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Summary
Le protocole présenté ici fournit une approche étape par étape pour l’isolement des macrophages cardiaques résidents de la région du ganglion sino-auriculaire (SAN) et du nœud auriculo-ventriculaire (AVN) du cœur de souris.
Abstract
Il a été démontré que les macrophages cardiaques résidents facilitent la conduction électrique dans le cœur. Le rythme cardiaque physiologique est initié par des impulsions électriques générées dans le nœud sino-auriculaire (SAN), puis conduites vers les ventricules via le nœud auriculo-ventriculaire (AVN). Pour étudier plus avant le rôle des macrophages résidents dans le système de conduction cardiaque, une isolation appropriée des macrophages résidents du SAN et de l’AVN est nécessaire, mais cela reste difficile. Ici, nous fournissons un protocole pour la microdissection fiable du SAN et de l’AVN dans les cœurs murins, suivie de l’isolement et de la culture des macrophages résidents.
Le SAN, situé à la jonction de la crista terminalis avec la veine cave supérieure, et l’AVN, situé au sommet du triangle de Koch, sont identifiés et microdisséqués. L’emplacement correct est confirmé par l’analyse histologique du tissu réalisée avec la coloration trichrome de Masson et par l’anti-HCN4.
Les tissus microdisséqués sont ensuite digérés par voie enzymatique pour obtenir des suspensions unicellulaires suivies de l’incubation avec un panel spécifique d’anticorps dirigés contre des marqueurs de surface spécifiques au type cellulaire. Cela permet d’identifier, de compter ou d’isoler différentes populations cellulaires par tri cellulaire activé par fluorescence. Pour différencier les macrophages cardiaques résidents des autres cellules immunitaires du myocarde, en particulier des macrophages dérivés de monocytes recrutés, une stratégie de déclenchement délicate est nécessaire. Tout d’abord, les cellules de la lignée lymphoïde sont détectées et exclues d’une analyse plus approfondie. Ensuite, les cellules myéloïdes sont identifiées avec des macrophages résidents déterminés par une expression élevée de CD45 et CD11b, et une faible expression de Ly6C. Avec le tri cellulaire, des macrophages cardiaques isolés peuvent ensuite être cultivés in vitro pendant plusieurs jours pour une étude plus approfondie. Nous décrivons donc un protocole pour isoler les macrophages résidents cardiaques situés dans le système de conduction cardiaque. Nous discutons des pièges de la microdissection et de la digestion du SAN et de l’AVN, et fournissons une stratégie de contrôle pour identifier, compter et trier de manière fiable les macrophages cardiaques par tri cellulaire activé par fluorescence.
Introduction
Le nœud sino-auriculaire (SAN) initie physiologiquement l’impulsion électrique et est donc le principal stimulateur cardiaque du cœur. Le nœud auriculo-ventriculaire (AVN) conduit l’impulsion électrique des oreillettes aux ventricules et agit également comme un stimulateur cardiaque auxiliaire1. En général, la génération et la conduction d’impulsions électriques est un processus complexe qui peut être modulé par divers facteurs2, y compris les macrophages résidents dans les régions SAN / AVN. Une étude récente de Hulsmans et al. démontre une population spécifique de macrophages cardiaques résidents qui sont enrichis en AVN et fonctionnent comme des acteurs clés dans le maintien d’un rythme cardiaque régulier3. Ils ont constaté que les macrophages sont couplés électriquement aux cardiomyocytes et pourraient modifier les propriétés électriques des cardiomyocytes couplés. Les auteurs notent également que de telles cellules conductrices s’entrelacent avec les macrophages sont également présentes dans d’autres composants du système de conduction cardiaque, tels que le SAN.
Actuellement, on ne sait pas exactement si le phénotype des macrophages cardiaques résidents diffère entre les régions cardiaques. Cependant, il a été démontré que le microenvironnement tissulaire peut affecter la transcription et le renouvellement prolifératif des macrophages tissulaires4. De plus, puisqu’il a été démontré que le phénotype des cardiomyocytes est différent d’une région à l’autre, les effets fonctionnels des macrophages sur les cardiomyocytes peuvent également être spécifiques à une région, même si le phénotype du macrophage lui-même peut être le même. Par conséquent, d’autres études sur des régions cardiaques spécifiques sont nécessaires.
Des études récentes ont démontré qu’à l’état d’équilibre, les macrophages résidents tissulaires sont établis avant la naissance, apparaissant indépendamment de l’hématopoïèse définitive, et persistent jusqu’à l’âge adulte5. Cependant, après l’épuisement des macrophages ou lors d’une inflammation cardiaque, les monocytes Ly6chi contribuent à reconstituer la population de macrophages cardiaques6. Des études impliquant le traçage génétique de la lignée, la parabiose, la cartographie du destin et le suivi cellulaire ont montré la coexistence d’une variété de populations de macrophages résidents dans les organes et les tissus, ainsi que le comportement cellulaire différent des sous-ensembles de macrophages potentiellement associés à leur ontogenèse 7,8,9.
