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Summary
El protocolo presentado aquí proporciona un enfoque paso a paso para el aislamiento de macrófagos residentes cardíacos de la región del nodo sinoauricular (SAN) y el nodo auriculoventricular (AVN) de corazones de ratón.
Abstract
Se ha demostrado que los macrófagos cardíacos residentes facilitan la conducción eléctrica en el corazón. El ritmo cardíaco fisiológico se inicia por impulsos eléctricos generados en el nódulo sinoauricular (SAN) y luego se conducen a los ventrículos a través del nódulo auriculoventricular (AVN). Para estudiar más a fondo el papel de los macrófagos residentes en el sistema de conducción cardíaca, es necesario un aislamiento adecuado de los macrófagos residentes de SAN y AVN, pero sigue siendo un desafío. Aquí, proporcionamos un protocolo para la microdisección confiable de la RAS y AVN en corazones murinos seguido del aislamiento y cultivo de macrófagos residentes.
Tanto el SAN que se encuentra en la unión de la crista terminalis con la vena cava superior, como AVN, que se encuentra en el vértice del triángulo de Koch, están identificados y microdisecados. La localización correcta se confirma mediante el análisis histológico del tejido realizado con tinción tricrómica de Masson y por anti-HCN4.
Los tejidos microdisecados se digieren enzimáticamente para obtener suspensiones de células individuales seguidas de la incubación con un panel específico de anticuerpos dirigidos contra marcadores de superficie específicos de tipo celular. Esto permite identificar, contar o aislar diferentes poblaciones celulares mediante clasificación celular activada por fluorescencia. Para diferenciar los macrófagos residentes cardíacos de otras células inmunes en el miocardio, especialmente los macrófagos derivados de monocitos reclutados, se necesita una estrategia de activación delicada diseñada. Primero, las células de linaje linfoide se detectan y se excluyen de un análisis adicional. Luego, las células mieloides se identifican con macrófagos residentes que se determinan por la alta expresión de CD45 y CD11b, y la baja expresión de Ly6C. Con la clasificación celular, los macrófagos cardíacos aislados se pueden cultivar in vitro durante varios días para una mayor investigación. Por lo tanto, describimos un protocolo para aislar macrófagos residentes cardíacos ubicados dentro del sistema de conducción cardíaca. Discutimos las trampas en la microdisección y digestión de SAN y AVN, y proporcionamos una estrategia de compuerta para identificar, contar y clasificar de manera confiable los macrófagos cardíacos mediante clasificación celular activada por fluorescencia.
Introduction
El nódulo sinoauricular (SAN) inicia fisiológicamente el impulso eléctrico y, por lo tanto, es el marcapasos primario del corazón. El nódulo auriculoventricular (AVN) conduce el impulso eléctrico desde las aurículas hasta los ventrículos y también actúa como un marcapasos subsidiario1. En general, la generación y conducción de impulsos eléctricos es un proceso complejo que puede ser modulado por varios factores2, incluyendo macrófagos residentes en regiones SAN/AVN. Un estudio reciente de Hulsmans et al. demuestra una población específica de macrófagos cardíacos residentes que se enriquecen en la AVN y funcionan como actores clave para mantener un latido cardíaco constante3. Encontraron que los macrófagos están acoplados eléctricamente a los cardiomiocitos y podrían cambiar las propiedades eléctricas de los cardiomiocitos acoplados. Los autores también señalan que tales células conductoras que se entrelazan con los macrófagos también están presentes en otros componentes del sistema de conducción cardíaca, como el SAN.
Actualmente, no se sabe completamente si el fenotipo de los macrófagos cardíacos residentes difiere entre las regiones cardíacas. Sin embargo, se ha demostrado que el microambiente tisular puede afectar la transcripción y renovación proliferativa de los macrófagos tisulares4. Además, dado que se ha demostrado que el fenotipo de los cardiomiocitos es diferente entre regiones, los efectos funcionales de los macrófagos sobre los cardiomiocitos también pueden ser específicos de la región, incluso si el fenotipo de macrófagos en sí puede ser el mismo. Por lo tanto, se necesitan más estudios sobre regiones cardíacas específicas.
Estudios recientes han demostrado que, en estado estacionario, los macrófagos residentes en el tejido se establecen prenatalmente, surgiendo independientemente de la hematopoyesis definitiva, y persisten en la edad adulta5. Sin embargo, después del agotamiento de macrófagos o durante la inflamación cardíaca, los monocitosLy6c hi contribuyen a reponer la población de macrófagos cardíacos6. Los estudios que involucran el rastreo genético del linaje, la parabiosis, el mapeo del destino y el seguimiento celular mostraron la coexistencia de una variedad de poblaciones de macrófagos residentes en tejidos en órganos y tejidos, y, también, diferentes comportamientos celulares de subconjuntos de macrófagos que están potencialmente asociados con su ontogenia 7,8,9.
