Cryo-EM och enpartikelanalys med scipion

Summary

Enpartikelanalys i kryoelektronmikroskopi är en av de viktigaste teknikerna som används för att bestämma strukturen hos biologiska ensembler med hög upplösning. Scipion ger verktygen för att skapa hela rörledningen för att bearbeta den information som erhållits av mikroskopet och uppnå en 3D-rekonstruktion av det biologiska provet.

Abstract

Kryoelektronmikroskopi har blivit ett av de viktigaste verktygen inom biologisk forskning för att avslöja den strukturella informationen om makromolekyler vid nära atomisk upplösning. I en partikelanalys avbildas det för vitrifierade provet av en elektronstråle och detektorerna i slutet av mikroskopkolonnen producerar filmer av det provet. Dessa filmer innehåller tusentals bilder av identiska partiklar i slumpmässiga orienteringar. Data måste gå igenom ett arbetsflöde för bild bearbetning med flera steg för att få den slutliga 3D-rekonstruerade volymen. Målet med bildbehandlingsarbetsflödet är att identifiera förvärvsparametrarna för att kunna rekonstruera det prov som studeras. Scipion tillhandahåller alla verktyg för att skapa det här arbetsflödet med flera bildbehandlingspaket i ett integrerande ramverk, vilket också möjliggör spårbarhet av resultaten. I den här artikeln presenteras hela bildbehandlingsarbetsflödet i Scipion och diskuteras med data som kommer från ett riktigt testfall, vilket ger alla detaljer som behövs för att gå från filmerna som erhålls av mikroskopet till en högupplöst slutlig 3D-rekonstruktion. Dessutom diskuteras kraften i att använda konsensusverktyg som gör det möjligt att kombinera metoder och bekräfta resultat längs varje steg i arbetsflödet, förbättra noggrannheten i de erhållna resultaten.

Introduction

I kryoelektronmikroskopi (cryo-EM) är enstaka partikelanalys (SPA) av vitrifierade frysta hydratiserade exemplar en av de mest använda och framgångsrika varianterna av avbildning för biologiska makromolekyler, eftersom det gör det möjligt att förstå molekylära interaktioner och funktionen hos biologiska ^ensembler1. Detta är tack vare de senaste framstegen inom denna bildteknik som gav upphov till "upplösningsrevolutionen"² och har möjliggjort framgångsrik bestämning av biologiska 3D-strukturer med nära atomupplösning. För närvarande var den högsta upplösningen i SPA cryo-EM 1,15 Å för apoferritin3 (EMDB-post: 11668). Dessa tekniska framsteg omfattar förbättringar i provberedningen4, bildförvärvet5 och bildbehandlingsmetoderna6. Den här artikeln fokuserar på den sista punkten.

Kortfattat är målet med bildbehandlingsmetoderna att identifiera alla förvärvsparametrar för att invertera mikroskopets avbildningsprocess och återställa 3D-strukturen hos det biologiska exemplaret som studeras. Dessa parametrar är kamerans vinst, den strålinducerade rörelsen, mikroskopets avvikelser (främst defokuseringen), 3D-vinkelorienteringen och översättningen av varje partikel och konformationstillståndet vid ett prov med konformationella förändringar. Antalet parametrar är dock mycket högt och cryo-EM kräver att man använder lågdosbilder för att undvika strålningsskador, vilket avsevärt minskar signal-till-brusförhållandet (SNR) för de förvärvade bilderna. Problemet kan således inte lösas entydigt och alla parametrar som endast ska beräknas kan uppskattas. Längs arbetsflödet för bild bearbetning bör rätt parametrar identifieras och ignorera de återstående för att slutligen få en högupplöst 3D-rekonstruktion.

De data som genereras av mikroskopet samlas in i ramar. Förenkla, en ram innehåller antalet elektroner som har kommit till en viss position (pixel) i bilden, när elektronräkningsdetektorer används. I ett visst synfält samlas flera bildrutor in och detta kallas en film. Eftersom låga elektrondoser används för att undvika strålningsskador som kan förstöra provet är SNR mycket låg och ramarna som motsvarar samma film måste vara genomsnittliga för att få en bild som avslöjar strukturell information om provet. Men inte bara ett enkelt medelvärde tillämpas, provet kan drabbas av skift och andra typer av rörelser under avbildningstiden på grund av den strålinducerade rörelsen som behöver kompenseras. De skiftkompenserade och genomsnittliga bildrutorna har en mikrograf.

När mikrograferna har erhållits måste vi uppskatta de avvikelser som mikroskopet introducerar för var och en av dem, kallad Kontrastöverföringsfunktion (CTF), som representerar förändringarna i kontrasten av mikrografen som en funktion av frekvens. Sedan kan partiklarna väljas och extraheras, vilket kallas partikelplockning. Varje partikel bör vara en liten bild som endast innehåller en kopia av det prov som studeras. Det finns tre familjer av algoritmer för partikelplockning: 1) de som bara använder någon grundläggande parameterisering av partikelns utseende för att hitta dem i hela uppsättningen mikrografer (t.ex. partikelstorlek), 2) de som lär sig hur partiklarna ser ut från användaren eller en förtränad uppsättning, och 3) de som använder bildmallar. Varje familj har olika egenskaper som kommer att visas senare.

Den extraherade uppsättningen partiklar som finns i mikrograferna kommer att användas i en 2D-klassificeringsprocess som har två mål: 1) rengöring av uppsättningen partiklar genom att kassera delmängden som innehåller rena brusbilder, överlappande partiklar eller andra artefakter, och 2) de genomsnittliga partiklarna som representerar varje klass kan användas som initial information för att beräkna en 3D-initial volym.

Den inledande 3D-volymberäkningen är nästa avgörande steg. Problemet med att få 3D-strukturen kan ses som ett optimeringsproblem i ett flerdimensionellt lösningslandskap, där det globala minimumet är den bästa 3D-volymen som representerar den ursprungliga strukturen, men flera lokala minima som representerar suboptimala lösningar kan hittas och där det är mycket lätt att fastna. Den ursprungliga volymen representerar utgångspunkten för sökprocessen, så dålig initial volymuppskattning kan hindra oss från att hitta det globala minimivärdet. Från den ursprungliga volymen hjälper ett 3D-klassificeringssteg till att upptäcka olika konformationstillstånd och rengöra igen uppsättningen partiklar; målet är att få en strukturellt homogen population av partiklar. Därefter kommer ett 3D-förfiningssteg att ansvara för att förfina vinkel- och översättningsparametrarna för varje partikel för att få bästa möjliga 3D-volym.

Slutligen, i de sista stegen, kan den erhållna 3D-rekonstruktionen slipas och poleras. Slipning är en process för att öka de höga frekvenserna av den rekonstruerade volymen, och poleringen är ett steg för att ytterligare förfina vissa parametrar, som CTF eller strålinducerad rörelsekompensation, på partikelnivå. Vissa valideringsprocedurer kan också användas för att bättre förstå den uppnådda lösningen i slutet av arbetsflödet.

