ERRATUM NOTICE
Important: There has been an erratum issued for this article. Read more …
Summary
הפרוטוקול המוצג כאן מספק גישה שלב אחר שלב לבידוד מקרופאגים תושבי לב מאזור הצומת הסינואטרלי (SAN) והצומת האטריובנטריקולרי (AVN) של לבבות העכברים.
Abstract
מקרופאגים לבביים מקומיים הוכחו כמקלים על ההולכה החשמלית בלב. קצב הלב הפיזיולוגי מופעל על ידי דחפים חשמליים הנוצרים בצומת הסינואטרלי (SAN) ולאחר מכן מוליכים אותם לחדרים דרך צומת אטריובנטריקולרי (AVN). כדי להמשיך ולחקור את תפקידם של מקרופאגים תושבים במערכת הולכת הלב, יש צורך בבידוד נכון של מקרופאגים תושבים מ-SAN ו-AVN, אך הוא עדיין מאתגר. כאן, אנו מספקים פרוטוקול למיקרו-דיסקציה אמינה של ה-SAN וה-AVN בלבבות מורין ואחריה הבידוד והתרבות של מקרופאגים מקומיים.
שניהם, SAN אשר ממוקם בצומת של crista terminalis עם הווריד הנבוב העליון, ו AVN אשר ממוקם בקצה המשולש של קוך, מזוהים microdissected. מיקום נכון מאושר על ידי ניתוח היסטולוגי של הרקמה המבוצע עם כתם טריכרום של מסון ועל ידי אנטי HCN4.
לאחר מכן, רקמות מיקרו-דיסקרטיות מתעכלות באופן אנזימטי כדי לקבל תרחיפים של תאים בודדים ולאחר מכן הדגירה עם פאנל מסוים של נוגדנים המכוונים נגד סמני פני שטח ספציפיים מסוג תא. זה מאפשר לזהות, לספור או לבודד אוכלוסיות תאים שונות על ידי מיון תאים מופעל פלואורסצנטי. כדי להבדיל בין מקרופאגים תושבי לב לבין תאים חיסוניים אחרים בשריר הלב, במיוחד מקרופאגים שמקורם במונוציטים, יש צורך באסטרטגיית גיתור עדינה. ראשית, תאי שושלת לימפואידים מזוהים ואינם נכללים בניתוח נוסף. לאחר מכן, תאים מיאלואידים מזוהים עם מקרופאגים מקומיים הנקבעים על ידי ביטוי גבוה של CD45 ו- CD11b, וביטוי נמוך של Ly6C. באמצעות מיון תאים, ניתן לטפח מקרופאגים לבביים מבודדים במבחנה במשך מספר ימים לצורך חקירה נוספת. לפיכך, אנו מתארים פרוטוקול לבידוד מקרופאגים תושבי לב הממוקמים בתוך מערכת ההולכה הלבבית. אנו דנים במלכודות במיקרו-דיסקציה ובעיכול SAN ו-AVN, ומספקים אסטרטגיית גידור לזיהוי, ספירה ומיון אמינים של מקרופאגים לבביים על-ידי מיון תאים המופעל על-ידי פלואורסצנציה.
Introduction
הצומת הסינואטריאלי (SAN) יוזם פיזיולוגית את הדחף החשמלי ולכן הוא קוצב הלב העיקרי של הלב. הצומת האטריובנטריקולרי (AVN) מוליך את הדחף החשמלי מהאטריה אל החדרים ופועל גם כקוצב לב בת1. באופן כללי, ייצור והולכה של דחפים חשמליים הוא תהליך מורכב שניתן לווסת על ידי גורמים שונים2, כולל מקרופאגים תושבים באזורי SAN/AVN. מחקר שנערך לאחרונה על ידי Hulsmans et al. מדגים אוכלוסייה ספציפית של מקרופאגים תושבי לב המועשרים ב- AVN ומתפקדים כשחקני מפתח בשמירה על דופק יציב3. הם מצאו כי מקרופאגים מצומדים חשמלית לקרדיומיוציטים ויכולים לשנות את התכונות החשמליות של קרדיומיוציטים מצומדים. המחברים מציינים גם כי תאים מוליכים כאלה המשולבים עם מקרופאגים נמצאים גם ברכיבים אחרים של מערכת ההולכה הלבבית, כגון SAN.
נכון לעכשיו, לא ידוע אם הפנוטיפ של מקרופאגים לבביים תושבים שונה בין אזורי הלב. עם זאת, הוכח כי מיקרו-סביבה של רקמות יכולה להשפיע על שעתוק והתחדשות שגשוג של מקרופאגים רקמתיים4. יתר על כן, מאחר שפנוטיפ הקרדיומיוציטים הוכח כשונה בין אזורים, ההשפעות התפקודיות של מקרופאגים על קרדיומיוציטים עשויות להיות גם ספציפיות לאזור, גם אם הפנוטיפ של המקרופאגים עצמו עשוי להיות זהה. לכן, יש צורך במחקרים נוספים על אזורי לב ספציפיים.
מחקרים אחרונים הראו כי במצב יציב, המקרופאגים השוכנים ברקמה נקבעים לפני הלידה, נובעים ללא תלות בהמטופויזה סופית, ונמשכים לבגרות5. עם זאת, לאחר דלדול מקרופאגים או במהלך דלקת לב, Ly6cהיי מונוציטים לתרום לחידוש אוכלוסיית מקרופאגים לבביים6. מחקרים שכללו מעקב אחר שושלת גנטית, פרביוזה, מיפוי גורלות ומעקב אחר תאים הראו את הדו-קיום של מגוון אוכלוסיות מקרופאגים תושבי רקמות באיברים וברקמות, וכן, התנהגות תאית שונה של תת-קבוצות מקרופאגים שעשויות להיות קשורות לאונטוגניה שלהם 7,8,9.