La caracterización de macrófagos cardíacos residentes se ha beneficiado del uso de la clasificación de células activadas magnéticas (MACS) y la clasificación de células activadas fluorescentes. Estos métodos son particularmente útiles para aislar poblaciones celulares específicas de múltiples fracciones de tejido al etiquetarlas con sus marcadores de superficie celular. Esto no solo conduce a una mayor pureza del tipo de célula inmune aislada, sino que también permite el análisis fenotípico. Aquí, presentamos un protocolo que incluye células recubiertas de perlas magnéticas seguidas de clasificación de células activadas fluorescentes para el enriquecimiento de macrófagos residentes cardíacos específicamente aislados de la región SAN y AVN.
Para explorar las características de los macrófagos residentes cardíacos en el sistema de conducción y su función para la conducción cardíaca y la arritmogénesis, la localización y disección precisas de SAN y AVN son críticas. Para la microdisección de SAN y AVN, se utilizan puntos de referencia anatómicos para la identificación de la región10. En resumen, SAN se encuentra en la unión de la vena cava superior y la aurícula derecha. AVN se encuentra dentro del triángulo de Koch, que está bordeado anteriormente por la valva septal de la válvula tricúspide, y posteriormente por el tendón de Todaro11. También proporcionamos un procedimiento preciso de microdisección de SAN y AVN en ratones que se confirma mediante histología y tinción de inmunofluorescencia.
Los macrófagos residentes aislados podrían usarse para experimentos adicionales, como la secuenciación de ARN, o podrían recuperarse y cultivarse durante más de dos semanas, lo que permitiría varios experimentos in vitro. Por lo tanto, nuestro protocolo describe un procedimiento muy valioso para el inmunorritmo. La Tabla 1 muestra la composición de todas las soluciones necesarias, la Figura 1 muestra los puntos de referencia de microdisección para SAN y AVN. La Figura 2 es una ilustración esquemática de la localización de SAN y AVN. La Figura 3 muestra la tinción histológica de SAN y AVN (tinción tricrómica e inmunofluorescencia de Masson). La Figura 4 muestra una estrategia de activación paso a paso para aislar macrófagos residentes cardíacos mediante clasificación celular activada por fluorescencia.
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Protocol
El cuidado de los animales y todos los procedimientos experimentales se llevaron a cabo de acuerdo con las directrices del Comité de Cuidado y Ética Animal de la Universidad de Munich y todos los procedimientos realizados en ratones fueron aprobados por el Gobierno de Baviera, Munich, Alemania. Se obtuvieron comercialmente ratones C57BL6/J.
1. Preparativos
- Preparar el tampón de clasificación celular (Tabla 1) y almacenar a 4 °C.
NOTA: Durante todo el procedimiento experimental, el tampón de clasificación celular siempre debe estar en hielo. - Prepare el tampón de digestión (Tabla 1) poco antes de la digestión, ya que la actividad de la colagenasa solo se pudo detectar durante unas pocas horas a temperatura ambiente.
- Consulte el protocolo publicado anteriormente para la preparación de la placa de disección10. En resumen, agregue 30 ml de gel de agarosa (3% -4%) en una placa de Petri de 100 mm de diámetro y enfríe a temperatura ambiente.
2. Sacrificio de animales y escisión del corazón
- Anestesiar al ratón con isoflurano colocándolo en una cámara de incubación conectada con un vaporizador de isoflurano y enjuagado con 5% de isoflurano / 95% de oxígeno.
- Después de la inyección de fentanilo para analgesia, abra la caja torácica y perfunda el corazón inyectando 5-10 ml de PBS 1x helado directamente en el ventrículo izquierdo (VI). Extrae el corazón de los ratones y ponlo en el plato de disección. Los detalles experimentales se han descrito en detalle anteriormente10.
3. Microdisección de SAN y AVN
- Después de aislar el corazón, realice los siguientes procedimientos de microdisección en la placa de disección con 1x PBS helado bajo el microscopio de disección.
- Utilice los puntos de referencia anatómicos cardíacos, es decir, aorta, arteria pulmonar, seno coronario, ventrículo izquierdo / derecho, etc. para determinar la izquierda/derecha (izquierda: VI; derecha: VD) y anterior/posterior (anterior: aorta; posterior: seno coronario) del corazón. Después de determinar la orientación, gire alrededor del corazón con la parte frontal del mismo en el fondo del plato (para exponer las venas grandes que se encuentran en la parte posterior).
- Microdisección de SAN
NOTA: La microdisección de la SAN se ha descrito previamente10. El proceso se describe brevemente a continuación.- Exponga la región intercava fijando los apéndices auriculares derechos (RAA) y el tejido adyacente a la vena cava superior (VCS) y la vena cava inferior (VCI) en la placa de microdisección utilizando alfileres de insectos.
