Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Injicerbara supramolecular Polymer-Nanopartikelhydrogeler för cell- och läkemedelsleveransapplikationer

Published: February 7, 2021 doi: 10.3791/62234
Automatic Translation
*1, *2, 1, 1,3,4
1Department of Materials Science & Engineering, Stanford University, 2Department of Chemical Engineering, Stanford University, 3Department of Bioengineering, Stanford University, 4Department of Pediatrics - Endocrinology, Stanford University
* These authors contributed equally

Summary

Detta protokoll beskriver syntesen och formuleringen av injicerbara, supramolecular polymer-nanopartiklar (PNP) hydrogel biomaterial. Tillämpningar av dessa material för läkemedelsleverans, biofarmaceutisk stabilisering och cellinkapsling och leverans demonstreras.

Abstract

Dessa metoder beskriver hur man formulerar injicerbara, supramolecular polymer-nanopartiklar (PNP) hydrogeler för användning som biomaterial. PNP-hydrogeler består av två komponenter: hydrofobiskt modifierad cellulosa som nätverkspolymer och självmonterade nanopartiklar av kärnskal som fungerar som icke-kovalenta tvärlänkare genom dynamiska, multivalenta interaktioner. Dessa metoder beskriver både bildandet av dessa självmonterade nanopartiklar genom nanoprecipitation samt formulering och blandning av de två komponenterna för att bilda hydrogeler med tunable mekaniska egenskaper. Användningen av dynamisk ljusspridning (DLS) och reologi för att karakterisera kvaliteten på de syntetiserade materialen är också detaljerad. Slutligen, nyttan av dessa hydrogeler för läkemedelsleverans, biofarmaceutisk stabilisering och cell inkapsling och leverans demonstreras genom in vitro experiment för att karakterisera läkemedelsfrisättning, termisk stabilitet och cell bosättning och livskraft. På grund av dess biokompatibilitet, injicerbarhet och milda gelbildningsförhållanden är detta hydrogelsystem en lätt tunable plattform som är lämplig för en rad biomedicinska applikationer.

Introduction

Injicerbara hydrogeler är ett framväxande verktyg för att leverera terapeutiska celler och läkemedel till kroppen på ett kontrollerat sätt1. Dessa material kan laddas med läkemedel eller celler och kan administreras på ett minimalt invasivt sätt genom direkt injektion till ytliga vävnader eller genom kateterleverans till djupa vävnader. I allmänhet består injicerbara hydrogeler av vattensvullna polymernätverk som är sammankopplade av övergående, fysiska interaktioner. I vila ger dessa tvärlänkar en solid struktur till gelerna, men vid applicering av tillräcklig mekanisk kraft störs dessa korslänkar tillfälligt och omvandlar materialet till ett vätskeliknande tillstånd som lätt kan flöda2. Det är dessa reologiska egenskaper som gör det möjligt för fysiska hydrogeler att shear-tunna och flöda genom små nåldiametrar under injektion3. Efter injektionen, polymernätverket av materialreformerna, så att det kan självläka och snabbt bilda en fast-liknande gel på plats4,5. Dessa strukturer kan fungera som långsamma depåer för droger eller byggnadsställningar för vävnadsregenerering6,7. Dessa material har använts i olika tillämpningar som omfattar läkemedelsleveransteknik, regenerativ medicin och immunengineering1,8,9,10,11,12.

Både naturmaterial (t.ex. alginat och kollagen) och syntetiska material (t.ex. poly(etylenglykol) (PEG) eller liknande hydrofila polymerer) har utvecklats som biokompatierbara injicerbara hydrogelmaterial13,14,15. Många naturmaterial uppvisar batch-till-parti variation som påverkar reproducerbarhet4,16. Dessa material är ofta temperaturkänsliga, härdning vid uppnående av fysiologiska temperaturer; Hanteringen av dessa material innebär således ytterligare tekniska och logistiska utmaningar17. Syntetiska material möjliggör mer exakt kemisk kontroll och utmärkt reproducerbarhet, men dessa material kan ibland utsättas för negativa immunsvar som begränsar deras biokompatibilitet, en kritisk egenskap för in vivo terapeutiskaapplikationer 6,18,19. De senaste ansträngningarna har visat att det finns många komplexa designkriterier involverade i att konstruera ett injicerbart hydrogelmaterial, inklusive optimering av mekaniska egenskaper, polymernätverkets maskstorlek, bioaktiva molekylära signaler, biologisk nedbrytbarhet och immunogenicitet hos materialet20,21,22,23,24,25,26. Alla dessa faktorer måste beaktas beroende på intresse, vilket innebär att en modulär, kemiskt tunable plattform är idealisk för att tillfredsställa en bred bredd av applikationer.

De nuvarande metoderna beskriver formuleringen och användningen av en injicerbar polymer-nanopartikel (PNP) hydrogelplattform som uppvisar tunable mekaniska egenskaper, en hög grad av biokompatibilitet och låg immunogenicitet, och presenterar platser för konjugering bioaktiva molekylära signaler27,28,29,30,31,32,33. Dessa PNP-hydrogeler består av hydrofobiskt modifierade cellulosapolymerer och självmonterade nanopartiklar av kärnskal som består av poly(etylenglykol)-block-poly(mjölksyra) (PEG-PLA)27,34 som interagerar för att producera ett supramolecular nätverk. Mer specifikt interagerar de dodecylmodifierade hydroxypropylmetylcellulosapolymererna (HPMC-C12)dynamiskt med ytan av PEG-PLA-nanopartiklar och överbryggar mellan dessa nanopartiklar för att bilda detta polymernätverk27,34. Dessa dynamiska, multivalenta interaktioner gör det möjligt för materialen att shear-tunna under injektionen och snabbt självläka efter administrering. PNP-hydrogelkomponenterna tillverkas enkelt genom enkla enpottsreaktioner och PNP-hydrogelen bildas under milda förhållanden genom enkel blandning av de två komponenterna35. På grund av enkel tillverkning är denna hydrogelplattform mycket översättbar i stor skala. PNP-hydrogels mekaniska egenskaper och maskstorlek styrs genom att polymer- och nanopartiklarnas viktprocent ändras i formuleringen. Tidigare studier med denna plattform visar att PNP-hydrogeler är mycket biologiskt stödberättigande, biologiskt nedbrytbara och icke-immunogena28,30,31. Sammantaget presenterar dessa hydrogeler bred nytta i biomedicinska tillämpningar som omfattar postoperativ vidhäftning förebyggande, vävnadsteknik och regenerering, ihållande läkemedelsleverans och immunengineering.

Protocol

Innan detta protokoll börjar är det nödvändigt att syntetisera HPMC-C12 och PEG-PLA med tidigare publicerademetoder 27,28,29,30,31,36,37,38.

1. Nanopartikelsyntes (NP) genom nanoprecipitation

OBS: Detta avsnitt beskriver syntesen av ett enda parti NPs, vilket ger 250 μL 20 wt% NPs i buffertlösning (50 mg torr PEG-PLA-polymer per sats). Anteckningar för att skala upp antalet batchar tillhandahålls i relevanta steg.