La caractérisation des macrophages cardiaques résidents a bénéficié de l’utilisation du tri des cellules activées magnétiques (MACS) et du tri des cellules activées par fluorescence. Ces méthodes sont particulièrement utiles pour isoler des populations cellulaires spécifiques de plusieurs fractions tissulaires en les marquant avec leurs marqueurs de surface cellulaire. Cela conduit non seulement à une plus grande pureté du type de cellule immunitaire isolée, mais permet également une analyse phénotypique. Ici, nous présentons un protocole comprenant des cellules recouvertes de billes magnétiques suivies d’un tri cellulaire activé par fluorescence pour l’enrichissement des macrophages résidents cardiaques spécifiquement isolés de la région SAN et AVN.
Pour explorer les caractéristiques des macrophages cardiaques résidents dans le système de conduction et leur fonction pour la conduction cardiaque et l’arythmogenèse, une localisation et une dissection précises du SAN et de l’AVN sont essentielles. Pour la microdissection du SAN et de l’AVN, des repères anatomiques sont utilisés pour l’identification de la région10. En bref, le SAN est situé à la jonction de la veine cave supérieure et de l’oreillette droite. AVN est situé dans le triangle de Koch, qui est bordé antérieurement par le feuillet septal de la valve tricuspide, et postérieurement par le tendon de Todaro11. Nous fournissons également une procédure de microdissection précise du SAN et de l’AVN chez la souris, confirmée par histologie et coloration par immunofluorescence.
Des macrophages résidents isolés pourraient être utilisés pour d’autres expériences telles que le séquençage de l’ARN ou pourraient être récupérés et cultivés pendant plus de deux semaines, ce qui permettrait diverses expériences in vitro. Par conséquent, notre protocole décrit une procédure très précieuse pour l’immuno-rythmologiste. Le tableau 1 montre la composition de toutes les solutions nécessaires, la figure 1 montre les repères de microdissection pour SAN et AVN. La figure 2 illustre schématiquement la localisation SAN et AVN. La figure 3 montre la coloration histologique du SAN et de l’AVN (coloration trichrome et immunofluorescence de Masson). La figure 4 montre une stratégie de contrôle étape par étape pour isoler les macrophages résidents cardiaques par tri cellulaire activé par fluorescence.
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Protocol
Les soins aux animaux et toutes les procédures expérimentales ont été menés conformément aux directives du comité de protection et d’éthique des animaux de l’Université de Munich et toutes les procédures entreprises sur les souris ont été approuvées par le gouvernement de Bavière, Munich, Allemagne. Les souris C57BL6/J ont été obtenues commercialement.
1. Préparatifs
- Préparer le tampon de tri des cellules (tableau 1) et conserver à 4 °C.
REMARQUE: Pendant toute la procédure expérimentale, le tampon de tri cellulaire doit toujours être sur la glace. - Préparer le tampon de digestion (tableau 1) peu de temps avant la digestion, car l’activité de la collagénase n’a pu être détectée que pendant quelques heures à température ambiante.
- Se référer au protocole précédemment publié pour la préparation de la boîte de dissection10. En bref, ajouter 30 mL de gel d’agarose (3 % à 4 %) dans une boîte de Petri de 100 mm de diamètre et laisser refroidir à température ambiante.
2. Sacrifice d’animaux et excision cardiaque
- Anesthésiez la souris avec de l’isoflurane en la plaçant dans une chambre d’incubation reliée à un vaporisateur d’isoflurane et rincée avec 5% d’isoflurane / 95% d’oxygène.
- Après l’injection de fentanyl pour l’analgésie, ouvrez la cage thoracique et perfuser le cœur en injectant 5 à 10 mL de 1x PBS glacé directement dans le ventricule gauche (LV). Extrayez le cœur de souris et mettez-le sur le plat de dissection. Les détails expérimentaux ont été décrits en détail précédemment10.
3. Microdissection du SAN et de l’AVN
- Après avoir isolé le cœur, effectuez les procédures de microdissection suivantes dans la boîte de dissection avec 1x PBS glacé au microscope à dissection.
- Utilisez les repères anatomiques cardiaques, c’est-à-dire l’aorte, l’artère pulmonaire, les sinus coronaires, le ventricule gauche / droit, etc. pour déterminer la gauche/droite (gauche : LV; droite : RV) et antérieure/postérieure (antérieure : aorte; postérieure : sinus coronaire) du cœur. Une fois l’orientation déterminée, tournez autour du cœur avec le devant de celui-ci au bas du plat (pour exposer les grosses veines situées à l’arrière).
- Microdissection du SAN
REMARQUE : La microdissection du SAN a déjà été décrite10. Le processus est décrit brièvement ci-dessous.- Exposer la région inter-cavale en épinglant les appendices auriculaires droits (RAA) et le tissu adjacent à la veine cave supérieure (SVC) et à la veine cave inférieure (IVC) sur la boîte de microdissection à l’aide d’épingles à insectes.
