Summary
Cet article démontre la préparation d’une fenêtre de formation image faite sur mesure complétée avec la canule d’infusion et son implantation sur la région CA1 du hippocampe chez les souris.
Abstract
L’imagerie des activités neuronales à la résolution d’une seule cellule chez les animaux éveillés au comportement est une approche très puissante pour l’étude des fonctions des circuits neuronaux en neurosciences des systèmes. Cependant, l’absorbance élevée et la diffusion de la lumière dans le tissu de mammifère limitent l’imagerie intravitale principalement aux régions superficielles du cerveau, laissant les zones profondes du cerveau, telles que l’hippocampe, hors de portée de la microscopie optique. Dans cette vidéo, nous montrons la préparation et l’implantation de la fenêtre d’imagerie sur mesure pour permettre l’imagerie in vivo chronique de la région CA1 de l’hippocampe dorsal chez des souris au comportement à tête fixe. La fenêtre sur mesure est complétée par une canule de perfusion qui permet l’administration ciblée de vecteurs viraux et de médicaments à la zone d’imagerie. En combinant cette préparation avec l’imagerie à large champ, nous avons effectué un enregistrement à long terme de l’activité neuronale à l’aide d’un indicateur de calcium fluorescent provenant de grands sous-ensembles de neurones chez des souris se comportant sur plusieurs semaines. Nous avons également démontré l’applicabilité de cette préparation pour l’imagerie de tension avec la résolution de simple-pic. Les indicateurs génétiquement codés haute performance de l’activité neuronale et les caméras CMOS scientifiques ont permis la visualisation récurrente des détails morphologiques subcellulaires des neurones uniques à haute résolution temporelle. Nous discutons également les avantages et les limitations potentielles de la méthode décrite et sa compatibilité avec d’autres techniques d’imagerie.
Introduction
L’hippocampe est une région clé du cerveau responsable de l’apprentissage et de la mémoire1 ainsi que de la navigation spatiale2. L’atrophie hippocampique est associée à des troubles neurologiques et psychiatriques impliquant une perte de mémoire et un déclin cognitif3,4,5. Chez la souris, l’hippocampe est un modèle très bien établi pour étudier l’apprentissage spatial, contextuel et associatif et la formation de la mémoire sur les niveaux cellulaire et réseau4,5. Les études mécanistes de l’apprentissage et de la mémoire nécessitent une interrogation longitudinale de la structure et de la fonction neuronales chez les souris qui se comportent. L’imagerie par fluorescence en combinaison avec des sondes génétiquement codées6 offre des capacités sans précédent pour enregistrer la dynamique de tension membranaire7,8,les transitoires de calcium9et les changements structurels10 sur de grands sous-ensembles de neurones par voie intravite. Cependant, l’accès optique à l’hippocampe chez la souris est obstrué par le cortex, qui peut atteindre plus de 1 mm d’épaisseur. Ici, nous avons décrit une procédure pour assembler un dispositif d’imagerie sur mesure et son implantation chronique dans la tête de souris pour un accès optique à long terme à la sous-région CA1 de l’hippocampe dorsal chez les souris se comportant. La canule de perfusion intégrée à l’implant d’imagerie permet l’administration de virus ou de médicaments directement sur les neurones dans le champ de vision. La préparation décrite en combinaison avec la microscopie à large champ permet l’imagerie récurrente des grands sous-ensembles de neurones chez les souris se comportant sur de longues périodes de temps. Nous avons utilisé cette préparation pour exprimer le calcium et la tension génétiquement codés indicateurs dans la région CA1 hippocampal par l’intermédiaire de l’injection ciblée du virus adeno-associé recombinant (rAAV) pour des enregistrements d’activité neuronale à la résolution unicellulaire. Nous avons également exécuté la formation image longitudinale de calcium des sous-ensembles neuronaux correspondants à la haute résolution spatio-temporelle chez les animaux de comportement. En outre, cette préparation est compatible avec la microscopie multiphotonique et la microendoscopie, élargissant ainsi la boîte à outils des techniques d’imagerie pour étudier les réseaux neuronaux aux niveaux cellulaire et subcellulaire chez les souris se comportant. Nous avons décrit les étapes critiques et le dépannage du protocole. Nous avons également discuté des pièges et des limites possibles de la méthode.
Protocol
Toutes les méthodes décrites ici ont été approuvées par le Comité institutionnel de protection et d’utilisation des animaux (IACUC) de l’Université Westlake.
1. Assemblage d’implants
REMARQUE : L’assemblage de l’implant d’imagerie est techniquement simple et ne nécessite que des articles disponibles dans le commerce(figure 1,voir aussi la table des matériaux). Les plaques de tête peuvent être fabriquées à l’atelier d’usinage local en utilisant des plaques en acier inoxydable ou en titane. Nous vous suggérons de préparer un stock d’implants entièrement assemblés avant de commencer les chirurgies. Une fois les expériences in vivo effectuées, les implants peuvent être récupérés et réutilisés plusieurs fois. Dans certains cas, il peut seulement être nécessaire de rattacher la canule d’infusion en sousyant ou en remplaçant le verre de couverture.
- Préparer les six composants matériels clés pour l’assemblage et l’installation d’implants d’imagerie (Figure 1).
Figure 1: Six composants matériels clés pour l’assemblage et l’installation de l’implant d’imagerie. (A) Canule factice. (B) Canule guide. (C) Canule d’imagerie. (D) Verre de couverture en verre. (E) Plaque frontale. (F) Canule interne. Barre d’échelle: 5 mm. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
- Allumez la machine à souder et chauffez-la à la température requise.