  1. Mät 50 mg PEG-PLA-polymer i en 8 ml glasscintillationsflaska och tillsätt 1 ml acetonitril. Vortex för att helt lösa upp.
    OBS: För att skala upp antalet partier, skala detta steg linjärt och tillsätt den totala mängden polymer och lösningsmedel som behövs i en enda injektionsflaska.
  2. Tillsätt 10 ml ultrapurevatten i en 20 ml glasscintillationsflaska med en liten omrörningsstång. Sätt på en omrörplatta inställd på 600 varv/min.
    OBS: Om steg 1.1 har skalats är det fortfarande nödvändigt att ha en individuell scintillationsflaska att fälla ut i för varje motsvarande sats. Till exempel, för 200 mg polymer upplöst i 4 ml acetonitril, förbered 4 x 20 ml scintillationsflaska.
  3. För att bilda NPs genom nanoprecipitation, tillsätt 1 ml polymerlösning på ett droppe i vattnet med en 200 μL-pipett. Rör om i 2 minuter. PEG-PLA-blocket är inte lösligt i vatten, och som ett resultat kommer NPs med kärnskal att självmontera med de hydrofoba PLA-blocken som kärna och hydrofila PEG-block som skal.
  4. Kontrollera partikelstorleken genom dynamisk ljusspridning (DLS).
    OBS: Denna procedur är särskilt skriven för en kommersiellt tillgänglig plåtläsare med tillhörande programvarupaket (se Materialförteckning ). För användning av alternativa instrument, se de provberedningsmetoder som beskrivs av instrumenttillverkaren.
    1. Späd 20 μL NP-lösning med 80 μL ultrapurvatten (analyskoncentration: 1 mg/ml PEG-PLA NPs). Tillsätt 30 μL per brunn till en klar botten svart 384-brunnsplatta (analysera i triplicate).
    2. Mät den hydrodynamiska radien och polydispersiteten för varje prov med en DLS-plåtläsare med hjälp av förinställda protokollalternativ i programvarupaketet. Som ett exempel på ett typiskt protokoll ställer du in datainsamlingsparametrarna för att hämta 5-10 DLS-mätningar med 2-5 s varaktighet per anskaffning och rapporterar sedan en genomsnittlig partikelstorlek och fördelning per brunn, beräknad från den klotformiga proteinmodellen. För att bilda hydrogeler med konsekventa reologiska egenskaper bör de resulterande partiklarna vara 30-50 nm i hydrodynamisk diameter med en polydispersitet (PD) < 0,2.
      OBS: Om NPs är mindre än önskat, använd en lösning på 75% acetonitril / 25% dimetylsulfoxid (DMSO) i steg 1.1. Att öka andelen DMSO i lösningsmedlet kommer i allmänhet att öka partikelstorleken.
  5. Överför NP-lösningen från 20 ml scintillationsflaskan till en centrifugalfilterenhet. Centrifugera vid 4500 x g i 1 timme för att koncentrera NP-lösningen till <250 μL.
  6. Återanvänd i önskad buffert, såsom fosfatbuffrad saltlösning (PBS), till 20 wt% NPs. Pipett innehållet i centrifugalfilterenheten till ett tjärat mikrocentrifugrör eller glasscintillationsflaska på en massbalans. Använd en liten mängd (50-100 μL) buffert för att skölja filtret och säkerställa insamling av alla NPs. Lägg till buffert för att nå en total massa på 250 mg.
    OBS: Partier kan poolas under återsuspension. NP-lagerlösningar kan förvaras vid 4 °C i cirka 1 månad. Frys inte. För längre lagring, kontrollera storlek och polydispersitet av DLS före användning.

2. Hydrogelformulering och inkapsling av läkemedel eller celler

OBS: Detta avsnitt beskriver beredning av 1 ml 2:10 PNP hydrogel formulering, med 2:10 betecknar 2 wt% HPMC-C12 och 10 wt% NPs (12 wt% totala fasta polymer) och 88 wt% buffertlösning, drug cargo lösning eller cell suspension. Formuleringsprocenten kan varieras för att ge hydrogeler med en rad mekaniska egenskaper. Till exempel användes 1:5 PNP hydrogeler för cell bosättning och livskraft experimentella resultat visas.

  1. Förbered lagerlösning på 6 wt% HPMC-C12 i PBS (eller annan buffert). Lös upp i 48 timmar för att säkerställa att polymeren är helt spridd.
    OBS: HPMC-C12-lagerlösningen är stabil i månader vid rumstemperatur. Lagring vid 4 °C rekommenderas dock för att hämma mikrobiell tillväxt.
  2. Tillsätt 333 mg 6 wt% HPMC-C12-stamlösning i en 1 ml luerlåsspruta.
  3. Tillsätt 500 μL 20 wt% NP-stamlösning till ett mikrocentrifugrör. Tillsätt 167 μL PBS och pipett att blanda. Fyll ytterligare en 1 ml luerlåsspruta med den utspädda NP-lösningen med en nål.
    OBS: För att ladda läkemedelslast, beräkna den önskade slutliga koncentrationen av läkemedlet i hydrogelen och ladda lämplig mängd i de 167 μL PBS som blandas med NPs. Om en molekylär sond är nödvändig för en in situ-analys, t.ex. för övervakning av läkemedelsstabilitet, lasta sonden på ett liknande sätt som beskrivs ovan för lastning av läkemedelslast. För att ladda celler, beräkna önskad slutlig cellkoncentration i hydrogelen och ladda lämpligt antal celler i de 167 μL PBS som blandas med NPs.
  4. Blanda de två hydrogelkomponenterna (HPMC-C12 och NPs) med hjälp av en armbågsblandningsmetod35.
    1. Fäst Luer-armbågskontakten på sprutan som innehåller NP-lösning (som valfritt även innehåller läkemedelslast eller celler). Tryck NP-lösningen genom armbågen tills menisken är synlig i den öppna änden. Dra tillbaka något och anslut sprutan som innehåller HPMC-C12-lösningen.
      OBS: Det är viktigt att minimera luft i armbågsanslutningen för att förhindra bildandet och spridningen av bubblor i hela hydrogelen under blandningsprocessen. När du blandar celler med armbågsblandaren, var noga med att blanda mer försiktigt eftersom blandning för snabbt kan utsätta cellerna för höga savkrafter, vilket leder till celldöd.
    2. Pumpa de två lösningarna fram och tillbaka genom armbågsblandaren i cirka 60 cykler tills ett homogent, ogenomskinligt vitt hydrogelmaterial har bildats.
    3. Tryck hela volymen hydrogel i en spruta. Ta bort den tomma sprutan och dra tillbaka kolven på den gelbelastade sprutan för att återställa material från armbågskontakten. Lock med nål eller kontakt.
      OBS: Det är nödvändigt att ta hänsyn till ~ 300 μL förlorad hydrogelvolym på grund av det döda utrymmet i blandningsprocessen. Om till exempel 700 μL slutlig hydrogelvolym önskas bör 1 ml hydrogel beredas. Hydrogelformuleringsprocessen kan skalas upp med hjälp av större sprutor. För styva hydrogelformuleringar, såsom 2:10, kan det dock bli svårt att blanda och injicera från sprutor större än 3 ml i volym på grund av det ökande förhållandet mellan sprutan och armbågen eller nåldiametern.
    4. Förvara hydrogelen i sprutan i rumstemperatur. Om läkemedel är inkapslade rekommenderas dock lagring vid 4 °C om inte läkemedelstillverkaren anger något annat. Frys inte in materialet.