- Couper le cœur le long du septum interauriculaire parallèle à la crista terminalis (CT) pour séparer la région inter-cavale et obtenir l’échantillon SAN (Figure 1A, Figure 2A). Placez l’échantillon dans un tube microcentrifuge vide de 1,5 mL sur de la glace.
- Microdissection de l’AVN
- Après le prélèvement de l’échantillon SAN, assurez-vous que le RAA et certaines parties de l’oreillette droite (PR) ont déjà été coupés, ne laissant que le septum interauriculaire (IAS) et le septum interventriculaire (IVS).
- Épinglez les parties restantes du cœur à travers le tissu adjacent à l’IAS et à l’IVS à l’aide d’épingles à insectes pour rendre le côté auriculaire droit de l’IAS orienté vers le haut.
- Regardez l’oreillette droite sur la surface endocardique pour le triangle de Koch. Il sera bordé antérieurement par la ligne charnière du feuillet septal de la valve tricuspide (TV), et postérieurement par le tendon de Todaro. L’orifice du sinus coronaire est observé à la base. (Figure 1B, Figure 2B).
- Coupez le triangle de Koch, qui contient l’AVN, et placez-le directement dans un tube microcentrifuge vide de 1,5 ml sur de la glace.
4. Digestion
- Préparer le tampon de digestion (tableau 1) peu de temps avant utilisation.
- Hachez bien les tissus SAN et AVN avec des scalpels.
REMARQUE: Bien hacher le tissu augmentera l’efficacité de la digestion et aidera à obtenir une bonne suspension cellulaire pour le tri. Comme les échantillons SAN et AVN sont assez petits, il est recommandé de hacher le tissu directement à l’intérieur du tube microcentrifuge de 1,5 ml pour réduire la perte d’échantillon. - Ajouter 500 μL de tampon de digestion par échantillon et laver tous les tissus hachés de la paroi du tube microcentrifuge de 1,5 mL. Un pipetage doux aide à digérer l’échantillon.
- Homogénéiser le tube sur une machine vortex (réglages : 37 °C, 750 tr/min pendant 1 h).
- Après digestion, transférer la suspension tissulaire dans un tube centrifugeux frais de 15 ml en passant à travers une crépine cellulaire de 40 μm. Rincer la passoire cellulaire avec 5 mL supplémentaires de tampon de tri cellulaire pour arrêter la digestion.
- Centrifuger le tube de 15 mL à 350 x g pendant 7 min à 4 °C. Retirez ensuite complètement le surnageant à l’aide de la pipette. Remettez en suspension la pastille de cellule avec un tampon de tri de cellule de 90 μL.
REMARQUE: Avant la séparation magnétique, pipeter doucement la suspension cellulaire plusieurs fois ou passer à travers une crépine cellulaire de 30 μm pour éliminer les amas cellulaires si nécessaire, afin d’obtenir une suspension unicellulaire pour une performance optimale d’enrichissement magnétique des populations cellulaires intéressantes.
5. Enrichissement magnétique du CD45 et coloration des échantillons
REMARQUE: Pour isoler les macrophages cardiaques avec une efficacité de tri élevée, l’exclusion des cellules indésirables, y compris les lymphocytes, a été réalisée avec des microbilles CD45 conformément au protocole du fabricant. Sur la base du panel de tri, les macrophages résidents cardiaques ont été identifiés comme CD45 élevé CD11b élevé CD64 élevé Ly6C faible / int F4/ 80 élevé.
- Ajouter 10 μL de microbilles CD45 par 107 cellules totales à la suspension cellulaire dans le tube à centrifuger de 15 mL. Bien mélanger les échantillons et les incuber pendant 15 min à 4 °C.
REMARQUE: Le comptage cellulaire à l’aide d’un hémocytomètre doit être brièvement effectué pour s’assurer que chaque tube ne contient pas plus de 107 cellules au total. Lorsque vous travaillez avec un nombre de cellules plus élevé, le volume de billes magnétiques doit être augmenté. - Préparer le mélange d’anticorps en diluant les anticorps suivants dans un tampon de tri cellulaire (dilution 1:100 pour chaque anticorps) : CD45-PE, CD11b-APC-Cy7, CD64-APC, F4/80-PE-Cy7, Ly6C-FITC. DAPI sera ajouté plus tard à la coloration pour discrimination vivante / morte.
- Après 15 min d’incubation du bille magnétique, ajouter 100 μL de mélange d’anticorps directement dans la suspension cellulaire dans le tube de 15 ml (alors la concentration finale de tous les anticorps est de 1:200) et incuber pendant 20 min à 4 °C.