Efter alla dessa steg kommer spårnings- och ^{dockningsprocesserna7} att bidra till att ge en biologisk mening till den erhållna 3D-rekonstruktionen, genom att bygga atommodeller de novo eller montera befintliga modeller. Om hög upplösning uppnås kommer dessa processer att berätta för oss positionerna för de biologiska strukturerna, även för de olika atomerna, i vår struktur.

^Scipion8 gör det möjligt att skapa hela arbetsflödet som kombinerar de mest relevanta bildbehandlingspaketen på ett integrerande sätt. ^Xmipp9, ^Relion10, CryoSPARC11, ^Eman12, ^Spider13, ^Cryolo14, ^Ctffind15, ^CCP416, ^Phenix17 och många fler paket kan inkluderas i Scipion. Dessutom innehåller det alla nödvändiga verktyg för att gynna integrationen, interoperabiliteten, spårbarheten och reproducerbarheten för att göra en fullständig spårning av hela bildbehandlingsarbetsflödet8.

Ett av de mest kraftfulla verktygen som Scipion tillåter oss att använda är konsensus, vilket innebär att jämföra resultaten som erhållits med flera metoder i ett steg av bearbetningen, vilket gör en kombination av den information som förmedlas av olika metoder för att generera en mer exakt utgång. Detta kan bidra till att öka prestandan och förbättra den uppnådda kvaliteten i de uppskattade parametrarna. Observera att ett enklare arbetsflöde kan byggas utan att använda konsensusmetoder. Vi har dock sett kraften i detta ^verktyg22,25 och arbetsflödet som presenteras i detta manuskript kommer att använda det i flera steg.

Alla steg som har sammanfattats i föregående stycken kommer att förklaras i detalj i följande avsnitt och kombineras i ett komplett arbetsflöde med hjälp av Scipion. Dessutom kommer hur man använder konsensusverktygen för att uppnå en högre överenskommelse om de genererade utgångarna att visas. I detta syfte har exempeldatauppsättningen för Plasmodium falciparum 80S Ribosome valts (EMPIAR-post: 10028, EMDB-post: 2660). Datasetet består av 600 filmer med 16 bildrutor i storlek 4096x4096 pixlar med en pixelstorlek på 1,34Å tagna vid en FEI POLARA 300 med en FEI FALCON II-kamera, med en rapporterad upplösning på EMDB är ^3,2Å18 .

Protocol

1. Skapa ett projekt i Scipion och importera data

1. Öppna Scipion och klicka på Skapa projekt, ange namnet på projektet och var det ska sparas (Kompletterande bild 1). Scipion öppnar projektfönstret som visar en arbetsyta med, till vänster, en panel med en lista över tillgängliga metoder, var och en av dem representerar ett bildbehandlingsverktyg som kan användas för att hantera data.
   OBS: Ctrl+F kan användas för att hitta en metod om den inte visas i listan.
2. Om du vill importera filmer som tas av mikroskopet väljer du pwem - importera filmer på vänster panel (eller skriv det när du trycker på Ctrl+F).
3. Ett nytt fönster kommer att öppnas (kompletterande figur 2). Där inkluderar du sökvägen till data och anskaffningsparametrarna. I det här exemplet använder du följande inställningar: Mikroskopspänning 300 kV, Sfärisk avvikelse 2,0 mm, amplitudkontrast 0,1, Förstoringshastighet 50000, samplingsfrekvensläge till Från bild och Pixelstorlek 1,34 Å. När alla parametrar i formuläret är ifyllda klickar du på knappen Kör .
   OBS: När en metod startar visas en ruta på arbetsytan i gul färg märkt som körd. När en metod är klar ändras rutan till grön och etiketten ändras till färdig. Vid ett fel under körningen av en metod visas rutan i rött, märkt som misslyckad. Kontrollera i så fall den nedre delen av arbetsytan, på fliken Utdatalogg visas en förklaring av felet.
4. När metoden är klar kontrollerar du resultatet i den nedre delen av arbetsytan på fliken Sammanfattning . Här presenteras de utgångar som genereras av metoden, i det här fallet uppsättningen filmer. Klicka på knappen Analysera resultat så visas ett nytt fönster med listan över filmer.

2. Filmjustering: från filmer till mikrografer

1. Använd metoden xmipp3 - optisk inriktning som implementerar optiskt ^flöde19. Använd följande parametrar för att fylla i formuläret (Kompletterande bild 3): Indatafilmerna är de som erhålls i steg 1, intervallet i Ramar till JUSTERA är från 2 till 13, de andra alternativen stannar kvar med standardvärdena. Kör programmet.
   OBS: Parametrarna i fetstil i ett formulär måste alltid fyllas i. De andra kommer att ha ett standardvärde eller kommer inte att krävas obligatoriskt. I den övre delen av formulärfönstret kan fälten där beräkningsresurserna distribueras hittas som trådar, API:er eller GPU:er.
2. Klicka på Analysera resultat för att kontrollera de erhållna mikrograferna och banan för de uppskattade skiften (figur 1). För varje mikrograf som ses: titta på den uppnådda mikrografens effektspektraldensitet (PSD), de banor som erhålls för att justera filmen (en punkt per bildruta) i kartesiska och polära koordinater och filnamnet på den erhållna mikrografen (klicka på den kan mikrografen inspekteras). Observera att partiklarna i provet är mycket mer synliga i mikrografen, jämfört med en enda bildruta i filmen.

3. CTF-skattning: beräkning av mikroskopets avvikelser

1. Använd först metoden grigoriefflab - ctffind15. Inställningen är: Inmatningsmikrograferna är utgången av steg 2, den manuella CTF-nedsamplingsfaktorn är inställd på 1,5 och upplösningsintervallet går från 0,06 till 0,42. I alternativen Avancerat (som du hittar genom att välja det här valet i formulärets expertnivå) anger du dessutom fönsterstorleken till 256. De återstående parametrarna ligger kvar med standardvärdena (kompletterande figur 4).
   Obs: I de flesta metoder i Scipion visar alternativet Avancerat fler konfigurationsparametrar. Använd dessa alternativ noggrant, när programmet som ska lanseras är helt känt och innebörden av parametrarna förstås. Vissa parametrar kan vara svåra att fylla utan att titta på data. I så fall visar Scipion ett trollspö på höger sida som visar ett guidefönster (Kompletterande figur 5). I fältet Lösning i det här formuläret är det till exempel särskilt användbart, eftersom dessa värden bör väljas för att ungefär täcka regionen från den första nollan till den sista märkbara ringen i PSD.
2. Klicka på Kör och analysera resultat (bild 2) när metoden är klar. Kontrollera att den uppskattade CTF matchar med den experimentella. För detta ändamål, titta på PSD och jämför de uppskattade ringarna i hörnet med de som kommer från data. Kontrollera också de erhållna defokusvärdena för att hitta oväntade värden och respektive mikrografer kan kasseras eller beräknas om. I det här exemplet kan hela uppsättningen mikrografer användas.
   OBS: Använd knapparna i den nedre delen av fönstret för att göra en delmängd av mikrografer (med Micrographs röd knapp) och för att beräkna om en CTF (med beräkna om CTF:er röd knapp), vid behov.
3. För att förfina den tidigare uppskattningen, använd xmipp3 - ctf ^{uppskattning20}. Välj som indatamikrografer utdata för steg 2, välj alternativet Använd defoci från en tidigare CTF-uppskattning, eftersom tidigare CTF-uppskattning väljer utdata för grigoriefflab - ctffind och, på avancerad nivå, ändra fönsterstorleken till 256 (kompletterande figur 6). Kör den.
4. Klicka på Analysera resultat för att kontrollera erhållna CTFs. Med den här metoden uppskattas och representeras mer data i några extra kolumner. Eftersom ingen av dem visar felaktiga uppskattade värden kommer alla mikrografer att användas i följande steg.

