kultur observeras RPE monolayers bestående av friska celler. RPE-kulturer visar apical microvilli, basala infoldings och snäva korsningar(figur 1C).
6. TER-mätning
OBS: Utför TER-mätningar av RPE-cellerna efter minst 4 dagar i kultur för att säkerställa en god integritet och polarisering av RPE-monoskiktet.
- Rengör voltohmmeterns elektroder med 70% etanol och torka dem försiktigt.
- Ta transwells från inkubatorn och utför TER-mätning inom 3 min för att undvika förändringar på grund av temperaturfluktuationer. För att mäta TER, sänk ner voltohmmeterns korta elektrod i den övre kammaren och den långa elektroden i membranets bottenkammare. Undvik kontakt med RPE-monoskiktet för att förhindra cellavlossning.
- För att beräkna TER, dra av värdet på blindprovet (membraninsats belagd med laminin utan celler) från provet. Multiplicera sedan det erhållna värdet (i ohm) med membraninsatsens yta (0,33 cm2 vid 6,5 mm membraninsats). Produkten ska vara minst 200 Ω x cm2 efter 72 h i kultur. TER-värdena bör mäta över 400 Ω x cm2 efter två veckor. Kassera RPE-kulturer med låga TER-värden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Detta protokoll har använts för att isolera och odla RPE-celler från genetiskt modifierade möss1. Inga skillnader har observerats mellan musstammar eller kön. Resultaten har bidragit till att förstå några viktiga aspekter av mekanismen bakom okulär sjukdomar såsom åldersrelaterad makuladegeneration, som är den vanligaste orsaken till synförlust bland äldre9. RPE celler isolerade efter detta protokoll var helt bifogas membranet infoga 24 timmar efter sådd och visade den typiska RPE storlek, morfologi och pigmentering efter 72 h1. Efter en vecka bildades ett mycket polariserat RPE monoskikt av sexkantiga pigmenterade RPE-celler med två atomkärnor förenade av snäva korsningar som uttrycker ZO-1 (Figur 1C, 2). Transmissionselektronmikrografer avslöjar förekomsten av apatiska mikrovilli och basala infoldings (Figur 1C). Polariseringen av RPE-monoskiktet bekräftades av TER-värden med ett genomsnitt som var högre än 200 Ω x cm2, som förblev stabil över tiden (figur 2).
Funktionell validering av denna metod utfördes genom phagocytosis analyser. Mus RPE celler odlades på membran insatser och matas med FITC-märkta nötkreatur POS. POS uppslukande och matsmältningen visades av fluorescerande mikroskopi (Figur 3).
Figur 1. RPE-celler vid olika tidpunkter. A)10x ljusfältsmikrografer av RPE-celler 24 h efter sådd på membraninsatserna och (B) efter en vecka. C)Transmissionselektronmikrografer visar apical microvilli, basala infoldings och melaninpigment (svarta fläckar) av RPE odlade på membraninsatserna i två veckor. Skalstänger: A, B: 100 μm, C: 2 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. TER över tid. Det transepitheliala elektriska motståndet (TER) på ~ 60 primära mus RPE-cellkulturer på membraninsatser mättes efter 0,5 (n = 33), 1 (n = 58), 1,5 (n = 54) och 2 (n = 60) veckor. TER når över 200 Ω x cm2 x 72 timmar och förblir stabil i minst två veckor. Data som representeras som enskilda värden med ± SD. Klicka här för att se en större version av den här siffran.