- Après 20 min d’incubation d’anticorps, laver la suspension cellulaire en ajoutant 1-2 mL de tampon de tri cellulaire pour 10 à 7 cellules et centrifugerà 350 x g pendant 10 min. Retirer complètement le surnageant par pipetage.
- Remettez en suspension jusqu’à 108 cellules dans 500 μL de tampon de tri cellulaire.
REMARQUE: Le nombre maximal de cellules pour la séparation magnétique doit être déterminé conformément au protocole du fabricant. - Préparez le jeu de séparation magnétique.
- Fixez la colonne magnétique à un séparateur magnétique approprié et placez un tube de collecte sous la colonne magnétique.
- Préparer les colonnes magnétiques en les rinçant avec un tampon de tri cellulaire : ajouter 500 μL de tampon de tri cellulaire en haut de la colonne et laisser passer le tampon.
- Appliquez immédiatement la suspension de cellules sur la colonne pendant le passage du tampon de tri des cellules.
REMARQUE: Évitez la formation de bulles d’air dans la colonne. Selon le protocole du fabricant, bien que le temps de remplissage de la colonne puisse changer par rapport aux conditions de stockage, il n’a aucune influence sur la qualité de la séparation. - Lavez la colonne avec un tampon de tri cellulaire de 3 x 500 μL. Le flux continu des étapes 5.7 et 5.8 contient des cellules non étiquetées, qui peuvent être éliminées si aucune expérience supplémentaire n’est nécessaire.
Remarque : Ajoutez le tampon de tri de cellule immédiatement lorsque le réservoir de colonne est presque vide. - Retirez la colonne du séparateur magnétique et placez-la sur un nouveau tube de collecte.
- Ajouter 1 mL de tampon de tri cellulaire sur la colonne. Rincez immédiatement la colonne en appliquant fermement le piston fourni avec la colonne. Le flux continu contient les cellules marquées magnétiquement.
- Ajoutez une solution DAPI dans toutes les suspensions de cellules marquées magnétiquement collectées peu de temps avant de les exécuter sur le trieur de cellules. Ajuster la concentration finale de DAPI à 0,3-0,5 μg/mL.
- Effectuer l’analyse FACS.
6. Échantillons pour compensation
- Préparez 6 tubes microcentrifugés bruns de 1,5 ml étiquetés respectivement « PE », « APC-Cy7 », « APC », « PE-Cy7 », « FITC » et « DAPI » pour protéger les anticorps de la lumière. Préparez un autre tube microcentrifuge de 1,5 mL étiqueté « non coloré ».
REMARQUE: Cela pourrait être fait en même temps que l’incubation de la suspension cellulaire avec les microbilles et les anticorps. L’échantillon non coloré pourrait être le tissu cardiomyocytaire prélevé au hasard dans le tissu cardiaque épargné et également traité conformément à l’étape 4. - Diluer chaque anticorps conjugué à la fluorescence avec tampon de tri cellulaire en 1:50 dans les tubes de microcentrifugation bruns de 1,5 mL marqués en conséquence.
- Ajouter une goutte de solution de billes de compensation et incuber pendant 20 min à 4 °C.
- Ajouter 2 mL de tampon de tri cellulaire dans chaque tube de microcentrifugation brun de 1,5 mL et centrifuger à 450 x g pendant 5 min. Jetez complètement le surnageant et remettez en suspension le billon contenant la pastille avec un tampon de tri cellulaire de 300 μL et transférez-les dans des tubes de tri de cellules qui sont également marqués en conséquence.
7. Exécution sur le trieur de cellules et stratégie de contrôle
- Appliquez d’abord les tubes d’échantillon et de compensation non colorés et ajustez les tensions de chaque canal pour aligner le pic positif et négatif sur la position appropriée de l’axe. Enregistrez les paramètres de compensation et appliquez-les aux exemples suivants.
- Appliquez les échantillons sur le trieur de cellules. Définissez la stratégie de contrôle comme décrit à la figure 4. Les macrophages résidents cardiaques sont identifiés comme CD45CD11b élevéCD64élevé Ly6C faible/int F4/80 élevé. DAPI est utilisé comme marqueur de viabilité cellulaire.
- Vérifiez les diagrammes de cytométrie de flux pour confirmer que la population cellulaire d’intérêt est correctement indiquée sur les graphiques. Sinon, réglez la tension de chaque canal à la vue centrale de chaque graphique.
- Si les réglages de tension sont satisfaisants, lancez la procédure de tri. Recueillir la population cellulaire triée dans un milieu de culture composé de DMEM contenant 10 % de sérum bovin fœtal, complété par 100 μg/mL de streptomycine et 100 U/mL de pénicilline.
8. Culture de macrophages résidents
- Après avoir recueilli les macrophages triés, transférer immédiatement les cellules dans des boîtes de culture tissulaire de 35 mm ou dans une plaque de 24 puits, ou les utiliser directement pour des expériences ultérieures.
- Pour mettre en culture des macrophages triés, incuber les cellules à 37 °C, incubateur à 5% de CO2 .