3. Mätning av reologiska egenskaper hos hydrogelformuleringar

OBS: Detta protokoll används specifikt med den kommersiella reometern som nämns i materialförteckningen med en 20 mm räfflad plåtgeometri. För användning av andra instrument, se tillverkarens instruktioner för provberedning.

  1. Formulera minst 700 μL PNP-hydrogel för reologisk karakterisering.
  2. Injicera material i mitten av den räfflad reometerplattan. Mängden varierar beroende på det valda geometrigapet. Som referens kräver ett mellanrum på 700 μm ~400-500 μL material.
  3. Sänk reometern till trimgapet (500-1000 μm) och vrid långsamt den övre reometerplattan när den kommer i kontakt med PNP-hydrogelen för att säkerställa att gapet fylls jämnt och helt.
  4. Kontrollera belastningen på PNP-hydrogelen så att den täcker hela reometerplattans yta. Använd en spatel- eller plasttrimmer för att försiktigt trimma och ta bort överflödigt material, så att det har en mycket liten utbuktning ur plattan.
  5. Sänk reometern till det slutliga geometrigapet och kontrollera att provet är rent laddat.
  6. Mät provet:s mekaniska egenskaper med hjälp av svängbara provningar, t.ex.
    OBS: I de representativa data som visas körs oscillaterande amplitudtester med en konstant frekvens på 10 rad/s. Oscillaterande frekvens svep körs vid en konstant 1% stam, inom den linjära viscoelastic regimen i amplitud svep. Flödessvepningar gick från höga savhastigheter till låga savhastigheter39. Alla tester avslutas med 10 poäng per decennium insamlade data och vid rumstemperatur. Testparametrarna kan behöva justeras beroende på formuleringens egenskaper. Att utsätta styvare PNP-material som 2:10-formuleringar för höga saxhastigheter kan leda till att materialet matas ut från reometerplattorna, vilket resulterar i felaktig mekanisk karakterisering och kräver omladdning av provet mellan efterföljande tester. Representativa uppgifter som visas nedan kan användas för jämförelse under kvalitetskontrolltestning.

4. Karakterisera in vitro-läkemedelsfrisättning

  1. Förbered kapillärrör genom att skära glas kapillärrör till önskad längd. Försegla ena änden av varje rör genom att använda en engångsspatel eller pipettspets för att trycka in en liten mängd epoxi i änden av röret för att bilda en kontakt. Låt epoxi ställas in per tillverkarens rekommenderade tid.
    OBS: Röret måste vara kortare än injektionsnålens längd. Slangar med innerdiameter på 2-3 μm rekommenderas så att en längd på 2,5 tum innehåller minst 300 μL av den totala volymen.
  2. Formulera minst 500 μL av ett PNP-hydrogelmaterial i en spruta som innehåller det läkemedel som är av intresse. Förbered varje provgrupp i en separat spruta.
  3. Injicera 100-200 μL PNP-hydrogelen längst ner i varje kapillärrör med en lång hypodermisk nål (22G, 4 tum). Förbered minst tre rör (triplicate) per provgrupp.
  4. (Valfritt) Placera fyllda kapillärrör i ett koniskt centrifugeringsrör och centrifugera i 1 min vid 1000 x g för att säkerställa att hydrogelens yta är enhetlig. Detta steg kan behöva upprepas, ändra tid och hastighet vid behov för att jämna ut materialets yta.
    VARNING: Se till att centrifugen är välbalanserad.
  5. Fyll försiktigt 200-300 μL PBS ovanpå hydrogelen i kapillärröret med en spruta och nål eller pipett. Kontakta eller stör inte hydrogelens yta. Försegla röret med lock eller kontakt eller lock med minst två lager paraffinfilm.
  6. (Valfritt) Inkubera prover vid 37 °C för att simulera in vivo-förhållanden.
  7. Ta försiktigt bort PBS helt från varje kapillär, utan att störa hydrogelytan, med en spruta och nål vid valda tidpunkter beroende på den förväntade tidsskalan för läkemedelsfrisättning. Ersätt volymen som tagits bort med färsk PBS. Förvara alikvoter under lämpliga förhållanden.
    OBS: De rekommenderade volymerna och tidpunkterna i steg 4.3, 4.5 och 4.7 kan optimeras för att fånga in vitro-läkemedelsfrisättning över en rad tidsskalor, beroende på hur mycket läkemedel som laddas i materialet och hur snabbt det släpps ut i supernatanten. Ett prov av utvalda tidpunkter kan vara 6 h, 1 dag, 3 dagar, 1 vecka och 2 veckor för ett långsamt frigörande läkemedel. Alikvoter kan också analyseras eftersom de förvärvas snarare än lagras.
  8. När studien är klar analyserar du alikvoter med en lämplig metod som ELISA, HPLC eller fluorescensanalys för att kvantifiera mängden läkemedel som frigörs vid varje tidpunktpunkt 40,41,42. Lämplig detektionsmetod varierar beroende på vilket läkemedel som är av intresse.
    OBS: In vitro-frisättningsstudier är användbara för att jämföra frisättning mellan olika hydrogelformuleringar eller läkemedelslast. In vitro-frisättningstiden anger inte ofta direkt en förväntad tidsskala för frisättning in vivo.

5. Karakterisera termisk stabilitet hos gelinkapslat insulin

  1. Formulera minst 1,2 ml PNP-hydrogel per provgrupp. Efter det förfarande som beskrivs i avsnitt 2. 3, ladda både insulin (läkemedelslast) och tioflavin T (ThT) (molekylär sond) i PNP-hydrogelen.
    OBS: Den primära aggregeringsmekanismen och därmed inaktiveringen av insulin är genom bildandet av amyloidfibriller. ThT är en lämplig molekylär sond eftersom den producerar en stark fluorescenssignal i närvaro av amyloidfibriller, vilket möjliggör övervakning på plats av insulinaggregering. Beroende på droglast av intresse kan aggregering övervakas med olika metoder. För de representativa data som visades laddades insulinet till en slutlig koncentration på 6, 7 eller 10 mg/ml och ThT till en slutlig koncentration på 25 μM.
  2. Använd en 21 G-nål och injicera 200 μL PNP-hydrogel per brunn i en svart 96-brunnsplatta. Varje provgrupp bör mätas i minst tre exemplar. Täta plattan med en optiskt klar självhäftande platttätning för att förhindra avdunstning.
  3. Sätt in plattan i en plåtläsare utrustad med temperaturreglering, skakningar och kinetisk avläsningsprogrammering och börja läsa protokollet. Representativa uppgifter förvärvades med en kommersiellt tillgänglig plåtläsare (se Materialförteckning) på följande villkor:
    1. Stressade åldersförhållanden: kontinuerlig linjär skakning (410 cpm, 5 mm) vid 37 °C.
    2. Datainsamling: excitation/emission 450 nm/482 nm med 20 minuters intervall
      OBS: Om en plåtläsare med temperaturreglering, skakapparat och kinetisk avläsningskapacitet inte är tillgänglig kan plattan placeras på en skakplatta i en inkubator och läsas manuellt vid ovan våglängder vid valda tidpunkter.
  4. Rita data som genomsnittlig fluorescenssignal över tid för varje grupp. Tid till aggregering kan kvantifieras genom att definiera ett godtyckligt signaltröskel43.
    OBS: För de representativa data som visas nedan definierades tröskelvärdet som 750 000 godtyckliga fluorescensenheter (AFU). Detta värde valdes för att ligga över den uppmätta baslinjen samtidigt som den fortfarande i tillräcklig utsträckning fångade in den aggregering som indikeras av en kraftig fluorescerande signalökning.
  5. Avsluta analysen när proverna aggregeras eller visuellt börjar dehydreras.

