Detta protokoll beskriver syntesen och formuleringen av injicerbara, supramolecular polymer-nanopartiklar (PNP) hydrogel biomaterial. Tillämpningar av dessa material för läkemedelsleverans, biofarmaceutisk stabilisering och cellinkapsling och leverans demonstreras.
Dessa metoder beskriver hur man formulerar injicerbara, supramolecular polymer-nanopartiklar (PNP) hydrogeler för användning som biomaterial. PNP-hydrogeler består av två komponenter: hydrofobiskt modifierad cellulosa som nätverkspolymer och självmonterade nanopartiklar av kärnskal som fungerar som icke-kovalenta tvärlänkare genom dynamiska, multivalenta interaktioner. Dessa metoder beskriver både bildandet av dessa självmonterade nanopartiklar genom nanoprecipitation samt formulering och blandning av de två komponenterna för att bilda hydrogeler med tunable mekaniska egenskaper. Användningen av dynamisk ljusspridning (DLS) och reologi för att karakterisera kvaliteten på de syntetiserade materialen är också detaljerad. Slutligen, nyttan av dessa hydrogeler för läkemedelsleverans, biofarmaceutisk stabilisering och cell inkapsling och leverans demonstreras genom in vitro experiment för att karakterisera läkemedelsfrisättning, termisk stabilitet och cell bosättning och livskraft. På grund av dess biokompatibilitet, injicerbarhet och milda gelbildningsförhållanden är detta hydrogelsystem en lätt tunable plattform som är lämplig för en rad biomedicinska applikationer.
Injicerbara hydrogeler är ett framväxande verktyg för att leverera terapeutiska celler och läkemedel till kroppen på ett kontrollerat sätt1. Dessa material kan laddas med läkemedel eller celler och kan administreras på ett minimalt invasivt sätt genom direkt injektion till ytliga vävnader eller genom kateterleverans till djupa vävnader. I allmänhet består injicerbara hydrogeler av vattensvullna polymernätverk som är sammankopplade av övergående, fysiska interaktioner. I vila ger dessa tvärlänkar en solid struktur till gelerna, men vid applicering av tillräcklig mekanisk kraft störs dessa korslänkar tillfälligt och omvandlar materialet till ett vätskeliknande tillstånd som lätt kan flöda2. Det är dessa reologiska egenskaper som gör det möjligt för fysiska hydrogeler att shear-tunna och flöda genom små nåldiametrar under injektion3. Efter injektionen, polymernätverket av materialreformerna, så att det kan självläka och snabbt bilda en fast-liknande gel på plats4,5. Dessa strukturer kan fungera som långsamma depåer för droger eller byggnadsställningar för vävnadsregenerering6,7. Dessa material har använts i olika tillämpningar som omfattar läkemedelsleveransteknik, regenerativ medicin och immunengineering1,8,9,10,11,12.
Både naturmaterial (t.ex. alginat och kollagen) och syntetiska material (t.ex. poly(etylenglykol) (PEG) eller liknande hydrofila polymerer) har utvecklats som biokompatierbara injicerbara hydrogelmaterial13,14,15. Många naturmaterial uppvisar batch-till-parti variation som påverkar reproducerbarhet4,16. Dessa material är ofta temperaturkänsliga, härdning vid uppnående av fysiologiska temperaturer; Hanteringen av dessa material innebär således ytterligare tekniska och logistiska utmaningar17. Syntetiska material möjliggör mer exakt kemisk kontroll och utmärkt reproducerbarhet, men dessa material kan ibland utsättas för negativa immunsvar som begränsar deras biokompatibilitet, en kritisk egenskap för in vivo terapeutiskaapplikationer 6,18,19. De senaste ansträngningarna har visat att det finns många komplexa designkriterier involverade i att konstruera ett injicerbart hydrogelmaterial, inklusive optimering av mekaniska egenskaper, polymernätverkets maskstorlek, bioaktiva molekylära signaler, biologisk nedbrytbarhet och immunogenicitet hos materialet20,21,22,23,24,25,26. Alla dessa faktorer måste beaktas beroende på intresse, vilket innebär att en modulär, kemiskt tunable plattform är idealisk för att tillfredsställa en bred bredd av applikationer.