- Changez le milieu de culture toutes les 48-72 h. Les cellules mortes flottantes peuvent être facilement éliminées par changement de milieu. Utilisez des macrophages vivants qui se fixent au fond de la boîte de culture pour une expérience ultérieure.
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Representative Results
Nous décrivons une procédure pratique pour l’isolement des macrophages cardiaques résidents spécifiquement de la région SAN et AVN. Pour confirmer une dissection correcte, la coloration trichrome de Masson et la coloration HCN4 immunofluorescente sont effectuées (Figure 3)12. Avec ce protocole, nous pourrions collecter environ 60 000 macrophages d’un cœur entier. La figure 4 montre la stratégie de contrôle pour le tri des macrophages cardiaques. Les macrophages cardiaques vivants résidents ont été identifiés comme CD45+CD11b+F4/80+CD64+Ly6C-. La figure 5 montre des macrophages cardiaques fraîchement triés qui ont été identifiés par leurs antigènes de surface CD45, F4/80 et CD11b. Des cellules fraîchement triées ont été observées au microscope en fond clair (Figure 5A). Les cellules triées étaient positives pour CD45 (CD45+) lorsqu’elles ont été observées sous le canal fluorophore-PE (Figure 5B). La même vue des cellules triées observées sous le canal fluorophore-APC-Cy7 a montré le phénotype CD11b + (Figure 5C). La même vue des cellules triées observées sous le canal fluorophore-PE-Cy7 a montré le phénotype F4/80+ (Figure 5D). La figure 5E est l’image fusionnée obtenue avec le microscope fluorescent pour les cellules triées. Ces cellules triples positives ont été identifiées comme des macrophages résidents cardiaques. La figure 6 montre des macrophages cardiaques isolés cultivés en milieu jusqu’à 6 jours. Les flèches blanches indiquent les macrophages, les flèches noires indiquent les cellules mortes flottantes de forme ronde.
Figure 1 : Anatomie du SAN et de l’AVN au microscope à dissection. (A) Anatomie du SAN au microscope à dissection. L’emplacement du SAN est indiqué par une ligne pointillée rouge dans la région inter-cavale (lignes pointillées noires). (B) Anatomie de l’AVN au microscope à dissection. Ce chiffre a été modifié par rapport à l’article10 publié précédemment. L’AVN (cercle pointillé rouge) est situé au sommet du triangle de Koch (triangle pointillé blanc) près du bas du septum membraneux. Le triangle de Koch est formé par le tendon de Todaro (TT, ligne pointillée verte), la valve tricuspide (TV, ligne pointillée bleue) et l’orifice du sinus coronaire (CS, ligne pointillée jaune). SVC, veine cave supérieure; IVC, veine cave inférieure; IAS, septum interauriculaire; RA, oreillette droite; RAA, appendice auriculaire droit; RV, ventricule droit; CT, Crista terminalis; IVS, septum interventriculaire; OF, fosse ovale. PA, artère pulmonaire; RV, ventricule droit; LV, ventricule gauche. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Illustration schématique de la localisation SAN et AVN. (A) Illustration schématique de la localisation SAN. Le SAN est indiqué par un cercle pointillé rouge dans la région inter-cavale à côté du CT (ligne pointillée noire). (B) illustration schématique de la localisation AVN. AVN est indiqué par un cercle pointillé rouge à l’intérieur du triangle de Koch (triangle pointillé gris) composé de TV et de l’orifice de CS. SVC, veine cave supérieure; IVC, veine cave inférieure; IAS, septum interauriculaire; RA, oreillette droite; RAA, appendice auriculaire droit; CT, Crista terminalis; IVS, septum interventriculaire; OF, fosse ovale; IVS, septum interventriculaire. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Identification du SAN et de l’AVN avec coloration histologique. Identification du SAN (A,B) et AVN (C,D). Coloration immunofluorescente des cellules du système de conduction positive HCN4 dans SAN (A) et AVN (C) ainsi que coloration trichrome de Masson de SAN (B) et AVN (D). Les flèches rouges indiquent l’artère du nœud sinusal (SNA, B), la flèche noire et la ligne pointillée noire indiquent l’AVN compact, la flèche bleue indique le corps fibreux central (CFB). CT, crista terminalis; CFB, corps fibreux central; CN, AVN compact; RA, oreillette droite; RV, ventricule droit; IAS, septum interauriculaire; IVS, septum interventriculaire; TV, valve tricuspide; MV, valve mitrale. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : Stratégie de contrôle pour le tri cellulaire des macrophages cardiaques résidents. Les cellules mononucléaires sont identifiées, les doublets sont exclus par FSC-W par rapport au FSC-A et les cellules mortes sont exclues par DAPI (A-D). Les cellules vivantes sont fermées sur les leucocytes CD45+ (E), puis fermées sur les cellules myéloïdes CD11b + (F). Les macrophages cardiaques ont été identifiés par l’expression de F4/80 et de CD64 (G), puis finalement stratifiés par l’expression de Ly6C (H). Les macrophages cardiaques vivants résidents sont identifiés comme CD45+CD11b+F4/80+CD64+Ly6C-. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 5 : Macrophages cardiaques fraîchement triés et coloration immunofluorescente. (A) Macrophages cardiaques fraîchement triés. Coloration immunofluorescente d’antigènes de surface spécifiques tels que CD45 (B), CD11b (C) ou F4/80 (D). Selon la stratégie de contrôle, les macrophages cardiaques sont identifiés comme des cellules triples positives (E). La barre d’échelle représente 50 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 6 : Culture de macrophages triés. Culture de macrophages triés en milieu de culture pendant 48h (A, B), 96 h (C,D) et 6 jours (E,F) respectivement. Deux plats de culture individuels par point temporel sont indiqués (plat 1: A, C, E; plat 2: B, D, F). Les flèches blanches indiquent des macrophages vivants avec une forme fusiforme et des protubérances typiques3. Les flèches noires indiquent des cellules mortes flottantes de forme ronde. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
| Composé | Concentration finale | g ou ml requis |
| Tampon FACS | ||
| BSA | 0.50% | |
| EDTA | 2 mM | |
| PBS (1X) | 500ml | |
| Tampon de digestion | ||
| Collagénase I | 450 U/mL | |
| Collagénase XI | 125 U/ml | |
| DNase I | 60 U/mL | |
| Hyaluronidase | 60 U/mL | |
| Tampon HEPES | 20 μl par 1 ml | |
| PBS (1X) | Ajouter jusqu’à 1 ml pour 2 échantillons | |
| Milieu de culture | ||
| DMEM | 79 ml | |
| Pénicilline/streptomycine | 1% | 1 ml |
| FBS (en anglais seulement) | 20% | 20 ml |
| TAE (50x) | ||
| Tris-base | 24.20% | 24,2 g |
| 100 % d’acide acétique | 5.71% | 5,71 ml |
| 0,5 M d’EDTA | 0,05 M | 10 ml |
| dH2O | Ajouter jusqu’à 100ml | |
Tableau 1 : Composition des solutions nécessaires.
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Discussion
Dans ce manuscrit, nous décrivons un protocole pour l’enrichissement des macrophages cardiaques résidents spécifiquement des régions SAN et AVN à haute pureté.
Les macrophages sont divisés en sous-populations en fonction de leur emplacement anatomique et de leur phénotype fonctionnel. Ils peuvent également passer d’un phénotype fonctionnel à un autre en réponse à des signaux microenvironnementaux variables13. Comparativement à d’autres organes comme la moelle osseuse et le foie, le tissu cardiaque contient un pourcentage plus faible de cellules immunitaires et un nombre absolu plus faible de chaque sous-population cellulaire14. Par conséquent, les méthodes de tri, d’enrichissement et de purification des cellules sont des outils nécessaires pour obtenir des quantités suffisantes de la population cellulaire d’intérêt. Le tri cellulaire activé par fluorescence et le MACS permettent d’obtenir des populations cellulaires pures et triées car ils permettent de mesurer simultanément diverses propriétés des cellules.
Différents panels de cytométrie en flux ont été décrits pour l’identification de sous-populations de macrophages cardiaques 3,6,15. La fonction des macrophages à l’état d’équilibre et de la maladie dépend non seulement de leur origine développementale, mais aussi de l’environnement tissulaire. En général, le cœur adulte contient deux sous-ensembles majeurs de macrophagesrésidents de Ly6C faible/CCR2 qui expriment différents niveaux de CMH-II et qui peuvent se maintenir via une prolifération locale à l’état d’équilibre, tandis que pendant la maladie classique, les monocytesélevés de Ly6C sont recrutés sur les sites d’inflammation, où ils se différencient en macrophages16 . Au cours du développement, différentes sous-populations de macrophages occupent différents emplacements cardiaques associés à des fonctions distinctes17. Notre objectif était d’étudier les macrophages résidents spécifiquement à partir du système de conduction cardiaque, en particulier les macrophages résidents des régions SAN et AVN. Selon Hulsmans et coll., les macrophages résidents cardiaques sont identifiés comme CD45 CD11b élevé CD64 élevé F4/80 élevéLy6Cfaible/int.
La récolte de macrophages résidents cardiaques d’une souris adulte pour le tri cellulaire nécessite environ 3 heures. Il est important d’organiser les procédures expérimentales de manière logique et de permettre l’incubation en parallèle pour gagner du temps et minimiser la manipulation des macrophages éventuellement fragiles dans la suspension. Comme la procédure de tri pourrait exercer une pression sur les cellules triées, nous avons recommandé de réduire le temps de tri en utilisant des billes magnétiques qui pourraient augmenter considérablement l’efficacité du tri et permettre également d’obtenir une plus grande pureté des macrophages résidents.