- Cortar el corazón a lo largo del tabique interauricular paralelo a la crista terminal (TC) para separar la región intercava y obtener la muestra SAN (Figura 1A, Figura 2A). Coloque la muestra en un tubo vacío de microcentrífuga de 1,5 ml sobre hielo.
- Microdisección de AVN
- Después de la recolección de la muestra de SAN, asegúrese de que el RAA y partes de la aurícula derecha (AR) ya se hayan cortado, dejando solo el tabique interauricular (IAS) y el tabique interventricular (IVS).
- Fije las partes restantes del corazón a través del tejido adyacente al IAS y al IVS usando alfileres de insectos para hacer que el lado auricular derecho del IAS esté hacia arriba.
- Mire la aurícula derecha en la superficie endocárdica para el triángulo de Koch. Estará bordeado anteriormente por la línea de bisagra de la valva septal de la válvula tricúspide (TV), y posteriormente por el tendón de Todaro. El orificio del seno coronario se observa en la base. (Figura 1B, Figura 2B).
- Corte el triángulo de Koch, que contiene el AVN, y colóquelo directamente en un tubo de microcentrífuga vacío de 1,5 ml sobre hielo.
4. Digestión
- Prepare el tampón de digestión (Tabla 1) poco antes de usarlo.
- Picar bien el tejido SAN y AVN con bisturís.
NOTA: Picar bien el tejido aumentará la eficiencia de la digestión y ayudará a obtener una buena suspensión celular para la clasificación. Como las muestras SAN y AVN son bastante pequeñas, se recomienda picar el tejido directamente dentro del tubo de microcentrífuga de 1,5 ml para reducir la pérdida de muestra. - Agregue 500 μL de tampón de digestión por muestra y lave todo el tejido picado de la pared del tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. El pipeteo suave ayuda a digerir la muestra.
- Homogeneizar el tubo en una máquina de vórtice (ajustes: 37 °C, 750 rpm durante 1 h).
- Después de la digestión, transfiera la suspensión tisular a un tubo centrífugo fresco de 15 ml pasando a través de un filtro celular de 40 μm. Enjuague el colador celular con 5 ml adicionales de tampón de clasificación celular para detener la digestión.
- Centrifugar el tubo de 15 ml a 350 x g durante 7 min a 4 °C. A continuación, retire el sobrenadante completamente con la pipeta. Resuspender el pellet celular con tampón de clasificación celular de 90 μL.
NOTA: Antes de la separación magnética, pipetear suavemente la suspensión celular unas cuantas veces o pasar a través de un filtro celular de 30 μm para eliminar los grupos de células si es necesario, para obtener una suspensión de una sola célula para un rendimiento óptimo del enriquecimiento magnético de poblaciones celulares interesantes.
5. Enriquecimiento magnético de CD45 y tinción de muestras
NOTA: Para aislar los macrófagos cardíacos con alta eficiencia de clasificación, se realizó la exclusión de células no deseadas, incluidos los linfocitos, con microperlas CD45 de acuerdo con el protocolo del fabricante. Con base en el panel de clasificación, los macrófagos residentes cardíacos se identificaron como CD45 alto CD11b alto CD64 alto Ly6Cbajo / int F4/80 alto.
- Añadir 10 μL de microperlas CD45 por 107 células totales a la suspensión celular en el tubo de centrífuga de 15 ml. Mezclar bien las muestras e incubarlas durante 15 min a 4 °C.
NOTA: El recuento de células con un hemocitómetro debe hacerse brevemente para asegurarse de que cada tubo no contenga más de 107 células en total. Cuando se trabaja con números de células más altos, el volumen de perlas magnéticas debe ampliarse. - Preparar la mezcla de anticuerpos diluyendo los siguientes anticuerpos en tampón de clasificación celular (dilución 1:100 para cada anticuerpo): CD45-PE, CD11b-APC-Cy7, CD64-APC, F4/80-PE-Cy7, Ly6C-FITC. DAPI se agregará más adelante a la tinción para la discriminación de vivos / muertos.
- Después de 15 minutos de incubación de perlas magnéticas, añadir 100 μL de mezcla de anticuerpos directamente en la suspensión celular en el tubo de 15 ml (entonces la concentración final de todos los anticuerpos es 1:200) e incubar durante 20 min a 4 °C.
- Después de 20 minutos de incubación de anticuerpos, lavar la suspensión celular agregando 1-2 ml de tampón de clasificación celular por 107 células y centrifugar a 350 x g durante 10 min. Retire completamente el sobrenadante mediante pipeteo.
- Resuspender hasta 108 células en 500 μL de tampón de clasificación celular.
NOTA: El número máximo de células para la separación magnética debe determinarse de acuerdo con el protocolo del fabricante. - Prepare el conjunto de separación magnética.