האפיון של מקרופאגים לבביים מקומיים נהנה משימוש במיון תאים מופעלים מגנטיים (MACS) ומיון תאים מופעלים פלואורסצנטיים. שיטות אלה שימושיות במיוחד לבידוד אוכלוסיות תאים ספציפיות משברי רקמות מרובים על ידי תיווגם עם סמני פני התא שלהם. זה לא רק מוביל לטוהר גבוה יותר של סוג התא החיסוני המבודד, אלא גם מאפשר ניתוח פנוטיפי. כאן אנו מציגים פרוטוקול הכולל תאים מצופים חרוזים מגנטיים ולאחר מכן מיון תאים מופעלים פלואורסצנטיים להעשרת מקרופאגים תושבי לב שבודדו במיוחד מאזור SAN ו- AVN.
כדי לחקור את המאפיינים של מקרופאגים תושבי לב במערכת ההולכה ואת תפקודם עבור הולכה לבבית והפרעות קצב, לוקליזציה מדויקת ודיסקציה של SAN ו- AVN הם קריטיים. עבור מיקרודיסקציה של SAN ו- AVN, ציוני דרך אנטומיים משמשים לזיהוי האזור10. בקצרה, SAN ממוקם בצומת של הווריד הנבוב העליון והאטריום הימני. AVN ממוקם בתוך המשולש של קוך, אשר גובל קדמית על ידי עלון מחיצה של שסתום tricuspid, ומאחור על ידי הגיד של Todaro11. אנו מספקים גם הליך מיקרו-דיסקציה מדויק של SAN ו- AVN בעכברים אשר אושר על ידי היסטולוגיה וצביעה אימונופלואורסצנטית.
מקרופאגים מקומיים מבודדים יכולים לשמש לניסויים נוספים כגון ריצוף RNA או שניתן לשחזר ולטפח אותם במשך יותר משבועיים ולאפשר ניסויים שונים במבחנה. לכן, הפרוטוקול שלנו מתאר הליך בעל ערך רב עבור האימונו-ריתמולוג. טבלה 1 מציגה את ההרכב של כל הפתרונות הדרושים, איור 1 מראה את ציוני הדרך של מיקרו-דיסקציה עבור SAN ו-AVN. איור 2 הוא המחשה סכמטית של לוקליזציה של SAN ו-AVN. איור 3 מראה את הכתמים ההיסטולוגיים של SAN ו-AVN (הכתם הטריכרום והאימונופלואורסצנציה של מאסון). איור 4 מראה אסטרטגיית מיון שלב אחר שלב לבידוד מקרופאגים תושבי לב על-ידי מיון תאים המופעלים על-ידי פלואורסצנציה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
הטיפול בבעלי חיים וכל הליכי הניסוי נערכו בהתאם להנחיות ועדת הטיפול והאתיקה של אוניברסיטת מינכן וכל ההליכים שבוצעו על עכברים אושרו על ידי ממשלת בוואריה, מינכן, גרמניה. עכברי C57BL6/J הושגו באופן מסחרי.
1. הכנות
- הכן את מאגר מיון התאים (טבלה 1) ואחסן ב- 4 °C.
הערה: במהלך כל הליך הניסוי, מאגר מיון התאים צריך להיות תמיד על קרח. - הכן את מאגר העיכול (טבלה 1) זמן קצר לפני העיכול, שכן ניתן היה לזהות את פעילות הקולגן רק למשך מספר שעות בטמפרטורת החדר.
- עיין בפרוטוקול שפורסם בעבר להכנת צלחת דיסקציה10. בקיצור, הוסיפו 30 מ"ל של ג'ל אגרוז (3%-4%) לצלחת פטרי בקוטר 100 מ"מ והתקררו בטמפרטורת החדר.
2. הקרבת בעלי חיים וכריתת לב
- הרדמת העכבר עם איזופלורן על ידי הצבתו בתא דגירה המחובר עם מכשיר אידוי איזופלורן ושטף עם 5% איזופלורן / 95% חמצן.
- לאחר הזרקת פנטניל לשיכוך כאבים, לפתוח את כלוב הצלעות ולהחדיר את הלב על ידי הזרקת 5-10 מ"ל של PBS קר כקרח 1x ישירות לתוך החדר השמאלי (LV). חלצו את לב העכברים והניחו אותו על צלחת הדיסקציה. פרטי הניסוי תוארו בפירוט בעבר10.
3. מיקרו-דיסקציה של SAN ו-AVN
- לאחר בידוד הלב, בצע את הליכי המיקרודיסקציה הבאים בצלחת הדיסקציה עם PBS קר כקרח 1x תחת מיקרוסקופ הניתוח.
- השתמש בציוני דרך אנטומיים לבביים, כלומר, אבי העורקים, עורק הריאה, הסינוס הכלילי, חדר שמאל/ימין וכו '. כדי לקבוע את השמאלי/ימני (משמאל: LV; מימין: RV) והקדמי/אחורי (קדמי: אבי העורקים; אחורי: סינוס כלילי) של הלב. לאחר קביעת הכיוון, סובבו את הלב עם חזיתו בתחתית המנה (כדי לחשוף את הוורידים הגדולים הממוקמים מאחור).
