Injicerbara supramolecular Polymer-Nanopartikelhydrogeler för cell- och läkemedelsleveransapplikationer

Vårt protokoll underlättar formuleringen av polymer-nanopartikelhydrogeler för användning som biomaterial. Vi hoppas att forskare kommer att utveckla detta material för translationella tillämpningar och utforska grundläggande biologiska frågor. PNP hydrogeler injiceras lätt genom små diameter nålar och katetrar, men snabbt självläker efter injektion.

Detta möjliggör icke-invasiv kontrollerad leverans av läkemedel och celler över långa tidsskalor. Denna teknik tänjer på gränserna för lokaliserad terapi och utökad läkemedelsfrisättning, med konsekvenser för breda rasande tillstånd från cancer till vävnadsregenerering till passiv immunisering. För att syntetisera nanopartiklar genom nanoutfällning, tillsätt 50 milligram PEG-PLA-polymer till en åtta milliliter glasscintillationsflaska och tillsätt en milliliter acetonitril till flaskan.

Vortex för att helt lösa upp. Tillsätt sedan 10 milliliter ultrarent vatten till en 20 milliliter glasscintillationsflaska med en liten omrörningsstång och placera injektionsflaskan på en omrörningsplatta inställd på 600 varv per minut. Använd en 200 mikroliterpipett för att tillsätta en milliliter polymerlösning droppevis till vattenflaskan.

Nanopartiklar av kärnskal kommer att bildas när polymerlösningen snabbt sprids i hela vattnet. Kontrollera partikelstorleken genom dynamisk ljusspridning enligt standardprotokoll. Överför sedan nanopartikellösningen till en centrifugalfilterenhet för att koncentrera lösningen till mindre än 250 mikroliter och återanvänd nanopartiklarna i en lämplig buffert.

För att förbereda hydrogelen, tillsätt 333 milligram 6%HPMC-C12 stamlösning till en milliliter Luer låsspruta och tillsätt 500 mikroliter av 20%nanopartikellagerlösningen och 167 mikroliter PBS till en åtta milliliter flaska. Efter blandning, använd en nål för att fylla ytterligare en milliliter Luer lås spruta med den utspädda nanopartikellösningen och fäst de två sprutorna på en armbågsblandare. Blanda de två lösningarna i cirka 60 cykler tills ett homogent, ogenomskinligt vitt hydrogelmaterial har bildats.

För att mäta de reologiska egenskaperna hos den formulerade hydrogelen, injicera lämplig volym hydrogel enligt det valda geometrigapet i mitten av en räfflad reometerplatta och använd svängnings- och flödestester för att mäta provets mekaniska egenskaper. För att karakterisera läkemedelsfrisättning från hydrogelen, förbered först en glas kapillär genom att använda epoxi för att försegla ena änden av varje rör. När epoxiet har ställts in, använd en fyra tums 22 gauge hypodermisk nål för att injicera 100 till 200 mikroliter hydrogel i minst tre rör per prov och tillsätt försiktigt 200 till 300 mikroliter PBS på varje volym hydrogel.

Vid lämpliga tidpunkter, enligt den förväntade tidsskalan för läkemedelsfrisättning, använd en nål för att försiktigt ta bort PBS från varje kapillär utan att störa hydrogelytan och tillsätt en ny volym PBS. När studien är klar analyserar du de insamlade PBS-alikvoterna med en lämplig metod för att kvantifiera mängden läkemedel som frigörs vid varje tidpunkt. För att karakterisera den termiska stabiliteten hos gelinkapslat insulin, ladda både insulin och tioflavin T i hydrogelen som demonstreras och använd en 21-gauge nål för att injicera 200 mikroliter av lasten och sonden lastad hydrogel i minst tre brunnar av en svart 96-brunnsplatta per prov.

Försegla sedan plattan med en optiskt klar självhäftande platttätning för att förhindra avdunstning och för in plattan i en plåtläsare utrustad med temperaturkontroll, skakningar och en kinetisk avläsningsprogrammering. För att bedöma hydrogelens inkapslade cellkraft, använd en 21 gauge nål för att injicera 150 mikroliter hydrogel som innehåller lämplig koncentration av celler i var och en av tre brunnar per prov i en klar botten 96-brunnsplatta och tillsätt 100 mikroliter av lämpligt cellmedium i varje volym hydrogel. På dag ett av kulturen, byt ut supernatanten på varje hydrogel vid lämplig tidpunkt för varje provgrupp med 50 mikroliter av två millimolar Calcein AM-lösning.

Efter en 30 minuters inkubation, avbilda mitten av varje brunn genom konfokal mikroskopi. För att utvärdera de inkapslade cellernas förmåga att bosätta sig i en spruta före injektionen, späd ut de celler som är av intresse till en gång 10 till de sex cellerna per milliliter i PBS-koncentrationen och färga cellerna med 50 mikroliter av två millimolar Calcein AM i 10 minuter vid rumstemperatur. Blanda cellerna med 500–700 mikroliter hydrogel i slutet av inkubationen, som påvisats och använd en 21 gauge nål för att injicera 100 till 200 mikroliter cell som innehåller hydrogel i botten av minst en cuvette per prov.

Avbilda sedan cuvettesna som ligger platta på sidorna på scenen i ett konfokalt mikroskop omedelbart efter injektionen och vid en och fyra timmar efter sådd för att observera om cellerna har bosatt sig i hydrogelen eller om de har förblivit upphängda. Geléns upptunning och självläkningsförmåga kan observeras med hjälp av flödessvep och stegsjuvningsprotokoll. Karakterisering av lagrings- och förlustmoduli med hjälp av ett svängande shearfrekvenssvepningsexperiment i den linjära viskoelastiska regimen vid frekvens varierar från 0,1 till 100 radianer per sekund avslöjar de fasta egenskaperna.

Det bör vanligtvis inte finnas en crossover av savlagring och förlust moduli observeras vid låga frekvenser för styvare formuleringar, medan crossover händelser kan förväntas för en svagare hydrogel formuleringar. Att variera polymerhalten i PNP-hydrogelerna kan ha en direkt inverkan på spridningen av last genom polymernätet och utsläppshastigheten från materialen. PNP-hydrogeler kan också stabilisera last som är mottaglig för termisk instabilitet, avsevärt förlänga lastens hållbarhetstid och minska beroendet av lagring och distribution av kylkedjan.

Införandet av integrin motiv kan vara användbart för att anpassa PNP hydrogels för cellulära terapier. Inkapslade celler kan fluorescerande märkas för att underlätta deras visualisering och kvantifiering. Till exempel kommer formuleringar som saknar vidhäftningsplatser att ha en låg cell livskraft eftersom inkapslade celler misslyckas med att föröka sig jämfört med celler inkapslade och formuleringar med vidhäftningsmotiv, såsom RGD.

Vi undersöker fortfarande hur förändringar i formuleringen påverkar polymermatrisens reologiska egenskaper och dynamiska nät. Vi använder också FRAP för att studera diffusion av molekyler inom hydrogelen. Dessa material kan användas för att ställa nya biologiska frågor om hur hållbar leverans kan påverka läkemedelsleverans, vaccinutveckling eller cancerimmunterapi.