REMARQUE: La température dépend de l’étain de soudage utilisé. - Polir la surface latérale de la canule d’imagerie à l’aide de papier de verre fin pour enlever la couche d’oxydation et ainsi faciliter une soudure plus forte.
- Ajuster la position de la canule d’imagerie et de la canule d’injection (canule de guidage avec canule factice insérée) à l’aide de mains secourables(Figure 2A,B).
- À l’aide d’une seringue munie d’une aiguille, appliquez une petite quantité de flux approprié sur le point de connexion entre l’imagerie et l’injection de canules pendant 5 secondes, puis retirez la gouttelette.
REMARQUE: Pour cette préparation, nous avons utilisé un flux disponible dans le commerce qui est spécifié par le fabricant pour être pour souder des pièces en acier inoxydable car les canules d’imagerie et d’infusion sont en acier inoxydable. Dans le cas d’autres matériaux utilisés pour fabriquer des canules, l’utilisateur final doit sélectionner le flux qui peut souder le matériau sélectionné. - Fondre l’étain de soudure et l’appliquer sur le point de connexion traité avec flux(Figure 2).
REMARQUE: Évitez l’excès d’étain de soudure, car il nécessitera une craniotomie plus importante inutile pendant la chirurgie.
Figure 2: Schéma d’assemblage de la canule d’injection, consistant en une canule de guidage avec canule factice insérée, avec la canule d’imagerie. (A) L’angle entre la canule d’injection et la canule d’imagerie doit être proche de 45 degrés. (B) La pointe de la canule d’injection doit être juste sur le bord de la canule d’imagerie. (C) Une taille appropriée de l’étain de soudage utilisé pour souder les canules d’imagerie et d’injection (la ligne rouge indique le contour de la gouttelette d’étain). (D)Taille inappropriée de l’étain de soudage qui doit être évitée lors de la préparation de l’implant (la ligne rouge indique le contour de la gouttelette d’étain). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
- Attendez que l’étain de soudure refroidisse. Habituellement, cela prend plusieurs secondes.
- Confirmer que la canule d’injection n’est pas bloquée en insérant la canule factice des deux côtés.
- Appliquez un adhésif optique à séchage UV sur la face inférieure de la canule d’imagerie à l’aide d’un cure-dent ou d’une aiguille de seringue de 26 G.
- Utilisez une pince à épiler fine pour placer soigneusement un verre de couverture de la taille correspondante à la canule d’imagerie.
REMARQUE: Le positionnement du verre doit être fait avec précision sur la canule d’imagerie sans trop déplacer le verre une fois qu’il a touché l’adhésif optique. Sinon, le verre se salit, réduisant ainsi la qualité de l’imagerie. - Durcir l’adhésif pendant au moins une heure par un éclairage UV de 350 à 400 nm à partir d’une lampe UV portable standard.
REMARQUE: L’adhésif utilisé doit être optiquement transparent. Sinon, cela diminuera la qualité de la fenêtre d’imagerie.
ATTENTION : Évitez l’exposition de la peau et des yeux en portant des lunettes anti-UV, des gants et un sarrau de laboratoire. - Lavez la canule à 70% d’éthanol, séchez à l’air et conservez-la dans un récipient stérile jusqu’à la chirurgie.
REMARQUE: Il est très important de garder le verre de couverture aussi propre et intact que possible. L’adhésif optique utilisé est chimiquement stable dans de l’éthanol à 70%.
2. Implantation de fenêtres
- Étapes de préparation avant la chirurgie
- Stérilisez tous les instruments chirurgicaux dans un autoclave.
- Préparez 1x PBS et 70% d’éthanol dans deux boîtes de Pétri distinctes.
- En option: Désinfectez la zone chirurgicale à l’aide de la lumière UV pendant au moins 20 minutes avant de commencer l’intervention chirurgicale.
REMARQUE: Fonctionner dans les conditions les plus stériles possibles se traduira par des fenêtres crâniennes couvertes de verre réussies et durables (jusqu’à 6 mois). La contamination peut entraîner une réduction de la transparence de la fenêtre ou une inflammation grave dans la plupart des cas.
- Intervention chirurgicale
- Stériliser la zone chirurgicale avec de l’éthanol à 70% juste avant la chirurgie.
- Peser l’animal et administrer une dose pré-chirurgicale d’analgésique par voie sous-cutanée selon le protocole animal approuvé par l’IACUC.
- Anesthésier une souris avec de l’isoflurane (4% pour l’induction, 1,5-2% pour le maintien, débit d’air de 0,3-0,5 L/min). Utilisez une technique de pincement de la queue et de pincement des pincements pour vous assurer que l’animal est complètement sous sédation. Observez les signes vitaux de l’animal, tels que la respiration, le SpO2et la fréquence cardiaque pendant toute la durée de la procédure.
- Utilisez une tondeuse ou une crème dépilatoire pour enlever la fourrure de l’arrière du cou jusqu’aux yeux.
- Placez la souris dans un cadre stéréotaxique sur un coussin chauffant chirurgical (en maintenant 37 °C). Fixez la tête avec des barres d’oreille. Poussez légèrement la tête dans toutes les directions pour vous assurer que la tête est fermement fixée.
- Appliquez une pommade pour les yeux pour empêcher les yeux de l’animal de se dessécher pendant la chirurgie.