6. Bedömning av cellens livskraft

  1. Formulera minst 2 ml PNP-hydrogel som innehåller önskad cellkoncentration enligt ovanstående protokoll (normalt 1 - 5 x 106 celler/ml). Förbered varje provgrupp i en separat spruta.
  2. Använd en 21G-nål och injicera 150 μL PNP-hydrogel i varje brunn i en klar botten 96-brunnsplatta; varje brunn är en replikat. Varje provgrupp ska ha 3-5 replikat per tidpunkt. Centrifugera plattan vid 50 x g i 2 min för att sprida hydrogelen jämnt i brunnen.
  3. Tillsätt 100 μL av lämpligt cellmedier ovanpå hydrogelen. Ta bort mediet varje dag och lägg till 100 μL nytt medium.
  4. På dag 1 tar du bort mediet ovanpå hydrogelen för de angivna replikaten för den tidspunkten för varje provgrupp. Tillsätt 50 μL 2 mM calcein AM-lösning ovanpå hydrogelerna. Inkubera i 30 min.
    OBS: Calcein AM kan användas för att identifiera och märka levande celler. I levande celler omvandlas den icke-fluorescerande calcein AM till en grön-fluorescerande calcein, av intracellulära esteraser efter acetoxymethyl ester hydrolys.
  5. Avbilda mitten av varje brunn i en 96-brunnsplatta med ett konfokalt mikroskop. Under en undersökning av ett område på minst 300 μm2 med en z-stapel som sträcker sig över minst 150 μm. Använd konforikal våglängdsinställningar för att fånga fluorescensen av kalcein (excitation/emission: 495 nm/515 nm).
  6. Upprepa steg 6.4 och 6.5 för varje efterföljande tidpunkt efter önskemål.
  7. Om du vill analysera varje bild komprimerar du alla z-stack-bilder till en enda plan med maximal intensitetsbild med FIJI eller liknande programvara. Kvantifiera antalet fluorescerande celler i varje bild. Förhållandet mellan antalet fluorescerande celler vid varje tidpunkt jämfört med antalet fluorescerande celler vid dag 1 är den relativa cellens livskraft i PNP-hydrogelerna.

7. Bedömning av cellsättning

  1. Beräkna antalet celler som krävs för att formulera 500-700 μL PNP-hydrogel vid en slutlig koncentration av 5 x 106 celler/ml. Suspendera celler i 1 ml PBS vid en koncentration av 1 x 106 celler/ml. Fläckceller genom att tillsätta 50 μL 2 mM kalcein AM. Inkubera cellerna med färgämnet i 10 min.
  2. Centrifugceller vid lämpliga förhållanden, ta bort PBS och återanvänd cellerna i den volym PBS som behövs för att bilda 500-700 μL av önskad PNP-hydrogel.
    OBS: Rekommenderad hastighet och varaktighet för att centrifugera varje specifik celltyp anges vanligtvis i produktdokumentationen.
  3. Formulera 500-700 μL PNP-hydrogel med de färgade cellerna (5 x 106 celler/ml) enligt protokollavsnitt 2.
  4. Använd en 21G-nål och injicera 100-200 μL PNP-hydrogel som innehåller de färgade cellerna i botten av en cuvette. Tre replikat bör utföras för varje prov. Flytta nålen fram och tillbaka i cuvetten medan du injicerar för att förhindra bubbelbildning.
  5. Omedelbart (tid t=0), avbilda cuvettesna som ligger på sidan över hela det platta cuvette rektangeln vid basen av cuvette. Använd de konfokala panelskanningsfunktionerna för att avbilda hela brunnsområdet och avbilda en z-stack i 3D över ett djup på 100 μm. För senare visualisering, antingen använda den konfokala mikroskopprogramvaran för att sy ihop alla enskilda plattor och utföra en maximal intensitetprojektion för att bilda en enda bild av det stora området eller använda FIJI-programvara på en persondator44,45.
  6. Stå upprätt efter avbildning.
  7. Bild vid 1 timme och 4 timmar för att observera om celler har bosatt sig i hydrogelen eller om de förblir upphängda.
    OBS: Dessa tidpunkter är förslag och kan ändras efter önskemål.
  8. Om du vill analysera varje bild komprimerar du alla z-stack-bilder till en bild med maximal intensitet i ett enda plan. Använd FIJI eller liknande programvara, kvantifiera cellfördelningen genom att mäta fluorescensintensiteten ner i cuvettens centrala vertikala profil för att bestämma graden av sedimentering.

Representative Results

PNP hydrogel tillverkning och karakterisering
PNP-hydrogeler bildas genom blandning av de två primära komponenterna - hydrofobiskt modifierade HPMC-polymerer och PEG-PLA-nanopartiklar (figur 1a). Terapeutisk last införlivas lättast i den extra buffert som används för att späda ut nanopartiklarna före hydrogelberedningen. För biomedicinsk karakterisering nedströms är det bekvämt att använda en armbågsblandningsmetod som möjliggör enkel och reproducerbar blandning av de två komponenterna (figur 1b). Efter lämplig blandning ska hydrogelen kännas fast i sprutan, men ge efter tryck och extrudera från en standardnål (21G visas) (Figur 1c). Efter injektionen bör hydrogelen snabbt sättas in i ett fast material som motstår flöde från gravitationen. För att helt karakterisera hydrogelen och säkerställa konsekventa batch-till-batch-produkter bör proverna analyseras med hjälp av flera olika experiment på en reometer. Geléns savtunnande och självläkande förmåga kommer lätt att observeras med hjälp av ett flödessvepningsprotokoll respektive stegsjuvningsprotokoll (figur 2a, b). För styvare geler, såsom 2:10-formuleringen, bör användaren leta efter viskositet för att minska minst två storleksordningar under flödessvepet när savhastigheten ökas från 0,1 till 100 s-1, vilket simulerar de mekaniska förhållandena under injektionen. Stegskjuvningsprotokollet bör avslöja en storleksminskning av viskositet under de höga savstegen och en snabb återgång (<5 s återhämtningstid) till baslinjens viskositet under de låga savstegen. Karakterisering av lagrings- och förlustmoduli med hjälp av ett svängbart svepexperiment för savfrekvens i det linjära viskoelastiska systemet bör avslöja fasta egenskaper vid frekvensintervall från 0,1-100 rad s-1 (Figur 2c). I synnerhet bör det vanligtvis inte finnas en crossover av savlagrings- och förlustmoduli som kan observeras vid låga frekvenser för styvare formuleringar som 2:10 hydrogelerna. En sådan crossover-händelse kan tyda på problem i kvaliteten på utgångsmaterialen, antingen den modifierade HPMC- eller PEG-PLA-polymeren, eller storleken och spridningen av PEG-PLA-nanopartiklarna. Det bör noteras att en crossover-händelse kan förväntas för svagare hydrogelformuleringar, såsom 1:5 hydrogel. Oscillaterande saftampitude sveper på PNP hydrogeler avslöjar att materialen inte ger efter förrän höga stressvärden tillämpas, vilket indikerar att dessa material har en avkastningsspänning, en tröskelmängd stress som krävs för att materialet ska flöda.

