ERRATUM NOTICE
Important: There has been an erratum issued for this article. Read more …
Summary
يوفر البروتوكول المقدم هنا نهجا خطوة بخطوة لعزل الضامة القلبية المقيمة من العقدة الجيبية الأذينية (SAN) ومنطقة العقدة الأذينية البطينية (AVN) لقلوب الفئران.
Abstract
وقد ثبت أن البلاعم القلبية المقيمة تسهل التوصيل الكهربائي في القلب. يبدأ إيقاع القلب الفسيولوجي بنبضات كهربائية متولدة في العقدة الجيبية الأذينية (SAN) ثم يتم إجراؤها على البطينين عبر العقدة الأذينية البطينية (AVN). لمزيد من الدراسة لدور البلاعم المقيمة في نظام التوصيل القلبي ، من الضروري عزل البلاعم المقيمة بشكل صحيح عن SAN و AVN ، لكنه لا يزال يمثل تحديا. هنا ، نقدم بروتوكولا للتشريح المجهري الموثوق به ل SAN و AVN في قلوب الفئران متبوعا بعزل وثقافة الضامة المقيمة.
يتم تحديد وتشريح كل من SAN الذي يقع عند تقاطع محطة crista مع الوريد الأجوف العلوي ، و AVN الذي يقع في قمة مثلث Koch ، وتشريحه بشكل دقيق. يتم تأكيد الموقع الصحيح من خلال التحليل النسيجي للأنسجة التي أجريت مع صبغة ماسون ثلاثية الألوان ومضاد HCN4.
ثم يتم هضم الأنسجة المجهرية إنزيميا للحصول على معلقات خلية واحدة تليها الحضانة مع لوحة محددة من الأجسام المضادة الموجهة ضد علامات سطح محددة من نوع الخلية. يسمح ذلك بتحديد أو عد أو عزل مجموعات الخلايا المختلفة عن طريق فرز الخلايا المنشطة بالفلورسنت. للتمييز بين الضامة القلبية المقيمة والخلايا المناعية الأخرى في عضلة القلب ، وخاصة الضامة المشتقة من الخلايا الوحيدة ، هناك حاجة إلى استراتيجية بوابة دقيقة. أولا ، يتم الكشف عن خلايا السلالة اللمفاوية واستبعادها من مزيد من التحليل. بعد ذلك ، يتم تحديد الخلايا النخاعية مع تحديد البلاعم المقيمة من خلال التعبير العالي لكل من CD45 و CD11b ، والتعبير المنخفض عن Ly6C. مع فرز الخلايا ، يمكن بعد ذلك زراعة البلاعم القلبية المعزولة في المختبر على مدار عدة أيام لمزيد من التحقيق. لذلك ، نصف بروتوكولا لعزل البلاعم القلبية الموجودة داخل نظام التوصيل القلبي. نناقش المزالق في التشريح الدقيق وهضم SAN و AVN ، ونقدم استراتيجية بوابات لتحديد الضامة القلبية وعدها وفرزها بشكل موثوق عن طريق فرز الخلايا المنشط بالفلورة.
Introduction
تبدأ العقدة الجيبية الأذينية (SAN) من الناحية الفسيولوجية النبضة الكهربائية ، وبالتالي فهي جهاز تنظيم ضربات القلب الأساسي. تقوم العقدة الأذينية البطينية (AVN) بتوصيل النبضة الكهربائية من الأذينين إلى البطينين وتعمل أيضا كجهاز تنظيم ضربات القلب الفرعي1. بشكل عام ، يعد توليد وتوصيل النبضات الكهربائية عملية معقدة يمكن تعديلها بواسطة عوامل مختلفة2 ، بما في ذلك البلاعم المقيمة في مناطق SAN / AVN. توضح دراسة حديثة أجراها Hulsmans et al. مجموعة محددة من الضامة القلبية المقيمة التي يتم تخصيبها في AVN وتعمل كلاعبين رئيسيين في الحفاظ على ضربات قلب ثابتة3. ووجدوا أن البلاعم مقترنة كهربائيا بخلايا عضلة القلب ويمكن أن تغير الخصائص الكهربائية لخلايا عضلة القلب المقترنة. لاحظ المؤلفون أيضا أن مثل هذه الخلايا الموصلة التي تتداخل مع الضامة موجودة أيضا في مكونات أخرى من نظام التوصيل القلبي ، مثل SAN.
حاليا ، من غير المعروف تماما ما إذا كان النمط الظاهري للبلاعم القلبية المقيمة يختلف بين مناطق القلب. ومع ذلك ، فقد ثبت أن البيئة المكروية للأنسجة يمكن أن تؤثر على النسخ والتجديد التكاثري للبلاعم الأنسجية4. علاوة على ذلك ، نظرا لأنه ثبت أن النمط الظاهري للخلية العضلية القلبية مختلف بين المناطق ، فقد تكون التأثيرات الوظيفية للبلاعم على خلايا عضلة القلب خاصة بالمنطقة ، حتى لو كان النمط الظاهري للبلاعم نفسه هو نفسه. لذلك ، هناك حاجة إلى مزيد من الدراسات على مناطق قلبية محددة.
أظهرت الدراسات الحديثة أنه في حالة مستقرة ، يتم إنشاء البلاعم المقيمة في الأنسجة قبل الولادة ، وتنشأ بشكل مستقل عن تكون الدم النهائي ، وتستمر حتى مرحلة البلوغ5. ومع ذلك ، بعد استنفاد البلاعم أو أثناء التهاب القلب ، تساهم حيدات Ly6chi في تجديد عدد البلاعم القلبية6. أظهرت الدراسات التي تضمنت تتبع النسب الجيني ، و parabiosis ، ورسم خرائط المصير ، وتتبع الخلايا تعايش مجموعة متنوعة من مجموعات البلاعم المقيمة في الأنسجة في الأعضاء والأنسجة ، وكذلك السلوك الخلوي المختلف للمجموعات الفرعية من البلاعم التي يحتمل أن تكون مرتبطة بتطورها7،8،9.