- Stérilisez le site chirurgical avec de la bétadine suivie d’éthanol de 70% trois fois avant de faire une incision.
- Enlevez la peau sur le dessus du crâne, en commençant par une coupe horizontale tout le long de la base de la tête, suivie de deux coupes dans le sens rostral, atteignant presque les paupières, puis de deux coupes obliques qui convergent vers la ligne médiane.
- Avec deux cotons-tiges stériles, rétractez le tissu conjonctif, ainsi que la musculature de l’arrière du cou, sur les bords du crâne.
REMARQUE: Essayez d’éviter d’endommager les vaisseaux sanguins (en particulier ceux cachés dans le muscle) pendant la manipulation. - Appliquer une goutte de solution de lidocaïne (~0,1 mL) à la surface du périoste pendant 2 minutes pour éviter une douleur excessive. Éventuellement pour réduire le cerveau de l’enflure après avoir retiré le crâne, 0,1 mL de 1% de dexaméthasone peut être injecté par voie sous-cutanée.
- Grattez doucement toute la zone exposée du crâne avec un scalpel pour créer une surface sèche et rugueuse qui permet à la colle et au ciment dentaire de mieux adhérer et d’entraîner ainsi une implantation chronique.
- Placez la pointe de l’aiguille montée sur la station stéréotaxique sur le bregma, définissez les trois coordonnées (AP: Antérieur-Postérieur; ML: Médial-latéral; DV: Dorsal-Ventral) comme 0.
- Placez la pointe de l’aiguille sur l’expression lambda et voyez si la coordonnée AP est 0 pour confirmer que la position de la tête est verticale, ainsi que si la coordonnée ML est 0 pour confirmer que la tête est positionnée horizontalement. Si ce n’est pas le cas, ajustez les boutons correspondants sur la station stéréotaxique, jusqu’à ce que les coordonnées AP et ML soient toutes deux à moins de 0,1 mm.
- Déplacez le bout de l’aiguille pour trouver les points correspondants pour la craniotomie et marquer leurs positions sur le crâne à l’aide d’un marqueur fin. Dans le cas de l’implantation pour l’hippocampe, il y a 4 points avec les coordonnées suivantes (AP: -0,68, ML: -2,0) (AP: -3,68, ML: -2,0) (AP: -2,18, ML: -0,5) et (AP: -2,18, ML: -3,5)11, ainsi que (AP: -4,0, ML: -2,0) pour le point le plus caudal de la canule d’injection.
REMARQUE: Le marqueur utilisé dans cette étape doit être stérilisé à l’aide de l’éclairage UV pendant au moins une heure avant la chirurgie. Les coordonnées indiquées ici sont pour les souris C57BL/6J âgées de 6 à 8 semaines. Les coordonnées peuvent différer en raison de différents âges ou souches de souris. - Dessinez un cercle basé sur quatre points marqués, ainsi que sur le contour de la zone de canule d’injection sur le côté caudal du cercle (Figure 3).
- Utilisez une perceuse pneumatique à la vitesse de 10 000 tr / min pour « dessiner » doucement le long du contour marqué sur le crâne.
- Percez le crâne jusqu’à ce qu’il reste une très fine couche d’os, qui commence généralement à trembler sous un toucher doux au centre.
- Appliquez une goutte de PBS 1x stérile au centre de la craniotomie, soulevez le lambeau osseux du crâne avec des pinces à pointe très minces ou deux aiguilles de 26 G approchant des côtés opposés.
REMARQUE: Le PBS aidera à enlever le morceau de crâne et à prévenir un saignement possible de la dura12. - Appliquez du PBS, suivi d’une aspiration douce à travers une aiguille émoussée 26G plusieurs fois pour nettoyer la surface de la dura.
- Retirez doucement la dura, soit par aspiration, soit par ciseaux ophtalmiques. Appliquez une aspiration douce (~-60kPa) pour abréger le cortex, ainsi que le corps calleux au-dessus de l’hippocampe.
REMARQUE: Le cortex est souvent plus jaune que le corps calleux, et le corps calleux est généralement plus blanc que l’hippocampe. Le corps calleux est généralement facile à distinguer par des fibres neuronales allant dans les directions verticale et horizontale lorsqu’il est observé du haut (Figure 3).
Figure 3: Coordonnées stéréotaxiques de la localisation de l’hippocampe et du processus d’ablation cérébrale. (A) Quatre coordonnées pour les bords de la zone de craniotomie. (B) Zone complète de craniotomie. (C-E) Images représentatives acquises lors de la chirurgie (à gauche) et leur diagramme schématique (à droite) indiquant les différentes couleurs et directions des fibres neurales de(A)Cortex(B)Corpus Callosum, et(C)Hippocampe visible lors de l’ablation du cortex. Barre d’échelle: 1 mm. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
- Le saignement à ce stade affectera la visibilité du tissu cérébral dans la craniotomie. Appliquer 1x PBS, suivi d’une aspiration douce, tout en aspirant le cortex pour se débarrasser du sang.
REMARQUE: Les saignements continus sont inévitables au cours de cette étape et, dans une certaine mesure, les saignements continus sont un signe de pression artérielle normale. Contrairement à l’implantation de fenêtre d’imagerie du cortex, la présence de sang sous la fenêtre optique est acceptable puisqu’elle sera effacée plusieurs jours après la chirurgie. L’insertion de la canule d’imagerie dans la cavité créée dès que possible après avoir ablé le cortex est optimale. - Si la craniotomie est plus grande de <0,5 mm que la canule d’imagerie, sauvez l’installation de la canule dans une certaine mesure en utilisant un scellement Kwik Sil supplémentaire avant de fixer l’implant avec SuperBond.