Karakterisera frigöringskinetik från PNP-hydrogeler
Ett viktigt steg i utformningen av PNP geler för läkemedelsleverans är karakteriseringen av läkemedelsfrisättning kinetik från en vald formulering. Det finns flera tekniker för detta, men en enkel in vitro-metodik ger användbara data under tidig formuleringsutveckling (figur 3a). Att variera polymerhalten i PNP-hydrogelerna genom att modulera mängden HPMC-C12 eller NPs är det enklaste sättet att justera dessa hydrogels mekaniska egenskaper och maskstorlek, vilket kan ha en direkt inverkan på spridningen av last genom polymernätet och frisättningshastigheten från materialen (figur 3b). För last som är större än den dynamiska nätstorleken (dvs. hög molekylvikt eller stor hydrodynamisk radie) bör forskarna förvänta sig en långsam, upplösningsmedierad frisättning av last från hydrogeldepån. Formuleringar med dynamiska maskstorlekar som är större än eller lika med lastens storlek möjliggör diffusionsmedierad frisättning som kan beskrivas med traditionella modeller av lastspridning ochsläppa ut 46,47,48,49. Baserat på formen på frisättningskurvan kan forskare omformulera hydrogelen för att justera den mot långsammare (t.ex. öka polymerhalten) eller snabbare (t.ex. minska polymerinnehållet).

Bedömning av stabiliteten hos terapeutisk last
Att bestämma stabiliteten hos den terapeutiska lasten i en hydrogelformulering är avgörande innan prekliniska eller cellulära studier påbörjas. Jämfört med andra syntetiska metoder för inkapsling av droger införlivar PNP-hydrogeler last på ett skonsamt sätt genom att blandas i bulkmaterialet, och det är osannolikt att inkapsling kommer att skada lasten. Dessa studier visar att PNP-hydrogeler också kan stabilisera last som är mottaglig för termisk instabilitet, såsom insulin, avsevärt förlänga hållbarheten och minska beroendet av kyllagring och distribution (figur 4). Det är viktigt att utvärdera lastens skick omedelbart efter inkapsling i hydrogelen samt efter längre lagringsperioder. Dessa data visar att insulin förblir stabilt i hydrogeler efter 28 dagars lagring under kontinuerlig termisk och mekanisk stress, med hjälp av en enkel fluorescensanalys för mätning av insulinaggregering. En alternativ teknik för fall där en lämplig plattanalys inte är tillgänglig skulle vara att utföra cirkulära dichroismmätningar av lasten, vilket är särskilt användbart för att bestämma proteinläkemedlens sekundära struktur.

Bestämning av cellens livskraft och spridning i PNP-hydrogeler
Många terapeutiska celler kräver att vidhäftningsmotiv förblir livskraftiga, och därmed är införandet av integrinmotiv som arginin-glycin-asparaginsyra (RGD) peptider ett viktigt steg för att anpassa PNP-hydrogeler för cellulära terapier50. Den modulära PEG-PLA-polymeren som består av NPs möjliggör kemisk funktionalisering av PEG-koronan genom enkla "klick" kemier28,51. I detta exempel var cellhäftande RGD-peptider fästa vid PEG-PLA-polymeren för att främja cellengagemang med PNP-hydrogelstrukturen. Formuleringar som saknar vidhäftningsplatser kommer att ha låg cell livskraft eftersom inkapslade celler misslyckas med att föröka sig jämfört med celler inkapslade i formuleringar med dessa vidhäftningsmotiv (Figur 5a, b). Inkapslade celler kan märkas med calcein AM eller annat lämpligt fluorescerande färgämne (t.ex. CFSE) för att underlätta cellräkning med ett fluorescensmikroskop. Under optimering bör livskraften jämföras med oförändrade PNP-hydrogeler för att säkerställa att integrin-funktionaliserade formuleringar ger ökad livskraft och spridning. Om integrin-funktionaliserade formuleringar ger liknande effekt som omodifierade hydrogeler, kan detta tyda på ett misslyckande i konjugationskemin som används för att införliva vidhäftningsmotiven.

Forskare bör förvänta sig att inkapslade celler är jämnt spridda genom hydrogelmediet när de använder en lämplig hydrogelformulering. Detta kommer att möjliggöra konsekvent och förutsägbar dosering av celler under hydrogel administrering och bör översättas till lokal lagring av celler i hydrogelen efter administrering. Fördelningen av celler kan enkelt bestämmas med fluorescensmikroskopitekniker. Celler kan märkas med ett lämpligt färgämne och sedan avbildas med konfokal mikroskopi. Bilderna kan bedömas visuellt (figur 5c) och även kvantitativt (figur 5d) med hjälp av ImageJ-programvara för att mäta den genomsnittliga fluorescensintensiteten längs bildens vertikala axel (eller längs vilken axelcellsavsättning på grund av gravitation som förväntas inträffa). Om hydrogelformuleringen är för svag för att stödja cellerna i suspension under längre tidsperioder, kommer cellinsättning att ske, vilket observeras i 1:1-formuleringen i figur 5. Att öka polymerinnehållet kan lösa problem med inhomogen cellspridning på grund av bosättning.