4. Partikelplockning: hitta partiklar i mikrograferna

1. Innan du börjar plocka, utför en förprocess av mikrograferna. Öppna xmipp3 - förbehandla mikrografer, ange som indatamikrografer de som erhållits i steg 2 och välj alternativen Ta bort dåliga pixlar? med Flera Stddev till 5 och Downsample mikrografer? Klicka på Kör och kontrollera att storleken på de resulterande mikrograferna har minskat.
2. För plockning använd xmipp3 - manuell plockning (steg 1) och xmipp3 - automatisk plockning (steg 2)²¹. Den manuella plockningen gör det möjligt att manuellt förbereda en uppsättning partiklar med vilka autoplockningssteget kommer att lära sig och generera hela uppsättningen partiklar. Kör först xmipp3 - manuell plockning (steg 1) med indatamikrografer som mikrografer som erhållits i den tidigare förbearbetningen. Klicka på Kör så visas ett nytt interaktivt fönster (bild 3).
3. I det här fönstret visas en lista över mikrograferna (figur 3a) och andra alternativ. Ändra storlek (px) till 150, detta kommer att vara storleken på lådan som innehåller varje partikel. Den markerade mikrografen visas i ett större fönster. Välj en region och plocka alla synliga partiklar i den (bild 3b). Klicka sedan på Aktivera utbildning för att starta inlärningen. De återstående regionerna i mikrografen väljs automatiskt (bild 3c). Kontrollera de plockade partiklarna och inkludera mer genom att klicka på den, eller ta bort de felaktiga med skift + klickning, om det behövs.
4. Välj nästa mikrograf i det första fönstret. Mikrografen plockas automatiskt. Kontrollera igen för att inkludera eller ta bort några partiklar, om det behövs. Upprepa detta steg med ungefär 5 mikrografer för att skapa en representativ träningsuppsättning.
5. När detta är gjort klickar du på Koordinater i huvudfönstret för att spara koordinaterna för alla plockade partiklar. Träningsuppsättningen av partiklar är redo att gå till autoplockningen för att slutföra processen för alla mikrografer.
6. Öppna xmipp3 - automatisk plockning (steg 2) som anger i Xmipp partikelplockning kör föregående manuella plockning och Micrographs att plocka som samma som övervakas. Klicka på Kör. Den här metoden genererar som utdata en uppsättning på cirka 100000 koordinater.
7. Tillämpa en konsensusmetod, så utför en andra plockningsmetod för att välja de partiklar som båda metoderna är överens om. Öppen sphire - cryolo ^plocka14 och välj förbehandlade mikrografer som input micrographs, Använd allmän modell? till Ja, med en konfidenströskel på 0,3 och en boxstorlek på 150 (kompletterande figur 8). Kör den. Denna metod bör också generera cirka 100000 koordinater.
8. Kör xmipp3 - djup konsensusplockning22. Eftersom indatakoordinater inkluderar utdata från sphire - cryolo-plockning (steg 4.7) och xmipp3 - automatisk plockning (steg 4.6), ställ in Välj modelltyp till Förtränad och Hoppa över träning och poäng direkt med förtränad modell? Till Ja (kompletterande figur 9). Kör den.
9. Klicka på Analysera resultat och, i det nya fönstret, på ögonikonen bredvid Välj partiklar/koordinater med höga zScoreDeepLearning1-värden. Ett nytt fönster öppnas med en lista över alla partiklar (figur 4). ZScore-värdena i kolumnen ger en inblick i kvaliteten på en partikel, låga värden betyder dålig kvalitet.
   1. Klicka på etiketten_xmipp_zScoreDeepLearning för att beställa partiklarna från högsta till lägsta zScore. Välj partiklarna med zScore högre än 0,75 och klicka på Koordinater för att skapa den nya deluppsättningen. Detta bör skapa en delmängd med cirka 50000 koordinater.
10. Öppen xmipp3 - djup mikrografrengörare. Välj som indatakoordinerar delmängd som erhållits i föregående steg, Mikrografkälla som samma som koordinater och behåll tröskelvärdet på 0,75. Kör den. Kontrollera på fliken Sammanfattning att antalet koordinater har minskats, men i det här fallet tas bara ett fåtal koordinater bort.
    OBS: Det här steget kan dessutom rengöra uppsättningen koordinater och kan vara mycket användbart för att rengöra andra datamängder med fler filmartefakter som kolzoner eller stora föroreningar.
11. Kör xmipp3 - extrahera partiklar (Kompletterande figur 10). Ange som ingång koordinerar koordinaterna som erhålls efter föregående steg, Micrographs källa som andra, Inmatning mikrografer som utgången av steg 2, CTF uppskattning som utdata för xmipp3 - ctf uppskattning, Nedsampling faktor till 3 och Partikel låda storlek till 100. På fliken Förbehandla i formuläret väljer du Ja till alla. Kör den.
12. Kontrollera att utgången ska innehålla partiklarna i reducerad storlek på 100x100 pixlar och en pixelstorlek på 4,02Å/px.
13. Kör igen xmipp3 - extrahera partiklar som ändrar följande parametrar: Nedsamplingsfaktor till 1 och Partikellådans storlek till 300. Kontrollera att utgången är samma uppsättning partiklar men nu med full upplösning.