- Si la craniotomie est plus petite de <0,5 mm que la canule d’imagerie, sauvez l’intervention chirurgicale dans une certaine mesure en coupant le bord de la craniotomie à l’aide d’une pince à épiler fine ou d’une paire de ciseaux ophtalmiques puisque l’os restant au bord de la craniotomie est plus mince que le crâne lui-même à la suite du forage.
NOTA: Les craniotomies qui dépassent les plages supérieures à 0,5 mm ne peuvent pas être sauvées. Les actions correspondantes dans ces cas devraient suivre la procédure de résiliation conformément au protocole animal.
- Insérez doucement l’implant dans la craniotomie.
- Appuyez fermement sur le dessus de l’implant avec l’aiguille en forme de L pour positionner la fenêtre optique de l’implant aussi près que possible de la surface exposée de l’hippocampe. Appliquez à plusieurs reprises du PBS sur le crâne autour de l’implant, suivi d’une aspiration pour enlever le sang autant que possible lors de l’insertion de l’implant. Appliquez ensuite une fine couche de Kwik Sil entre l’implant et le crâne pour empêcher le ciment dentaire de pénétrer sous le crâne(Figure 4).
- Assurez-vous que le placement de la fenêtre optique de l’implant est juste contre l’hippocampe pour éviter l’accumulation de sang ou d’autres liquides en dessous.
REMARQUE: Le point critique est de s’assurer que le verre de couverture de la canule d’imagerie est placé directement contre l’hippocampe, ce qui peut nécessiter une pression douce sur le dessus de la canule pendant le processus d’installation et d’étanchéité. Que la face supérieure de la canule d’imagerie soit parallèle au crâne n’est pas critique pour l’accès optique final tant que la fenêtre optique est placée contre l’hippocampe. - Selon l’épaisseur moyenne du cortex au-dessus de la zone CA1, maintenir la surface supérieure de la canule d’imagerie au-dessus de la surface du crâne d’environ 0,5 mm pour faciliter la fixation de la canule au crâne (Figure 4).
- Assurez-vous que le placement de la fenêtre optique de l’implant est juste contre l’hippocampe pour éviter l’accumulation de sang ou d’autres liquides en dessous.
- Une fois que le Kwik Sil est guéri, ce qui ne prend généralement pas plus de ~ 1 min, appliquez Super-Bond C &B uniformément sur la surface du crâne, la surface de Kwik-Sil et la surface supérieure de l’implant.
- Une fois que le Super-Bond C&B est durci, appliquez de la résine de base de prothèse au-dessus du Super-Bond C&B, ainsi que la peau autour de l’incision faite au début de la chirurgie.
REMARQUE: D’autres types de ciment sont disponibles auprès de plusieurs fournisseurs. Suivez les instructions du fabricant correspondant. - Une fois la résine de base de prothèse dentaire durcie, placez la plaque de tête sur la résine autour de l’implant et rendez-la concentrique avec la canule d’imagerie. Appliquez plus de résine de base de prothèse autour et au-dessus de la plaque de tête pour fixer sa position. Laissez-le guérir pendant plusieurs minutes.
- Évitez d’accumuler une épaisse couche de ciment autour de la canule pour assurer un meilleur accès à la fenêtre d’imagerie avec la lentille de l’objectif (Figure 4).
Figure 4: Schéma de schéma d’implantation de fenêtre en vue (A) coronale et (B) sagittale. a) Plaque frontale; b)Résine de base pour prothèses dentaires; c)Super-lien; d)Kwik-Sil; e)Canule d’imagerie; f)Canule d’injection; g) Étain à souder. (C): Souris avec l’implant installé après la chirurgie. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
- Diluer la résine de base de prothèse pour diminuer sa viscosité, lui permettant ainsi de remplir les mises en garde qui sont difficiles à atteindre avec un applicateur.
- Placez délicatement un ruban de caoutchouc isolé au-dessus de la fenêtre pour protéger la fenêtre d’une éventuelle contamination par la litière des animaux.
- Lorsque la chirurgie est terminée, injectez un médicament anti-inflammatoire par voie sous-cutanée pour prévenir une réponse inflammatoire.
- Placez l’animal dans une cage chaude jusqu’à ce qu’il se remette de l’anesthésie.
- Vérifiez l’état de santé de la souris pour 72 h après la chirurgie en observant le comportement général. Les anti-inflammatoires et les analgésiques sont injectés par voie sous-cutanée pendant deux à trois jours après la chirurgie toutes les 24 heures pour libérer la douleur et réduire la réponse inflammatoire.
REMARQUE: D’autres procédures de surveillance, médicaments et dosages sont possibles pour les soins postopératoires, reportez-vous au protocole animal approuvé par l’IUCAC pour la procédure exacte. - Vérifiez la fenêtre 5-7 jours après la chirurgie pour observer la vascularisation sous la fenêtre. Dans le cas d’une fenêtre claire, l’animal est prêt pour l’injection de virus.
3. Injection de virus
REMARQUE : On fait habituellement l’injection de virus dans les 5 à 7 jours suivant la chirurgie. Avant l’injection du virus, il faut confirmer que la fenêtre d’imagerie est claire et qu’il est possible d’observer la vascularisation cérébrale (Figure 5). Dans certains cas, il peut prendre jusqu’à 14-16 jours pour effacer la fenêtre, ce qui est également acceptable si aucune inflammation du cerveau n’est détectée.