L’application de ce protocole comprend, sans toutefois s’y limiter, la purification des macrophages et/ou de tout autre type de cellules non cardiomyocytaires du tissu cardiaque et de toute autre souche de souris. Les macrophages triés pourraient être utilisés pour des expériences ultérieures, par exemple des tests de motilité cellulaire, des études d’expression génique ou protéique, etc. Le séquençage de l’ARN unicellulaire est également possible en collectant les cellules une par une directement dans le tube collecteur du trieur de cellules.
Cependant, le tri cellulaire basé sur la cytométrie en flux a ses limites. Un panel d’anticorps conçu avec précision est important et doit tenir compte de l’expression des antigènes sur la population cellulaire d’intérêt et du fluorophore conjugué aux anticorps. La fonction et la viabilité des cellules pourraient être altérées par les anticorps de liaison, ce qui pourrait affecter les résultats des expériences ultérieures. En outre, les instruments de tri cellulaire complexes sont coûteux, sophistiqués et également sujets à des problèmes de blocage du système fluidique et d’étalonnage laser. Par conséquent, l’entretien par un spécialiste hautement qualifié et le bon fonctionnement par un technicien professionnel expérimenté sont nécessaires. Même si le tri cellulaire pourrait fournir une population cellulaire pure d’intérêt, l’efficacité globale est encore relativement faible.
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Disclosures
Aucun conflit d’intérêts potentiel pertinent pour cet article n’a été signalé.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par le China Scholarship Council (CSC, à R. Xia), le Centre allemand de recherche cardiovasculaire (DZHK; 81X2600255 à S. Clauss, 81Z0600206 à S. Kääb, 81Z0600204 à C.S.), la Fondation Corona (S199/10079/2019 à S. Clauss), le SFB 914 (projet Z01 à S. Massberg), l’ERA-NET sur les maladies cardiovasculaires (ERA-CVD; 01KL1910 à S. Clauss) et la Heinrich-and-Lotte-Mühlfenzl Stiftung (à S. Clauss). Les bailleurs de fonds n’ont joué aucun rôle dans la préparation des manuscrits.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anesthesia | |||
| Isoflurane vaporizer system | Hugo Sachs Elektronik | 34-0458, 34-1030, 73-4911, 34-0415, 73-4910 | Includes an induction chamber, a gas evacuation unit and charcoal filters |
| Modified Bain circuit | Hugo Sachs Elektronik | 73-4860 | Includes an anesthesia mask for mice |
| Surgical Platform | Kent scientific | SURGI-M | |
| In vivo instrumentation | |||
| Fine forceps | Fine Science Tools | 11295-51 | |
| Iris scissors | Fine Science Tools | 14084-08 | |
| Spring scissors | Fine Science Tools | 91500-09 | |
| Tissue forceps | Fine Science Tools | 11051-10 | |
| Tissue pins | Fine Science Tools | 26007-01 | Could use 27G needles as a substitute |
| General lab instruments | |||
| Orbital shaker | Sunlab | D-8040 | |
| Pipette,volume 10ul, 100ul, 1000ul | Eppendorf | Z683884-1EA | |
| Magnetic stirrer | IKA | RH basic | |
| Microscopes | |||
| Dissection stereo- zoom microscope | vwr | 10836-004 | |
| Leica microscope | Leica microsystems | Leica DM6 | |
| Flow cytometry machine | |||
| Beckman Coulter | Beckman coulter | MoFlo Astrios | |
| Software | |||
| FlowJo v10 | FlowJo | ||
| General Lab Material | |||
| 0.2 µm syringe filter | sartorius | 17597 | |
| 100 mm petri dish | Falcon | 351029 | |
| 27G needle | BD Microlance 3 | 300635 | |
| 50 ml Polypropylene conical Tube | FALCON | 352070 | |
| Cover slips | Thermo scientific | 7632160 | |
| Eppendorf Tubes | Eppendorf | 30121872 | |
| 5ml Syringe | Braun | 4606108V | |
| Chemicals | |||
| 0.5 M EDTA | Sigma | 20-158 | |
| Acetic acid | Merck | 100063 | Component of TEA |
| Agarose | Biozym | 850070 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A2153-100G | |
| Collagenase I | Worthington Biochemical | LS004196 | |
| Collagenase XI | Sigma | C7657 | |
| DNase I | Sigma | D4527 | |
| Hyaluronidase | Sigma | H3506 | |
| HEPES buffer | Sigma | H4034 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A2153-100G | |
| DPBS (1X) Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Gibco | 14190-094 | |
| Fetal bovine serum | Sigma | F2442-500ml | |
| Penicillin − Streptomycin | Sigma | P4083 | |
| DMEM | Gibco | 41966029 | |
| Drugs | |||
| Fentanyl 0.5 mg/10 ml | Braun Melsungen | ||
| Isoflurane 1 ml/ml | Cp-pharma | 31303 | |
| Oxygen 5L | Linde | 2020175 | Includes a pressure regulator |
| Antibodies | |||
| Anti-mouse Ly6C FITC (clone HK1.4) | BioLegend | Cat# 128006 | diluted to 1:100 |
| Anti-mouse F4/80 PE/Cy7(clone BM8) | BioLegend | Cat# 123114 | diluted to 1:100 |
| Anti-mouse CD64 APC (clone X54-5/7.1) | BioLegend | Cat# 139306 | diluted to 1:100 |
| Anti-mouse CD11b APC/Cy7(clone M1/70) | BioLegend | Cat# 101226 | diluted to 1:100 |
| Anti-mouse CD45 PE (clone 30-F11) | BioLegend | Cat# 103106 | diluted to 1:100 |
| Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate (DAPI) | Invitrogen | H3570 | diluted to 1:1000 |
| Animals | |||
| Mouse, C57BL/6 | Charles River Laboratories |
References
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- Clauss, S., et al. Animal models of arrhythmia: classic electrophysiology to genetically modified large animals. Nature Review Cardiology. 16 (8), 457-475 (2019).
- Hulsmans, M., et al. Macrophages Facilitate Electrical Conduction in the Heart. Cell. 169 (3), 510-522 (2017).
- Rosas, M., et al. The transcription factor Gata6 links tissue macrophage phenotype and proliferative renewal. Science. 344 (6184), 645-648 (2014).
- Schulz, C., et al. A lineage of myeloid cells independent of Myb and hematopoietic stem cells. Science. 336 (6077), 86-90 (2012).
- Epelman, S., et al. Embryonic and adult-derived resident cardiac macrophages are maintained through distinct mechanisms at steady state and during inflammation. Immunity. 40 (1), 91-104 (2014).
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- Bajpai, G., et al. The human heart contains distinct macrophage subsets with divergent origins and functions. Nature Medicine. 24 (8), 1234-1245 (2018).
- Davies, L. C., Jenkins, S. J., Allen, J. E., Taylor, P. R.
- Xia, R., et al. Whole-mount immunofluorescence staining, confocal imaging and 3D reconstruction of the sinoatrial and atrioventricular node in the mouse. Journal of Visualized Experiments. (166), e62058 (2020).
- van Weerd, J. H., Christoffels, V. M. The formation and function of the cardiac conduction system. Development. 143 (2), 197-210 (2016).
- Ye Sheng, X., et al. Isolation and characterization of atrioventricular nodal cells from neonate rabbit heart. Circulation: Arrhythmia and Electrophysiology. 4 (6), 936-946 (2011).
- Murray, P. J., Wynn, T. A. Protective and pathogenic functions of macrophage subsets. Nature Reviews Immunology. 11 (11), 723-737 (2011).
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- Bajpai, G., et al. Tissue resident CCR2- and CCR2+ cardiac macrophages differentially orchestrate monocyte recruitment and fate specification following myocardial injury. Circulation Research. 124 (2), 263-278 (2019).
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- Leid, J., et al. Primitive embryonic macrophages are required for coronary development and maturation. Circulation Research. 118 (10), 1498-1511 (2016).
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Médecine numéro 171 système de conduction cardiaque ganglion sino-auriculaire ganglion auriculo-ventriculaire macrophages cardiaques résidents cytométrie en flux tri cellulaire activé magnétiquement MACS tri cellulaire activé par fluorescence microdissection culture cellulaire primaireErratum
Formal Correction: Erratum: Isolation and Culture of Resident Cardiac Macrophages from the Murine Sinoatrial and Atrioventricular Node
Posted by JoVE Editors on 02/02/2023.
Citeable Link.
An erratum was issued for: Isolation and Culture of Resident Cardiac Macrophages from the Murine Sinoatrial and Atrioventricular Node. The Authors section was updated from:
Ruibing Xia123
Simone Loy1
Stefan Kääb13
Anna Titova1
Christian Schulz123
Steffen Massberg123
Sebastian Clauss123
1University Hospital Munich, Department of Medicine I Ludwig-Maximilian-Unversity Munich (LMU)
2Walter Brendel Center of Experimental Medicine (WBex) LMU Munich
3German Center for Cardiovascular Research (DZHK), Partner Site Munich, Munich Heart Alliance (MHA)
to:
Ruibing Xia123
Simone Loy1
Stefan Kääb13
Anna Titova1
Christian Schulz123
Steffen Massberg123
Sebastian Clauss123
1University Hospital Munich, Department of Medicine I Ludwig-Maximilian-University Munich (LMU)
2Insitute of Surgical Research at the Walter Brendel Center of Experimental Medicine, University Hospital Munich, Ludwig-Maximilians-University (LMU)
3German Center for Cardiovascular Research (DZHK), Partner Site Munich, Munich Heart Alliance (MHA)