استفاد توصيف البلاعم القلبية المقيمة من استخدام فرز الخلايا المنشطة المغناطيسية (MACS) وفرز الخلايا المنشطة بالفلورسنت. هذه الطرق مفيدة بشكل خاص لعزل مجموعات خلايا معينة من كسور الأنسجة المتعددة عن طريق تسميتها بعلامات سطح الخلية. هذا لا يؤدي فقط إلى نقاء أعلى لنوع الخلايا المناعية المعزولة ، ولكنه يسمح أيضا بتحليل النمط الظاهري. هنا ، نقدم بروتوكولا يتضمن خلايا مغلفة بالخرز المغناطيسي متبوعا بفرز الخلايا المنشطة بالفلورسنت لإثراء الضامة القلبية المقيمة المعزولة على وجه التحديد من منطقة SAN و AVN.
لاستكشاف خصائص البلاعم القلبية المقيمة في نظام التوصيل ووظيفتها في التوصيل القلبي وعدم انتظام ضربات القلب ، يعد التوطين الدقيق وتشريح SAN و AVN أمرا بالغ الأهمية. للتشريح المجهري ل SAN و AVN ، يتم استخدام المعالم التشريحية لتحديد المنطقة10. باختصار ، يقع SAN عند تقاطع الوريد الأجوف العلوي والأذين الأيمن. يقع AVN داخل مثلث كوخ ، الذي يحده من الأمام نشرة الحاجز للصمام ثلاثي الشرف ، وخلفيا وتر تودارو11. كما نقدم إجراء تشريح دقيق ل SAN و AVN في الفئران وهو ما تؤكده الأنسجة وتلطيخ التألق المناعي.
يمكن استخدام البلاعم المقيمة المعزولة لإجراء مزيد من التجارب مثل تسلسل الحمض النووي الريبي أو يمكن استعادتها وزراعتها لأكثر من أسبوعين مما يسمح بإجراء تجارب مختلفة في المختبر. لذلك ، يصف بروتوكولنا إجراء قيما للغاية لأخصائي الإيقاع المناعي. يوضح الجدول 1 تكوين جميع الحلول اللازمة ، ويبين الشكل 1 معالم التشريح المجهري ل SAN و AVN. الشكل 2 هو توضيح تخطيطي لتوطين SAN و AVN. يوضح الشكل 3 التلوين النسيجي ل SAN و AVN (تلطيخ ماسون ثلاثي الألوان والتألق المناعي). يوضح الشكل 4 استراتيجية بوابة خطوة بخطوة لعزل البلاعم القلبية المقيمة عن طريق فرز الخلايا المنشط بالفلورة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تم إجراء رعاية الحيوان وجميع الإجراءات التجريبية وفقا للمبادئ التوجيهية للجنة رعاية الحيوان والأخلاقيات بجامعة ميونيخ وتمت الموافقة على جميع الإجراءات المتخذة على الفئران من قبل حكومة بافاريا ، ميونيخ ، ألمانيا. تم الحصول على الفئران C57BL6 / J تجاريا.
1. الاستعدادات
- قم بإعداد مخزن فرز الخلايا (الجدول 1) وتخزينه في 4 درجات مئوية.
ملاحظة: أثناء الإجراء التجريبي بأكمله ، يجب أن يكون المخزن المؤقت لفرز الخلايا دائما على الجليد. - تحضير مخزن الهضم المؤقت (الجدول 1) قبل وقت قصير من عملية الهضم حيث لا يمكن اكتشاف نشاط كولاجيناز إلا لبضع ساعات في درجة حرارة الغرفة.
- الرجوع إلى البروتوكول المنشور مسبقا لإعداد طبق التشريح10. باختصار ، أضف 30 مل من هلام الأغاروز (3٪ -4٪) إلى طبق بتري بقطر 100 مم واتركه يبرد في درجة حرارة الغرفة.
2. التضحية بالحيوانات واستئصال القلب
- تخدير الفأر باستخدام إيزوفلوران عن طريق وضعه في غرفة حضانة متصلة بمبخر إيزوفلوران وغسله بنسبة 5٪ إيزوفلوران / 95٪ أكسجين.
- بعد حقن الفنتانيل للتسكين ، افتح القفص الصدري وقم بتخلل القلب عن طريق حقن 5-10 مل من الثلج البارد 1x PBS مباشرة في البطين الأيسر (LV). استخراج قلب الفئران ووضعه على طبق التشريح. تم وصف التفاصيل التجريبية بالتفصيل سابقا10.
3. تشريح دقيق ل SAN و AVN
- بعد عزل القلب ، قم بإجراء عمليات التشريح المجهري التالية في طبق التشريح باستخدام 1x PBS المثلج تحت مجهر التشريح.
- استخدم المعالم التشريحية القلبية ، مثل الشريان الأورطي ، الشريان الرئوي ، الجيب التاجي ، البطين الأيسر / الأيمن ، إلخ. لتحديد اليسار / اليمين (اليسار: LV ؛ اليمين: RV) والأمامي / الخلفي (الأمامي: الشريان الأورطي ؛ الخلفي: الجيب التاجي) للقلب. بعد تحديد الاتجاه ، أدر القلب مع الجزء الأمامي منه في أسفل الطبق (لفضح الأوردة الكبيرة الموجودة في الخلف).