Figure 5: Image représentative de la fenêtre optique (A) avant et (B) après injection de virus complétée par du colorant FastGreen. Arrow indique la même structure de vascularisation. Barre d’échelle: 1 mm. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
- Ajouter une solution mère de colorant vert rapide à la solution virale, diluée au titre souhaité, dans un rapport de 1:9 dans un tube PCR.
REMARQUE: Un colorant vert rapide est ajouté pour faciliter la visualisation de la solution virale pendant l’injection. - Connectez le tube en polyéthylène avec la seringue, puis remplissez le tube avec de l’huile minérale à l’aide d’une pompe à seringue.
- Connectez la canule interne à l’autre extrémité du tube, infuser et retirer l’huile minérale plusieurs fois pour vous assurer que la canule interne n’est pas bouchée.
- Anesthésier l’animal avec de l’isoflurane (4% pour l’induction, 1,5-2% pour le maintien, débit d’air de 0,3 à 0,5 L/min), fixer la tête dans un cadre stéréotaxique sur un coussin chauffant (en maintenant 37 °C), appliquer une pommade pour les yeux.
- Retirer 600 nL de la solution virale, retirer la canule factice et insérer la canule interne reliée à la seringue d’injection dans la canule guide, infuser le virus à la vitesse de 50 nL/min pendant 10 minutes au total.
REMARQUE : Vérifiez si le colorant est visible à travers la fenêtre à l’aide d’un stéréomicroscope pour confirmer le succès de l’injection du virus (Figure 5). - Après l’injection, gardez la canule interne connectée pendant 10 minutes pour permettre au virus de se propager sous la fenêtre.
- Retirez doucement la canule interne de la canule de guidage et récapitulez-la avec une canule factice.
- Placez l’animal dans une cage chaude jusqu’à ce qu’il se remette de l’anesthésie.
REMARQUE: En règle générale, les souris sont prêtes pour l’imagerie dans les 10-20 jours après l’injection virale. Le niveau et le temps d’expression dépendent du sérotype et du promoteur du virus utilisés pour stimuler l’expression des gènes.
4. Imagerie de souris éveillées au microscope à large champ.
REMARQUE: La plaque de tête préparée offre une stabilité extraordinaire de l’implant d’imagerie et permet ainsi une imagerie longitudinale chez les souris éveillées et se comportant avec des artefacts de mouvement minimaux.
- Induisez la souris avec 4% d’isoflurane pendant quelques minutes, fixez sa plaque de tête à la fourche de tête, puis fixez la fourche de tête sur le tapis roulant.
REMARQUE: La fourche de tête et le tapis roulant sont personnalisés pour la plaque de tête utilisée dans cette étude, veuillez consulter les documents à l’appui pour les fichiers CAO correspondants. L’induction de la souris avant la fixation de la tête est facultative car il est possible d’habituer l’animal pour cette procédure. - Déplacez le tapis roulant sous l’étage de microscope et placez la fenêtre optique sous la lentille de l’objectif.
- Utilisez une lentille d’objectif à faible grossissement pour trouver le meilleur champ de vision (FOV) pour l’imagerie fonctionnelle, puis passez à une lentille d’objectif NA plus élevée pour enregistrer les activités neuronales à une résolution unicellulaire.
REMARQUE: Si la canule d’injection est toujours un obstacle pour que la lentille de l’objectif atteigne sa distance de travail, utilisez une tondeuse à fil pour couper la canule d’injection de la plaque frontale.
Representative Results
Imagerie in vivo de l’activité neuronale à l’aide d’un indicateur de calcium génétiquement codé. En moyenne, l’imagerie in vivo commence 3-4 semaines après l’implantation si un niveau suffisant d’expression transgène est atteint. À ce moment-là, l’oedème cérébral et l’hémorragie sont habituellement complètement résolus, et la vascularisation de cerveau peut être facilement observée par la fenêtre optique. Ici nous avons utilisé la préparation décrite pour exécuter les enregistrements répétés de l’activité neuronale dans la région CA1 hippocampique dorsale chez les souris se comportant sous microscope à large champ de fluorescence. Pour enregistrer l’activité neuronale, nous avons utilisé un indicateur de calcium génétiquement codé brillant, nommé NCaMP713, qui présente une sensibilité au calcium et une résolution temporelle similaires à celles de GCaMP6s14. Pour exprimer l’indicateur NCaMP7 dans l’hippocampe, nous avons injecté le virus rAAV/DJ-CAG-NCaMP7 à l’aide d’une canule de perfusion et lancé l’imagerie de longitude à 14 jours après l’injection. Pour enregistrer l’activité neuronale, nous avons utilisé un objectif d’air NA 0.3 10x et une caméra sCMOS Hamamatsu OrcaFusion qui permettait l’imagerie à un champ de vision d’environ 1,5 x 1,5 mm à une fréquence allant jusqu’à 100 Hz. La fluorescence verte a été enthousiasmée par une LED de 470 nm disponible dans le commerce à l’aide d’un ensemble de filtres GFP standard. La profondeur moyenne de l’imagerie obtenue dans le canal vert est d’environ 50-120 μm, ce qui permet d’enregistrer l’activité neuronale principalement dans la strate oriens et la strate pyramidale. La profondeur d’imagerie dans les canaux proche infrarouge peut atteindre jusqu’à 200 μm pour atteindre les couches profondes de l’hippocampe8. Le temps d’enregistrement moyen par champ de vision était de 6 à 12 minutes, bien que des séances d’imagerie beaucoup plus longues soient possibles, car le NCaMP7 se caractérise par une photostabilité extrêmement élevée et aucune phototoxicité détectable n’a été observée (Figure 6).