5. 2D-klassificering: gruppering av liknande partiklar tillsammans

1. Öppna metoden cryosparc2 - 2d ^{classification11} med indatapartiklar som de som erhålls i steg 4.11 och, på fliken 2D-klassificering, Antalet klasser till 128, behåll alla andra parametrar med standardvärdena. Kör den.
2. Klicka på Analysera resultat och sedan på ögonikonen bredvid Visa partikelklasser med Scipion (bild 5). Den här klassificeringen hjälper till att rengöra uppsättningen partiklar, eftersom flera klasser kommer att verka bullriga eller med artefakter. Välj de klasser som innehåller bra vyer. Klicka på Partiklar (röd knapp i den nedre delen av fönstret) för att skapa den renare deluppsättningen.
3. Öppna nu xmipp3 - cl2d23 och ange som Indatabilder bilderna som erhållits i föregående steg och Antal klasser som 128. Klicka på Kör.
   OBS: Denna andra klassificering används som ytterligare rengöringssteg för uppsättningen partiklar. Vanligtvis är det användbart att ta bort så mycket bullriga partiklar som möjligt. Men om ett enklare arbetsflöde önskas kan endast en 2D-klassificeringsmetod användas.
4. När metoden är klar kontrollerar du de 128 genererade klasserna genom att klicka på Analysera resultat och på Vad du ska visa: klasser. De flesta av de genererade klasserna visar en projektion av makromolekylen med viss detaljnivå. Vissa av dem verkar dock bullriga (i det här exemplet cirka 10 klasser). Välj alla bra klasser och klicka på knappen Klasser för att generera en ny delmängd med bara de bra. Den här delmängden kommer att användas som indata till en av metoderna för att generera en första volym. Med samma valda klasser klickar du på Partiklar för att skapa en renare delmängd efter att ha tagit bort de som tillhör de dåliga klasserna.
5. Öppna pwem - delmängd med full uppsättning objekt som utdata på 4.13 (alla partiklar i full storlek), Gör slumpmässig delmängd till Nr, Annan inställd som delmängd av partiklar som skapats i föregående steg och Ange operation som skärningspunkt. Detta kommer att extrahera den tidigare delmängden från partiklarna med full upplösning.

6. Initial volymuppskattning: bygga den första gissningen av 3D-volymen

1. I det här steget uppskattar du två inledande volymer med olika metoder och använder sedan ett konsensusverktyg för att generera den slutliga uppskattade 3D-volymen. Öppna xmipp3 - rekonstruera ^{signifikant24-metod} med indataklasser som de som erhålls efter steg 5, symmetrigrupp som c1 och behåll de återstående parametrarna med sina standardvärden (kompletterande figur 11). Utför det.
2. Klicka på Analysera resultat. Kontrollera att en lågupplöst volym av storlek 100x100x100 pixlar och en pixelstorlek på 4,02Å/px erhålls.
3. Öppna xmipp3 - beskära/ändra storlek på volymer (kompletterande bild 12) använda som indatavolymer den som erhållits i föregående steg, Ändra storlek på volymer? till Ja, Ändra storlek på alternativet Samplingshastighet och Ändra storlek på samplingsfrekvensen till 1,34 Å/px. Kör den. Kontrollera på fliken Sammanfattning att utdatavolymen har rätt storlek.
4. Skapa nu den andra initiala volymen. Öppen relion - 3D initial ^model10, eftersom indatapartiklar använder de goda partiklarna med full upplösning (utgång på 5,5) och ställer in Partikelmaskdiametern till 402Å, behåll de återstående parametrarna med standardvärdena. Kör den.
5. Klicka på Analysera resultat och sedan i Visa volym med: segment. Kontrollera att en lågupplöst volym men med strukturens huvudform erhålls (kompletterande figur 13).
6. Öppna pwem - anslut uppsättningar för att kombinera de två genererade initiala volymerna för att skapa indata till konsensus metoden. Ange bara volymer som indatatyp och välj de två inledande volymerna i indatauppsättningen. Kör den. Utdata ska vara en uppsättning som innehåller två objekt med båda volymerna.
7. Konsensusverktyget är det som ingår i xmipp3 - svärmkonsensus25. Öppna den. Använd som fullstora bilder de bra partiklarna med full upplösning (utdata på 5,5), som initiala volymer uppsättningen med två objekt som genereras i föregående steg, och se till att symmetrigruppen är c1. Klicka på Kör.
8. Klicka på Analysera resultat. Kontrollera att en mer detaljerad utmatningsvolym erhålls (bild 6). Även om det finns mer brus som omger strukturen, för att ha mer information i strukturkartan kommer att hjälpa följande förfining steg för att undvika lokala minima.
   OBS: Om UCSF ^Chimera26 är tillgängligt använder du den sista ikonen i den övre delen av fönstret för att göra en 3D-visualisering av den erhållna volymen.
9. Öppna och utför relion - 3D auto-refine10 för att göra en första 3D vinkeltilldelning av partiklarna. Välj som ingångspartiklar effekten 5,5 och ställ in partikelmaskdiametern till 402Å. På fliken Referens 3D-karta väljer du som Inmatningsvolym den som erhölls i föregående steg, Symmetri som c1 och Initialt lågpassfilter till 30Å (Kompletterande figur 14).
10. Klicka på Analysera resultat. I det nya fönstret väljer du final som volym för att visualisera och klicka på Visa volym med: segment för att se erhållen volym. Kontrollera även Fourier shell korrelation (FSC) genom att klicka på Visa upplösningsdiagram i resultatfönstret och vinkeltäckningen i Display vinkelfördelning: 2D-diagram (bild 7). Den rekonstruerade volymen innehåller mycket mer detaljer (troligen med några suddiga områden i den yttre delen av strukturen), och FSC korsar tröskeln på 0,143 runt 4,5Å. Vinkeltäckningen täcker hela 3D-sfären.

7.3D klassificering: upptäcka konformationstillstånd

1. Om olika konformationstillstånd finns i data kan man upptäcka om det finns olika konformationstillstånd. Öppen relion - 3D-klassificering10 (Kompletterande figur 15). Eftersom indatapartiklar använder de som just erhållits i 6.10, och ställ in partikelmaskdiametern till 402Å. På fliken Referens 3D-kart använder du som indatavolym den som erhålls efter steg 6.10, ställer in Symmetri på c1 och Initialt lågpassfilter till 15Å. Ange slutligen antalet klasser på fliken Optimering på fliken Optimering. Kör den.
2. Kontrollera resultaten genom att klicka på Analysera resultat, välj Visa klassificering i Scipion. De tre genererade klasserna och några intressanta mått visas. De två första klasserna bör ha ett liknande antal tilldelade bilder (storlekskolumn ) och se mycket lika ut, medan den tredje har färre bilder och ett mer suddigt utseende. Dessutom bör rlnAccuracyRotations och rlnAccuracyTranslations vara klart bättre för de två första klasserna. Välj de två bästa klasserna och klicka på knappen Klasser för att generera en delmängd som innehåller dem.
3. Upprepa steg 7.1 och 7.2 för att generera en andra grupp bra klasser. Båda kommer att vara bidrag från konsensusverktyget.
4. Öppna och kör xmipp3 - konsensusklasser 3D och välj som indataklasser de två delmängderna som genereras i föregående steg.
5. Klicka på Analysera resultat. Antalet sammanfallande partiklar mellan klasser presenteras: det första värdet är antalet sammanfallande partiklar i den första klassen av delmängd 1 och den första klassen av delmängd 2, det andra värdet är antalet sammanfallande partiklar i den första klassen av delmängd 1 och den andra klassen av delmängd 2, etc. Kontrollera att partiklarna slumpmässigt tilldelas klasserna ett eller två, vilket innebär att 3D-klassificeringsmetoden inte kan hitta konformationsförändringar. Med tanke på detta resultat kommer hela uppsättningen partiklar att användas för att fortsätta bearbetningen.