- تشريح مجهري لشبكة SAN
ملاحظة: تم وصف التشريح الدقيق لشبكة SAN سابقا10. يتم وصف العملية باختصار أدناه.- كشف المنطقة بين الأجوف عن طريق تثبيت الزوائد الأذينية اليمنى (RAA) والأنسجة المجاورة للوريد الأجوف العلوي (SVC) والوريد الأجوف السفلي (IVC) على طبق التشريح المجهري باستخدام دبابيس الحشرات.
- قطع القلب على طول الحاجز بين الأذينين بالتوازي مع crista terminalis (CT) لفصل المنطقة بين الأجوف والحصول على عينة SAN (الشكل 1A ، الشكل 2A). ضع العينة في أنبوب طرد مركزي دقيق فارغ سعة 1.5 مل على الثلج.
- تشريح مجهري للانواع اللاوعائي
- بعد جمع عينة SAN ، تأكد من أن RAA وأجزاء من الأذين الأيمن (RA) قد تم قطعها بالفعل ولم يتبق سوى الحاجز بين الأذينين (IAS) والحاجز بين البطينين (IVS).
- قم بتثبيت الأجزاء المتبقية من القلب من خلال الأنسجة المجاورة ل IAS و IVS باستخدام دبابيس الحشرات لجعل الجانب الأذيني الأيمن من IAS متجها لأعلى.
- انظر إلى الأذين الأيمن على سطح الشغاف لمثلث كوخ. سيحده من الأمام الخط المفصلي لنشرة الحاجز للصمام ثلاثي الشرف (TV) ، وخلفيا وتر تودارو. لوحظ فتحة الجيب التاجي في القاعدة. (الشكل 1 ب ، الشكل 2 ب).
- قطع مثلث كوخ ، الذي يحتوي على AVN ، ووضعه مباشرة في أنبوب طرد مركزي دقيق فارغ سعة 1.5 مل على الجليد.
4. الهضم
- تحضير مخزن الهضم المؤقت (الجدول 1) قبل وقت قصير من الاستخدام.
- فرم أنسجة SAN و AVN جيدا باستخدام المشارط.
ملاحظة: فرم الأنسجة جيدا سيزيد من كفاءة الهضم ويساعد في الحصول على تعليق خلوي جيد للفرز. نظرا لأن عينات SAN و AVN صغيرة جدا ، يوصى بفرم الأنسجة مباشرة داخل أنبوب الطرد المركزي الدقيق سعة 1.5 مل لتقليل فقد العينة. - أضف 500 ميكرولتر من محلول الهضم لكل عينة واغسل جميع الأنسجة المفرومة من جدار أنبوب الطرد المركزي الدقيق سعة 1.5 مل. يساعد السحب اللطيف على هضم العينة.
- تجانس الأنبوب على آلة دوامة (الإعدادات: 37 درجة مئوية ، 750 دورة في الدقيقة لمدة 1 ساعة).
- بعد الهضم ، انقل معلق الأنسجة إلى أنبوب طرد مركزي جديد سعة 15 مل عن طريق المرور عبر مصفاة خلية 40 ميكرومتر. شطف مصفاة الخلية مع 5 مل إضافية من عازلة فرز الخلايا لوقف عملية الهضم.
- جهاز طرد مركزي لأنبوب 15 مل عند 350 × جم لمدة 7 دقائق عند 4 درجات مئوية. ثم قم بإزالة الطافت تماما باستخدام ماصة. أعد تعليق حبيبات الخلية باستخدام مخزن مؤقت لفرز الخلايا 90 ميكرولتر.
ملاحظة: قبل الفصل المغناطيسي ، ماصة تعليق الخلية برفق عدة مرات أو تمر عبر مصفاة خلية 30 ميكرومتر لإزالة كتل الخلايا إذا لزم الأمر ، للحصول على تعليق خلية واحدة للحصول على الأداء الأمثل للإثراء المغناطيسي لمجموعات الخلايا المثيرة للاهتمام.
5. التخصيب المغناطيسي ل CD45 وتلطيخ العينة
ملاحظة: لعزل البلاعم القلبية بكفاءة فرز عالية ، تم إجراء استبعاد الخلايا غير المرغوب فيها بما في ذلك الخلايا الليمفاوية باستخدام ميكروبيدات CD45 وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة. بناء على لوحة الفرز ، تم تحديد الضامة المقيمة القلبية على أنها CD45 عالية CD11b عالية CD64 عالية Ly6C منخفضة /int F4 /80 عالية.
- أضف 10 ميكرولتر من ميكروبيدات CD45 لكل 107 خلايا إجمالية إلى تعليق الخلية في أنبوب الطرد المركزي سعة 15 مل. اخلطي العينات جيدا واحتضنيها لمدة 15 دقيقة عند 4 درجات مئوية.
ملاحظة: يجب إجراء عد الخلايا باستخدام مقياس الدم لفترة وجيزة للتأكد من أن كل أنبوب لا يحتوي على أكثر من 107 خلايا إجمالا. عند العمل مع أرقام خلايا أعلى ، يجب زيادة حجم الخرز المغناطيسي. - تحضير خليط الأجسام المضادة عن طريق تخفيف الأجسام المضادة التالية في مخزن فرز الخلايا (تخفيف 1: 100 لكل جسم مضاد): CD45-PE ، CD11b-APC-Cy7 ، CD64-APC ، F4 / 80-PE-Cy7 ، Ly6C-FITC. ستتم إضافة DAPI لاحقا إلى تلطيخ التمييز الحي / الميت.
- بعد 15 دقيقة من حضانة الخرزة المغناطيسية ، أضف 100 ميكرولتر من خليط الأجسام المضادة مباشرة إلى معلق الخلية في أنبوب 15 مل (ثم يكون التركيز النهائي لجميع الأجسام المضادة 1: 200) واحتضانها لمدة 20 دقيقة عند 4 درجات مئوية.