Bild 3. Phagocytos analyser. 40x fluorescerande mikrografer av primära mus RPE-kulturer som utfodrats med FITC-märkt bovin POS (grön) i två timmar och fixerad medmetanol 25. Mindre fragment motsvarar smält POS inuti cellens cytoplasma. Visualisering av snäva korsningar (röd) underlättades av immunostaining med antikroppar anti-ZO1 som tidigare beskrivits1,9. DAPI (blå) användes för att färga atomkärnor. Typiska mus-RPE-celler med två atomkärnor kan observeras i mitten av bilden. Skalbar: 50 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Medan flera metoder för mus RPE cell isolering och kultur hade utvecklatsföre 1,13,20,22,26,27, Fernandez-Godino metod först används membraninsatser som möjliggör effektiv tillväxt av RPE-cellerna i kultur i veckor1,9. En annan stor förändring i deras protokoll1,9 var användningen av enzymatiska lösningar istället för mekanisk peeling för att skilja RPE-cellerna1,13,20,26. Linserna avlägsnades genom ett snitt i hornhinnan, vilket lämnade iris epitel intakt och bevara näthinnans integritet under den första inkubationen. Den milda isoleringen av RPE-cellerna i kombination med användning av membraninsatser och specifikt RPE-medium23 resulterar i en förbättrad cellöverlevnad, vilket förbättrar bildandet av ett funktionellt sammanflöde av monoskikt som efterliknar RPE: s fysiologiska förhållanden inom några dagar i kultur2. Vanligtvis visar primära mus RPE-celler som odlas med denna metod sexkantig morfologi, polarisering, pigmentering, barriäregenskaper och spridning. Dessutom kan RPE odlas i avsaknad av serum från dag tre upp till flera veckor, vilket är viktigt för att studera komplementrelaterade RPE patologier9.
En begränsning av detta protokoll är att primära musens RPE-celler som odlas på membraninsatser inte kan expanderas. Passaging primära mus RPE celler med enzymatiska lösningar eller kultivering dem under lång tid resulterar i förlust av pigmentering, av-differentiering och minskad TER, därmed förlora de egenskaper som liknar in vivo funktioner. Den begränsade mängden RPE-celler som erhålls från ett djur förpliktar att samla prover från olika djur för transkriptomiska och proteomiska analyser, där relativt stora mängder utgångsmaterial krävs. Det rekommenderas inte att skala upp RPE-kulturerna genom att slå samman fler ögon till en större membraninsats, eftersom det kan resultera i en högre andel celldöd och flerskiktade RPE-kulturer.
Det finns några kritiska steg i protokollet också. Högst två ögon bör skördas samtidigt tills viss erfarenhet har aquired, eftersom en förlängd dissekeringstid resulterar i en högre andel celldöd. Den optiska nerven får skäras bort först före inkubationen med trypsin. Det är viktigt att hantera ögonkoppen utan att störa RPE-cellerna, men synnerven smälts av trypsin, vilket leder till föroreningar i RPE-kulturerna. Peeling av okulär musklerna måste utföras med försiktighet. Om sclera är perforerad och neurala näthinnan dyker ut, måste ögat kasseras eftersom RPE-cellerna kommer att skadas och inte kommer att överleva. Minimalt tryck bör appliceras för att ta bort linserna. Det är att föredra att utföra ett större hornhinnans snitt. Det är viktigt att ögonkoppen är öppen och helt nedsänkt i trypsin så att alla RPE-celler utsätts för lösningen. RPE-cellerna måste samlas in genom skonsam skakning av ögonkoppen och aldrig genom att spruta media eller skala dem mekaniskt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande ekonomiska intressen.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av Ocular Genomics Institute vid Massachusetts Eye and Ear.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 ml BD Luer-Lok tip syringe, disposable | BD Biosciences | 309604 | |
| 15 ml centrifuge tube | VWR International | 21008-103 | |
| 50 ml centrifuge tube | VWR International | 21008-951 | |
| Alpha Minimum Essential Medium | Sigma-Aldrich | M4526-500ML | |
| Angled micro forceps | WPI | 501727 | |