8.3D förfining: raffinering av vinkeltilldelningar av en homogen population

1. Återigen, tillämpa en konsensusstrategi i detta steg. Öppna och kör först pwem - delmängd med fullständig uppsättning objekt som utdata på 6,9, Gör slumpmässig delmängd till Ja och Antal element till 5000. Med detta skapas en delmängd av bilder med en tidigare justering för att träna metoden som används i följande steg.
2. Öppna xmipp3 - djup justering, ställ in indatabilder som utdata från bra partiklar som erhålls i 5,5, Volym som den som erhålls efter 6,10, Inmatningsutbildningsuppsättning som den som skapades i föregående steg, Målupplösning till 10Å, och behåll de återstående parametrarna med standardvärdena (kompletterande bild 16). Klicka på Kör.
3. Klicka på Analysera resultat för att kontrollera den erhållna vinkelfördelningen, där det inte saknas vägbeskrivningar och vinkeltäckningen förbättras något jämfört med 6,10 (figur 8).
4. Öppna och kör xmipp3 - jämför vinklar och välj som ingångspartiklar 1 utgången av 6,9 och Ingångspartiklar 2 utgången på 8,2, se till att symmetrigruppen är c1. Den här metoden beräknar avtalet mellan xmipp3 - djup justering och relion - 3D automatisk raffinering.
5. Klicka på Analysera resultat, listan över partiklar, med erhållna skillnader i skift och vinklar, visas. Klicka på stapelikonen i den övre delen av fönstret, ett annat fönster öppnas som gör det möjligt att göra diagram över de beräknade variablerna. Välj _xmipp_angleDiff och klicka på Plot för att se en representation av vinkelskillnaderna per partikel. Gör samma sak med _xmipp_shiftDiff. I dessa siffror är ungefär hälften av partiklarna överens om ungefär hälften av partiklarna (figur 9). Välj partiklar med vinkelskillnader som är lägre än 10º och skapa en ny delmängd.
6. Öppna nu xmipp3 - highres27 för att göra en lokal förfining av de tilldelade vinklarna. Välj först som Bilder i full storlek de bilder som erhållits i föregående steg, och när initiala volymer matas ut 6,9, ställ in radie av partikel till 150 pixlar och Symmetrigrupp som c1. På fliken Vinkeltilldelning anger du bildjusteringen till Lokal, Antal iterationer till 1 och Max. Målupplösning som 5Å/px (kompletterande figur 17). Kör den.
7. Kontrollera att utdatavolymen är mindre än 300x300x300 pixlar och med något högre pixelstorlek på fliken Sammanfattning .
8. Klicka på Analysera resultat för att se de erhållna resultaten. Klicka på Displayupplösningsdiagram för att se FSC och på Displayvolym: Rekonstruerad för att se erhållen volym (Kompletterande bild 18). En bra upplösningsvolym nära 4-3.5Å erhålls.
9. Klicka på Visa utdatapartiklar och klicka på stapelikonen i fönstret med listan över partiklar. I det nya fönstret väljer du Skriv som histogram, med 100 lagerplatser, väljer _xmipp_cost etikett och trycker slutligen på Plot (Kompletterande bild 19). På så sätt presenteras histogrammet för kostnadsetiketten , som innehåller korrelationen mellan partikeln och den projektionsriktning som valts för den. I detta fall erhålls en icke-icke-dal densitetsfunktion, vilket är ett tecken på att inte ha olika populationer i uppsättningen partiklar. Således kommer alla att användas för att fortsätta förfining
   OBS: Om du ser en multimodal densitetsfunktion bör uppsättningen partiklar som tillhör det högre maxvärdet väljas för att fortsätta arbetsflödet endast med dem.
10. Öppna och köra igen xmipp3 - highres med Fortsätt från en tidigare körning? till Ja, ange som bilder i full storlek som erhållits efter 8,5 och Välj föregående körning med den tidigare körningen av Xmipp Highres. På fliken Vinkeltilldelning ställer du in bildjusteringen på Lokal, med 1 iteration och 2,6Å/px som målupplösning (full upplösning).
11. Nu ska utdata innehålla en volym med full upplösning (storlek 300x300x300 pixlar). Klicka på Analysera resultat för att återigen kontrollera erhållen volym och FSC, som nu ska vara en högupplöst volym vid cirka 3Å (figur 10).

9. Utvärdering och efterbehandling

1. Öppna xmipp3 - lokal MonoRes28. Den här metoden beräknar upplösningen lokalt. Ställ in som inmatningsvolym den som erhålls efter 8.10, ställ in Vill du använda halva volymer? till Ja och Upplösningsintervall från 1 till 10Å. Kör den.
2. Klicka på Analysera resultat och välj Visa histogram för upplösning och Visa färgade segment (bild 11). Upplösningen i de olika delarna av volymen visas. De flesta voxels i den centrala delen av strukturen bör presentera resolutioner runt 3Å, medan de värsta upplösningarna uppnås i de yttre delarna. Dessutom visas ett histogram av upplösningarna per voxel med en topp runt (även nedan) 3Å.
3. Öppna och kör xmipp3 - localdeblur slipning29 för att applicera en slipning. Välj som inmatningskarta den som erhålls i 8.10, och som upplösningskarta den som erhölls i föregående steg med MonoRes.
4. Klicka på Analysera resultat för att kontrollera de erhållna volymerna. Öppna den sista, motsvarande den senaste iterationen av algoritmen. Det rekommenderas att du öppnar volymen med andra verktyg, till exempel UCSF ^Chimera26, för att bättre se volymens egenskaper i 3D (figur 12).
5. Slutligen öppnar du valideringsverktyget som ingår i xmipp3 - validera övermontering30 som visar hur upplösningen ändras med antalet partiklar. Öppna den och inkludera som indatapartiklar partiklarna som erhålls i steg 8.5, ställ in Beräkna bruset som är bundet för upplösning? till Ja, med initial 3D-referensvolym som utdata på 8,10. I avancerade alternativ ställer du in antalet partiklar på "500 1000 1500 2000 3000 5000 10000 15000 20000" (Kompletterande figur 20). Kör den.
6. Klicka på Analysera resultat. Två tomter kommer att visas (figur 13) med upplösningens utveckling, i den gröna linjen, när antalet partiklar som används i rekonstruktionen växer. Den röda linjen representerar den resolution som uppnåtts med en rekonstruktion av justerat gaussiskt buller. Upplösningen förbättras med antalet partiklar och en stor skillnad i rekonstruktionen från partiklar jämfört med den från buller observeras, vilket är en indikator på att ha partiklar med god strukturell information.
7. Från de tidigare resultaten kunde en montering av en modell i den efterbehandlade volymen utföras, vilket skulle göra det möjligt att upptäcka makromolekylens biologiska strukturer.

Representative Results

Vi har använt datauppsättningen för Plasmodium falciparum 80S Ribosome (EMPIAR-post: 10028, EMDB-post: 2660) för att genomföra testet och, med Scipion-protokollet presenterat i föregående avsnitt, har en högupplöst 3D rekonstruerad volym av makromolekylen i detta specifika exempel uppnåtts, med början i den information som samlas in av mikroskopet som består av mycket bullriga bilder som innehåller 2D-projektioner i alla orienteringar.