De nuvarande metoderna beskriver formuleringen och användningen av en injicerbar polymer-nanopartikel (PNP) hydrogelplattform som uppvisar tunable mekaniska egenskaper, en hög grad av biokompatibilitet och låg immunogenicitet, och presenterar platser för konjugering bioaktiva molekylära signaler27,28,29,30,31,32,33. Dessa PNP-hydrogeler består av hydrofobiskt modifierade cellulosapolymerer och självmonterade nanopartiklar av kärnskal som består av poly(etylenglykol)-block-poly(mjölksyra) (PEG-PLA)27,34 som interagerar för att producera ett supramolecular nätverk. Mer specifikt interagerar de dodecylmodifierade hydroxypropylmetylcellulosapolymererna (HPMC-C12)dynamiskt med ytan av PEG-PLA-nanopartiklar och överbryggar mellan dessa nanopartiklar för att bilda detta polymernätverk27,34. Dessa dynamiska, multivalenta interaktioner gör det möjligt för materialen att shear-tunna under injektionen och snabbt självläka efter administrering. PNP-hydrogelkomponenterna tillverkas enkelt genom enkla enpottsreaktioner och PNP-hydrogelen bildas under milda förhållanden genom enkel blandning av de två komponenterna35. På grund av enkel tillverkning är denna hydrogelplattform mycket översättbar i stor skala. PNP-hydrogels mekaniska egenskaper och maskstorlek styrs genom att polymer- och nanopartiklarnas viktprocent ändras i formuleringen. Tidigare studier med denna plattform visar att PNP-hydrogeler är mycket biologiskt stödberättigande, biologiskt nedbrytbara och icke-immunogena28,30,31. Sammantaget presenterar dessa hydrogeler bred nytta i biomedicinska tillämpningar som omfattar postoperativ vidhäftning förebyggande, vävnadsteknik och regenerering, ihållande läkemedelsleverans och immunengineering.
Polymer-Nanopartikel (PNP) hydrogeler tillverkas enkelt och möjliggör långsiktig lokal leverans av terapeutiska celler och läkemedel genom minimalt invasiv administrering via direkt injektion eller kateter leverans. Dessa protokoll beskriver formuleringen av PNP hydrogels och karakteriseringsmetoder för att säkerställa kvaliteten på de resulterande materialen. Supramolecular PNP hydrogels är skalbara att tillverka och bildas genom enkel blandning av modifierade cellulosapolymerer och polymera kärnskal nanopartiklar. De nuvarande metoderna beskriver underlättande förfaranden för att bilda geler förinstallerade i sprutor genom enkla armbågsblandning protokoll. Genom kvalitetskontrollmått för var och en av komponentdelarna, till exempel DLS för att övervaka NP-storlek och distribution, kan man reproducerbart formulera PNP-hydrogelmaterial med konsekventa reologiska egenskaper. Genom att variera mängden HPMC-C12 eller NPs kan man modulera maskstorleken och styvheten hos den resulterande PNP-hydrogelen. Dessa egenskaper kan justeras för att bäst passa en viss biomedicinsk applikation, och med de reologiska metoderna som beskrivs här kan forskare karakterisera PNP-hydrogels saxförtunnande och självläkande egenskaper när de optimerar plattformen för sina specifika applikationer. Metoder för in vitro-frisättningsstudier beskrivs också; forskare kan använda dessa studier för att karakterisera den relativa tidsskalan för frisättning av läkemedel av intresse, vilket informerar framtida in vivo-studier. Med hjälp av stabilitetsstudier kan forskare också bedöma dessa materials förmåga att bidra till att bevara den biologiska strukturen och stabiliteten hos känsliga bioterapeuter över tid och extrema temperaturer, med övertygande potentiella tillämpningar för att minska det kalla kedjeberoendet av bioterapeuter. Slutligen, med enkla cell livskraft analyser, cell tillväxt och migrering inom PNP material kan utvärderas, med potentiella tillämpningar i cellterapier och byggnadsställningar.
Vår grupp har hittat många övertygande applikationer för PNP hydrogel plattform27. PNP-hydrogeler har använts för långsam leverans av subunitvacciner, vilket gör det möjligt för matchade kinetiska frisättningsprofiler av antigener och adjuvanser att öka omfattningen, varaktigheten och kvaliteten på det humorala immunsvaret31. PNP-hydrogeler har visat sig ha en mindre maskstorlek än de vanligaste hydrogelerna, så de är effektiva för att bromsa diffusion och långsamt släppa molekylär last. De unika vävnadsankregeringsegenskaperna och mekaniska egenskaperna hos PNP-hydrogeler har också använts för att bilda fysiska barriärer för att förhindra vidhäftningar som uppstår vid kirurgi genom att spruta hydrogelerna över stora ytor av organ efter operation30. PNP hydrogeler har också visat sig vara effektiva cell leverans fordon, och de mekaniska egenskaperna skyddar faktiskt celler från de mekaniska krafter som förekommer i sprutan nålen under injektionen, förbättra cellens livskraft29. När NPs konjugeras med en cellhäftande peptid kan celler fästa och engagera sig med PNP-matrisen för att förbli livskraftiga. Med hjälp av detta tillvägagångssätt har PNP-hydrogeler visat sig förbättra den lokala retentionen av injicerade stamceller jämfört med metoder med flytande fordon28. Dessutom har PNP-hydrogeler visat sig förhindra termiskt inducerad aggregering av inkapslat insulin, även under hårda stressade åldrandeförhållanden, vilket tyder på att dessa material kan minska behovet av att kyla temperaturkänsliga läkemedel38.