| Bench-top centrifuge | any | ||
| CO2 incubator | Thermo | HERA VIOS 160I CO2 SST TC 120V | |
| Dissecting microscope | Any | ||
| Dulbecco’s Phospate Buffered Saline no Calcium, no Magnesium | Gibco | 14190144 | |
| Dumont #5 45° Medical Biology tweezers, 0.05 x 0.01 mm tip, 11 cm length | WPI | 14101 | |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | E7023-500ML | |
| Falcon Easy-Grip Clear Polystyrene Cell Culture Dish, 35mm | BD Biosciences | 353001 | |
| Fetal Bovine Serum | Hyclone | SH30071.03 | Heat inactivated. |
| Hank’s Balanced Salt Solution plus Calcium and Magnesium, no Phenol Red | Life Technologies | 14175095 | |
| Hank’s Balanced Salt Solution plus Calcium and Magnesium, no Phenol Red B6 | Life Technologies | 14025092 | |
| HEPES 1M | Gibco | 15630106 | |
| Hyaluronidase | Sigma-Aldrich | H-3506 1G | |
| Hydrocortisone | Sigma-Aldrich | H-0396 | |
| Laminar flow hood | Thermo | CLASS II A2 4 115V PACKAGECLA | |
| Laminin 1mg/ml | Sigma-Aldrich | L2020-1 MG | Dilute in PBS at 37C to 1mg/ml |
| McPherson-Vannas Micro Scissors 8 cm long | WPI | 503216 | |
| Non-essential amino acids 100X | Gibco | 11140050 | |
| N1 Supplement 100X | Sigma-Aldrich | N6530-5ML | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-148 | |
| Sterile Bard-Parker Carbon steel surgical blade size 11 | Fisher-Scientific | 08-914B | |
| Taurine | Sigma-Aldrich | T-0625 | |
| Tissue culture treated 12-well plates | Fisher-Scientific | 08-772-29 | |
| Tissue culture treated 6-well plates | Fisher-Scientific | 14-832-11 | |
| Transwell supports 6.5 mm | Sigma-Aldrich | CLS3470-48EA | |
| Triiodo-thyronin | Sigma-Aldrich | T-5516 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Gibco | 25200056 | |
| Tweezer, Dumont #5 Medical Biology 11 cm, curved, stainless steel 0.02 x 0.06 mm Mod tips | WPI | 500232 | |
| Vannas Scissors 8cm long, stainless steel | WPI | 501790 | |
| Whatman Puradisc 25mm Syringe Filters 0.45μm pore size | Fisher-Scientific | 6780-2504 |
References
- Fernandez-Godino, R., Garland, D. L., Pierce, E. A. Isolation, culture and characterization of primary mouse RPE cells. Nature Protocols. 11 (7), 1206-1218 (2016).
- Strauss, O. The retinal pigment epithelium in visual function. Physiological Reviews. 85 (3), 845-881 (2005).
- Konari, K., et al. Development of the blood-retinal barrier in vitro: Formation of tight junctions as revealed by occludin and ZO-1 correlates with the barrier function of chick retinal pigment epithelial cells. Experimental Eye Research. 61 (1), 99-108 (1995).
- Kay, P., Yang, Y. C., Paraoan, L. Directional protein secretion by the retinal pigment epithelium: Roles in retinal health and the development of age-related macular degeneration. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 17 (7), 833-843 (2013).
- Johnson, L. V., Leitner, W. P., Staples, M. K., Anderson, D. H. Complement activation and inflammatory processes in drusen formation and age related macular degeneration. Experimental Eye Research. 73 (6), 887-896 (2001).
- Hageman, G. S., et al. An integrated hypothesis that considers drusen as biomarkers of immune-mediated processes at the RPE-Bruch's membrane interface in aging and age-related macular degeneration. Progress in Retinal and Eye Research. 20 (6), 705-732 (2001).
- Lommatzsch, A., et al. Are low inflammatory reactions involved in exudative age-related macular degeneration. Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 246 (6), 803-810 (2008).
- Bandyopadhyay, M., Rohrer, B. Matrix metalloproteinase activity creates pro-angiogenic environment in primary human retinal pigment epithelial cells exposed to complement. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (4), 1953-1961 (2012).
- Fernandez-Godino, R., Garland, D. L., Pierce, E. A. A local complement response by RPE causes early-stage macular degeneration. Human Molecular Genetics. 24 (19), 5555-5569 (2015).