- Fije la columna magnética a un separador magnético adecuado y coloque un tubo de recolección debajo de la columna magnética.
- Prepare las columnas magnéticas enjuagando con tampón de clasificación celular: agregue 500 μL de tampón de clasificación celular en la parte superior de la columna y deje pasar el tampón.
- Aplique la suspensión de celdas inmediatamente sobre la columna mientras pasa el búfer de clasificación de celdas.
NOTA: Evite la formación de burbujas de aire en la columna. Según el protocolo del fabricante, aunque el tiempo de llenado de la columna puede cambiar con respecto a las condiciones de almacenamiento, no influye en la calidad de la separación. - Lave la columna con 3 tampón de clasificación de celdas de 500 μL. El flujo en los pasos 5.7 y 5.8 contiene celdas no marcadas, que pueden descartarse si no se necesita más experimento.
NOTA: Agregue el búfer de clasificación de celdas inmediatamente cuando el depósito de columna esté casi vacío. - Retire la columna del separador magnético y colóquela en un nuevo tubo de recolección.
- Agregue 1 ml de búfer de clasificación celular a la columna. Enjuague inmediatamente la columna aplicando firmemente el émbolo suministrado con la columna. El flujo a través contiene las células marcadas magnéticamente.
- Agregue la solución DAPI a todas las suspensiones celulares etiquetadas magnéticamente recolectadas poco antes de ejecutarlas en el clasificador celular. Ajustar la concentración final de DAPI a 0,3-0,5 μg/ml.
- Realizar análisis FACS.
6. Muestras para compensación
- Prepare 6 tubos de microcentrífuga marrones de 1,5 ml etiquetados como "PE", "APC-Cy7", "APC", "PE-Cy7", "FITC" y "DAPI" respectivamente para proteger los anticuerpos de la luz. Prepare otro tubo de microcentrífuga de 1,5 ml etiquetado como "sin teñir".
NOTA: Esto podría hacerse al mismo tiempo que se incuba la suspensión celular con las microperlas y los anticuerpos. La muestra no teñida podría ser el tejido cardiomiocitario recogido al azar del tejido cardíaco preservado y también tratado de acuerdo con el paso 4. - Diluir cada anticuerpo conjugado con fluorescencia con tampón de clasificación celular en 1:50 en los tubos de microcentrífuga marrón de 1,5 ml que están marcados en consecuencia.
- Añadir una gota de solución de perlas de compensación e incubar durante 20 min a 4 °C.
- Agregue 2 ml de tampón de clasificación celular en cada tubo de microcentrífuga marrón de 1,5 ml y centrifugar a 450 x g durante 5 min. Deseche completamente el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet que contiene la perla con tampón de clasificación celular de 300 μL y transfiéralos a tubos clasificadores de células que también estén marcados en consecuencia.
7. Ejecución en el clasificador de celdas y estrategia de compuerta
- Aplique primero la muestra sin teñir y los tubos de compensación y ajuste los voltajes de cada canal para alinear el pico positivo y negativo a la posición correcta del eje. Guarde la configuración de compensación y aplíquela a los siguientes ejemplos.
- Aplicar las muestras en el clasificador de celdas. Establezca la estrategia de acceso como se describe en la figura 4. Los macrófagos residentes cardíacos se identifican como CD45 alto CD11b altoCD64alto Ly6C bajo / int F4/80alto. DAPI se utiliza como marcador de viabilidad celular.
- Verifique los diagramas de citometría de flujo para confirmar que la población celular de interés se muestra correctamente en los gráficos. Si no es así, ajuste el voltaje de cada canal a la vista central de cada gráfico.
- Si los ajustes de voltaje son satisfactorios, inicie el procedimiento de clasificación. Recolectar la población celular clasificada en un medio de cultivo compuesto por DMEM que contiene 10% de suero fetal bovino, suplementado con 100 μg/mL de estreptomicina y 100 U/ml de penicilina.
8. Cultivo de macrófagos residentes
- Después de reunir los macrófagos clasificados, transfiera las células inmediatamente a placas de cultivo de tejidos de 35 mm o a una placa de 24 pocillos, o utilícelas directamente para experimentos posteriores.
- Para cultivar macrófagos clasificados, incubar las células a 37 °C, incubadora deCO2 al 5%.
- Cambiar el medio de cultivo cada 48-72 h. Las células muertas flotantes se pueden eliminar fácilmente mediante un cambio medio. Use macrófagos vivos adheridos al fondo de la placa de cultivo para el experimento posterior.