Figure 1
Figur 1:Polymer-nanopartiklar (PNP) hydrogeler bildas lätt genom blandning av två komponenter. En skonsam blandning av dessa två komponenter ger en injicerbar hydrogel, där HPMC-C12-polymererna är fysiskt korslänkade av dynamiska, multivalenta interaktioner med PEG-PLA-nanopartiklarna. b)Fotografi som demonstrerar gelformulering genom blandning med två sprutor, var och en innehållande en komponent i PNP-hydrogelen. Genom att ansluta de två sprutorna med en Luer-lock armbågskontakt kan de två komponenterna enkelt blandas under sterila förhållanden för att ge en bubbelfri hydrogel förinstallerad i en spruta för omedelbar användning. NP-lösningen är färgad blå för demonstration. c)Demonstration av injektionen av PNP-hydrogeler och deras återfastställelse. i) PNP hydrogel i en spruta med en fastsatt 21G nål. ii) Injektionen placerar hydrogelen under sajuvning som tillfälligt bryter samspelet mellan polymer och nanopartiklar, vilket skapar en vätskeliknande konsistens. iii) Efter injektionen reformeras snabbt de dynamiska interaktionerna mellan polymer och nanopartiklar, vilket gör det möjligt för hydrogelen att självläka till ett fast ämne. iv) Den fasta hydrogelen flödar inte under krafter som är svagare än dess avkastningsspänning, såsom gravitationen. PNP-hydrogelen färgas blå för demonstration. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Figure 2
Figur 2: Reologisk karakterisering av två PNP-hydrogelformuleringar. Formuleringar betecknas som polymer wt.%: NP wt.%. a)Stadigt savflöde sveper från låg till hög savhastighet av PNP-hydrogeler. Viskositet som en funktion av savhastighet kännetecknar savförtunnande egenskaper. b)Viskositet som funktion av oscillerande savhastigheter mellan låga savhastigheter (vit bakgrund, 0,1 s−1)till höga savhastigheter (röd bakgrund; 10 s−1)som visar självläkande egenskaper hos PNP-hydrogeler. Savsatser införs för 30 s vardera. c)Elastisk lagringsmodul G′ och trögflytande förlust modulus G" som en funktion av frekvens vid en konstant 1% stam för olika PNP hydrogel formuleringar. d)Amplitud sveper med en konstant frekvens av 10 rad/s för att karakterisera elastisk lagring modulus G′ och trögflytande förlust modulus G" av PNP-hydrogeler som en funktion av stress. Denna reologiska karakterisering kan användas som jämförelse för kvalitetskontroll. Denna siffra har anpassats från Grosskopf et al.28Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3:In vitro-frisättning av bovint serumalbumin (BSA) från PNP-hydrogeler. Formuleringar betecknas som polymer wt.%: NP wt.%. a)Schematiskt som beskriver det experimentella in vitro-utgivningsprotokollet. Alikvoter avlägsnas från PNP hydrogel-laddade kapillärrör över tid. b)In vitro-frisättning av BSA från 1:10 PNP, 2:5 PNP och 2:10 PNP rapporterade som den massa som samlats in av den angivna tidspunkten dividerad med den totala massa som samlats in under analysen (data som visas som medelvärde ± SD; n = 3). BSA upptäcktes genom absorbansmätningar. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Figure 4
Figur 4:Termisk stabilitet hos insulin inkapslat i PNP-hydrogeler genom ThT-analys. Formuleringar betecknas som polymer wt.%: NP wt.%. Insulin inkapslat i både 1:5 och 2:10 PNP hydrogel förblev oaggregaterad i över 28 dagar vid stressade åldrande förhållanden på 37 °C och konstant agitation. Tid till aggregering för insulin formulerat i PBS var 20 ± 4 h (medelvärde ± SD, aggregeringströskel 750 000 AFU). Data som presenteras som ett genomsnitt av n = 4 experimentella replikat (AFU, godtyckliga fluorescensenheter). Denna siffra har anpassats från Meis et al.38Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 5
Figur 5:Cell livskraft och cellsättning i PNP-hydrogeler. a)Representativa bilder av livskraftiga hMSC i 1:5 PNP-hydrogeler med och utan det cellhäftande motivet arginin-glycin-asparaginsyra (RGD) som konjugerats till PEG-PLA NPs. hMSCs var calceinfärgade i 30 minuter före inneslutning. Skalstrecket representerar 100 μm. (b) Cellens livskraft dag 6 definierad som antalet fluorescerande celler i bilden i förhållande till antalet fluorescerande celler på dag 1 (data som visas som genomsnittlig ± SD. n = 3). c,d) Iartikel 3.1 skall Cellinkapsling och sedimentering av experiment med hMSCs. c) Bilder med maximal intensitet av kalcein AM-färgade hMSCs inkapslade i 1:1 PNP hydrogel (översta raden) och 1:5 PNP hydrogel (nedre raden) över 4 timmar för att kvantifiera cell bosättning. Skalstången representerar 1 mm. ( d )Genomsnittlighorisontell pixelintensitet för hMSC:er längs hydrogelens vertikala profil. Denna siffra har anpassats från Grosskopf et al.28Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Discussion

Polymer-Nanopartikel (PNP) hydrogeler tillverkas enkelt och möjliggör långsiktig lokal leverans av terapeutiska celler och läkemedel genom minimalt invasiv administrering via direkt injektion eller kateter leverans. Dessa protokoll beskriver formuleringen av PNP hydrogels och karakteriseringsmetoder för att säkerställa kvaliteten på de resulterande materialen. Supramolecular PNP hydrogels är skalbara att tillverka och bildas genom enkel blandning av modifierade cellulosapolymerer och polymera kärnskal nanopartiklar. De nuvarande metoderna beskriver underlättande förfaranden för att bilda geler förinstallerade i sprutor genom enkla armbågsblandning protokoll. Genom kvalitetskontrollmått för var och en av komponentdelarna, till exempel DLS för att övervaka NP-storlek och distribution, kan man reproducerbart formulera PNP-hydrogelmaterial med konsekventa reologiska egenskaper. Genom att variera mängden HPMC-C12 eller NPs kan man modulera maskstorleken och styvheten hos den resulterande PNP-hydrogelen. Dessa egenskaper kan justeras för att bäst passa en viss biomedicinsk applikation, och med de reologiska metoderna som beskrivs här kan forskare karakterisera PNP-hydrogels saxförtunnande och självläkande egenskaper när de optimerar plattformen för sina specifika applikationer. Metoder för in vitro-frisättningsstudier beskrivs också; forskare kan använda dessa studier för att karakterisera den relativa tidsskalan för frisättning av läkemedel av intresse, vilket informerar framtida in vivo-studier. Med hjälp av stabilitetsstudier kan forskare också bedöma dessa materials förmåga att bidra till att bevara den biologiska strukturen och stabiliteten hos känsliga bioterapeuter över tid och extrema temperaturer, med övertygande potentiella tillämpningar för att minska det kalla kedjeberoendet av bioterapeuter. Slutligen, med enkla cell livskraft analyser, cell tillväxt och migrering inom PNP material kan utvärderas, med potentiella tillämpningar i cellterapier och byggnadsställningar.

Vår grupp har hittat många övertygande applikationer för PNP hydrogel plattform27. PNP-hydrogeler har använts för långsam leverans av subunitvacciner, vilket gör det möjligt för matchade kinetiska frisättningsprofiler av antigener och adjuvanser att öka omfattningen, varaktigheten och kvaliteten på det humorala immunsvaret31. PNP-hydrogeler har visat sig ha en mindre maskstorlek än de vanligaste hydrogelerna, så de är effektiva för att bromsa diffusion och långsamt släppa molekylär last. De unika vävnadsankregeringsegenskaperna och mekaniska egenskaperna hos PNP-hydrogeler har också använts för att bilda fysiska barriärer för att förhindra vidhäftningar som uppstår vid kirurgi genom att spruta hydrogelerna över stora ytor av organ efter operation30. PNP hydrogeler har också visat sig vara effektiva cell leverans fordon, och de mekaniska egenskaperna skyddar faktiskt celler från de mekaniska krafter som förekommer i sprutan nålen under injektionen, förbättra cellens livskraft29. När NPs konjugeras med en cellhäftande peptid kan celler fästa och engagera sig med PNP-matrisen för att förbli livskraftiga. Med hjälp av detta tillvägagångssätt har PNP-hydrogeler visat sig förbättra den lokala retentionen av injicerade stamceller jämfört med metoder med flytande fordon28. Dessutom har PNP-hydrogeler visat sig förhindra termiskt inducerad aggregering av inkapslat insulin, även under hårda stressade åldrandeförhållanden, vilket tyder på att dessa material kan minska behovet av att kyla temperaturkänsliga läkemedel38.