- מיקרודיסקציה של SAN
הערה: מיקרו-דיסקציה של ה-SAN תוארה קודםלכן כ-10. התהליך מתואר בקצרה להלן.- חשוף את האזור הבין-קבלי על ידי הצמדת נספחי הפרוזדורים הימניים (RAA) והרקמה הסמוכה לווריד הנבוב העליון (SVC) ולווריד הנבוב התחתון (IVC) על צלחת המיקרו-דיסקציה באמצעות סיכות חרקים.
- חתכו את הלב לאורך המחיצה הבין-פרוזדורית במקביל ל-crista terminalis (CT) כדי להפריד בין האזור הבין-קבלי ולקבל את דגימת ה-SAN (איור 1A, איור 2A). שים את הדגימה בצינור מיקרוצנטריפוגה ריק של 1.5 מ"ל על קרח.
- מיקרו-דיסקציה של AVN
- לאחר איסוף דגימת ה- SAN ודא שה- RAA וחלקים מהאטריום הימני (RA) כבר נחתכו והותירו רק את המחיצה הבין-חדרית (IAS) ואת המחיצה הבין-חדרית (IVS).
- הצמד את החלקים הנותרים של הלב דרך הרקמה הסמוכה ל-IAS ול-IVS באמצעות סיכות חרקים כדי לגרום לצד הפרוזדורים הימני של ה-IAS לפנות כלפי מעלה.
- התבונן באטריום הימני על המשטח האנדוקרדיאלי למשולש של קוך. הוא יהיה גובל קדמית על ידי קו הציר של עלון המחיצה של שסתום tricuspid (טלוויזיה), ומאחור על ידי הגיד של Todaro. הפתח של הסינוס הכלילי נצפה בבסיס. (איור 1B, איור 2B).
- חותכים את המשולש של קוך, המכיל את AVN, ומכניסים אותו ישירות לצינור מיקרוצנטריפוגה ריק של 1.5 מ"ל על קרח.
4. עיכול
- יש להכין את מאגר העיכול (טבלה 1) זמן קצר לפני השימוש.
- טחנו היטב את רקמת ה-SAN וה-AVN בעזרת אזמלים.
הערה: טחינה טובה של הרקמה תגביר את יעילות העיכול ותעזור לקבל תרחיף תאים טוב למיון. מכיוון שדגימות SAN ו- AVN קטנות למדי, מומלץ לטחון את הרקמה ישירות בתוך צינור המיקרוצנטריפוגה של 1.5 מ"ל כדי להפחית את אובדן הדגימה. - הוסף 500 μL של חיץ עיכול לכל דגימה ושטוף את כל הרקמות הטחונות מהקיר של צינור microcentrifuge 1.5 מ"ל. צנרת עדינה מסייעת בעיכול הדגימה.
- הומוגניזציה של הצינור במכונת מערבולת (הגדרות: 37 מעלות צלזיוס, 750 סל"ד למשך שעה).
- לאחר העיכול, העבר את תרחיף הרקמה לצינור צנטריפוגה טרי של 15 מ"ל על ידי מעבר דרך מסננת תאים של 40 מיקרומטר. שטפו את מסננת התאים עם 5 מ"ל נוספים של חיץ מיון תאים כדי לעצור את העיכול.
- צנטריפוגה צינור 15 מ"ל ב 350 x גרם במשך 7 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. לאחר מכן להסיר את supernatant לחלוטין באמצעות פיפטה. השהה את גלולת התא עם מאגר מיון תאים של 90 μL.
הערה: לפני הפרדה מגנטית, פיפטה של מתלה התא בעדינות כמה פעמים או לעבור דרך מסננת תאים בגודל 30 מיקרומטר כדי להסיר גושים של תאים במידת הצורך, כדי לקבל תרחיף של תא בודד לביצועים אופטימליים של העשרה מגנטית של אוכלוסיות תאים מעניינות.
5. העשרה מגנטית של CD45 וכתמת דגימות
הערה: כדי לבודד את המקרופאגים הלבביים ביעילות מיון גבוהה, הרחקה של תאים לא רצויים כולל לימפוציטים בוצעה עם מיקרובי CD45 על פי פרוטוקול היצרן. בהתבסס על לוח המיון, מקרופאגים תושבי לב זוהו כ-CD45 גבוה CD11b גבוה CD64גבוה Ly6C נמוך / int F4/ 80 גבוה.
- הוסף 10 μL של מיקרובי CD45 לכל 107 תאים סה"כ לתרחיף התא בצינור הצנטריפוגה של 15 מ"ל. מערבבים היטב את הדגימות ומדגרים אותן במשך 15 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
הערה: ספירת התאים באמצעות המוציטומטר צריכה להיעשות בקצרה כדי לוודא שכל צינור מכיל לא יותר מ 107 תאים סה"כ. כאשר עובדים עם מספרי תאים גבוהים יותר, יש להגדיל את נפח החרוזים המגנטיים. - הכינו את תערובת הנוגדנים על ידי דילול הנוגדנים הבאים במאגר מיון התאים (דילול 1:100 לכל נוגדן): CD45-PE, CD11b-APC-Cy7, CD64-APC, F4/80-PE-Cy7, Ly6C-FITC. DAPI יתווסף מאוחר יותר לכתמים על אפליה של חיים/מתים.
- לאחר 15 דקות של דגירה של חרוזים מגנטיים, הוסיפו 100 μL של תערובת נוגדנים ישירות לתוך תרחיף התאים בצינור 15 מ"ל (אז כל הריכוז הסופי של הנוגדנים הוא 1:200) ודגרה במשך 20 דקות ב-4 מעלות צלזיוס.