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Representative Results
Describimos un procedimiento práctico para el aislamiento de macrófagos residentes cardíacos específicamente de la región SAN y AVN. Para confirmar una disección correcta, se realiza la tinción tricrómica de Masson y la tinción inmunofluorescente de HCN4 (Figura 3)12. Con este protocolo, podríamos recolectar aproximadamente 60,000 macrófagos de un corazón completo. La figura 4 muestra la estrategia de compuerta para clasificar los macrófagos cardíacos. Los macrófagos cardíacos residentes vivos se identificaron como CD45 + CD11b + F4 / 80 + CD64 + Ly6C-. La Figura 5 muestra macrófagos cardíacos recién clasificados que fueron identificados por sus antígenos de superficie CD45, F4/80 y CD11b. Se observaron células recién clasificadas bajo la visión de campo claro del microscopio (Figura 5A). Las células clasificadas fueron positivas para CD45 (CD45+) cuando se observaron bajo el canal fluoróforo-PE (Figura 5B). La misma vista de las células clasificadas cuando se observó bajo el canal fluoróforo-APC-Cy7 mostró fenotipo CD11b+ (Figura 5C). La misma vista de las células clasificadas cuando se observó bajo el canal fluoróforo-PE-Cy7 mostró fenotipo F4/80+ (Figura 5D). La figura 5E es la imagen combinada obtenida con el microscopio fluorescente para las células clasificadas. Estas células triple positivas se identificaron como macrófagos residentes cardíacos. La Figura 6 muestra macrófagos cardíacos aislados cultivados en medio hasta 6 días. Las flechas blancas indican macrófagos, las flechas negras indican células muertas flotantes de forma redonda.
Figura 1: Anatomía de la RAS y AVN bajo el microscopio de disección. (A) Anatomía de la RAS bajo el microscopio de disección. La ubicación de la RAS está indicada por una línea discontinua roja dentro de la región intercaval (líneas discontinuas negras). (B) Anatomía de la AVN bajo el microscopio de disección. Esta cifra ha sido modificada del artículo10 publicado anteriormente. El AVN (círculo discontinuo rojo) se encuentra en el vértice del triángulo de Koch (triángulo discontinuo blanco) cerca de la parte inferior del tabique membranoso. El triángulo de Koch está formado por el tendón de Todaro (TT, línea discontinua verde), la válvula tricúspide (TV, línea discontinua azul) y el orificio del seno coronario (CS, línea discontinua amarilla). SVC: vena cava superior; VCI: vena cava inferior; IAS: tabique interauricular; AR: aurícula derecha; RAA: apéndice auricular derecho; RV: ventrículo derecho; TC: Crista terminalis; IVS: tabique interventricular; OF: fosa ovalada. PA: arteria pulmonar; RV: ventrículo derecho; VI: ventrículo izquierdo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Ilustración esquemática de la localización de SAN y AVN. (A) Ilustración esquemática de la localización de SAN. SAN se indica mediante un círculo discontinuo rojo dentro de la región intercaval además de la CT (línea discontinua negra). (B) ilustración esquemática de la localización AVN. AVN se indica mediante un círculo discontinuo rojo dentro del triángulo de Koch (triángulo discontinuo gris) compuesto por TV y el orificio de CS. SVC: vena cava superior; VCI: vena cava inferior; IAS: tabique interauricular; AR: aurícula derecha; RAA: apéndice auricular derecho; TC: Crista terminalis; IVS: tabique interventricular; OF: fosa ovalada; IVS: tabique interventricular. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Identificación de la RAS y AVN con tinción histológica. Identificación de la SAN (A, B) y AVN (C, D). Tinción inmunofluorescente de células del sistema de conducción positivas HCN4 en SAN (A) y AVN (C), así como tinción tricrómica de Masson de SAN (B) y AVN (D). Las flechas rojas indican la arteria del nodo sinusal (SNA, B), la flecha negra y la línea discontinua negra indican AVN compacta, la flecha azul indica el cuerpo fibroso central (CFB). TC: crista terminalis; CFB: cuerpo fibroso central; CN: AVN compacto; AR: aurícula derecha; RV: ventrículo derecho; IAS: tabique interauricular; IVS: tabique interventricular; TV: válvula tricúspide; MV: válvula mitral. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Estrategia de compuerta para la clasificación celular de macrófagos cardíacos residentes. Las células mononucleares son identificadas, los dobletes son excluidos por FSC-W vs. FSC-A y las células muertas son excluidas por DAPI (A-D). Las células vivas están bloqueadas en los leucocitos CD45 + (E) y luego bloqueadas en las células mieloides CD11b + (F). Los macrófagos cardíacos se identificaron mediante la expresión de F4/80 y CD64 (G), y finalmente se estratificaron mediante la expresión de Ly6C (H). Los macrófagos cardíacos residentes vivos se identifican como CD45 + CD11b + F4 / 80 + CD64 + Ly6C-. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Macrófagos cardíacos recién clasificados y tinción inmunofluorescente. (A) Macrófagos cardíacos recién clasificados. Tinción inmunofluorescente de antígenos de superficie específicos como CD45 (B), CD11b (C) o F4/80 (D). De acuerdo con la estrategia de compuerta, los macrófagos cardíacos se identifican como células triple positivas (E). La barra de escala representa 50 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6: Cultivo de macrófagos ordenados. Cultivo de macrófagos clasificados en medio de cultivo durante 48h (A, B), 96 h (C,D) y 6 días (E,F) respectivamente. Se muestran dos platos de cultivo individuales por punto de tiempo (plato 1: A, C, E; plato 2: B, D, F). Las flechas blancas indican macrófagos vivos con forma de huso y protuberancias típicas3. Las flechas negras indican celdas muertas flotantes de forma redonda. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Compuesto | Concentración final | g o ml requerido |
| Tampón FACS | ||
| BSA | 0.50% | |
| EDTA | 2 mM | |
| PBS (1X) | 500ml | |
| Tampón de digestión | ||
| Colagenasa I | 450 U/ml | |
| Colagenasa XI | 125 U/ml | |
| DNasa I | 60 U/ml | |
| Hialuronidasa | 60 U/ml | |
| Búfer HEPES | 20 μl por 1 ml | |
| PBS (1X) | Añadir hasta 1 ml para 2 muestras | |
| Medio de cultivo | ||
| DMEM | 79 ml | |
| Penicilina/estreptomicina | 1% | 1 ml |
| FBS (en inglés) | 20% | 20 ml |
| TAE (50x) | ||
| Tris-base | 24.20% | 24,2 g |
| 100 % ácido acético | 5.71% | 5,71 ml |
| EDTA de 0,5 m | 0,05 m | 10 ml |
| dH2O | Añadir hasta 100ml | |
Tabla 1: Composición de las soluciones necesarias.
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Discussion
En este manuscrito, describimos un protocolo para el enriquecimiento de macrófagos residentes cardíacos específicamente de las regiones SAN y AVN a alta pureza.
Los macrófagos se dividen en subpoblaciones en función de su ubicación anatómica y fenotipo funcional. También pueden cambiar de un fenotipo funcional a otro en respuesta a señales microambientales variables13. En comparación con otros órganos como la médula ósea y el hígado, el tejido cardíaco contiene un menor porcentaje de células inmunes y menores números absolutos de cada subpoblación celular14. Por lo tanto, los métodos de clasificación, enriquecimiento y purificación celular son herramientas necesarias para obtener cantidades suficientes de la población celular de interés. La clasificación celular activada por fluorescencia y MACS permiten obtener poblaciones celulares puras y ordenadas, ya que permite la medición simultánea de varias propiedades de las células.
Se han descrito diferentes paneles de citometría de flujo para la identificación de subpoblaciones de macrófagos cardíacos 3,6,15. La función de los macrófagos en estado estacionario y la enfermedad no solo dependen de su origen de desarrollo, sino también del entorno del tejido. En general, el corazón adulto contiene dos subconjuntos principales de macrófagosresidentes en Ly6C bajo/CCR2 que expresan diferentes niveles de MHC-II y que pueden mantenerse a través de la proliferación local en estado estacionario, mientras que durante la enfermedad los monocitosaltos clásicos de Ly6C se reclutan en sitios de inflamación, donde se diferencian en macrófagos16 . Durante el desarrollo, diferentes subpoblaciones de macrófagos ocupan diferentes ubicaciones cardíacas asociadas a distintas funciones17. Nuestro objetivo fue estudiar los macrófagos residentes específicamente del sistema de conducción cardíaca, especialmente los macrófagos residentes de las regiones SAN y AVN. Según Hulsmans et al. los macrófagos residentes cardíacos se identifican como CD45 alto CD11b altoCD64alto F4/80 altoLy6Cbajo/int.
La recolección de macrófagos residentes cardíacos de un ratón adulto para la clasificación celular requiere aproximadamente 3 horas. Es importante organizar los procedimientos experimentales lógicamente y permitir la incubación en paralelo para ahorrar tiempo y minimizar el manejo de los macrófagos posiblemente frágiles en la suspensión. Como el procedimiento de clasificación podría ejercer presión sobre las células clasificadas, recomendamos reducir el tiempo de clasificación mediante el uso de perlas magnéticas que podrían aumentar enormemente la eficiencia de clasificación y también permiten obtener una mayor pureza de los macrófagos residentes.
La aplicación de este protocolo incluye, entre otros, la purificación de macrófagos y / o cualquier otro tipo de células no cardiomiocitos del tejido cardíaco y cualquier otra cepa de ratones. Los macrófagos ordenados podrían usarse para experimentos posteriores, por ejemplo, ensayos de motilidad celular, estudios de expresión génica o proteica, etc. La secuenciación de ARN unicelular también es posible mediante la recolección de células una por una directamente desde el tubo colector del clasificador de células.