Figure 6: Enregistrement de l’activité neuronale dans les neurones de l’hippocampe à l’aide d’un indicateur de calcium génétiquement codé par fluorescence verte. (A)Un champ de vision sélectionné scopique sous un microscope à fluorescence à large champ dans un canal vert. (B) Les 15 ER correspondant aux neurones simples représentés en A et sélectionnés à l’aide de la projection d’écart type de l’ensemble de l’enregistrement. (C) Traces représentatives d’essai unique de fluorescence des 15 neurones sélectionnés dans B. (D) Une vue zoom avant représentative de 2 traces de calcium montrées dans les boîtes de couleur correspondantes montrées dans la barre d’échelle C. 100 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Pour obtenir des traces de fluorescence, les régions d’intérêt (ROIs) correspondant aux somas neuronaux ont été segmentées manuellement et analysées par le logiciel ImageJ. Avant la correction du mouvement de l’analyse d’image, les procédures courantes de post-enregistrement chez les animaux éveillés n’étaient pas nécessaires, car les ensembles de données acquis ne présentaient pas d’artefacts de mouvement en raison de la grande stabilité de l’implant d’imagerie. Un enregistrement optique représentatif à essai unique des activités neuronales de l’hippocampe chez une souris au comportement éveillé est présenté à la figure 6. 15 ROIs correspondant à des somas neuronaux ont été sélectionnés manuellement à partir du même FOV représenté à la figure 6B,et les traces de fluorescence à essai unique au sein de chaque ROI sont représentées à la figure 6C. La figure 6D montre deux parties représentatives de traces de fluorescence provenant de deux ROIs différents. Nous avons exécuté 4 sessions consécutives de formation image pour le même FOV avec des intervalles de 3 jours. Il a été possible d’identifier et d’imager les mêmes neurones dans certains FOVs pendant au moins deux semaines (les séances d’imagerie plus longues n’ont pas été effectuées pour cette étude, cependant, la même préparation a été utilisée pour une étude d’imagerie jusqu’à 6 mois chez des souris précédemment7; Figure 7). Dans cette étude, nous avons utilisé le vecteur AAV/DJ-CAG, qui conduisait une forte expression du gène d’intérêt même 21 jours après l’administration du virus(Figure supplémentaire 1). L’expression continue a compliqué l’identification à long terme des mêmes neurones en raison de l’augmentation du fond de fluorescence et de l’apparition de nouveaux neurones exprimant l’indicateur de calcium. Par conséquent, la sélection du sérotype et du promoteur de l’AAV pour stimuler l’expression des gènes cibles devrait être l’une des considérations importantes au cours de la conception expérimentale, en particulier si l’imagerie longitudinale du même sous-ensemble de neurones est nécessaire. La qualité de l’imagerie a permis de résoudre les dendrites proximales ainsi que de visualiser les vaisseaux sanguins.
Figure 7: Séquence d’images de quatre FOVs différents de la région de l’hippocampe suivis sur 12 jours. L’animal a été implanté avec la fenêtre le jour 0 et a été injecté avec le virus rAAV/DJ-CAG-NCaMP7 le jour 7. Les pointes de flèche indiquent le neurone suivi dans le FOV. Barres d’échelle: 80 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Imagerie in vivo de l’activité neuronale à l’aide d’un capteur de tension génétiquement codé.
Dans cette étude, nous avons également utilisé un nouveau capteur de tension génétiquement codé, nommé SomArchon7, qui permet l’imagerie de tension avec une résolution monocellulaire à pointes uniques chez les animaux se comportant7,8. Pour exprimer SomArchon, nous avons injecté le virus rAAV/DJ-CAG-SomArchon à l’aide d’une canule de perfusion et effectué une imagerie de tension chez une souris au comportement fixe de la tête plusieurs jours après l’injection. Pour enregistrer l’activité neuronale, nous avons utilisé un objectif 40x NA 0.8 objectif et une caméra Hamamatsu OrcaFusion sCMOS qui nous a permis d’imager 150x40 μm FOV à un taux d’acquisition allant jusqu’à 830 Hz. La protéine GFP, qu’une partie de SomArchon construit pour faciliter la visualisation de l’expression dans la plage visible du spectre, peut être facilement iimage dans le canal vert (excitation LED à 470/20 nm, émission 525/50 nm) pour localiser les cellules d’intérêt pour l’imagerie de tension. Des enregistrements de tension optique ont été réalisés dans le canal proche infrarouge (excitation laser 637 nm à 3,4 W/mm2,émission 665 nm de passe longue) avec 4 x 4 binning à 830 Hz taux d’acquisition. Nous avons enregistré l’activité spontanée d’un neurone de l’hippocampe chez une souris éveillée avec un SNR moyen de 7 par potentiel d’action (Figure 8).