- بعد 20 دقيقة من حضانة الأجسام المضادة ، اغسل معلق الخلية بإضافة 1-2 مل من المخزن المؤقت لفرز الخلايا لكل 107 خلايا وأجهزة طرد مركزي عند 350 × جم لمدة 10 دقائق. قم بإزالة المادة الطافية تماما عن طريق سحب العينات.
- أعد تعليق ما يصل إلى 108 خلايا في 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت لفرز الخلايا.
ملاحظة: يجب تحديد الحد الأقصى لعدد الخلايا للفصل المغناطيسي وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة. - تحضير مجموعة الفصل المغناطيسي.
- قم بتوصيل العمود المغناطيسي بفاصل مغناطيسي مناسب وضع أنبوب تجميع أسفل العمود المغناطيسي.
- قم بإعداد الأعمدة المغناطيسية عن طريق الشطف باستخدام المخزن المؤقت لفرز الخلايا: أضف 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت لفرز الخلايا في الجزء العلوي من العمود واترك المخزن المؤقت يمر.
- قم بتطبيق تعليق الخلية على الفور على العمود أثناء مرور المخزن المؤقت لفرز الخلايا.
ملاحظة: تجنب تكوين فقاعات الهواء في العمود. وفقا لبروتوكول التصنيع ، على الرغم من أن وقت ملء العمود قد يتغير من ظروف التخزين ، إلا أنه ليس له أي تأثير على جودة الفصل. - اغسل العمود بمخزن مؤقت لفرز الخلايا 3 × 500 ميكرولتر. يحتوي التدفق في الخطوة 5.7 والخطوة 5.8 على خلايا غير مسماة ، والتي يمكن التخلص منها إذا لم تكن هناك حاجة إلى مزيد من التجربة.
ملاحظة: إضافة المخزن المؤقت لفرز الخلايا مباشرة عندما يكون خزان العمود فارغا تقريبا. - قم بإزالة العمود من الفاصل المغناطيسي وضعه على أنبوب تجميع جديد.
- أضف 1 مل من المخزن المؤقت لفرز الخلايا إلى العمود. اغسل العمود على الفور عن طريق تطبيق المكبس المرفق مع العمود بإحكام. يحتوي التدفق من خلال الخلايا المسماة مغناطيسيا.
- أضف محلول DAPI إلى جميع معلقات الخلايا التي تم جمعها مغناطيسيا قبل وقت قصير من تشغيلها على فارز الخلايا. اضبط التركيز النهائي ل DAPI على 0.3-0.5 ميكروغرام / مل.
- إجراء تحليل FACS.
6. عينات للتعويض
- قم بإعداد 6 أنابيب طرد مركزي دقيقة بنية سعة 1.5 مل تحمل علامة "PE" و "APC-Cy7" و "APC" و "PE-Cy7" و "FITC" و "DAPI" على التوالي لحماية الأجسام المضادة من الضوء. قم بإعداد أنبوب طرد مركزي دقيق آخر سعة 1.5 مل يسمى "غير ملوث".
ملاحظة: يمكن القيام بذلك في نفس الوقت الذي يتم فيه احتضان معلق الخلية بالميكروبيدات والأجسام المضادة. يمكن أن تكون العينة غير الملوثة هي نسيج عضلة القلب الذي تم جمعه عشوائيا من أنسجة القلب التي تم تجنيبها ومعالجتها أيضا وفقا للخطوة 4. - قم بتخفيف كل جسم مضاد مترافق مع مخزن فرز الخلايا إلى 1:50 في أنابيب الطرد المركزي الدقيقة البنية سعة 1.5 مل والتي تم تمييزها وفقا لذلك.
- أضيفي قطرة واحدة من محلول الخرز التعويضي واحتضنيه لمدة 20 دقيقة عند 4 درجات مئوية.
- أضف 2 مل من المخزن المؤقت لفرز الخلايا في كل أنبوب طرد مركزي بني سعة 1.5 مل وأجهزة طرد مركزي بسرعة 450 × جم لمدة 5 دقائق. تخلص تماما من المادة الطافية وأعد تعليق الحبيبات المحتوية على حبة مع مخزن مؤقت لفرز الخلايا 300 ميكرولتر وانقلها إلى أنابيب فرز الخلايا التي تم تمييزها أيضا وفقا لذلك.
7. تشغيل على فارز الخلايا واستراتيجية البوابة
- قم بتطبيق العينة غير الملوثة وأنابيب التعويض أولا واضبط الفولتية لكل قناة لمحاذاة كل من الذروة الموجبة والسالبة إلى الموضع المناسب للمحور. احفظ إعدادات التعويض وقم بتطبيقها على العينات التالية.
- قم بتطبيق العينات على فارز الخلايا. قم بتعيين استراتيجية البوابة كما هو موضح في الشكل 4. يتم تحديد الضامة المقيمة في القلب على أنها CD45 عالية CD11b عالية CD64 عالية Ly6C منخفضة /int F4 /80 عالية. يستخدم DAPI كعلامة صلاحية الخلية.
- تحقق من مخططات قياس التدفق الخلوي للتأكد من أن عدد الخلايا محل الاهتمام يظهر بشكل صحيح على الرسوم البيانية. إذا لم يكن الأمر كذلك ، فاضبط جهد كل قناة على العرض المركزي لكل مخطط.
- إذا كانت إعدادات الجهد مرضية ، فابدأ إجراء الفرز. اجمع عدد الخلايا المصنفة في وسط مزرعة يتكون من DMEM يحتوي على 10٪ مصل بقري جنيني ، مكمل ب 100 ميكروغرام / مل ستربتومايسين و 100 وحدة / مل بنسلين.