De viktigaste resultaten som erhålls efter att ha kört hela protokollet presenteras i figur 10, figur 11 och figur 12. Figur 10 representerar den erhållna 3D-volymen före efterbearbetning. I figur 10a kan man se en FSC på 3 Å, att den ligger mycket nära Nyquistgränsen (med data med en pixelstorlek på 1,34 Å är Nyquistgränsen 2,6 Å). Figur 10b visar några delar av den rekonstruerade 3D-volymen med höga detaljnivåer och väldefinierade strukturer. I figur 11 presenteras resultaten efter att lokalt analysera upplösningen av den erhållna 3D-volymen. Det kan ses att de flesta voxels i strukturen uppnår en upplösning under 3 Å, främst de som ligger i den centrala delen av strukturen. Den yttre delen visar dock sämre upplösningar, vad som överensstämmer med den suddighet som förekommer i dessa områden i figur 10b- Figur 12 visar samma 3D-karta efter efterbehandling som kan markera volymens högre frekvenser, avslöja mer information och förbättra representationen, vilket särskilt kan ses i 3D-presentationen i figur 12c.

I figur 14 användes ^Chimera26 för att se en 3D-representation av den erhållna volymen (figur 14a), efterbehandlad (figur 14b) och upplösningskartan (figur 14c), färgad med färgkoden för de lokala upplösningarna. Detta kan ge ännu mer information om den erhållna strukturen. Detta verktyg är mycket användbart för att få en inblick i kvaliteten på den erhållna volymen, eftersom mycket små detaljer i hela 3D-kontexten av strukturen kan ses. När den uppnådda upplösningen är tillräcklig kan även vissa biokemiska delar av strukturen hittas (t.ex. alfa-spiraler i figur 14d. I denna siffra måste det belysas den höga upplösning som uppnåtts i alla centrala delar av 3D-strukturen, som kan ses som de mörkblå områdena i figur 14c.

Alla tidigare resultat uppnåddes tack vare en god prestanda för hela protokollet, men så kanske inte är fallet. Det finns flera sätt att identifiera ett dåligt beteende. I det mest allmänna fallet händer detta när den erhållna strukturen har låg upplösning och den inte kan utvecklas till en bättre. Ett exempel på detta presenteras i figur 15. En suddig volym (figur 15c) resulterar i en låg FSC, vilket kan ses i FSC-kurvan (figur 15a) och histogrammet för den lokala uppskattningen (figur 15b). Det här exemplet genererades med hjälp av en 3D-förfiningsmetod med felaktiga indata, eftersom det förväntade sig vissa specifika egenskaper i indatauppsättningen med partiklar som de inte uppfyller. Som framgår är det alltid mycket viktigt att veta hur de olika metoderna förväntar sig att ta emot data och förbereda dem ordentligt. I allmänhet kan det finnas ett problem i bearbetningsarbetsflödet eller underliggande data när en utdata som den i figur 15 erhålls.

Det finns flera kontrollpunkter längs arbetsflödet som kan analyseras för att veta om protokollet utvecklas korrekt eller inte. Till exempel, direkt efter plockning, kan flera av de metoder som diskuterats tidigare rangordna partiklarna och ge en poäng för var och en av dem. Vid dåliga partiklar tillåter dessa metoder att identifiera och ta bort dem. 2D-klassificeringen kan också vara en bra indikator på att ha en dålig uppsättning partiklar. Figur 16 visar ett exempel på en så dålig uppsättning. I figur 16a visas bra klasser som innehåller vissa detaljer om strukturen, medan figur 16b visar dåliga klasser, som är bullriga eller ocentrerade, i detta sista fall kan man se att plockningen var felaktig och två partiklar verkar dyka upp tillsammans. En annan kontrollpunkt är den första volymuppskattningen, figur 17 visar ett exempel på bra (figur 17a) och dåliga (figur 17b) första uppskattningar. Den felaktiga uppskattningen skapades med en felaktig inställning för metoden. Det måste beaktas att alla inställningar bör göras noggrant och välja på lämpligt sätt varje parameter enligt de data som analyseras. Om man inte har en karta med minimal strukturell information kommer följande förfining inte att kunna få en bra rekonstruktion.

När problemet är ett dåligt förvärv, där filmerna inte bevarar strukturell information, blir det omöjligt att extrahera bra partiklar från dem och få en framgångsrik bearbetning. I så fall bör fler filmer samlas in för att få en högupplöst 3D-rekonstruktion. Men om så inte är fallet finns det flera sätt att hantera problem längs bearbetningsarbetsflödet. Om plockningen inte är tillräckligt bra finns det flera sätt att försöka fixa det, t.ex. upprepa plockningen, använda olika metoder eller försöka manuellt plocka fler partiklar för att hjälpa metoderna att lära av dem. Under 2D-klassificeringen, om bara några klasser är bra, överväg också att upprepa plockprocessen. I den första volymuppskattningen, försök att använda flera metoder om några av dem gav felaktiga resultat. Detsamma gäller 3D-förfining. Efter detta resonemang har flera konsensusverktyg presenterats i detta manuskript, vilket kan vara mycket användbart för att undvika problem och fortsätta behandlingen med korrekta uppgifter. Tack vare att vi använder konsensus mellan flera metoder kan vi kassera data som är svåra att plocka, klassificera, justera etc., vilket förmodligen är en indikator på dåliga data. Men om flera metoder kan komma överens i den genererade utdata, innehåller förmodligen dessa data värdefull information för att fortsätta behandlingen.

Vi uppmuntrar läsaren att ladda ner fler datamängder och försöka bearbeta dem enligt rekommendationerna som presenteras i detta manuskript och att skapa ett liknande arbetsflöde som kombinerar bearbetningspaket med hjälp av Scipion. Att försöka bearbeta en datauppsättning är det bästa sättet att lära sig kraften i de bearbetningsverktyg som finns tillgängliga i den senaste tekniken i Cryo-EM, att känna till de bästa reglerna för att övervinna de möjliga nackdelarna som uppstår under bearbetningen och att öka prestandan för de tillgängliga metoderna i varje specifikt testfall.

Figur 1. Resultat för filmjustering. a) Resultatens huvudfönster, med en förteckning över alla mikrografer som genereras och ytterligare information: effektspektraldensiteten, banan för den uppskattade justeringen i polära koordinater, samma i kartesiska koordinater, filnamnet på den genererade mikrografen. b) Den inriktningsbana som representeras i kartesiska koordinater. c) Den genererade mikrografen. Klicka här för att se en större version av den här figuren.

Figur 2. CTF-uppskattning med Ctffind-resultat. Huvudfönstret med resultaten innehåller en siffra med den uppskattade PSD (i ett hörn) tillsammans med PSD som kommer från data och flera defokusskärmar. Klicka här för att se en större version av den här figuren.

Figur 3. Manuell plockfönster med Xmipp. a) Huvudfönstret med en förteckning över mikrografer som ska bearbetas och några andra parametrar. b) Manuellt plocka partiklar inuti en region i en mikrograf. c) och d) Automatiskt plockade partiklar som skall övervakas för att skapa en uppsättning träningspartiklar för Xmipps automatiska plockningsmetod. Klicka här för att se en större version av den här figuren.