- Fernandez-Godino, R., Bujakowska, K. M., Pierce, E. A. Changes in extracellular matrix cause RPE cells to make basal deposits and activate the alternative complement pathway. Human Molecular Genetics. 27 (1), 147-159 (2018).
- Fernandez-Godino, R., Pierce, E. A. C3a triggers formation of sub-retinal pigment epithelium deposits via the ubiquitin proteasome pathway. Scientific Reports. 8 (1), 1-14 (2018).
- Farkas, M. H., et al. Mutations in Pre-mRNA processing factors 3, 8, and 31 cause dysfunction of the retinal pigment epithelium. American Journal of Pathology. 184 (10), 2641-2652 (2014).
- Geisen, P., Mccolm, J. R., King, B. M., Hartnett, E. Characterization of Barrier Properties and Inducible VEGF Expression of Several Types of Retinal Pigment Epithelium in Medium-Term Culture. Current Eye Research. 31, 739 (2006).
- Schütze, C., et al. Retinal pigment epithelium findings in patients with albinism using wide-field polarization-sensitive optical coherence tomography. Retina. 34 (11), 2208-2217 (2014).
- Samuels, I. S., Bell, B. A., Pereira, A., Saxon, J., Peachey, N. S. Early retinal pigment epithelium dysfunction is concomitant with hyperglycemia in mouse models of type 1 and type 2 diabetes. Journal of Neurophysiology. 113 (4), 1085-1099 (2015).
- Garland, D. L., et al. Mouse genetics and proteomic analyses demonstrate a critical role for complement in a model of DHRD/ML, an inherited macular degeneration. Human Molecular Genetics. 23 (1), 52-68 (2014).
- Fu, L., et al. The R345W mutation in EFEMP1 is pathogenic and causes AMD-like deposits in mice. Human Molecular Genetics. 16 (20), 2411-2422 (2007).
- Greenwald, S. H., et al. Mouse Models of NMNAT1-Leber Congenital Amaurosis (LCA9) Recapitulate Key Features of the Human Disease. American Journal of Pathology. 186 (7), 1925-1938 (2016).
- Gupta, P. R., et al. Ift172 conditional knock-out mice exhibit rapid retinal degeneration and protein trafficking defects. Human Molecular Genetics. 27 (11), 2012-2024 (2018).
- Gibbs, D., Williams, D. S. Isolation and culture of primary mouse retinal pigmented epithelial cells. Advances in Experimental Medicine and Biology. 533, 347-352 (2003).
- Bonilha, V. L., Finnemann, S. C., Rodriguez-Boulan, E. Ezrin promotes morphogenesis of apical microvilli and basal infoldings in retinal pigment epithelium. Journal of Cell Biology. 147 (7), 1533-1547 (1999).
- Nandrot, E. F., et al. Loss of synchronized retinal phagocytosis and age-related blindness in mice lacking αvβ5 integrin. Journal of Experimental Medicine. 200 (12), 1539-1545 (2004).
- Maminishkis, A., et al. Confluent monolayers of cultured human fetal retinal pigment epithelium exhibit morphology and physiology of native tissue. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 47 (8), 3612-3624 (2006).
- Maminishkis, A., Miller, S. S. Experimental models for study of retinal pigment epithelial physiology and pathophysiology. Journal of Visualized Experiments. (45), (2010).
- Brydon, E. M., et al. AAV-Mediated Gene Augmentation Therapy Restores Critical Functions in Mutant PRPF31+/− iPSC-Derived RPE Cells. Molecular Therapy - Methods and Clinical Development. 15, 392-402 (2019).
- Shang, P., Stepicheva, N. A., Hose, S., Zigler, J. S., Sinha, D. Primary cell cultures from the mouse retinal pigment epithelium. Journal of Visualized Experiments. 2018 (133), (2018).
- Bonilha, V. Age and disease-related structural changes in the retinal pigment epithelium. Clinical Ophthalmology. 2 (2), 413 (2008).