- לאחר 20 דקות של דגירה של נוגדנים, שטפו את מתלה התאים על ידי הוספת 1-2 מ"ל של מאגר מיון תאים לכל 107 תאים וצנטריפוגה בגודל 350 x g למשך 10 דקות. הסר לחלוטין את הסופרנטנט על ידי פיפטציה.
- השהה עד 108 תאים במאגר מיון תאים של 500 μL.
הערה: מספר התא המרבי להפרדה מגנטית צריך להיקבע בהתאם לפרוטוקול היצרן. - הכינו את ערכת ההפרדה המגנטית.
- חברו את העמודה המגנטית למפריד מגנטי מתאים והניחו צינור איסוף מתחת לעמוד המגנטי.
- הכן את העמודות המגנטיות על ידי שטיפה עם מאגר מיון תאים: הוסף 500 μL של מאגר מיון תאים בראש העמודה ותן למאגר לעבור.
- החל את השעיית התא באופן מיידי על העמודה בזמן שמאגר מיון התאים עובר דרכה.
הערה: הימנע מהיווצרות בועות אוויר בעמודה. על פי פרוטוקול היצרן, למרות שזמן מילוי העמודות עשוי להשתנות מתנאי האחסון, אין לו השפעה על איכות ההפרדה. - שטפו את העמודה עם מאגר מיון תאים בגודל 3 x 500 μL. הזרימה בשלב 5.7 ובשלב 5.8 מכילה תאים ללא תווית, אותם ניתן להשליך אם אין צורך בניסוי נוסף.
הערה: הוסף את מאגר מיון התאים מיד כאשר מאגר העמודות כמעט ריק. - הסר את העמודה מהמפריד המגנטי והנח אותה על צינור איסוף חדש.
- הוסף 1 מ"ל של מאגר מיון תאים לעמודה. יש לשטוף מיד את העמוד על ידי החלת הבוכנה המסופקת עם העמודה. הזרימה מכילה את התאים המסומנים מגנטית.
- הוסף תמיסת DAPI לכל מתלי התאים המסומנים מגנטית שנאספו זמן קצר לפני הפעלתם על סדרן התאים. התאם את הריכוז הסופי של DAPI ל- 0.3-0.5 מיקרוגרם למ"ל.
- בצע ניתוח FACS.
6. דוגמאות לפיצוי
- הכן 6 צינורות מיקרוצנטריפוגה חומים בגודל 1.5 מ"ל המסומנים כ-"PE", "APC-Cy7", "APC", "PE-Cy7", "FITC" ו-"DAPI" בהתאמה כדי להגן על נוגדנים מפני אור. הכן עוד שפופרת מיקרוצנטריפוגה אחת של 1.5 מ"ל המסומנת כ"לא מוכתמת ".
הערה: זה יכול להיעשות באותו זמן כמו דגירה של תרחיף התא עם חיידקים ונוגדנים. הדגימה הלא מוכתמת יכולה להיות רקמת קרדיומיוציטים שנאספת באופן אקראי מרקמת הלב החסכה וגם מטופלת על פי שלב 4. - דלל כל נוגדן מצומד פלואורסצנטי יחיד עם חיץ מיון תאים ל-1:50 בצינורות מיקרוצנטריפוגה חומים בגודל 1.5 מ"ל המסומנים בהתאם.
- מוסיפים טיפה אחת של תמיסת חרוזי פיצוי ומדגרים במשך 20 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
- הוסף 2 מ"ל של מאגר מיון תאים לכל צינור מיקרוצנטריפוגה חום של 1.5 מ"ל וצנטריפוגה בגודל 450 x גרם למשך 5 דקות. יש להשליך לחלוטין את הסופר-נאטנט ולתלות מחדש את החרוז המכיל גלולה עם חיץ מיון תאים של 300 μL ולהעביר אותם לצינורות מיון תאים המסומנים גם הם בהתאם.
7. ריצה על סדרן התאים ואסטרטגיית גידור
- החל תחילה את צינורות הדגימה והפיצוי הלא מוכתמים והתאם את המתחים של כל ערוץ כדי ליישר את השיא החיובי והשלילי למיקום הנכון של הציר. שמור את הגדרות הפיצוי והחל אותן על הדוגמאות הבאות.
- החל את הדגימות על סדרן התאים. הגדר את אסטרטגיית הגידור כמתואר באיור 4. מקרופאגים תושבי לב מזוהים כ- CD45 גבוה CD11bגבוהCD64גבוה Ly6Cנמוך / int F4/ 80 גבוה. DAPI משמש כסמן כדאיות תאים.
- בדוק את תרשימי הציטומטריה של הזרימה כדי לוודא שאוכלוסיית התאים המעניינים מוצגת כראוי בתרשימים. אם לא, התאם את המתח של כל ערוץ לתצוגה המרכזית של כל תרשים.
- אם הגדרות המתח משביעות רצון, התחל את הליך המיון. אסוף את אוכלוסיית התאים הממוינים לתרבית המורכבת מ-DMEM המכיל 10% סרום בקר עוברי, בתוספת 100 מיקרוגרם/מ"ל סטרפטומיצין ו-100 פניצילין U/mL.
8. תרבות מקרופאגים תושבים
- לאחר איסוף המקרופאגים הממוינים, העבירו את התאים באופן מיידי לכלי תרבית רקמה בקוטר 35 מ"מ או ל-24 צלחות באר, או השתמשו בהם ישירות לניסויים הבאים.