Figur 4. Djup konsensusplockning med Xmipp-resultat. Parametern zScoreDeepLearning ger vikt åt en partikels godhet och det är nyckeln till att upptäcka dåliga partiklar. a) De lägsta zScores-värdena är associerade med artefakter. b) De högsta zScores är associerade med partiklar som innehåller makromolekylen. Klicka här för att se en större version av den här figuren.

Figur 5. 2D-klassificering med Cryosparc-resultat. De klasser som genereras (medelvärden av delmängder av partiklar som kommer från samma orientering) visas. Flera bra klasser valda i rött (med viss detaljnivå) och några dåliga klasser som inte valts (bullriga och ocentrerade klasser). Klicka här för att se en större version av den här figuren.

Figur 6. 3D-initial volym med svärmkonsensusresultat. En vy över den 3D-initiala volymen som erhållits efter att ha kört konsensusverktyget xmipp3 - svärmkonsensus, med hjälp av de tidigare 3D-initiala volymuppskattningarna av Xmipp och Relion. a) Volymen representeras av segment. b) 3D-visualisering av volymen. Klicka här för att se en större version av den här figuren.

Figur 7. Förfining av en 3D-initial volym med Relion-resultat. a) FSC-kurva som erhålls och passerar tröskeln vid en 4,5Å, ungefär. b) Vinkeltäckning som visas som övre vy över 3D-sfären. I det här fallet, eftersom det inte finns någon symmetri, bör de tilldelade partiklarna täcka hela sfären. c) Raffinerad volym som representeras av segment. Klicka här för att se en större version av den här figuren.

Figur 8. 3D-justering baserad på djupinlärning med Xmipp-resultat. Resultaten som genereras av xmipp3 - deep align-metoden för 3D-justering . a) Vinkeltilldelningen för varje partikel i form av omvandlingsmatris. b) Vinkeltäckningen. Klicka här för att se en större version av den här figuren.

Figur 9. Konsensusresultat för 3D-justering. a) Förteckning över partiklar med erhållna skillnader i skift- och vinkelparametrar. b) Diagram över vinkelskillnaderna per partikel. c) Diagram över skiftskillnaden per partikel. Klicka här för att se en större version av den här figuren.

Figur 10. Slutlig iteration av 3D-förfiningsresultat. a) FSC-kurvan. b) Erhållen volym med full upplösning med segment. Klicka här för att se en större version av den här figuren.

Figur 11. Lokal upplösningsanalys med Xmipp-resultat. Resultat av metoden xmipp3 - lokala MonoRes. a) Vissa representativa segment färgade med upplösningsvärdet per voxel, enligt färgkoden. b) Histogram med lokal upplösning. Klicka här för att se en större version av den här figuren.

Figur 12. Slipning med Xmipp-resultat. Resultat av xmipp3 - localdeblur slipningsmetod . a) Förteckning över erhållna volymer per iteration. b) 3D-volym som erhålls efter den senaste iterationen representerad av segment. c) En 3D-representation av den slutliga volymen. Klicka här för att se en större version av den här figuren.

Figur 13. Validera övermonteringsverktyget i Xmipp-resultatet. Resultat av xmipp3 - överanpassning av validering. Den gröna linjen motsvarar rekonstruktion från data, den röda linjen från brus. a) Invers av den kvadratiska upplösningen med logaritmen av antalet partiklar. b) Upplösning med antalet partiklar. Klicka här för att se en större version av den här figuren.

Figur 14. Flera 3D-representationer av den erhållna volymen. a) Förbehandlad volym. b) Efterbehandlad volym. c) Lokal upplösning, mörkblå voxels är de med högre upplösning (2.75Å) och mörkröda voxels är de med lägre upplösning (10.05Å). d) Zooma in den efterbehandlade volymen där en alfa-helix (röd oval) kan ses. Klicka här för att se en större version av den här figuren.

Figur 15. Exempel på en dålig 3D-rekonstruktion. a) FSC-kurva med kraftigt fall och som passerar tröskeln vid låg upplösning. b) Histogram med lokal upplösning. c) 3D-volym per segment. Klicka här för att se en större version av den här figuren.

Figur 16. Exempel på 2D-klasser. a) Bra klasser som visar en viss detaljnivå. b) Dåliga klasser som innehåller buller och artefakter (övre delen erhålls med Xmipp, lägre med CryoSparc). Klicka här för att se en större version av den här figuren.

Figur 17. Exempel på 3D-initial volym med olika egenskaper. a) God initial volym där makromolekylens form kan observeras. b) Dålig utgångsvolym där den erhållna formen skiljer sig helt från den förväntade. Klicka här för att se en större version av den här figuren.

Kompletterande figur 1. Skapa ett Scipion-projekt. Fönster som visas av Scipion där ett gammalt projekt kan väljas eller ett nytt kan skapas med ett namn och en plats för det projektet. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Kompletterande figur 2. Importera filmmetod. Fönster visas av Scipion när pwem - import filmer är öppna. Här måste de viktigaste förvärvsparametrarna inkluderas för att låta de filmer som ska bearbetas i Scipion. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Kompletterande figur 3. Filmjusteringsmetod. Fönster som visas av Scipion när xmipp3 - optisk justering används. Indatafilmerna, bildintervallet som övervägs för justering och några andra parametrar för att bearbeta filmerna bör fyllas i. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Kompletterande figur 4. CTF-skattningsmetod med Ctffind. Formuläret i Scipion med alla nödvändiga fält för att köra programmet Ctffind. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Kompletterande figur 5. Trollkarl i Scipion. En guide som hjälper användaren att fylla i vissa parametrar i formuläret . I det här fallet ska guiden slutföra upplösningsfältet i metoden grigoriefflab - ctffind . Klicka här för att ladda ner den här filen.