8. ثقافة البلاعم المقيمة
- بعد جمع البلاعم التي تم فرزها ، انقل الخلايا على الفور إما إلى أطباق زراعة الأنسجة 35 مم أو 24 صفيحة بئر ، أو استخدمها مباشرة في التجارب اللاحقة.
- لزراعة البلاعم المصنفة ، احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية ، حاضنة 5٪ CO2 .
- تغيير وسط الثقافة كل 48-72 ساعة. يمكن إزالة الخلايا الميتة العائمة بسهولة عن طريق التغيير المتوسط. استخدم البلاعم الحية المرفقة بقاع طبق الاستزراع للتجربة اللاحقة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
وصفنا إجراء عمليا لعزل الضامة القلبية المقيمة على وجه التحديد من منطقة SAN و AVN. لتأكيد التشريح الصحيح ، يتم إجراء تلطيخ Masson's Trichrome وتلطيخ HCN4 المناعي (الشكل 3) 12. باستخدام هذا البروتوكول ، يمكننا جمع ما يقرب من 60000 بلاعم من قلب واحد كامل. يوضح الشكل 4 استراتيجية البوابة لفرز البلاعم القلبية. تم تحديد البلاعم القلبية الحية على أنها CD45 + CD11b + F4 / 80 + CD64 + Ly6C-. يوضح الشكل 5 البلاعم القلبية المصنفة حديثا والتي تم تحديدها بواسطة مستضداتها السطحية CD45 و F4 / 80 و CD11b. لوحظت خلايا تم فرزها حديثا تحت منظر المجال الساطع للمجهر (الشكل 5 أ). كانت الخلايا المصنفة إيجابية ل CD45 (CD45 +) عند ملاحظتها تحت قناة fluorophore-PE (الشكل 5B). أظهر نفس العرض للخلايا المصنفة عند ملاحظتها تحت قناة fluorophore-APC-Cy7 النمط الظاهري CD11b + (الشكل 5C). أظهر نفس العرض للخلايا المصنفة عند ملاحظتها تحت قناة fluorophore-PE-Cy7 النمط الظاهري F4 / 80 + (الشكل 5D). الشكل 5E هو الصورة المدمجة التي تم الحصول عليها باستخدام المجهر الفلوري للخلايا التي تم فرزها. تم تحديد هذه الخلايا الإيجابية الثلاثية على أنها بلاعم قلبية مقيمة. يوضح الشكل 6 البلاعم القلبية المعزولة المزروعة في وسط حتى 6 أيام. تشير الأسهم البيضاء إلى الضامة ، وتشير الأسهم السوداء إلى خلايا ميتة عائمة مستديرة الشكل.
الشكل 1: تشريح SAN و AVN تحت مجهر التشريح. (أ) تشريح SAN تحت مجهر التشريح. يشار إلى موقع SAN بخط أحمر متقطع داخل المنطقة بين الفجوات (خطوط متقطعة سوداء). (ب) تشريح التنخر اللاوعائي تحت مجهر التشريح. () عدل هذا الرقم من المادة10 المنشورة سابقا. يقع AVN (الدائرة الحمراء المتقطعة) في قمة مثلث كوخ (مثلث أبيض متقطع) بالقرب من قاع الحاجز الغشائي. يتكون مثلث كوخ من وتر تودارو (TT ، خط متقطع أخضر) ، صمام ثلاثي الشرف (تلفزيون ، خط متقطع أزرق) وفتحة الجيب التاجي (CS ، خط أصفر متقطع). SVC ، الوريد الأجوف العلوي ؛ IVC ، الوريد الأجوف السفلي. IAS ، الحاجز بين الأذينين. RA ، الأذين الأيمن. RAA ، الزائدة الأذينية اليمنى ؛ RV ، البطين الأيمن. CT ، كريستا الطرفية. IVS ، الحاجز بين البطينين. OF ، الحفرة البيضاوية. السلطة الفلسطينية ، الشريان الرئوي. RV ، البطين الأيمن. LV ، البطين الأيسر. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 2: رسم تخطيطي لتوطين SAN وAVN . (أ) رسم تخطيطي لتوطين SAN. يشار إلى SAN بدائرة حمراء متقطعة داخل المنطقة بين الفجوات إلى جانب CT (الخط الأسود المتقطع). (ب) رسم تخطيطي لتوطين AVN. يشار إلى AVN بدائرة حمراء متقطعة داخل مثلث كوخ (مثلث رمادي متقطع) يتكون من تلفزيون وفتحة CS. SVC ، الوريد الأجوف العلوي. IVC ، الوريد الأجوف السفلي. IAS ، الحاجز بين الأذينين. RA ، الأذين الأيمن. RAA ، الزائدة الأذينية اليمنى ؛ CT ، كريستا الطرفية. IVS ، الحاجز بين البطينين. OF ، الحفرة البيضاوية ؛ IVS ، الحاجز بين البطينين. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 3: تحديد SAN و AVN مع صبغة نسيجية. تحديد SAN (A ، B) و AVN (C ، D). تلطيخ الفلورسنت المناعي لخلايا نظام التوصيل الإيجابي HCN4 في SAN (A) و AVN (C) بالإضافة إلى تلطيخ ماسون ثلاثي الألوان ل SAN (B) و AVN (D). تشير الأسهم الحمراء إلى شريان العقدة الجيبية (SNA ، B) ، والسهم الأسود والخط الأسود المتقطع إلى AVN المضغوط ، ويشير السهم الأزرق إلى الجسم الليفي المركزي (CFB). CT ، كريستا الطرفية. CFB ، الجسم الليفي المركزي. CN ، AVN المدمجة ؛ RA ، الأذين الأيمن. RV ، البطين الأيمن. IAS ، الحاجز بين الأذينين. IVS ، الحاجز بين البطينين. التلفزيون ، صمام ثلاثي الشرفات. MV ، الصمام التاجي. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 4: استراتيجية بوابات لفرز خلايا البلاعم القلبية المقيمة. يتم تحديد الخلايا أحادية النواة ، ويتم استبعاد الثنائيات بواسطة FSC-W مقابل FSC-A ويتم استبعاد الخلايا الميتة بواسطة DAPI (A-D). يتم بوابات الخلايا الحية على كريات الدم البيضاء CD45 + (E) ، ثم يتم تبطينها على خلايا CD11b + النخاعية (F). تم تحديد البلاعم القلبية من خلال التعبير عن كل من F4 / 80 و CD64 (G) ، ثم تم تقسيمها أخيرا بواسطة تعبير Ly6C (H). يتم تحديد البلاعم القلبية الحية على أنها CD45 + CD11b + F4 / 80 + CD64 + Ly6C-. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 5: البلاعم القلبية المصنفة حديثا والتلطيخ المناعي. أ: البلاعم القلبية المصنفة حديثا. تلطيخ مناعي لمستضدات سطحية معينة مثل CD45 (B) أو CD11b (C) أو F4 / 80 (D). وفقا لاستراتيجية البوابة ، يتم تحديد الضامة القلبية كخلايا إيجابية ثلاثية (E). يمثل شريط المقياس 50 ميكرومتر. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 6: ثقافة البلاعم المصنفة. استزراع البلاعم المصنفة في وسط الاستزراع لمدة 48 ساعة (أ ، ب) ، 96 ساعة (ج ، د) و 6 أيام (ه ، فهرنهايت) على التوالي. يتم عرض طبقين فرديين لكل نقطة زمنية (الطبق 1: A ، C ، E ؛ الطبق 2: B ، D ، F). تشير الأسهم البيضاء إلى البلاعم الحية ذات الشكل الشبيه بالمغزل والنتوءات النموذجية3. تشير الأسهم السوداء إلى خلايا ميتة عائمة مستديرة الشكل. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
| مركب | التركيز النهائي | ز أو مل المطلوبة |
| المخزن المؤقت FACS | ||
| جيش صرب البوسنه | 0.50% | |
| إيدتا | 2 مليمتر | |
| برنامج تلفزيوني (1X) | 500 مل | |
| العازلة الهضم | ||
| كولاجيناز الأول | 450 وحدة / مل | |
| كولاجيناز الحادي عشر | 125 وحدة / مل | |
| دالإنزيمات الأولى | 60 وحدة / مل | |
| هيالورونيداز | 60 وحدة / مل | |
| HEPES العازلة | 20 ميكرولتر لكل 1 مل | |
| برنامج تلفزيوني (1X) | أضف ما يصل إلى 1 مل لعينات 2 | |
| وسط ثقافي | ||
| دمم | 79 مل | |
| البنسلين / الستربتومايسين | 1% | 1 مل |
| FBS | 20% | 20 مل |
| تاي (50x) | ||
| قاعدة تريس | 24.20% | 24.2 غ |
| 100٪ حمض الخليك | 5.71% | 5.71 مل |
| 0.5 م EDTA | 0.05 م | 10 مل |
| dH2O | أضف ما يصل إلى 100 مل | |
الجدول 1: تكوين الحلول اللازمة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
في هذه المخطوطة ، نصف بروتوكولا لإثراء الضامة القلبية المقيمة على وجه التحديد من مناطق SAN و AVN بنقاوة عالية.
تنقسم البلاعم إلى مجموعات فرعية بناء على موقعها التشريحي والنمط الظاهري الوظيفي. يمكنهم أيضا التبديل من نمط ظاهري وظيفي إلى آخر استجابة لإشارات البيئة الدقيقة المتغيرة13. بالمقارنة مع الأعضاء الأخرى مثل نخاع العظام والكبد ، تحتوي أنسجة القلب على نسبة أقل من الخلايا المناعية وأعداد مطلقة أقل لكل مجموعة فرعية خلوية14. لذلك ، تعد طرق فرز الخلايا وإثرائها وتنقيتها أدوات ضرورية للحصول على كميات كافية من عدد الخلايا محل الاهتمام. يسمح فرز الخلايا المنشط بالفلورة ، و MACS بالحصول على مجموعات خلايا نقية ومصنفة لأنها تسمح بالقياس المتزامن للخصائص المختلفة للخلايا.
تم وصف لوحات قياس التدفق الخلوي المختلفة لتحديد المجموعات السكانية الفرعية للبلاعم القلبية3،6،15. لا تعتمد وظيفة البلاعم في الحالة المستقرة والمرض على أصلها التنموي فحسب ، بل تعتمد أيضا على بيئة الأنسجة. بشكل عام ، يحتوي القلب البالغ على مجموعتين فرعيتين رئيسيتين من الضامة المقيمة Ly6Cالمنخفضة / CCR2 التي تعبر عن مستويات مختلفة من MHC-II والتي يمكن أن تحافظ على نفسها عن طريق الانتشار المحلي في حالة مستقرة بينما أثناء المرض يتم تجنيد وحيدات Ly6Cالعالية الكلاسيكية إلى مواقع الالتهاب ، حيث تتمايز إلى بلاعم16 . أثناء التطور ، تحتل مجموعات فرعية مختلفة من الضامة مواقع قلبية مختلفة مرتبطة بوظائف متميزة17. كنا نهدف إلى دراسة البلاعم المقيمة على وجه التحديد من نظام التوصيل القلبي ، وخاصة الضامة المقيمة من منطقتي SAN و AVN. وفقا ل Hulsmans et al. تم تحديد الضامة المقيمة في القلب على أنها CD45 عالية CD11b عالية CD64عالية F4 / 80عالية Ly6Cمنخفضة / int.