Sammantaget kommer de metoder som beskrivs här att göra det möjligt för forskargrupper att tillverka och utforska PNP-hydrogeler som biomaterial. Dessa protokoll ger syntestekniker i labbskala för att tillverka tillräckligt med hydrogelmaterial för att bedriva både in vitro- och in vivo-studier. De studier som beskrivs ovan visar att de dynamiska tvärlänkarna i dessa material gör det möjligt att vara lämplig för en rad biomedicinska tillämpningar genom att tillåta aktiv motilitet hos instängda celler samtidigt som passiv diffusion av molekylär last begränsars. Det förväntas att forskare kommer att hitta PNP-plattformen ett tillgängligt och kraftfullt verktyg för att förbättra kliniska resultat genom kontrollerad läkemedelsleverans och för att studera grundläggande biologiska mekanismer som cellrekrytering och mekanobiologi.
The authors have nothing to disclose.
Denna forskning stöddes ekonomiskt av Center for Human Systems Immunology med Bill & Melinda Gates Foundation (OPP1113682) och Bill & Melinda Gates Foundation (OPP1211043). C.M.M. stöttades av en Stanford examensstipendium och Stanford Bio-X William och Lynda Steere gemenskap. A.K.G. är tacksam för national science foundation graduate research fellowship och Gabilan Fellowship of the Stanford Graduate Fellowship in Science and Engineering. S.C. stöddes av National Cancer Institute of the National Institutes of Health under Award Number F32CA247352. Författarna vill också varmt erkänna Appel Lab-medlemmar inklusive Dr. Gillie Roth, Dr. Anthony Yu, Dr. Lyndsay Stapleton, Dr. Hector Lopez Hernandez, Dr. Andrea d’Aquino, Dr. Julie Baillet, Celine Liong, Ben Ou, Emily Meany, Emily Gale och Dr. Anton Smith för deras ansträngning och tid att hjälpa Appel Lab att utveckla dessa protokoll under åren.
21G needles | BD | 305165 | PNP hydrogel injection |
22G, 4 in hypodermic needles | Air-Tite | N224 | In vitro release studies |
384-well plates, black, clear bottom | Corning | 3540 | Dynamic light scattering (DLS) |
96-well plates, black | Fisher Scientific | 07-200-627 | Biostability studies |
96-well plates, clear | Corning | 3599 | Cell viability and settling studies |
Calcein AM | Thermo Fisher Scientific | C3100MP | Cell viability and settling studies |
Capillary tubes | McMaster-Carr | 8729K66 | In vitro release studies |
Centrifugal filter units | Fisher Scientific | UFC901024 | NP concentration |
Cuvettes | Millipore Sigma | BR759015-100EA | Cell viability and settling studies |
DLS Plate Reader | Wyatt Technology | DynaPro II Plate Reader | Dynamic light scattering (DLS) |
Epoxy | VWR International | 300007-392 (EA) | In vitro release studies |
Hypodermic needles | Air-Tite | 8300015027 | In vitro release studies |
Luer elbow connector | Cole-Parmer | EW-30800-12 | PNP hydrogel formulation |
Luer lock syringe | Fisher Scientific | 14-955-456 | PNP hydrogel formulation |
Phosphate Buffered Saline (1x) | Fisher Scientific | 10010049 | PNP hydrogel formulation |
Plastic Spatula | Thomas Scientific | 1229F13 | Rheological characterization |
Plate Reader | BioTek | Synergy H1 Hybrid Multi-Mode Plate Reader | Biostability studies |
Plate seals | Excel Scientific | TS-RT2-100 | Biostability studies |
Recombinant human insulin | Gibco | A11382II | Biostability studies |
Rheometer | TA Instruments | DHR-2 Rheometer | Rheological characterization |
Thioflavin T | Sigma-Aldrich | T3516-5G | Biostability studies |