Sammantaget kommer de metoder som beskrivs här att göra det möjligt för forskargrupper att tillverka och utforska PNP-hydrogeler som biomaterial. Dessa protokoll ger syntestekniker i labbskala för att tillverka tillräckligt med hydrogelmaterial för att bedriva både in vitro- och in vivo-studier. De studier som beskrivs ovan visar att de dynamiska tvärlänkarna i dessa material gör det möjligt att vara lämplig för en rad biomedicinska tillämpningar genom att tillåta aktiv motilitet hos instängda celler samtidigt som passiv diffusion av molekylär last begränsars. Det förväntas att forskare kommer att hitta PNP-plattformen ett tillgängligt och kraftfullt verktyg för att förbättra kliniska resultat genom kontrollerad läkemedelsleverans och för att studera grundläggande biologiska mekanismer som cellrekrytering och mekanobiologi.

Disclosures

Dessa författare har inget att avslöja.

Acknowledgments

Denna forskning stöddes ekonomiskt av Center for Human Systems Immunology med Bill & Melinda Gates Foundation (OPP1113682) och Bill & Melinda Gates Foundation (OPP1211043). C.M.M. stöttades av en Stanford examensstipendium och Stanford Bio-X William och Lynda Steere gemenskap. A.K.G. är tacksam för national science foundation graduate research fellowship och Gabilan Fellowship of the Stanford Graduate Fellowship in Science and Engineering. S.C. stöddes av National Cancer Institute of the National Institutes of Health under Award Number F32CA247352. Författarna vill också varmt erkänna Appel Lab-medlemmar inklusive Dr. Gillie Roth, Dr. Anthony Yu, Dr. Lyndsay Stapleton, Dr. Hector Lopez Hernandez, Dr. Andrea d'Aquino, Dr. Julie Baillet, Celine Liong, Ben Ou, Emily Meany, Emily Gale och Dr. Anton Smith för deras ansträngning och tid att hjälpa Appel Lab att utveckla dessa protokoll under åren.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
21G needles BD 305165 PNP hydrogel injection
22G, 4 in hypodermic needles Air-Tite N224 In vitro release studies
384-well plates, black, clear bottom Corning 3540 Dynamic light scattering (DLS)
96-well plates, black Fisher Scientific 07-200-627 Biostability studies
96-well plates, clear Corning 3599 Cell viability and settling studies
Calcein AM Thermo Fisher Scientific C3100MP Cell viability and settling studies
Capillary tubes McMaster-Carr 8729K66 In vitro release studies
Centrifugal filter units Fisher Scientific UFC901024 NP concentration
Cuvettes Millipore Sigma BR759015-100EA Cell viability and settling studies
DLS Plate Reader Wyatt Technology DynaPro II Plate Reader Dynamic light scattering (DLS)
Epoxy VWR International 300007-392 (EA) In vitro release studies
Hypodermic needles Air-Tite 8300015027 In vitro release studies
Luer elbow connector Cole-Parmer EW-30800-12 PNP hydrogel formulation
Luer lock syringe Fisher Scientific 14-955-456 PNP hydrogel formulation
Phosphate Buffered Saline (1x) Fisher Scientific 10010049 PNP hydrogel formulation
Plastic Spatula Thomas Scientific 1229F13 Rheological characterization
Plate Reader BioTek Synergy H1 Hybrid Multi-Mode Plate Reader Biostability studies
Plate seals Excel Scientific TS-RT2-100 Biostability studies
Recombinant human insulin Gibco A11382II Biostability studies
Rheometer TA Instruments DHR-2 Rheometer Rheological characterization
Thioflavin T Sigma-Aldrich T3516-5G Biostability studies