يتطلب حصاد البلاعم القلبية المقيمة من فأر بالغ واحد لفرز الخلايا حوالي 3 ساعات. من المهم ترتيب الإجراءات التجريبية بشكل منطقي والسماح بالحضانة بالتوازي لتوفير الوقت وتقليل التعامل مع البلاعم الهشة المحتملة في التعليق. نظرا لأن إجراء الفرز يمكن أن يمارس ضغطا على الخلايا التي تم فرزها ، فقد أوصينا بتقليل وقت الفرز باستخدام الخرز المغناطيسي الذي يمكن أن يزيد من كفاءة الفرز بشكل كبير ويسمح أيضا بالحصول على نقاوة أعلى من الضامة المقيمة.
يشمل تطبيق هذا البروتوكول على سبيل المثال لا الحصر تنقية البلاعم و / أو أي نوع آخر من الخلايا غير القلبية من أنسجة القلب وأي سلالات فئران أخرى. يمكن استخدام البلاعم المصنفة في التجارب اللاحقة ، على سبيل المثال فحوصات حركة الخلايا ، ودراسات التعبير الجيني أو البروتيني ، إلخ. تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية ممكن أيضا عن طريق جمع الخلايا واحدة تلو الأخرى مباشرة من أنبوب التجميع الخاص بفارز الخلايا.
ومع ذلك ، فإن فرز الخلايا القائم على قياس التدفق الخلوي له حدوده. تعد لوحة الأجسام المضادة المصممة بدقة مهمة ويجب أن تأخذ في الاعتبار التعبير عن المستضدات على عدد الخلايا محل الاهتمام والفلوروفور المترافق مع الأجسام المضادة. قد تتغير وظيفة الخلايا وصلاحيتها بواسطة الأجسام المضادة الملزمة ، مما قد يؤثر على نتائج التجارب اللاحقة. بالإضافة إلى ذلك ، فإن أدوات فرز الخلايا المعقدة باهظة الثمن ومتطورة وعرضة أيضا لمشاكل انسداد نظام السوائل ومعايرة الليزر. ومن ثم يلزم الصيانة من قبل متخصص مدرب تدريبا عاليا والتشغيل بشكل صحيح من قبل فني محترف متمرس. على الرغم من أن فرز الخلايا يمكن أن يوفر مجموعة خلايا نقية ذات أهمية ، إلا أن الكفاءة الإجمالية لا تزال منخفضة نسبيا.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
لم يتم الإبلاغ عن أي تضارب محتمل في المصالح ذات صلة بهذه المقالة.
Acknowledgments
تم دعم هذا العمل من قبل مجلس المنح الدراسية الصيني (CSC ، إلى R. Xia) ، والمركز الألماني لأبحاث القلب والأوعية الدموية (DZHK ؛ 81X2600255 إلى S. Clauss ، و 81Z0600206 إلى S. Kääb ، و 81Z0600204 إلى CS) ، ومؤسسة Corona Foundation (S199 / 10079/2019 إلى S. Clauss) ، و SFB 914 (المشروع Z01 إلى S. Massberg) ، و ERA-NET حول أمراض القلب والأوعية الدموية (ERA-CVD ؛ 01KL1910 إلى S. Clauss) و Heinrich-and-Lotte-Mühlfenzl Stiftung (إلى S. Clauss). لم يكن للممولين أي دور في إعداد المخطوطات.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anesthesia | |||
| Isoflurane vaporizer system | Hugo Sachs Elektronik | 34-0458, 34-1030, 73-4911, 34-0415, 73-4910 | Includes an induction chamber, a gas evacuation unit and charcoal filters |
| Modified Bain circuit | Hugo Sachs Elektronik | 73-4860 | Includes an anesthesia mask for mice |
| Surgical Platform | Kent scientific | SURGI-M | |
| In vivo instrumentation | |||
| Fine forceps | Fine Science Tools | 11295-51 | |
| Iris scissors | Fine Science Tools | 14084-08 | |
| Spring scissors | Fine Science Tools | 91500-09 | |
| Tissue forceps | Fine Science Tools | 11051-10 | |
| Tissue pins | Fine Science Tools | 26007-01 | Could use 27G needles as a substitute |
| General lab instruments | |||
| Orbital shaker | Sunlab | D-8040 | |
| Pipette,volume 10ul, 100ul, 1000ul | Eppendorf | Z683884-1EA | |
| Magnetic stirrer | IKA | RH basic | |
| Microscopes | |||
| Dissection stereo- zoom microscope | vwr | 10836-004 | |
| Leica microscope | Leica microsystems | Leica DM6 | |
| Flow cytometry machine | |||
| Beckman Coulter | Beckman coulter | MoFlo Astrios | |
| Software | |||
| FlowJo v10 | FlowJo | ||
| General Lab Material | |||
| 0.2 µm syringe filter | sartorius | 17597 | |
| 100 mm petri dish | Falcon | 351029 | |
| 27G needle | BD Microlance 3 | 300635 | |
| 50 ml Polypropylene conical Tube | FALCON | 352070 | |
| Cover slips | Thermo scientific | 7632160 | |
| Eppendorf Tubes | Eppendorf | 30121872 | |
| 5ml Syringe | Braun | 4606108V | |
| Chemicals | |||
| 0.5 M EDTA | Sigma | 20-158 | |
| Acetic acid | Merck | 100063 | Component of TEA |
| Agarose | Biozym | 850070 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A2153-100G | |
| Collagenase I | Worthington Biochemical | LS004196 | |
| Collagenase XI | Sigma | C7657 | |
| DNase I | Sigma | D4527 | |
| Hyaluronidase | Sigma | H3506 | |
| HEPES buffer | Sigma | H4034 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A2153-100G | |
| DPBS (1X) Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Gibco | 14190-094 | |
| Fetal bovine serum | Sigma | F2442-500ml | |
| Penicillin − Streptomycin | Sigma | P4083 | |
| DMEM | Gibco | 41966029 | |
| Drugs | |||
| Fentanyl 0.5 mg/10 ml | Braun Melsungen | ||
| Isoflurane 1 ml/ml | Cp-pharma | 31303 | |
| Oxygen 5L | Linde | 2020175 | Includes a pressure regulator |
| Antibodies | |||
| Anti-mouse Ly6C FITC (clone HK1.4) | BioLegend | Cat# 128006 | diluted to 1:100 |
| Anti-mouse F4/80 PE/Cy7(clone BM8) | BioLegend | Cat# 123114 | diluted to 1:100 |
| Anti-mouse CD64 APC (clone X54-5/7.1) | BioLegend | Cat# 139306 | diluted to 1:100 |
| Anti-mouse CD11b APC/Cy7(clone M1/70) | BioLegend | Cat# 101226 | diluted to 1:100 |
| Anti-mouse CD45 PE (clone 30-F11) | BioLegend | Cat# 103106 | diluted to 1:100 |
| Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate (DAPI) | Invitrogen | H3570 | diluted to 1:1000 |
| Animals | |||
| Mouse, C57BL/6 | Charles River Laboratories |
References
- Nikolaidou, T., Aslanidi, O. V., Zhang, H., Efimov, I. R. Structure-function relationship in the sinus and atrioventricular nodes. Pediatric Cardiology. 33 (6), 890-899 (2012).