Kompletterande figur 6. CTF-förfiningsmetod med Xmipp. Formen av xmipp3 - ctf uppskattning med alla parametrar för att göra en förfining av en tidigare uppskattad CTF. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Kompletterande figur 7. Förbehandla mikrografer metod. Formen av xmipp3 - förbehandla mikrografer som gör det möjligt att utföra vissa operationer över dem. I det här exemplet är ta bort dåliga pixlar och Downsample-mikrografer användbara. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Kompletterande figur 8. Plockningsmetod med Cryolo. Formuläret för att köra Cryolo-plockmetoden med hjälp av ett förtränat nätverk. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Kompletterande figur 9. Konsensusplockningsmetod med Xmipp. Formen av xmipp3 - djup konsensusplockning baserad på djupinlärning för att beräkna en konsensus av koordinater, med hjälp av ett förtränat nätverk över flera uppsättningar koordinater som erhållits med olika plockmetoder. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Kompletterande figur 10. Extrahera partiklar metod. Inmatnings- och förbearbetningsflikar av xmipp3 - extrahera partiklar. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Kompletterande figur 11.3D initial volymmetod med Xmipp. Formen på metoden xmipp3 - rekonstruera betydande för att få en första 3D-karta. Flikarna Indata och Villkor visas. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Kompletterande figur 12. Ändra storlek på volymmetoden. Formuläret för att göra en beskärning eller storleks storlek på en volym. I det här exemplet används den här metoden för att generera en full storleks volym efter xmipp3 - rekonstruera betydande. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Kompletterande figur 13.3D initial volym med Relion-resultat. En vy över den erhållna 3D-initialvolymen med relion - 3D-initial modellmetod efter segment. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Kompletterande figur 14. Förfining av den ursprungliga volymen med Relion. Formen på metoden relion - 3D auto-refine. I det här exemplet användes den för att förfina en initial volym som uppskattas efter konsensus. Flikarna Indata och Referens 3D visas. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Kompletterande figur 15.3D klassificeringsmetod. Form av relion - 3D-klassificering. Flikarna Indata, Referens 3D-karta och Optimering visas. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Kompletterande figur 16.3D anpassning baserad på en djupinlärningsmetod. Formuläret öppnades för metoden xmipp3 - djup justering. Här är det nödvändigt att träna ett nätverk med en träningsuppsättning, då kommer det nätverket att förutsäga vinkeluppgiften per partikel. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Kompletterande figur 17.3D förfiningsmetod. Form av xmipp3 - highres-metoden . Flikar Indata och vinkeltilldelning visas. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Kompletterande figur 18. Första iterationen av 3D-förfiningsresultat. a) FSC-kurvan. b) Erhållen volym (av mindre storlek än den fullständiga upplösningen) som representeras som segment. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Kompletterande figur 19. Första iteration av 3D-förfining korrelationsanalys. Ett nytt fönster visas genom att klicka på stapelikonen i den övre delen av fönstret med listan över partiklar. I fönstret Plot-kolumner kan ett histogram över önskad uppskattad parameter skapas. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Kompletterande figur 20. Verktyg för överanpassning av validering. Form av xmipp3 - validera övermonteringsmetod . Klicka här för att ladda ner den här filen.

Discussion

För närvarande är cryo-EM ett viktigt verktyg för att avslöja 3D-strukturen hos biologiska prover. När bra data samlas in med mikroskopet kommer de tillgängliga bearbetningsverktygen att göra det möjligt för oss att få en 3D-rekonstruktion av makromolekylen som studeras. Cryo-EM databehandling kan uppnå nära atomisk upplösning, vilket är nyckeln till att förstå det funktionella beteendet hos en makromolekyl och är också avgörande för läkemedelsupptäckt.

Scipion är en programvara som gör det möjligt att skapa hela arbetsflödet som kombinerar de mest relevanta bildbehandlingspaketen på ett integrerande sätt, vilket hjälper spårbarheten och reproducerbarheten för hela bildbehandlingsarbetsflödet. Scipion ger en mycket komplett uppsättning verktyg för att utföra behandlingen; Att få högupplösta rekonstruktioner beror dock helt på kvaliteten på de förvärvade uppgifterna och hur dessa uppgifter behandlas.

För att få en högupplöst 3D-rekonstruktion är det första kravet att få bra filmer från mikroskopet, som bevarar strukturell information till hög upplösning. Om så inte är fallet kommer arbetsflödet inte att kunna extrahera högupplöst information från data. Sedan bör ett framgångsrikt bearbetningsarbetsflöde kunna extrahera partiklar som verkligen motsvarar strukturen och hitta orienteringarna för dessa partiklar i 3D-utrymmet. Om något av stegen i arbetsflödet misslyckas försämras kvaliteten på den rekonstruerade volymen. Scipion gör det möjligt att använda olika paket i något av bearbetningsstegen, vilket hjälper till att hitta det lämpligaste tillvägagångssättet för att bearbeta data. Tack vare att det finns många paket tillgängliga kan dessutom konsensusverktyg som ökar noggrannheten genom att nå en överenskommelse om de uppskattade resultaten av olika metoder användas. Det har också diskuterats i detalj i avsnittet Representativa resultat flera valideringsverktyg och hur man identifierar korrekta och felaktiga resultat i varje steg i arbetsflödet, för att upptäcka potentiella problem och hur man försöker lösa dem. Det finns flera kontroll punkter längs protokollet som kan hjälpa till att inse om protokollet körs korrekt eller inte. Några av de mest relevanta är: plockning, 2D-klassificering, inledande volymuppskattning och 3D-justering. Att kontrollera indata, upprepa steget med en annan metod eller använda konsensus är alternativ som är tillgängliga i Scipion som användaren kan använda för att hitta lösningar när problem uppstår.

När det gäller tidigare metoder för paketintegration inom Cryo-EM-området är ^Appion31 den enda som möjliggör verklig integration av olika programvarupaket. Appion är dock tätt förknippat med ^Leginon32, ett system för automatiserad insamling av bilder från elektronmikroskop. Den största skillnaden med Scipion är att datamodellen och lagringen är mindre kopplade. På ett sådant sätt, för att skapa ett nytt protokoll i Scipion, behöver endast ett Python-skript utvecklas. Men i Appion måste utvecklaren skriva skriptet och ändra den underliggande databasen. Sammanfattningsvis utvecklades Scipion för att förenkla underhåll och utökningsbarhet.

Vi har i detta manuskript presenterat ett komplett arbetsflöde för Cryo-EM-bearbetning, med hjälp av den verkliga falldatauppsättningen för Plasmodium falciparum 80S Ribosome (EMPIAR-post: 10028, EMDB-post: 2660). Stegen som behandlas och diskuteras här kan sammanfattas som filmjustering, CTF-uppskattning, partikelplockning, 2D-klassificering, inledande kartuppskattning, 3D-klassificering, 3D-förfining, utvärdering och efterbehandling. Olika paket har använts och konsensusverktyg har tillämpats i flera av dessa steg. Den slutliga 3D-rekonstruerade volymen uppnådde en upplösning på 3 Å och i den efterbehandlade volymen kan vissa sekundära strukturer särskiljas, som alfa-spiraler, vilket hjälper till att beskriva hur atomer är ordnade i rymden.

Arbetsflödet som presenteras i detta manuskript visar hur Scipion kan användas för att kombinera olika Cryo-EM-paket på ett enkelt och integrerande sätt för att förenkla behandlingen och samtidigt få ett mer tillförlitligt resultat.

I framtiden kommer utvecklingen av nya metoder och paket att fortsätta växa och programvara som Scipion för att enkelt integrera dem alla kommer att bli ännu viktigare för forskarna. Konsensusstrategier kommer att vara mer relevanta även då, när det kommer att finnas gott om metoder med olika grund, vilket bidrar till att få mer exakta uppskattningar av alla parametrar som ingår i återuppbyggnadsprocessen i Cryo-EM. Spårning och reproducerbarhet är nyckeln i forskningsprocessen och lättare att uppnå med Scipion tack vare att ha ett gemensamt ramverk för utförande av kompletta arbetsflöden.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
no material is used in this article	-	-	-