- כדי למיין מקרופאגים ממוינים בתרבית, לדגור על התאים ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 אינקובטור.
- שנה את מדיום התרבות כל 48-72 שעות. תאים מתים צפים ניתנים להסרה בקלות על ידי שינוי בינוני. השתמש במקרופאגים חיים המחוברים לתחתית צלחת התרבית לצורך הניסוי הבא.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
אנו מתארים הליך מעשי לבידוד של מקרופאגים תושבי לב במיוחד מאזור SAN ו- AVN. כדי לאשר דיסקציה נכונה, מבוצעים צביעת Trichrome של Masson וצביעת HCN4 אימונופלואורסצנטית (איור 3)12. בעזרת פרוטוקול זה יכולנו לאסוף כ-60,000 מקרופאגים מלב שלם אחד. איור 4 מציג את אסטרטגיית המיון למיון מקרופאגים לבביים. מקרופאגים לבביים חיים זוהו כ-CD45+CD11b+F4/80+CD64+Ly6C-. איור 5 מראה מקרופאגים לבביים ממוינים טריים שזוהו על-ידי אנטיגנים על פני השטח שלהם CD45, F4/80 ו-CD11b. תאים ממוינים טריים נצפו תחת תצפית שדה בהיר של מיקרוסקופ (איור 5A). התאים הממוינים היו חיוביים ל-CD45 (CD45+) כאשר נצפו מתחת לתעלת הפלואורופור-PE (איור 5B). אותה תצוגה של התאים הממוינים כאשר נצפתה תחת ערוץ פלואורופור-APC-Cy7 הראתה פנוטיפ CD11b+ (איור 5C). אותה תצוגה של התאים הממוינים כאשר נצפתה בערוץ פלואורופור-PE-Cy7 הראתה פנוטיפ F4/80+ (איור 5D). איור 5E הוא התמונה הממוזגת המתקבלת עם המיקרוסקופ הפלואורסצנטי עבור התאים הממוינים. תאים חיוביים משולשים אלה זוהו כמקרופאגים תושבי הלב. איור 6 מראה מקרופאגים לבביים מבודדים שגודלו בתרבית בינונית עד 6 ימים. חצים לבנים מציינים מקרופאגים, חצים שחורים הצביעו על תאים מתים צפים בצורת עגול.
איור 1: אנטומיה של ה-SAN וה-AVN תחת מיקרוסקופ הדיסקציה. (A) אנטומיה של ה-SAN תחת מיקרוסקופ הדיסקציה. מיקומו של ה-SAN מסומן על-ידי קו מקווקו אדום בתוך האזור הבין-קבלי (קווים מקווקווים שחורים). (B) אנטומיה של ה-AVN תחת מיקרוסקופ הדיסקציה. נתון זה שונה ממאמר10 שפורסם בעבר. ה-AVN (עיגול מקווקו אדום) ממוקם בקצה המשולש של קוך (משולש מקווקו לבן) בסמוך לתחתית המחיצה הממברנית. המשולש של קוך נוצר על ידי הגיד של Todaro (TT, קו מקווקו ירוק), שסתום tricuspid (טלוויזיה, קו מקווקו כחול) ואת הפתח של הסינוס הכלילי (CS, קו מקווקו צהוב). SVC, וריד קאווה מעולה; IVC, וריד קאווה נחות; IAS, מחיצות בין-פרוזדוריות; RA, אטריום ימני; RAA, נספח פרוזדורים ימני; RV, חדר ימין; CT, Crista terminalis; IVS, מחיצה בין-חדרית; OF, פוסה סגלגלה. PA, עורק ריאתי; RV, חדר ימין; LV, חדר שמאל. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 2: איור סכמטי של לוקליזציה של SAN ו-AVN. (A) איור סכמטי של לוקליזציה של SAN. SAN מסומן על ידי עיגול מקווקו אדום בתוך האזור הבין-קבלי מלבד ה- CT (קו מקווקו שחור). (B) איור סכמטי של לוקליזציה של AVN. AVN מסומן על ידי עיגול מקווקו אדום בתוך משולש קוך (משולש מקווקו אפור) המורכב מטלוויזיה ומהפתח של CS. SVC, וריד קאווה מעולה; IVC, וריד קאווה נחות; IAS, מחיצות בין-פרוזדוריות; RA, אטריום ימני; RAA, נספח פרוזדורים ימני; CT, Crista terminalis; IVS, מחיצה בין-חדרית; OF, פוסה סגלגלה; IVS, מחיצה בין-חדרית. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 3: זיהוי ה-SAN וה-AVN עם כתם היסטולוגי. זיהוי ה-SAN (A,B) וה-AVN (C,D). צביעה אימונופלואורסצנטית של תאי מערכת הולכה חיובית HCN4 ב-SAN (A) ו-AVN (C) וכן צביעה טריכרומית של SAN (B) ו-AVN (D) של Masson. חיצים אדומים מציינים עורק צומת סינוס (SNA, B), חץ שחור וקו מקווקו שחור מציינים AVN קומפקטי, חץ כחול מציין את הגוף הסיבי המרכזי (CFB). CT, crista terminalis; CFB, גוף סיבי מרכזי; CN, AVN קומפקטי; RA, אטריום ימני; RV, חדר ימין; IAS, מחיצות בין-פרוזדוריות; IVS, מחיצה בין-חדרית; טלוויזיה, שסתום טריקוספיד; MV, שסתום מיטרלי. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 4: אסטרטגיית גטינג למיון תאים של מקרופאגים לבביים מקומיים. תאים חד-גרעיניים מזוהים, כפילים אינם נכללים על ידי FSC-W לעומת FSC-A ותאים מתים אינם נכללים על ידי DAPI (A-D). תאים חיים מגודרים על CD45+ לויקוציטים (E), ולאחר מכן מגודרים על CD11b+ תאים מיאלואידים (F). מקרופאגים לבביים זוהו על ידי הביטוי של F4/80 ו- CD64 (G), ולאחר מכן רובד על ידי ביטוי Ly6C (H). מקרופאגים לבביים חיים מזוהים כ-CD45+CD11b+F4/80+CD64+Ly6C-. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 5: מקרופאגים לבביים ממוינים טריים וכתמים אימונופלואורסצנטיים. (A) מקרופאגים לבביים ממוינים טריים. צביעה אימונופלואורסצנטית של אנטיגנים ספציפיים על פני השטח כגון CD45 (B), CD11b (C) או F4/80 (D). על פי אסטרטגיית הגטינג, מקרופאגים לבביים מזוהים כתאים חיוביים משולשים (E). סרגל קנה המידה מייצג 50 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 6: תרבות של מקרופאגים ממוינים. תרבית של מקרופאגים ממוינים במדיום תרבית במשך 48 שעות (A, B), 96 שעות (C,D) ו-6 ימים (E,F) בהתאמה. מוצגות שתי מנות תרבות בודדות בכל נקודת זמן (מנה 1: A, C, E; מנה 2: B, D, F). חצים לבנים מציינים מקרופאגים חיים בעלי צורה דמוית ציר ובליטות אופייניות3. חצים שחורים מציינים תאים מתים צפים בצורת עגול. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
| תרכובת | ריכוז סופי | g או ml נדרש |
| מאגר FACS | ||
| BSA | 0.50% | |
| EDTA | 2 מ"מ | |
| PBS (פי 1) | 500 מ"ל | |
| חיץ עיכול | ||
| קולגןאז I | 450 U/mL | |
| קולגןאז XI | 125 U/מ"ל | |
| DNase I | 60 U/מ"ל | |
| היאלורונידז | 60 U/מ"ל | |
| מאגר HEPES | 20 מיקרוגרם ל-1 מ"ל | |
| PBS (פי 1) | יש להוסיף עד 1 מ"ל עבור 2 דוגמיות | |
| מדיום תרבותי | ||
| DMEM | 79 מ"ל | |
| פניצילין/סטרפטומיצין | 1% | 1 מ"ל |
| FBS | 20% | 20 מ"ל |
| TAE (50x) | ||
| טריס-בייס | 24.20% | 24.2 גרם |
| 100% חומצה אצטית | 5.71% | 5.71 מ"ל |
| 0.5 מ' אדטה | 0.05 מ' | 10 מ"ל |
| dH2O | הוסף עד 100 מ"ל | |
טבלה 1: הרכב הפתרונות הדרושים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
בכתב יד זה, אנו מתארים פרוטוקול להעשרת מקרופאגים תושבי לב במיוחד מאזורי SAN ו- AVN בטוהר גבוה.
מקרופאגים מחולקים לתת-אוכלוסיות על סמך מיקומם האנטומי והפנוטיפ התפקודי שלהם. הם יכולים גם לעבור מפנוטיפ פונקציונלי אחד למשנהו בתגובה לאותות מיקרו-סביבתיים משתנים13. בהשוואה לאיברים אחרים כגון מח עצם וכבד, רקמת הלב מכילה אחוז נמוך יותר של תאי חיסון ומספרים מוחלטים נמוכים יותר של כל תת-אוכלוסייה תאית14. לכן, מיון תאים, שיטות העשרה וטיהור הם כלים נחוצים כדי להשיג כמויות מספיקות של אוכלוסיית התא המעניינת. מיון תאים המופעל על ידי פלואורסצנציה, ו-MACS מאפשרים להשיג אוכלוסיות תאים טהורות וממוינות מכיוון שהם מאפשרים מדידה סימולטנית של תכונות שונות של התאים.
לוחות ציטומטריה שונים של זרימה תוארו לזיהוי תת-אוכלוסיות של מקרופאגים לבביים 3,6,15. הפונקציה של מקרופאגים במצב יציב ומחלה לא רק תלויים במקור ההתפתחותי שלהם, אלא גם על סביבת הרקמות. באופן כללי, הלב הבוגר מכיל שתי תת-קבוצות עיקריות של מקרופאגים מקומיים מסוג Ly6C low/CCR2 המבטאים רמות שונות של MHC-II ואשר יכולים לשמור על עצמם באמצעות התפשטות מקומית במצב יציב ואילו במהלך המחלה הקלאסית Ly6C מונוציטיםגבוהים מגויסים לאתרים של דלקת, שם הם מתבדלים למקרופאגים16 . במהלך ההתפתחות, תת-אוכלוסיות שונות של מקרופאגים תופסות מקומות לבביים שונים הקשורים לתפקודים שונים17. שמנו לנו למטרה לחקור את המקרופאגים התושבים באופן ספציפי ממערכת ההולכה הלבבית, במיוחד המקרופאגים התושבים מאזורי SAN ו-AVN. על פי Hulsmans et al. מקרופאגים תושבי לב מזוהים כ- CD45 גבוה CD11bגבוהCD64גבוה F4/80גבוהLy6Cנמוך / int.