Sin embargo, la clasificación celular basada en citometría de flujo tiene sus limitaciones. Un panel de anticuerpos diseñado con precisión es importante y debe considerar la expresión de antígenos en la población celular de interés y el fluoróforo conjugado con los anticuerpos. La función y la viabilidad de las células podrían verse alteradas por los anticuerpos de unión, lo que podría afectar los resultados de experimentos posteriores. Además, los complejos instrumentos de clasificación de células son caros, sofisticados y también propensos a problemas con bloqueos del sistema de fluidos y calibración láser. Por lo tanto, se requiere el mantenimiento por parte de especialistas altamente capacitados y la operación adecuada por parte de un técnico profesional experimentado. A pesar de que la clasificación celular podría proporcionar una población celular pura de interés, la eficiencia general sigue siendo relativamente baja.
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Disclosures
No se informó de ningún posible conflicto de intereses relevante para este artículo.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por el Consejo de Becas de China (CSC, a R. Xia), el Centro Alemán de Investigación Cardiovascular (DZHK; 81X2600255 a S. Clauss, 81Z0600206 a S. Kääb, 81Z0600204 a C.S.), la Fundación Corona (S199/10079/2019 a S. Clauss), el SFB 914 (proyecto Z01 a S. Massberg), el ERA-NET sobre Enfermedades Cardiovasculares (ERA-CVD; 01KL1910 a S. Clauss) y la Heinrich-and-Lotte-Mühlfenzl Stiftung (a S. Clauss). Los financiadores no tuvieron ningún papel en la preparación del manuscrito.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anesthesia | |||
| Isoflurane vaporizer system | Hugo Sachs Elektronik | 34-0458, 34-1030, 73-4911, 34-0415, 73-4910 | Includes an induction chamber, a gas evacuation unit and charcoal filters |
| Modified Bain circuit | Hugo Sachs Elektronik | 73-4860 | Includes an anesthesia mask for mice |
| Surgical Platform | Kent scientific | SURGI-M | |
| In vivo instrumentation | |||
| Fine forceps | Fine Science Tools | 11295-51 | |
| Iris scissors | Fine Science Tools | 14084-08 | |
| Spring scissors | Fine Science Tools | 91500-09 | |
| Tissue forceps | Fine Science Tools | 11051-10 | |
| Tissue pins | Fine Science Tools | 26007-01 | Could use 27G needles as a substitute |
| General lab instruments | |||
| Orbital shaker | Sunlab | D-8040 | |
| Pipette,volume 10ul, 100ul, 1000ul | Eppendorf | Z683884-1EA | |
| Magnetic stirrer | IKA | RH basic | |
| Microscopes | |||
| Dissection stereo- zoom microscope | vwr | 10836-004 | |
| Leica microscope | Leica microsystems | Leica DM6 | |
| Flow cytometry machine | |||
| Beckman Coulter | Beckman coulter | MoFlo Astrios | |
| Software | |||
| FlowJo v10 | FlowJo | ||
| General Lab Material | |||
| 0.2 µm syringe filter | sartorius | 17597 | |
| 100 mm petri dish | Falcon | 351029 | |
| 27G needle | BD Microlance 3 | 300635 | |
| 50 ml Polypropylene conical Tube | FALCON | 352070 | |
| Cover slips | Thermo scientific | 7632160 | |
| Eppendorf Tubes | Eppendorf | 30121872 | |
| 5ml Syringe | Braun | 4606108V | |
| Chemicals | |||
| 0.5 M EDTA | Sigma | 20-158 | |
| Acetic acid | Merck | 100063 | Component of TEA |
| Agarose | Biozym | 850070 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A2153-100G | |
| Collagenase I | Worthington Biochemical | LS004196 | |
| Collagenase XI | Sigma | C7657 | |
| DNase I | Sigma | D4527 | |
| Hyaluronidase | Sigma | H3506 | |
| HEPES buffer | Sigma | H4034 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A2153-100G | |
| DPBS (1X) Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Gibco | 14190-094 | |
| Fetal bovine serum | Sigma | F2442-500ml | |
| Penicillin − Streptomycin | Sigma | P4083 | |
| DMEM | Gibco | 41966029 | |
| Drugs | |||
| Fentanyl 0.5 mg/10 ml | Braun Melsungen | ||
| Isoflurane 1 ml/ml | Cp-pharma | 31303 | |
| Oxygen 5L | Linde | 2020175 | Includes a pressure regulator |
| Antibodies | |||
| Anti-mouse Ly6C FITC (clone HK1.4) | BioLegend | Cat# 128006 | diluted to 1:100 |
| Anti-mouse F4/80 PE/Cy7(clone BM8) | BioLegend | Cat# 123114 | diluted to 1:100 |
| Anti-mouse CD64 APC (clone X54-5/7.1) | BioLegend | Cat# 139306 | diluted to 1:100 |
| Anti-mouse CD11b APC/Cy7(clone M1/70) | BioLegend | Cat# 101226 | diluted to 1:100 |
| Anti-mouse CD45 PE (clone 30-F11) | BioLegend | Cat# 103106 | diluted to 1:100 |
| Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate (DAPI) | Invitrogen | H3570 | diluted to 1:1000 |
| Animals | |||
| Mouse, C57BL/6 | Charles River Laboratories |
References
- Nikolaidou, T., Aslanidi, O. V., Zhang, H., Efimov, I. R. Structure-function relationship in the sinus and atrioventricular nodes. Pediatric Cardiology. 33 (6), 890-899 (2012).