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Mandal, A., Clegg, J. R., Anselmo, A. C., Mitragotri, S. Hydrogels in the clinic. Bioengineering Translational Medicine. 5 (2), 10158 (2020).
  2. Appel, E. A., del Barrio, J., Loh, X. J., Scherman, O. A. Supramolecular polymeric hydrogels. Chemical Society Reviews. 41 (18), 6195-6214 (2012).
  3. Mann, J. L., Yu, A. C., Agmon, G., Appel, E. A. Supramolecular polymeric biomaterials. Biomaterials Science. 6 (1), 10-37 (2018).
  4. Foster, A. A., Marquardt, L. M., Heilshorn, S. C. The diverse roles of hydrogel mechanics in injectable stem cell transplantation. Current Opinion in Chemical Engineering. 15, 15-23 (2017).
  5. Aguado, B. A., Mulyasasmita, W., Su, J., Lampe, K. J., Heilshorn, S. C. Improving viability of stem cells during syringe needle flow through the design of hydrogel cell carriers. Tissue Engineering Part A. 18 (7-8), 806-815 (2012).
  6. Marquardt, L. M., Heilshorn, S. C. Design of injectable materials to improve stem cell transplantation. Current Stem Cell Reports. 2 (3), 207-220 (2016).
  7. Guvendiren, M., Burdick, J. A. Engineering synthetic hydrogel microenvironments to instruct stem cells. Current Opinion in Biotechnology. 24 (5), 841-846 (2013).
  8. Marquardt, L. M., et al. Designer, injectable gels to prevent transplanted Schwann cell loss during spinal cord injury therapy. Science Advances. 6 (14), 1039 (2020).
  9. Stephan, S. B., et al. Biopolymer implants enhance the efficacy of adoptive T-cell therapy. Nature Biotechnology. 33 (1), 97-101 (2015).
  10. Tuladhar, A., et al. Injectable hydrogel enables local and sustained co-delivery to the brain: two clinically approved biomolecules, cyclosporine and erythropoietin, accelerate functional recovery in rat model of stroke. Biomaterials. 235, 119794 (2020).
  11. Pakulska, M. M., Miersch, S., Shoichet, M. S. Designer protein delivery: From natural to engineered affinity-controlled release systems. Science. 351 (6279), (2016).
  12. Gupta, D., Tator, C. H., Shoichet, M. S. Fast-gelling injectable blend of hyaluronan and methylcellulose for intrathecal, localized delivery to the injured spinal cord. Biomaterials. 27 (11), 2370-2379 (2006).
  13. Verbeke, C. S., Mooney, D. J. Injectable, pore-forming hydrogels for in vivo enrichment of immature dendritic cells. Advanced Healthcare Materials. 4 (17), 2677-2687 (2015).
  14. Tous, E., Purcell, B., Ifkovits, J. L., Burdick, J. A. Injectable acellular hydrogels for cardiac repair. Journal of Cardiovascular Translational Research. 4 (5), 528-542 (2011).
  15. Zhao, X., et al. Antibacterial anti-oxidant electroactive injectable hydrogel as self-healing wound dressing with hemostasis and adhesiveness for cutaneous wound healing. Biomaterials. 122, 34-47 (2017).
  16. Johnson, T. D., Christman, K. L. Injectable hydrogel therapies and their delivery strategies for treating myocardial infarction. Expert Opinion on Drug Delivery. 10 (1), 59-72 (2013).
  17. Kleinman, H. K., Martin, G. R. Seminars in Cancer Biology. , Elsevier. 378-386 (2005).
  18. Hickey, J. W., et al. Engineering an artificial T-cell stimulating matrix for immunotherapy. Advanced Materials. 31 (23), 1807359 (2019).
  19. Baumann, M. D., et al. An injectable drug delivery platform for sustained combination therapy. Journal of Controlled Release. 138 (3), 205-213 (2009).
  20. Trappmann, B., et al. Matrix degradability controls multicellularity of 3D cell migration. Nature Communications. 8 (1), 1-8 (2017).
  21. Figueiredo, L., et al. Assessing glucose and oxygen diffusion in hydrogels for the rational design of 3D stem cell scaffolds in regenerative medicine. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 12 (5), 1238-1246 (2018).
  22. Daly, A. C., Riley, L., Segura, T., Burdick, J. A. Hydrogel microparticles for biomedical applications. Nature Reviews Materials. , 1-24 (2019).
  23. Chaudhuri, O., et al. Substrate stress relaxation regulates cell spreading. Nature Communications. 6 (1), 1-7 (2015).
  24. Cai, L., Dewi, R. E., Heilshorn, S. C. Injectable hydrogels with in situ double network formation enhance retention of transplanted stem cells. Advanced Functional Materials. 25 (9), 1344-1351 (2015).
  25. Fisher, S. A., Baker, A. E., Shoichet, M. S. Designing peptide and protein modified hydrogels: selecting the optimal conjugation strategy. Journal of the American Chemical Society. 139 (22), 7416-7427 (2017).
  26. Li, R. H., Altreuter, D. H., Gentile, F. T. Transport characterization of hydrogel matrices for cell encapsulation. Biotechnology and Bioengineering. 50 (4), 365-373 (1996).
  27. Appel, E. A., et al. Self-assembled hydrogels utilizing polymer-nanoparticle interactions. Nature Communications. 6 (6295), (2015).
  28. Grosskopf, A. K., et al. Injectable supramolecular polymer-nanoparticle hydrogels enhance human mesenchymal stem cell delivery. Bioengineering and Translational Medicine. 5 (1), 10147 (2020).
  29. Lopez Hernandez, H., Grosskopf, A. K., Stapleton, L. M., Agmon, G., Appel, E. A. Non-newtonian polymer-nanoparticle hydrogels enhance cell viability during injection. Macromolecular Bioscience. 19 (1), (2019).
  30. Stapleton, L. M., et al. Use of a supramolecular polymeric hydrogel as an effective post-operative pericardial adhesion barrier. Nature Biomedical Engineering. 3 (8), 611-620 (2019).
  31. Roth, G. A., et al. Injectable hydrogels for sustained codelivery of subunit vaccines enhance humoral immunity. ACS Central Science. , (2020).
  32. Steele, A. N., et al. A biocompatible therapeutic catheter-deliverable hydrogel for in situ tissue engineering. Advanced Healthcare Materials. 8 (5), 1801147 (2019).
  33. Fenton, O. S., et al. Injectable polymer-nanoparticle hydrogels for local immune cell recruitment. Biomacromolecules. 20 (12), 4430-4436 (2019).
  34. Yu, A. C., Smith, A. A., Appel, E. A. Structural considerations for physical hydrogels based on polymer-nanoparticle interactions. Molecular Systems Design & Engineering. 5 (1), 401-407 (2020).
  35. Wisdom, K., Chaudhuri, O. 3D Cell Culture: Methods and Protocols. Koledova, Z. , Springer. New York. 29-37 (2017).
  36. Lohmeijer, B. G., et al. Guanidine and amidine organocatalysts for ring-opening polymerization of cyclic esters. Macromolecules. 39 (25), 8574-8583 (2006).
  37. Cheng, J., et al. Formulation of functionalized PLGA-PEG nanoparticles for in vivo targeted drug delivery. Biomaterials. 28 (5), 869-876 (2007).
  38. Meis, C. M., et al. Self-assembled, dilution-responsive hydrogels for enhanced thermal stability of insulin biopharmaceuticals. ACS Biomaterials Science & Engineering. , (2020).
  39. Franck, A., Germany, T. Viscoelasticity and dynamic mechanical testing. TA Instruments. , New Castle, DE, USA. AN004 (1993).
  40. Appel, E. A., et al. Self-assembled hydrogels utilizing polymer-nanoparticle interactions. Nature Communications. 6, 6295 (2015).
  41. Gallastegui, A., et al. Controlled release of antibiotics from photopolymerized hydrogels: kinetics and microbiological studies. Materials Science and Engineering: C. 102, 896-905 (2019).
  42. Qiao, M., Chen, D., Ma, X., Liu, Y. Injectable biodegradable temperature-responsive PLGA-PEG-PLGA copolymers: synthesis and effect of copolymer composition on the drug release from the copolymer-based hydrogels. International Journal of Pharmaceutics. 294 (1-2), 103-112 (2005).
  43. Schlein, M. Insulin Formulation Characterization-The Thioflavin T Assays. The AAPS Journal. 19 (2), 397-408 (2017).
  44. Preibisch, S., Saalfeld, S., Tomancak, P. Globally optimal stitching of tiled 3D microscopic image acquisitions. Bioinformatics. 25 (11), 1463-1465 (2009).
  45. Sakas, G., Grimm, M., Savopoulos, A. EUROGRAPHICS workshop on Rendering Techniques. , Springer. 51-63 (1995).
  46. Axpe, E., et al. A multiscale model for solute diffusion in hydrogels. Macromolecules. 52 (18), 6889-6897 (2019).
  47. Peppas, N., Bures, P., Leobandung, W., Ichikawa, H. Hydrogels in pharmaceutical formulations. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 50 (1), 27-46 (2000).
  48. Ritger, P. L., Peppas, N. A. A simple equation for description of solute release I. Fickian and non-fickian release from non-swellable devices in the form of slabs, spheres, cylinders or discs. Journal of Controlled Release. 5 (1), 23-36 (1987).
  49. Reinhart, C. T., Peppas, N. A. Solute diffusion in swollen membranes. Part II. Influence of crosslinking on diffusive properties. Journal of Membrane Science. 18, 227-239 (1984).
  50. Salinas, C. N., Anseth, K. S. The influence of the RGD peptide motif and its contextual presentation in PEG gels on human mesenchymal stem cell viability. Journal of Tissue Engineering and Regenerative. 2 (5), 296-304 (2008).
  51. Smith, A. A., et al. Nanoparticles presenting potent TLR7/8 agonists enhance anti-PD-L1 immunotherapy in cancer treatment. Biomacromolecules. 21 (9), 3704-3712 (2020).

Tags

Bioengineering Nummer 168 läkemedelsleverans cellinkapsling biomaterial hydrogeler biofarmaceutiska läkemedel
Injicerbara supramolecular Polymer-Nanopartikelhydrogeler för cell- och läkemedelsleveransapplikationer
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Meis, C. M., Grosskopf, A. K.,… More

Meis, C. M., Grosskopf, A. K., Correa, S., Appel, E. A. Injectable Supramolecular Polymer-Nanoparticle Hydrogels for Cell and Drug Delivery Applications. J. Vis. Exp. (168), e62234, doi:10.3791/62234 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter