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Summary
Il protocollo qui presentato fornisce un approccio passo-passo per l'isolamento dei macrofagi residenti cardiaci dalla regione del nodo senoatriale (SAN) e del nodo atrioventricolare (AVN) dei cuori di topo.
Abstract
È stato dimostrato che i macrofagi cardiaci residenti facilitano la conduzione elettrica nel cuore. Il ritmo cardiaco fisiologico è iniziato da impulsi elettrici generati nel nodo senoatriale (SAN) e quindi condotto ai ventricoli tramite nodo atrioventricolare (AVN). Per studiare ulteriormente il ruolo dei macrofagi residenti nel sistema di conduzione cardiaca, è necessario un adeguato isolamento dei macrofagi residenti da SAN e AVN, ma rimane impegnativo. Qui, forniamo un protocollo per la microdissezione affidabile di SAN e AVN nei cuori murini seguita dall'isolamento e dalla coltura dei macrofagi residenti.
Entrambi, SAN che si trova alla giunzione della crista terminalis con la vena cava superiore, e AVN che si trova all'apice del triangolo di Koch, sono identificati e microsezionati. La corretta localizzazione è confermata dall'analisi istologica del tessuto eseguita con la colorazione tricromica di Masson e dall'anti-HCN4.
I tessuti microdissezionati vengono quindi digeriti enzimaticamente per ottenere sospensioni monocellulari seguite dall'incubazione con uno specifico pannello di anticorpi diretti contro marcatori di superficie specifici del tipo cellulare. Ciò consente di identificare, contare o isolare diverse popolazioni cellulari mediante selezione cellulare attivata fluorescente. Per differenziare i macrofagi residenti cardiaci da altre cellule immunitarie nel miocardio, in particolare i macrofagi derivati dai monociti reclutati, è necessaria una delicata strategia di gating ideata. In primo luogo, le cellule della linea linfoide vengono rilevate ed escluse da ulteriori analisi. Quindi, le cellule mieloidi sono identificate con macrofagi residenti determinati dall'alta espressione di CD45 e CD11b e dalla bassa espressione di Ly6C. Con la selezione cellulare, i macrofagi cardiaci isolati possono quindi essere coltivati in vitro per diversi giorni per ulteriori indagini. Descriviamo quindi un protocollo per isolare i macrofagi residenti cardiaci situati all'interno del sistema di conduzione cardiaca. Discutiamo le insidie nella microdissezione e nella digestione di SAN e AVN e forniamo una strategia di gating per identificare, contare e ordinare in modo affidabile i macrofagi cardiaci mediante la selezione cellulare attivata dalla fluorescenza.
Introduction
Il nodo senoatriale (SAN) avvia fisiologicamente l'impulso elettrico ed è, quindi, il pacemaker primario del cuore. Il nodo atrioventricolare (AVN) conduce l'impulso elettrico dagli atri ai ventricoli e funge anche da pacemaker sussidiario1. In generale, la generazione e la conduzione di impulsi elettrici è un processo complesso che può essere modulato da vari fattori2, inclusi i macrofagi residenti nelle regioni SAN / AVN. Un recente studio di Hulsmans et al. dimostra una popolazione specifica di macrofagi residenti cardiaci che sono arricchiti nell'AVN e funzionano come attori chiave nel mantenere un battito cardiaco costante3. Hanno scoperto che i macrofagi sono accoppiati elettricamente ai cardiomiociti e potrebbero cambiare le proprietà elettriche dei cardiomiociti accoppiati. Gli autori osservano inoltre che tali cellule conduttrici che si intercedono con i macrofagi sono presenti anche in altri componenti del sistema di conduzione cardiaca, come il SAN.
Attualmente, non è completamente noto se il fenotipo dei macrofagi cardiaci residenti differisca tra le regioni cardiache. Tuttavia, è stato dimostrato che il microambiente tissutale può influenzare la trascrizione e il rinnovamento proliferativo dei macrofagi tissutali4. Inoltre, poiché è stato dimostrato che il fenotipo dei cardiomiociti è diverso tra le regioni, gli effetti funzionali dei macrofagi sui cardiomiociti possono anche essere specifici per regione, anche se il fenotipo macrofagico stesso può essere lo stesso. Pertanto, sono necessari ulteriori studi su specifiche regioni cardiache.
Studi recenti hanno dimostrato che, allo stato stazionario, i macrofagi residenti nei tessuti si stabiliscono prenatale, insorgono indipendentemente dall'ematopoiesi definitiva e persistono nell'età adulta5. Tuttavia, dopo deplezione dei macrofagi o durante l'infiammazione cardiaca, glihimonociti Ly6c contribuiscono a ricostituire la popolazione di macrofagi cardiaci6. Gli studi che coinvolgono il tracciamento del lignaggio genetico, la parabiosi, la mappatura del destino e il tracciamento cellulare hanno mostrato la coesistenza di una varietà di popolazioni di macrofagi residenti nei tessuti in organi e tessuti e, inoltre, un diverso comportamento cellulare dei sottogruppi di macrofagi che sono potenzialmente associati alla loro ontogenesi 7,8,9.
La caratterizzazione dei macrofagi cardiaci residenti ha beneficiato dell'uso della selezione delle cellule attivate magnetiche (MACS) e della selezione delle cellule attivate fluorescenti. Questi metodi sono particolarmente utili per isolare specifiche popolazioni cellulari da più frazioni di tessuto etichettandole con i loro marcatori di superficie cellulare. Ciò non solo porta ad una maggiore purezza del tipo di cellula immunitaria isolata, ma consente anche l'analisi fenotipica. Qui, presentiamo un protocollo che include cellule rivestite di perline magnetiche seguite da selezione cellulare attivata fluorescente per l'arricchimento di macrofagi residenti cardiaci specificamente isolati dalla regione SAN e AVN.
Per esplorare le caratteristiche dei macrofagi residenti cardiaci nel sistema di conduzione e la loro funzione per la conduzione cardiaca e l'aritmogenesi, la localizzazione e la dissezione precise di SAN e AVN sono fondamentali. Per la microdissezione di SAN e AVN, vengono utilizzati punti di riferimento anatomici per l'identificazione della regione10. In breve, SAN si trova all'incrocio della vena cava superiore e dell'atrio destro. AVN si trova all'interno del triangolo di Koch, che è delimitato anteriormente dal foglietto settale della valvola tricuspide e posteriormente dal tendine di Todaro11. Forniamo anche un'accurata procedura di microdissezione di SAN e AVN nei topi che è confermata dall'istologia e dalla colorazione con immunofluorescenza.
I macrofagi residenti isolati potrebbero essere utilizzati per ulteriori esperimenti come il sequenziamento dell'RNA o potrebbero essere recuperati e coltivati per più di due settimane consentendo vari esperimenti in vitro. Pertanto, il nostro protocollo descrive una procedura di grande valore per l'immuno-ritmologo. La Tabella 1 mostra la composizione di tutte le soluzioni necessarie, la Figura 1 mostra i punti di riferimento della microdissezione per SAN e AVN. La Figura 2 illustra schematicamente la localizzazione di SAN e AVN. La Figura 3 mostra la colorazione istologica di SAN e AVN (colorazione tricromatica e immunofluorescenza di Masson). La Figura 4 mostra una strategia di gating passo-passo per isolare i macrofagi residenti cardiaci mediante selezione cellulare attivata dalla fluorescenza.
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Protocol
La cura degli animali e tutte le procedure sperimentali sono state condotte in conformità con le linee guida del comitato per la cura e l'etica degli animali dell'Università di Monaco e tutte le procedure intraprese sui topi sono state approvate dal governo della Baviera, Monaco, Germania. I topi C57BL6/J sono stati ottenuti commercialmente.
1. Preparativi
- Preparare il buffer di selezione delle celle (Tabella 1) e conservare a 4 °C.
NOTA: Durante l'intera procedura sperimentale, il buffer di selezione delle cellule deve essere sempre congelato. - Preparare il tampone di digestione (Tabella 1) poco prima della digestione poiché l'attività della collagenasi potrebbe essere rilevata solo per poche ore a temperatura ambiente.
- Fare riferimento al protocollo precedentemente pubblicato per la preparazione del piatto di dissezione10. In breve, aggiungere 30 ml di gel di agarosio (3% -4%) in una capsula di Petri di 100 mm di diametro e raffreddare a temperatura ambiente.
2. Sacrificio animale e asportazione del cuore
- Anestetizzare il topo con isoflurano mettendolo in una camera di incubazione collegata con un vaporizzatore di isoflurano e lavato con isoflurano al 5% / 95% di ossigeno.
- Dopo l'iniezione di fentanil per l'analgesia, aprire la gabbia toracica e perfondere il cuore iniettando 5-10 ml di 1x PBS ghiacciato direttamente nel ventricolo sinistro (LV). Estrarre il cuore di topo e metterlo sul piatto di dissezione. I dettagli sperimentali sono stati descritti in dettaglio in precedenza10.
3. Microdissezione di SAN e AVN
- Dopo aver isolato il cuore, eseguire le seguenti procedure di microdissezione nel piatto di dissezione con 1x PBS ghiacciato al microscopio da dissezione.
- Utilizzare i punti di riferimento anatomici cardiaci, cioè aorta, arteria polmonare, seno coronarico, ventricolo sinistro / destro, ecc. per determinare la sinistra/destra (sinistra: LV; destra: RV) e anteriore/posteriore (anteriore: aorta; posteriore: seno coronarico) del cuore. Dopo aver determinato l'orientamento, girare intorno al cuore con la parte anteriore di esso nella parte inferiore del piatto (per esporre le grandi vene che si trovano posteriormente).
- Microdissezione di SAN
NOTA: la microdissezione della SAN è stata precedentemente descritta10. Il processo è descritto in breve di seguito.- Esporre la regione inter-cavale fissando le appendici atriali destre (RAA) e il tessuto adiacente alla vena cava superiore (SVC) e alla vena cava inferiore (IVC) sul piatto di microdissezione usando perni di insetti.
- Tagliare il cuore lungo il setto interatriale parallelo alla crista terminalis (CT) per separare la regione inter-cavale e ottenere il campione SAN (Figura 1A, Figura 2A). Mettere il campione in una provetta di microcentrifuga vuota da 1,5 mL su ghiaccio.
- Microdissezione di AVN
- Dopo la raccolta del campione SAN, assicurarsi che il RAA e parti dell'atrio destro (RA) siano già stati tagliati lasciando solo il setto interatriale (IAS) e il setto interventricolare (IVS).
- Appuntare le parti rimanenti del cuore attraverso il tessuto adiacente alla IAS e all'IVS usando perni di insetto per rendere il lato atriale destro della IAS rivolto verso l'alto.
- Guarda l'atrio destro sulla superficie endocardica per il triangolo di Koch. Sarà delimitato anteriormente dalla linea cerniera del foglietto settale della valvola tricuspide (TV) e posteriormente dal tendine di Todaro. L'orifizio del seno coronarico è osservato alla base. (Figura 1B, Figura 2B).
- Tagliare il triangolo di Koch, che contiene l'AVN, e metterlo direttamente in una provetta di microcentrifuga vuota da 1,5 ml sul ghiaccio.
4. Digestione
- Preparare il tampone di digestione (Tabella 1) poco prima dell'uso.
- Tritare bene il tessuto SAN e AVN con bisturi.
NOTA: Tritare bene il tessuto aumenterà l'efficienza della digestione e aiuterà a ottenere una buona sospensione cellulare per la selezione. Poiché i campioni SAN e AVN sono piuttosto piccoli, si consiglia di tritare il tessuto direttamente all'interno della provetta da microcentrifuga da 1,5 mL per ridurre la perdita di campione. - Aggiungere 500 μL di tampone digestivo per campione e lavare tutto il tessuto tritato dalla parete della provetta da 1,5 mL di microcentrifuga. Il pipettaggio delicato aiuta a digerire il campione.
- Omogeneizzare il tubo su una macchina a vortice (impostazioni: 37 °C, 750 rpm per 1 h).
- Dopo la digestione, trasferire la sospensione tissutale in una provetta da centrifuga fresca da 15 ml passando attraverso un filtro cellulare da 40 μm. Risciacquare il filtro cellulare con altri 5 ml di tampone di selezione cellulare per interrompere la digestione.
- Centrifugare il tubo da 15 mL a 350 x g per 7 minuti a 4 °C. Quindi rimuovere completamente il surnatante usando la pipetta. Risospendere il pellet cellulare con tampone di selezione cellulare da 90 μL.
NOTA: Prima della separazione magnetica, pipettare delicatamente la sospensione cellulare alcune volte o passare attraverso un filtro cellulare da 30 μm per rimuovere i grumi cellulari, se necessario, per ottenere una sospensione a cella singola per prestazioni ottimali di arricchimento magnetico di popolazioni cellulari interessanti.
5. Arricchimento magnetico di CD45 e colorazione del campione
NOTA: Per isolare i macrofagi cardiaci con elevata efficienza di selezione, l'esclusione di cellule indesiderate inclusi i linfociti è stata eseguita con microsfere CD45 secondo il protocollo del produttore. Sulla base del pannello di selezione, i macrofagi residenti cardiaci sono stati identificati come CD45 alto CD11b alto CD64 alto Ly6Cbasso / int F4/ 80 alto.
- Aggiungere 10 μL di microsfere CD45 per 107 cellule totali alla sospensione cellulare nella provetta da centrifuga da 15 ml. Mescolare bene i campioni e incubarli per 15 minuti a 4 °C.
NOTA: Il conteggio delle cellule utilizzando un emocitometro deve essere eseguito brevemente per assicurarsi che ogni tubo contenga non più di 107 cellule totali. Quando si lavora con numeri di celle più elevati, il volume delle sfere magnetiche deve essere aumentato. - Preparare la miscela anticorpale diluendo i seguenti anticorpi nel tampone di selezione cellulare (diluizione 1:100 per ciascun anticorpo): CD45-PE, CD11b-APC-Cy7, CD64-APC, F4/80-PE-Cy7, Ly6C-FITC. DAPI verrà aggiunto in seguito alla colorazione per discriminazione vivi/morti.
- Dopo 15 minuti di incubazione magnetica a sfere, aggiungere 100 μL di miscela di anticorpi direttamente nella sospensione cellulare nel tubo da 15 mL (quindi la concentrazione finale di tutti gli anticorpi è 1:200) e incubare per 20 minuti a 4 °C.
- Dopo 20 minuti di incubazione degli anticorpi, lavare la sospensione cellulare aggiungendo 1-2 ml di tampone di selezione cellulare per 107 cellule e centrifugare a 350 x g per 10 minuti. Rimuovere completamente il surnatante mediante pipettaggio.
- Risospendere fino a 108 celle in 500 μL di buffer di selezione cellulare.
NOTA: il numero massimo di celle per la separazione magnetica deve essere determinato in base al protocollo del produttore. - Preparare il set di separazione magnetica.
- Fissare la colonna magnetica a un separatore magnetico adatto e posizionare un tubo di raccolta sotto la colonna magnetica.
- Preparare le colonne magnetiche risciacquando con tampone di selezione cellulare: aggiungere 500 μL di tampone di selezione cellulare nella parte superiore della colonna e lasciare passare il tampone.
- Applicare immediatamente la sospensione delle celle sulla colonna mentre il buffer di ordinamento delle celle è in transito.
NOTA: Evitare la formazione di bolle d'aria nella colonna. Secondo il protocollo del produttore, sebbene il tempo di riempimento della colonna possa cambiare dalle condizioni di conservazione, non ha alcuna influenza sulla qualità della separazione. - Lavare la colonna con 3 tampone di selezione delle celle da 500 μL. Il flow-through nel passaggio 5.7 e nel passaggio 5.8 contiene celle non etichettate, che possono essere scartate se non sono necessari ulteriori esperimenti.
NOTA: aggiungere immediatamente il buffer di ordinamento delle celle quando il serbatoio della colonna è quasi vuoto. - Rimuovere la colonna dal separatore magnetico e posizionarla su un nuovo tubo di raccolta.
- Aggiungere 1 mL di buffer di ordinamento delle celle nella colonna. Lavare immediatamente la colonna applicando saldamente lo stantuffo fornito con la colonna. Il flow-through contiene le celle marcate magneticamente.
- Aggiungere la soluzione DAPI in tutte le sospensioni cellulari raccolte con etichetta magnetica poco prima di eseguirle sul selezionatore cellulare. Regolare la concentrazione finale di DAPI a 0,3-0,5 μg/ml.
- Eseguire analisi FACS.
6. Campioni di risarcimento
- Preparare 6 provette da microcentrifuga marrone da 1,5 mL etichettate rispettivamente come "PE", "APC-Cy7", "APC", "PE-Cy7", "FITC" e "DAPI" per proteggere gli anticorpi dalla luce. Preparare un altro tubo di microcentrifuga da 1,5 ml etichettato come "non macchiato".
NOTA: Questo potrebbe essere fatto contemporaneamente all'incubazione della sospensione cellulare con le microsfere e gli anticorpi. Il campione non colorato potrebbe essere il tessuto cardiomiocitario raccolto casualmente dal tessuto cardiaco risparmiato e trattato anche secondo la fase 4. - Diluire ogni singolo anticorpo coniugato a fluorescenza con tampone di selezione cellulare in 1:50 nelle provette di microcentrifuga marrone da 1,5 mL contrassegnate di conseguenza.
- Aggiungere una goccia di soluzione di perline di compensazione e incubare per 20 minuti a 4 °C.
- Aggiungere 2 ml di tampone di selezione cellulare in ogni provetta da microcentrifuga marrone da 1,5 ml e centrifugare a 450 x g per 5 minuti. Scartare completamente il surnatante e risospendere il pellet contenente il cordone con tampone di selezione cellulare da 300 μL e trasferirli in provette selezionatrici anch'esse contrassegnate di conseguenza.
7. Esecuzione sul selezionatore di celle e strategia di gating
- Applicare prima il campione non colorato e i tubi di compensazione e regolare le tensioni di ciascun canale per allineare sia il picco positivo che quello negativo alla posizione corretta dell'asse. Salvare le impostazioni di compensazione e applicarle ai seguenti esempi.
- Applicare i campioni sullo smistatore di cellule. Impostare la strategia di gating come descritto nella Figura 4. I macrofagi residenti cardiaci sono identificati come CD45 alto CD11b alto CD64 alto Ly6Cbasso / int F4/ 80alto. DAPI è usato come marcatore di vitalità cellulare.
- Controllare i grafici di citometria a flusso per confermare che la popolazione cellulare di interesse sia correttamente mostrata sui grafici. In caso contrario, regolare la tensione di ciascun canale in base alla vista centrale di ciascun grafico.
- Se le impostazioni di tensione sono soddisfacenti, avviare la procedura di ordinamento. Raccogliere la popolazione cellulare ordinata in terreno di coltura composto da DMEM contenente il 10% di siero fetale bovino, integrato con 100 μg / mL di streptomicina e 100 U / mL di penicillina.
8. Cultura dei macrofagi residenti
- Dopo aver raccolto i macrofagi ordinati, trasferire immediatamente le cellule in piastre di coltura tissutale da 35 mm o in una piastra a 24 pozzetti o utilizzarle direttamente per esperimenti successivi.
- Per coltivare macrofagi selezionati, incubare le cellule a 37 °C, incubatore al 5% di CO2 .
- Cambiare il terreno di coltura ogni 48-72 ore. Le cellule morte galleggianti possono essere facilmente rimosse con un cambiamento medio. Utilizzare macrofagi vivi attaccati al fondo del piatto di coltura per esperimenti successivi.
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Representative Results
Descriviamo una procedura pratica per l'isolamento di macrofagi residenti cardiaci specificamente dalla regione SAN e AVN. Per confermare una corretta dissezione, viene eseguita la colorazione Trichrome di Masson e la colorazione immunofluorescente HCN4 (Figura 3)12. Con questo protocollo, potremmo raccogliere circa 60.000 macrofagi da un cuore intero. La Figura 4 mostra la strategia di gating per l'ordinamento dei macrofagi cardiaci. I macrofagi cardiaci vivi residenti sono stati identificati come CD45+CD11b+F4/80+CD64+Ly6C-. La Figura 5 mostra i macrofagi cardiaci appena ordinati che sono stati identificati dai loro antigeni di superficie CD45, F4/80 e CD11b. Le cellule appena selezionate sono state osservate al microscopio in campo chiaro (Figura 5A). Le cellule selezionate erano positive per CD45 (CD45+) quando osservate sotto il canale fluoroforo-PE (Figura 5B). La stessa visione delle cellule ordinate quando osservata sotto il canale fluoroforo-APC-Cy7 ha mostrato il fenotipo CD11b + (Figura 5C). La stessa visione delle cellule ordinate quando osservata sotto il canale fluoroforo-PE-Cy7 ha mostrato il fenotipo F4/80+ (Figura 5D). La figura 5E è l'immagine unita ottenuta con il microscopio fluorescente per le cellule selezionate. Queste cellule triple positive sono state identificate come macrofagi residenti cardiaci. La figura 6 mostra macrofagi cardiaci isolati coltivati in mezzo fino a 6 giorni. Le frecce bianche indicano i macrofagi, le frecce nere indicano cellule morte fluttuanti di forma rotonda.
Figura 1: Anatomia della SAN e dell'AVN al microscopio a dissezione. (A) Anatomia della SAN al microscopio a dissezione. La posizione della SAN è indicata da una linea tratteggiata rossa all'interno della regione inter-cavale (linee tratteggiate nere). (B) Anatomia dell'AVN al microscopio a dissezione. Questa cifra è stata modificata rispetto all'articolo10 pubblicato in precedenza. L'AVN (cerchio tratteggiato rosso) si trova all'apice del triangolo di Koch (triangolo tratteggiato bianco) vicino alla parte inferiore del setto membranoso. Il triangolo di Koch è formato dal tendine di Todaro (TT, linea tratteggiata verde), dalla valvola tricuspide (TV, linea tratteggiata blu) e dall'orifizio del seno coronarico (CS, linea tratteggiata gialla). SVC, vena cava superiore; IVC, vena cava inferiore; IAS, setto interatriale; RA, atrio destro; RAA, appendice atriale destra; RV, ventricolo destro; CT, Crista terminalis; IVS, setto interventricolare; DI, fossa ovale. PA, arteria polmonare; RV, ventricolo destro; LV, ventricolo sinistro. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 2: Illustrazione schematica della localizzazione SAN e AVN. (A) Illustrazione schematica della localizzazione SAN. SAN è indicato da un cerchio tratteggiato rosso all'interno della regione inter-cavale oltre alla CT (linea tratteggiata nera). (B) illustrazione schematica della localizzazione AVN. AVN è indicato da un cerchio tratteggiato rosso all'interno del triangolo di Koch (triangolo tratteggiato grigio) composto da TV e dall'orifizio di CS. SVC, vena cava superiore; IVC, vena cava inferiore; IAS, setto interatriale; RA, atrio destro; RAA, appendice atriale destra; CT, Crista terminalis; IVS, setto interventricolare; DI, fossa ovale; IVS, setto interventricolare. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 3: Identificazione della SAN e dell'AVN con colorazione istologica. Identificazione dei SAN (A,B) e AVN (C,D). Colorazione immunofluorescente di cellule del sistema di conduzione positiva HCN4 in SAN (A) e AVN (C) e colorazione tricromatica di Masson di SAN (B) e AVN (D). Le frecce rosse indicano l'arteria del nodo del seno (SNA, B), la freccia nera e la linea tratteggiata nera indicano AVN compatto, la freccia blu indica il corpo fibroso centrale (CFB). CT, crista terminalis; CFB, corpo fibroso centrale; CN, AVN compatto; RA, atrio destro; RV, ventricolo destro; IAS, setto interatriale; IVS, setto interventricolare; TV, valvola tricuspide; MT, valvola mitrale. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 4: Strategia di gating per lo smistamento cellulare dei macrofagi cardiaci residenti. Le cellule mononucleate sono identificate, i doppietti sono esclusi da FSC-W vs. FSC-A e le cellule morte sono escluse da DAPI (A-D). Le cellule vive sono dipendenti sui leucociti CD45+ (E) e quindi sulle cellule mieloidi CD11b + (F). I macrofagi cardiaci sono stati identificati dall'espressione sia di F4/80 che di CD64 (G), e poi infine stratificati dall'espressione di Ly6C (H). I macrofagi cardiaci vivi residenti sono identificati come CD45+CD11b+F4/80+CD64+Ly6C-. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 5: Macrofagi cardiaci appena selezionati e colorazione immunofluorescente. (A) Macrofagi cardiaci appena ordinati. Colorazione immunofluorescente di specifici antigeni di superficie come CD45 (B), CD11b (C) o F4/80 (D). Secondo la strategia di gating, i macrofagi cardiaci sono identificati come cellule triple positive (E). La barra della scala rappresenta 50 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 6: Coltura di macrofagi ordinati. Coltura di macrofagi ordinati in terreno di coltura rispettivamente per 48 ore (A, B), 96 ore (C, D) e 6 giorni (E, F). Vengono mostrati due singoli piatti di cultura per punto temporale (piatto 1: A, C, E; piatto 2: B, D, F). Le frecce bianche indicano macrofagi vivi con forma a fuso e sporgenze tipiche3. Le frecce nere indicano celle morte fluttuanti di forma rotonda. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
| Composto | Concentrazione finale | g o ml richiesto |
| Buffer FACS | ||
| BSA | 0.50% | |
| EDTA | 2 mM | |
| PBS (1X) | 500ml | |
| Tampone di digestione | ||
| Collagenasi I | 450 U/mL | |
| Collagenasi XI | 125 U/mL | |
| DNasi I | 60 U/mL | |
| Ialuronidasi | 60 U/mL | |
| Tampone HEPES | 20 μl per 1 ml | |
| PBS (1X) | Aggiungere fino a 1 ml per 2 campioni | |
| Terreno di coltura | ||
| DMEM · | 79 ml | |
| Penicillina/streptomicina | 1% | 1 ml |
| FBS | 20% | 20 ml |
| TAE (50x) | ||
| Tris-base | 24.20% | 24,2 g |
| 100 % acido acetico | 5.71% | 5,71 ml |
| 0,5 M EDTA | 0,05 m | 10 ml |
| dH2O | Aggiungi fino a 100ml | |
Tabella 1: Composizione delle soluzioni necessarie.
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Discussion
In questo manoscritto, descriviamo un protocollo per l'arricchimento di macrofagi residenti cardiaci specificamente dalle regioni SAN e AVN ad alta purezza.
I macrofagi sono divisi in sottopopolazioni in base alla loro posizione anatomica e al fenotipo funzionale. Possono anche passare da un fenotipo funzionale all'altro in risposta a segnali microambientali variabili13. Rispetto ad altri organi come il midollo osseo e il fegato, il tessuto cardiaco contiene una percentuale inferiore di cellule immunitarie e numeri assoluti più bassi di ciascuna sottopopolazione cellulare14. Pertanto, i metodi di selezione, arricchimento e purificazione delle cellule sono strumenti necessari per ottenere quantità sufficienti della popolazione cellulare di interesse. La selezione cellulare attivata dalla fluorescenza e il MACS consentono di ottenere popolazioni cellulari pure e ordinate in quanto consentono la misurazione simultanea di varie proprietà delle cellule.
Sono stati descritti diversi pannelli di citometria a flusso per l'identificazione di sottopopolazioni di macrofagi cardiaci 3,6,15. La funzione dei macrofagi allo stato stazionario e nella malattia non dipende solo dalla loro origine evolutiva, ma anche dall'ambiente tissutale. In generale, il cuore adulto contiene due sottogruppi principali di macrofagi residenti a basso livello di Ly6C / CCR2- che esprimono diversi livelli di MHC-II e che possono mantenersi attraverso la proliferazione locale allo stato stazionario mentre durante la malattiai monociti alti classici di Ly6Cvengono reclutati nei siti di infiammazione, dove si differenziano in macrofagi16 . Durante lo sviluppo, diverse sottopopolazioni di macrofagi occupano diverse posizioni cardiache associate a funzioni distinte17. Abbiamo mirato a studiare i macrofagi residenti specificamente dal sistema di conduzione cardiaca, in particolare i macrofagi residenti dalle regioni SAN e AVN. Secondo Hulsmans et al. i macrofagi residenti cardiaci sono identificati come CD45 alto CD11b alto CD64alto F4/80alto Ly6Cbasso/ int.
La raccolta di macrofagi residenti cardiaci da un topo adulto per lo smistamento cellulare richiede circa 3 ore. È importante organizzare logicamente le procedure sperimentali e consentire l'incubazione in parallelo per risparmiare tempo e ridurre al minimo la manipolazione dei macrofagi potenzialmente fragili nella sospensione. Poiché la procedura di selezione potrebbe esercitare pressione sulle celle selezionate, abbiamo raccomandato di ridurre il tempo di selezione utilizzando sfere magnetiche che potrebbero aumentare enormemente l'efficienza di selezione e consentire anche di ottenere una maggiore purezza dei macrofagi residenti.
L'applicazione di questo protocollo include ma non è limitata alla purificazione dei macrofagi e / o di qualsiasi altro tipo di cellule non cardiomiocitarie dal tessuto cardiaco e da qualsiasi altro ceppo di topi. I macrofagi selezionati potrebbero essere utilizzati per esperimenti successivi, ad esempio saggi di motilità cellulare, studi di espressione genica o proteica, ecc. Il sequenziamento dell'RNA a singola cellula è anche possibile raccogliendo le cellule una per una direttamente dal tubo di raccolta del selezionatore cellulare.
Tuttavia, la selezione cellulare basata sulla citometria a flusso ha i suoi limiti. Un pannello anticorpale progettato con precisione è importante e deve considerare l'espressione degli antigeni sulla popolazione cellulare di interesse e il fluoroforo coniugato agli anticorpi. La funzione e la vitalità delle cellule potrebbero essere alterate dagli anticorpi leganti, che potrebbero influenzare i risultati degli esperimenti successivi. Inoltre, i complessi strumenti di selezione delle celle sono costosi, sofisticati e anche soggetti a problemi con i blocchi del sistema fluidico e la calibrazione laser. Quindi sono necessari la manutenzione da parte di specialisti altamente qualificati e il corretto funzionamento da parte di un tecnico professionista esperto. Anche se la selezione delle cellule potrebbe fornire una popolazione cellulare pura di interesse, l'efficienza complessiva è ancora relativamente bassa.
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Disclosures
Non è stato segnalato alcun potenziale conflitto di interessi rilevante per questo articolo.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto dal China Scholarship Council (CSC, a R. Xia), dal Centro tedesco per la ricerca cardiovascolare (DZHK; 81X2600255 a S. Clauss, 81Z0600206 a S. Kääb, 81Z0600204 a C.S.), la Fondazione Corona (S199/10079/2019 a S. Clauss), l'SFB 914 (progetto Z01 a S. Massberg), l'ERA-NET sulle malattie cardiovascolari (ERA-CVD; 01KL1910 a S. Clauss) e la Heinrich-and-Lotte-Mühlfenzl Stiftung (a S. Clauss). I finanziatori non hanno avuto alcun ruolo nella preparazione dei manoscritti.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anesthesia | |||
| Isoflurane vaporizer system | Hugo Sachs Elektronik | 34-0458, 34-1030, 73-4911, 34-0415, 73-4910 | Includes an induction chamber, a gas evacuation unit and charcoal filters |
| Modified Bain circuit | Hugo Sachs Elektronik | 73-4860 | Includes an anesthesia mask for mice |
| Surgical Platform | Kent scientific | SURGI-M | |
| In vivo instrumentation | |||
| Fine forceps | Fine Science Tools | 11295-51 | |
| Iris scissors | Fine Science Tools | 14084-08 | |
| Spring scissors | Fine Science Tools | 91500-09 | |
| Tissue forceps | Fine Science Tools | 11051-10 | |
| Tissue pins | Fine Science Tools | 26007-01 | Could use 27G needles as a substitute |
| General lab instruments | |||
| Orbital shaker | Sunlab | D-8040 | |
| Pipette,volume 10ul, 100ul, 1000ul | Eppendorf | Z683884-1EA | |
| Magnetic stirrer | IKA | RH basic | |
| Microscopes | |||
| Dissection stereo- zoom microscope | vwr | 10836-004 | |
| Leica microscope | Leica microsystems | Leica DM6 | |
| Flow cytometry machine | |||
| Beckman Coulter | Beckman coulter | MoFlo Astrios | |
| Software | |||
| FlowJo v10 | FlowJo | ||
| General Lab Material | |||
| 0.2 µm syringe filter | sartorius | 17597 | |
| 100 mm petri dish | Falcon | 351029 | |
| 27G needle | BD Microlance 3 | 300635 | |
| 50 ml Polypropylene conical Tube | FALCON | 352070 | |
| Cover slips | Thermo scientific | 7632160 | |
| Eppendorf Tubes | Eppendorf | 30121872 | |
| 5ml Syringe | Braun | 4606108V | |
| Chemicals | |||
| 0.5 M EDTA | Sigma | 20-158 | |
| Acetic acid | Merck | 100063 | Component of TEA |
| Agarose | Biozym | 850070 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A2153-100G | |
| Collagenase I | Worthington Biochemical | LS004196 | |
| Collagenase XI | Sigma | C7657 | |
| DNase I | Sigma | D4527 | |
| Hyaluronidase | Sigma | H3506 | |
| HEPES buffer | Sigma | H4034 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A2153-100G | |
| DPBS (1X) Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Gibco | 14190-094 | |
| Fetal bovine serum | Sigma | F2442-500ml | |
| Penicillin − Streptomycin | Sigma | P4083 | |
| DMEM | Gibco | 41966029 | |
| Drugs | |||
| Fentanyl 0.5 mg/10 ml | Braun Melsungen | ||
| Isoflurane 1 ml/ml | Cp-pharma | 31303 | |
| Oxygen 5L | Linde | 2020175 | Includes a pressure regulator |
| Antibodies | |||
| Anti-mouse Ly6C FITC (clone HK1.4) | BioLegend | Cat# 128006 | diluted to 1:100 |
| Anti-mouse F4/80 PE/Cy7(clone BM8) | BioLegend | Cat# 123114 | diluted to 1:100 |
| Anti-mouse CD64 APC (clone X54-5/7.1) | BioLegend | Cat# 139306 | diluted to 1:100 |
| Anti-mouse CD11b APC/Cy7(clone M1/70) | BioLegend | Cat# 101226 | diluted to 1:100 |
| Anti-mouse CD45 PE (clone 30-F11) | BioLegend | Cat# 103106 | diluted to 1:100 |
| Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate (DAPI) | Invitrogen | H3570 | diluted to 1:1000 |
| Animals | |||
| Mouse, C57BL/6 | Charles River Laboratories |
References
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- Clauss, S., et al. Animal models of arrhythmia: classic electrophysiology to genetically modified large animals. Nature Review Cardiology. 16 (8), 457-475 (2019).
- Hulsmans, M., et al. Macrophages Facilitate Electrical Conduction in the Heart. Cell. 169 (3), 510-522 (2017).
- Rosas, M., et al. The transcription factor Gata6 links tissue macrophage phenotype and proliferative renewal. Science. 344 (6184), 645-648 (2014).
- Schulz, C., et al. A lineage of myeloid cells independent of Myb and hematopoietic stem cells. Science. 336 (6077), 86-90 (2012).
- Epelman, S., et al. Embryonic and adult-derived resident cardiac macrophages are maintained through distinct mechanisms at steady state and during inflammation. Immunity. 40 (1), 91-104 (2014).
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- Bajpai, G., et al. The human heart contains distinct macrophage subsets with divergent origins and functions. Nature Medicine. 24 (8), 1234-1245 (2018).
- Davies, L. C., Jenkins, S. J., Allen, J. E., Taylor, P. R.
- Xia, R., et al. Whole-mount immunofluorescence staining, confocal imaging and 3D reconstruction of the sinoatrial and atrioventricular node in the mouse. Journal of Visualized Experiments. (166), e62058 (2020).
- van Weerd, J. H., Christoffels, V. M. The formation and function of the cardiac conduction system. Development. 143 (2), 197-210 (2016).
- Ye Sheng, X., et al. Isolation and characterization of atrioventricular nodal cells from neonate rabbit heart. Circulation: Arrhythmia and Electrophysiology. 4 (6), 936-946 (2011).
- Murray, P. J., Wynn, T. A. Protective and pathogenic functions of macrophage subsets. Nature Reviews Immunology. 11 (11), 723-737 (2011).
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- Bajpai, G., et al. Tissue resident CCR2- and CCR2+ cardiac macrophages differentially orchestrate monocyte recruitment and fate specification following myocardial injury. Circulation Research. 124 (2), 263-278 (2019).
- Honold, L., Nahrendorf, M. Resident and monocyte-derived macrophages in cardiovascular disease. Circulation Research. 122 (1), 113-127 (2018).
- Leid, J., et al. Primitive embryonic macrophages are required for coronary development and maturation. Circulation Research. 118 (10), 1498-1511 (2016).
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Medicina Numero 171 sistema di conduzione cardiaca nodo senoatriale nodo atrioventricolare macrofagi cardiaci residenti citometria a flusso selezione di cellule attivate magnetiche MACS selezione cellulare attivata da fluorescenza microdissezione coltura cellulare primariaErratum
Formal Correction: Erratum: Isolation and Culture of Resident Cardiac Macrophages from the Murine Sinoatrial and Atrioventricular Node
Posted by JoVE Editors on 02/02/2023.
Citeable Link.
An erratum was issued for: Isolation and Culture of Resident Cardiac Macrophages from the Murine Sinoatrial and Atrioventricular Node. The Authors section was updated from:
Ruibing Xia123
Simone Loy1
Stefan Kääb13
Anna Titova1
Christian Schulz123
Steffen Massberg123
Sebastian Clauss123
1University Hospital Munich, Department of Medicine I Ludwig-Maximilian-Unversity Munich (LMU)
2Walter Brendel Center of Experimental Medicine (WBex) LMU Munich
3German Center for Cardiovascular Research (DZHK), Partner Site Munich, Munich Heart Alliance (MHA)
to:
Ruibing Xia123
Simone Loy1
Stefan Kääb13
Anna Titova1
Christian Schulz123
Steffen Massberg123
Sebastian Clauss123
1University Hospital Munich, Department of Medicine I Ludwig-Maximilian-University Munich (LMU)
2Insitute of Surgical Research at the Walter Brendel Center of Experimental Medicine, University Hospital Munich, Ludwig-Maximilians-University (LMU)
3German Center for Cardiovascular Research (DZHK), Partner Site Munich, Munich Heart Alliance (MHA)