- Clauss, S., et al. Animal models of arrhythmia: classic electrophysiology to genetically modified large animals. Nature Review Cardiology. 16 (8), 457-475 (2019).
- Hulsmans, M., et al. Macrophages Facilitate Electrical Conduction in the Heart. Cell. 169 (3), 510-522 (2017).
- Rosas, M., et al. The transcription factor Gata6 links tissue macrophage phenotype and proliferative renewal. Science. 344 (6184), 645-648 (2014).
- Schulz, C., et al. A lineage of myeloid cells independent of Myb and hematopoietic stem cells. Science. 336 (6077), 86-90 (2012).
- Epelman, S., et al. Embryonic and adult-derived resident cardiac macrophages are maintained through distinct mechanisms at steady state and during inflammation. Immunity. 40 (1), 91-104 (2014).
- Gordon, S., Pluddemann, A. Tissue macrophages: heterogeneity and functions. BMC Biology. 15 (1), 53 (2017).
- Bajpai, G., et al. The human heart contains distinct macrophage subsets with divergent origins and functions. Nature Medicine. 24 (8), 1234-1245 (2018).
- Davies, L. C., Jenkins, S. J., Allen, J. E., Taylor, P. R.
- Xia, R., et al. Whole-mount immunofluorescence staining, confocal imaging and 3D reconstruction of the sinoatrial and atrioventricular node in the mouse. Journal of Visualized Experiments. (166), e62058 (2020).
- van Weerd, J. H., Christoffels, V. M. The formation and function of the cardiac conduction system. Development. 143 (2), 197-210 (2016).
- Ye Sheng, X., et al. Isolation and characterization of atrioventricular nodal cells from neonate rabbit heart. Circulation: Arrhythmia and Electrophysiology. 4 (6), 936-946 (2011).
- Murray, P. J., Wynn, T. A. Protective and pathogenic functions of macrophage subsets. Nature Reviews Immunology. 11 (11), 723-737 (2011).
- Pinto, A. R., et al.
- Bajpai, G., et al. Tissue resident CCR2- and CCR2+ cardiac macrophages differentially orchestrate monocyte recruitment and fate specification following myocardial injury. Circulation Research. 124 (2), 263-278 (2019).
- Honold, L., Nahrendorf, M. Resident and monocyte-derived macrophages in cardiovascular disease. Circulation Research. 122 (1), 113-127 (2018).
- Leid, J., et al. Primitive embryonic macrophages are required for coronary development and maturation. Circulation Research. 118 (10), 1498-1511 (2016).
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Medicina Número 171 sistema de conducción cardíaca ganglio sinoauricular nódulo auriculoventricular macrófagos cardíacos residentes citometría de flujo clasificación celular activada magnéticamente MACS clasificación celular activada por fluorescencia microdisección cultivo celular primarioErratum
Formal Correction: Erratum: Isolation and Culture of Resident Cardiac Macrophages from the Murine Sinoatrial and Atrioventricular Node
Posted by JoVE Editors on 02/02/2023.
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An erratum was issued for: Isolation and Culture of Resident Cardiac Macrophages from the Murine Sinoatrial and Atrioventricular Node. The Authors section was updated from:
Ruibing Xia123
Simone Loy1
Stefan Kääb13
Anna Titova1
Christian Schulz123
Steffen Massberg123
Sebastian Clauss123
1University Hospital Munich, Department of Medicine I Ludwig-Maximilian-Unversity Munich (LMU)
2Walter Brendel Center of Experimental Medicine (WBex) LMU Munich
3German Center for Cardiovascular Research (DZHK), Partner Site Munich, Munich Heart Alliance (MHA)
to:
Ruibing Xia123
Simone Loy1
Stefan Kääb13
Anna Titova1
Christian Schulz123
Steffen Massberg123
Sebastian Clauss123
1University Hospital Munich, Department of Medicine I Ludwig-Maximilian-University Munich (LMU)
2Insitute of Surgical Research at the Walter Brendel Center of Experimental Medicine, University Hospital Munich, Ludwig-Maximilians-University (LMU)
3German Center for Cardiovascular Research (DZHK), Partner Site Munich, Munich Heart Alliance (MHA)