Figure 8: Enregistrement de l’activité neuronale dans les neurones de l’hippocampe à l’aide d’un indicateur de tension génétiquement codé par fluorescence proche infrarouge SomArchon. (A) Un champ de vision choisi scopique sous microscope à fluorescence à large champ dans le canal proche infrarouge. (B) Trace de fluorescence à essai unique du neurone dans A.(C) Une vue zoom avant représentative de la trace de tension dans la boîte correspondante montrée dans B. Barre d’échelle: 25 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
histologie
Une fois l’étude d’imagerie fonctionnelle effectuée, l’analyse post mortem est utilisée pour confirmer le placement correct de l’implant, la zone d’expression du virus et la localisation d’une protéine d’intérêt dans les neurones ginés. Pour la vérification histologique de l’expression du virus et la mise en place de l’implant, des sections coronales du cerveau fixe PFA ont été examinées sous un microscope à large champ à fluorescence(figure 9A, C). Un microscope confocal a été utilisé pour acquérir des images haute résolution de neurones individuels exprimant l’indicateur de calcium, ainsi que l’indicateur de tension(Figure 9B,D). La souillure de DAPI a été employée pour visualiser la morphologie globale de la tranche de cerveau. En outre, les tranches de cerveau peuvent être évaluées utilisant l’immunohistochemistry pour vérifier l’astrogliosis ou le gliosis provoqué par l’implantation de fenêtre et l’expression virale. Nos études précédentes ont démontré que le procédé n’a pas induit la gliosenotable 7.
Figure 9: Vérification histologique de la position de la fenêtre optique et de l’expression du virus. (A) Image fluorescente représentative de la tranche cérébrale de la section coronale montrant le placement de la fenêtre optique à partir d’une souris exprimant le NCaMP. Barre d’échelle: 1 mm. (B) Image confocale représentative des neurones exprimant les indicateurs NCaMP7. Barre d’échelle: 25 μm. (C) Image de fluorescence représentative de la tranche cérébrale de la section coronale montrant le placement de la fenêtre optique à partir d’une souris exprimant SomArchon. Barre d’échelle: 1 mm. (D) Image confocale représentative des neurones exprimant les indicateurs SomArchon. Barre d’échelle: 25 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure supplémentaire 1: Analyse quantitative de l’intensité relative de la fluorescence avec le temps d’expression. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
Discussion
Ici nous décrivons une méthode pour la formation image à long terme de la région CA1 de l’hippocampe chez les souris se comportant. La méthode est basée sur l’implantation chronique d’une fenêtre d’imagerie sur mesure, qui permet également l’administration ciblée de virus ou de médicaments directement aux neurones d’intérêt. Le présent protocole se compose de quatre parties principales : i) assemblage de l’implant d’imagerie ; ii) l’installation d’un implant d’imagerie; iii) injection de virus par implant d’imagerie; iv) imagerie fonctionnelle chez les souris qui se comportent. Ci-dessous, nous décrivons et discutons des étapes critiques du protocole, du dépannage, des modifications et des limitations de la méthode. Nous discutons également l’importance de la méthode et de ses applications alternatives potentielles.
Il y a plusieurs étapes critiques dans le protocole décrit qui sont assez importantes pour la chirurgie réussie : (i) préparation d’un implant d’imagerie de haute qualité ; ii) affections chirurgicales stériles; (iii) aspiration du cortex ; iv) la mise en place précise de l’implant d’imagerie; v) injection virale. Comme l’indique l’étape 1.6, l’excès d’étain de soudure nécessiterait une plus grande craniotomie et augmente ainsi le risque d’inflammation. Il est également très important d’utiliser une quantité appropriée de colle optique adhésive lors de la fixation du verre de couverture à la canule d’imagerie, comme indiqué à l’étape 1.11, car une quantité insuffisante peut entraîner une fuite de liquide céphalorachidien dans la canule d’imagerie et la rendre opaque. D’autre part, l’excès d’adhésif optique peut entraîner une diminution de la transparence de la fenêtre en verre. La contamination possible de l’implant d’imagerie peut provoquer une prolifération active du tissu conjonctif sous la fenêtre optique et/ou une inflammation sévère, ce qui entraînera l’arrêt précoce de l’expérience. Par conséquent, l’assemblage et la préparation de l’implant d’imagerie avant la chirurgie sont presque aussi importants que l’intervention chirurgicale elle-même.
Pendant la chirurgie, la partie du cortex sous craniotomie est ablée par aspiration douce, ce qui entraîne des saignements inévitables. Le sang sur le site chirurgical réduit considérablement la visibilité du tissu cérébral qui doit être enlevé. Ceci complique l’évaluation précise de la profondeur requise de l’ablation de tissu. Le rinçage soigneux du site chirurgical avec pbs à chaque fois avant d’appliquer l’aspiration pour enlever la partie suivante du tissu fournit un meilleur contrôle de la profondeur. Le tissu cérébral doit toujours être enlevé en petites portions étape par étape confirmant la profondeur du tissu enlevé avant de procéder à plus d’aspiration. Un contrôle plus fin de l’aspiration peut également être obtenu avec une aiguille émoussée plus fine. Nous suggérons d’utiliser une aiguille de 26 G, cependant, plus petit que 26 G de diamètre est plus enclin au colmatage. En outre, il faut généralement beaucoup de pratique pour déterminer la profondeur précise d’aspiration requise pour chaque animal, car la couleur du cortex, du corps calleux et de l’hippocampe peut varier d’une souris à l’autre(Figure 3).