קציר המקרופאגים תושבי הלב מעכבר בוגר אחד למיון תאים דורש כ-3 שעות. חשוב לארגן את הליכי הניסוי בצורה הגיונית ולאפשר דגירה במקביל כדי לחסוך זמן ולמזער את הטיפול במקרופאגים השבריריים בפושע. מכיוון שהליך המיון יכול להפעיל לחץ על התאים הממוינים, המלצנו לקצר את זמן המיון על ידי שימוש בחרוזים מגנטיים שיכולים להגביר מאוד את יעילות המיון וגם מאפשרים להשיג טוהר גבוה יותר של מקרופאגים מקומיים.
היישום של פרוטוקול זה כולל, בין היתר, טיהור של מקרופאגים ו/או כל סוג אחר של תאים שאינם קרדיומיוציטים מרקמת הלב ומכל זן עכברים אחר. המקרופאגים הממוינים יכולים לשמש לניסויים הבאים, למשל מבחני תנועתיות תאים, מחקרי ביטוי גנים או חלבונים וכו'. ריצוף RNA חד-תאי אפשרי גם על ידי איסוף תאים אחד-אחד ישירות מצינור האיסוף של סדרן התאים.
עם זאת, למיון תאים מבוסס ציטומטריה של זרימה יש מגבלות. פאנל נוגדנים שתוכנן במדויק הוא חשוב ועליו לקחת בחשבון את הביטוי של אנטיגנים על אוכלוסיית התאים המעניינים והפלואורופור המצומד לנוגדנים. תפקוד התאים ויכולת הקיום שלהם עשויים להשתנות על-ידי נוגדנים קושרים, מה שעשוי להשפיע על תוצאות הניסויים הבאים. בנוסף, מכשירי מיון התאים המורכבים הם יקרים, מתוחכמים, וגם מועדים לבעיות עם חסימות מערכת fluidics וכיול לייזר. מכאן שנדרשת תחזוקה על ידי מומחה מיומן ביותר ותפעול נכון על ידי טכנאי מקצועי ומנוסה. אף על פי שמיון תאים יכול לספק אוכלוסיית תאים טהורה ומעניינת, היעילות הכוללת עדיין נמוכה יחסית.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
לא דווח על ניגוד עניינים פוטנציאלי הרלוונטי לכתבה זו.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי מועצת המלגות של סין (CSC, ל- R. Xia), המרכז הגרמני לחקר הלב וכלי הדם (DZHK; 81X2600255 ל- S. Clauss, 81Z0600206 ל- S. Kääb, 81Z0600204 ל- C.S.), קרן הקורונה (S199/10079/2019 ל- S. Clauss), SFB 914 (פרויקט Z01 ל- S. Massberg), ה- ERA-NET למחלות לב וכלי דם (ERA-CVD; 01KL1910 ל- S. Clauss) וקרן היינריך ולוטה מולפנצל (ל- S. Clauss). למממנים לא היה כל תפקיד בהכנת כתבי היד.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anesthesia | |||
| Isoflurane vaporizer system | Hugo Sachs Elektronik | 34-0458, 34-1030, 73-4911, 34-0415, 73-4910 | Includes an induction chamber, a gas evacuation unit and charcoal filters |
| Modified Bain circuit | Hugo Sachs Elektronik | 73-4860 | Includes an anesthesia mask for mice |
| Surgical Platform | Kent scientific | SURGI-M | |
| In vivo instrumentation | |||
| Fine forceps | Fine Science Tools | 11295-51 | |
| Iris scissors | Fine Science Tools | 14084-08 | |
| Spring scissors | Fine Science Tools | 91500-09 | |
| Tissue forceps | Fine Science Tools | 11051-10 | |
| Tissue pins | Fine Science Tools | 26007-01 | Could use 27G needles as a substitute |
| General lab instruments | |||
| Orbital shaker | Sunlab | D-8040 | |
| Pipette,volume 10ul, 100ul, 1000ul | Eppendorf | Z683884-1EA | |
| Magnetic stirrer | IKA | RH basic | |
| Microscopes | |||
| Dissection stereo- zoom microscope | vwr | 10836-004 | |
| Leica microscope | Leica microsystems | Leica DM6 | |
| Flow cytometry machine | |||
| Beckman Coulter | Beckman coulter | MoFlo Astrios | |
| Software | |||
| FlowJo v10 | FlowJo | ||
| General Lab Material | |||
| 0.2 µm syringe filter | sartorius | 17597 | |
| 100 mm petri dish | Falcon | 351029 | |
| 27G needle | BD Microlance 3 | 300635 | |
| 50 ml Polypropylene conical Tube | FALCON | 352070 | |
| Cover slips | Thermo scientific | 7632160 | |
| Eppendorf Tubes | Eppendorf | 30121872 | |
| 5ml Syringe | Braun | 4606108V | |
| Chemicals | |||
| 0.5 M EDTA | Sigma | 20-158 | |
| Acetic acid | Merck | 100063 | Component of TEA |
| Agarose | Biozym | 850070 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A2153-100G | |
| Collagenase I | Worthington Biochemical | LS004196 | |
| Collagenase XI | Sigma | C7657 | |
| DNase I | Sigma | D4527 | |
| Hyaluronidase | Sigma | H3506 | |
| HEPES buffer | Sigma | H4034 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A2153-100G | |
| DPBS (1X) Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Gibco | 14190-094 | |
| Fetal bovine serum | Sigma | F2442-500ml | |
| Penicillin − Streptomycin | Sigma | P4083 | |
| DMEM | Gibco | 41966029 | |
| Drugs | |||
| Fentanyl 0.5 mg/10 ml | Braun Melsungen | ||
| Isoflurane 1 ml/ml | Cp-pharma | 31303 | |
| Oxygen 5L | Linde | 2020175 | Includes a pressure regulator |
| Antibodies | |||
| Anti-mouse Ly6C FITC (clone HK1.4) | BioLegend | Cat# 128006 | diluted to 1:100 |
| Anti-mouse F4/80 PE/Cy7(clone BM8) | BioLegend | Cat# 123114 | diluted to 1:100 |
| Anti-mouse CD64 APC (clone X54-5/7.1) | BioLegend | Cat# 139306 | diluted to 1:100 |
| Anti-mouse CD11b APC/Cy7(clone M1/70) | BioLegend | Cat# 101226 | diluted to 1:100 |
| Anti-mouse CD45 PE (clone 30-F11) | BioLegend | Cat# 103106 | diluted to 1:100 |
| Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate (DAPI) | Invitrogen | H3570 | diluted to 1:1000 |
| Animals | |||
| Mouse, C57BL/6 | Charles River Laboratories |
References
- Nikolaidou, T., Aslanidi, O. V., Zhang, H., Efimov, I. R. Structure-function relationship in the sinus and atrioventricular nodes. Pediatric Cardiology. 33 (6), 890-899 (2012).