- Clauss, S., et al. Animal models of arrhythmia: classic electrophysiology to genetically modified large animals. Nature Review Cardiology. 16 (8), 457-475 (2019).
- Hulsmans, M., et al. Macrophages Facilitate Electrical Conduction in the Heart. Cell. 169 (3), 510-522 (2017).
- Rosas, M., et al. The transcription factor Gata6 links tissue macrophage phenotype and proliferative renewal. Science. 344 (6184), 645-648 (2014).
- Schulz, C., et al. A lineage of myeloid cells independent of Myb and hematopoietic stem cells. Science. 336 (6077), 86-90 (2012).
- Epelman, S., et al. Embryonic and adult-derived resident cardiac macrophages are maintained through distinct mechanisms at steady state and during inflammation. Immunity. 40 (1), 91-104 (2014).
- Gordon, S., Pluddemann, A. Tissue macrophages: heterogeneity and functions. BMC Biology. 15 (1), 53 (2017).
- Bajpai, G., et al. The human heart contains distinct macrophage subsets with divergent origins and functions. Nature Medicine. 24 (8), 1234-1245 (2018).
- Davies, L. C., Jenkins, S. J., Allen, J. E., Taylor, P. R.
- Xia, R., et al. Whole-mount immunofluorescence staining, confocal imaging and 3D reconstruction of the sinoatrial and atrioventricular node in the mouse. Journal of Visualized Experiments. (166), e62058 (2020).
- van Weerd, J. H., Christoffels, V. M. The formation and function of the cardiac conduction system. Development. 143 (2), 197-210 (2016).
- Ye Sheng, X., et al. Isolation and characterization of atrioventricular nodal cells from neonate rabbit heart. Circulation: Arrhythmia and Electrophysiology. 4 (6), 936-946 (2011).
- Murray, P. J., Wynn, T. A. Protective and pathogenic functions of macrophage subsets. Nature Reviews Immunology. 11 (11), 723-737 (2011).
- Pinto, A. R., et al.
- Bajpai, G., et al. Tissue resident CCR2- and CCR2+ cardiac macrophages differentially orchestrate monocyte recruitment and fate specification following myocardial injury. Circulation Research. 124 (2), 263-278 (2019).
- Honold, L., Nahrendorf, M. Resident and monocyte-derived macrophages in cardiovascular disease. Circulation Research. 122 (1), 113-127 (2018).
- Leid, J., et al. Primitive embryonic macrophages are required for coronary development and maturation. Circulation Research. 118 (10), 1498-1511 (2016).
Tags
الطب ، العدد 171 ، نظام التوصيل القلبي ، العقدة الجيبية الأذينية ، العقدة الأذينية البطينية ، الضامة القلبية المقيمة ، قياس التدفق الخلوي ، فرز الخلايا المنشطة المغناطيسية ، MACS ، فرز الخلايا المنشطة بالفلورة ، التشريح المجهري ، زراعة الخلايا الأوليةErratum
Formal Correction: Erratum: Isolation and Culture of Resident Cardiac Macrophages from the Murine Sinoatrial and Atrioventricular Node
Posted by JoVE Editors on 02/02/2023.
Citeable Link.
An erratum was issued for: Isolation and Culture of Resident Cardiac Macrophages from the Murine Sinoatrial and Atrioventricular Node. The Authors section was updated from:
Ruibing Xia123
Simone Loy1
Stefan Kääb13
Anna Titova1
Christian Schulz123
Steffen Massberg123
Sebastian Clauss123
1University Hospital Munich, Department of Medicine I Ludwig-Maximilian-Unversity Munich (LMU)
2Walter Brendel Center of Experimental Medicine (WBex) LMU Munich
3German Center for Cardiovascular Research (DZHK), Partner Site Munich, Munich Heart Alliance (MHA)
to:
Ruibing Xia123
Simone Loy1
Stefan Kääb13
Anna Titova1
Christian Schulz123
Steffen Massberg123
Sebastian Clauss123
1University Hospital Munich, Department of Medicine I Ludwig-Maximilian-University Munich (LMU)
2Insitute of Surgical Research at the Walter Brendel Center of Experimental Medicine, University Hospital Munich, Ludwig-Maximilians-University (LMU)
3German Center for Cardiovascular Research (DZHK), Partner Site Munich, Munich Heart Alliance (MHA)