- Clauss, S., et al. Animal models of arrhythmia: classic electrophysiology to genetically modified large animals. Nature Review Cardiology. 16 (8), 457-475 (2019).
- Hulsmans, M., et al. Macrophages Facilitate Electrical Conduction in the Heart. Cell. 169 (3), 510-522 (2017).
- Rosas, M., et al. The transcription factor Gata6 links tissue macrophage phenotype and proliferative renewal. Science. 344 (6184), 645-648 (2014).
- Schulz, C., et al. A lineage of myeloid cells independent of Myb and hematopoietic stem cells. Science. 336 (6077), 86-90 (2012).
- Epelman, S., et al. Embryonic and adult-derived resident cardiac macrophages are maintained through distinct mechanisms at steady state and during inflammation. Immunity. 40 (1), 91-104 (2014).
- Gordon, S., Pluddemann, A. Tissue macrophages: heterogeneity and functions. BMC Biology. 15 (1), 53 (2017).
- Bajpai, G., et al. The human heart contains distinct macrophage subsets with divergent origins and functions. Nature Medicine. 24 (8), 1234-1245 (2018).
- Davies, L. C., Jenkins, S. J., Allen, J. E., Taylor, P. R.
- Xia, R., et al. Whole-mount immunofluorescence staining, confocal imaging and 3D reconstruction of the sinoatrial and atrioventricular node in the mouse. Journal of Visualized Experiments. (166), e62058 (2020).
- van Weerd, J. H., Christoffels, V. M. The formation and function of the cardiac conduction system. Development. 143 (2), 197-210 (2016).
- Ye Sheng, X., et al. Isolation and characterization of atrioventricular nodal cells from neonate rabbit heart. Circulation: Arrhythmia and Electrophysiology. 4 (6), 936-946 (2011).
- Murray, P. J., Wynn, T. A. Protective and pathogenic functions of macrophage subsets. Nature Reviews Immunology. 11 (11), 723-737 (2011).
- Pinto, A. R., et al.
- Bajpai, G., et al. Tissue resident CCR2- and CCR2+ cardiac macrophages differentially orchestrate monocyte recruitment and fate specification following myocardial injury. Circulation Research. 124 (2), 263-278 (2019).
- Honold, L., Nahrendorf, M. Resident and monocyte-derived macrophages in cardiovascular disease. Circulation Research. 122 (1), 113-127 (2018).
- Leid, J., et al. Primitive embryonic macrophages are required for coronary development and maturation. Circulation Research. 118 (10), 1498-1511 (2016).
Tags
רפואה גיליון 171 מערכת הולכת לב צומת סינואטרלי צומת אטריובנטריקולרית מקרופאגים לבביים תושבים ציטומטריה של זרימה מיון תאים מופעל מגנטית MACS מיון תאים המופעלים על ידי פלואורסצנציה מיקרודיסקציה תרבית תאים ראשונייםErratum
Formal Correction: Erratum: Isolation and Culture of Resident Cardiac Macrophages from the Murine Sinoatrial and Atrioventricular Node
Posted by JoVE Editors on 02/02/2023.
Citeable Link.
An erratum was issued for: Isolation and Culture of Resident Cardiac Macrophages from the Murine Sinoatrial and Atrioventricular Node. The Authors section was updated from:
Ruibing Xia123
Simone Loy1
Stefan Kääb13
Anna Titova1
Christian Schulz123
Steffen Massberg123
Sebastian Clauss123
1University Hospital Munich, Department of Medicine I Ludwig-Maximilian-Unversity Munich (LMU)
2Walter Brendel Center of Experimental Medicine (WBex) LMU Munich
3German Center for Cardiovascular Research (DZHK), Partner Site Munich, Munich Heart Alliance (MHA)
to:
Ruibing Xia123
Simone Loy1
Stefan Kääb13
Anna Titova1
Christian Schulz123
Steffen Massberg123
Sebastian Clauss123
1University Hospital Munich, Department of Medicine I Ludwig-Maximilian-University Munich (LMU)
2Insitute of Surgical Research at the Walter Brendel Center of Experimental Medicine, University Hospital Munich, Ludwig-Maximilians-University (LMU)
3German Center for Cardiovascular Research (DZHK), Partner Site Munich, Munich Heart Alliance (MHA)