L’insertion et la fixation de l’implant d’imagerie doivent être effectuées très précisément pour assurer la position la plus proche possible de la fenêtre d’imagerie de la surface dorsale de l’hippocampe. La taille de la craniotomie préparée doit correspondre étroitement à l’implant et permettre son insertion sans résistance significative. En même temps, il ne devrait pas y avoir d’espace visible entre le crâne et l’implant pour assurer une étanchéité appropriée et éviter l’exposition des tissus cérébraux. Une pression douce et stable doit être appliquée sur le haut de l’implant pendant son étanchéité au crâne. Il est presque inévitable d’avoir du sang sous la fenêtre d’imagerie pendant l’installation de l’implant. Si l’intervention chirurgicale est effectuée correctement, la fenêtre devrait s’effacer dans 3-7 jours et la vascularisation du cerveau devient clairement visible. Il est également important de s’assurer que le virus est correctement injecté sous la fenêtre. En cas d’échec de l’expression, le virus peut être réinjecté plusieurs fois.
La complication principale que nous avons rencontrée dans certains cas est visibilité réduite de la fenêtre de formation image. Il y a plusieurs raisons possibles pour la mauvaise qualité d’imagerie : i) inflammation continue ; ii) excroissance du tissu conjonctif sur le verre; iii) grand écart entre la fenêtre et l’hippocampe. L’inflammation est habituellement causée par la contamination pendant la chirurgie ou par l’implant d’imagerie mal stérilisé. Nous proposons d’autoclaver les instruments chirurgicaux avant et après chaque chirurgie, de désinfecter le secteur de chirurgie juste avant le procédé, et de porter l’équipement de protection individuelle propre pendant la chirurgie. Les implants d’imagerie doivent être nettoyés après assemblage, stérilisés et stockés dans des conditions stériles. L’excroissance du tissu conjonctif sur le verre de l’implant d’imagerie peut être due à une contamination mécanique à la surface du verre ou à un traumatisme excessif du tissu cérébral lors de l’ablation du cortex. Après l’assemblage de l’implant, il est important de confirmer que la surface du verre est propre et lisse. En outre, tous les morceaux de tissu cérébral endommagé doivent être soigneusement enlevés avant d’insérer l’implant d’imagerie dans la craniotomie. Dans certains cas, l’espace entre la fenêtre vitrée et l’hippocampe entraîne l’accumulation de liquide céphalorachidien, ce qui réduit la qualité de l’imagerie. Par conséquent, lors de l’installation de l’implant, il est crucial de l’insérer tout le chemin pour assurer un bon contact entre l’hippocampe et la fenêtre en verre. Parfois, il est difficile d’identifier la raison exacte de la fenêtre d’imagerie opaque. Nous suggérons d’effectuer une analyse post mortem pour révéler les conditions sous la fenêtre optique et ajuster en conséquence les chirurgies suivantes.
La méthode présente plusieurs limites fondamentales et techniques qui doivent être prises en compte avant et pendant l’imagerie in vivo. L’une des principales limitations est l’ablation du cortex. Une partie du cortex visuel et sensoriel est enlevée pendant la chirurgie. Bien qu’il soit difficile d’évaluer avec précision l’impact de l’ablation du cortex, car le tissu cérébral enlevé ne se projette pas directement sur l’hippocampe, plusieurs études n’ont démontré aucune altération notable de l’apprentissage dépendant de l’hippocampe ou d’autres fonctions pertinentes de l’hippocampe15,16. Les limites optiques doivent également être prises en compte, en particulier lorsque des lentilles à objectif à NA élevé sont utilisées. Par exemple, dans cette étude, nous avons utilisé une canule de 1,75 mm de long avec un diamètre intérieur de 1,9 mm. La géométrie de cette canule ne préservera pas le NA complet de l’objectif d’air avec NA plus de ~ 0,5 ou l’objectif d’eau avec NA plus de ~ 0,6 car il coupera une partie de la lumière. Une autre limitation, commune à tous les implants d’imagerie cérébrale, est qu’une partie du cerveau est exposée, favorisant ainsi la perte de chaleur17,18. Cependant, la température physiologique du cerveau peut être facilement restaurée lors de l’imagerie par perfusion d’un tampon chaud.
La méthode décrite peut être facilement modifiée ou ajustée pour d’autres applications. Par exemple, la préparation peut être adaptée pour l’imagerie du striatum7. Comme le striatum est légèrement plus profond que l’hippocampe, la canule d’imagerie plus longue doit être utilisée pour assembler l’implant d’imagerie. Nous proposons d’utiliser la canule de formation image de 2.0 millimètres. Les coordonnées de la craniotomie doivent être ajustées en conséquence (AP : +0,8 mm, ML : −1,8 mm). De plus, l’injection de virus via une canule de perfusion permet d’obtenir l’expression d’un transgène dans une fine couche de neurones lors de l’utilisation du sérotype AAV à propagation restreinte19,20. Il est particulièrement bénéfique pour l’imagerie à un photon en raison de la réduction de la fluorescence hors focalisation à partir de couches plus profondes et, par conséquent, de l’amélioration de l’imagerie à résolution monocellulaire. En outre, la canule d’injection peut également être utilisée lors de l’imagerie fonctionnelle pour l’administration de médicaments ou d’autres produits chimiques directement sur les neurones dans FOV (Figure 5B). La canule de perfusion globale ajoute des fonctionnalités utiles à l’implant d’imagerie, améliorant la qualité de l’imagerie en raison de l’expression virale ciblée et permettant la stimulation pharmacologique des neurones dans FOV. La plaque de tête utilisée offre une stabilité extraordinaire de l’implant d’imagerie minimisant les artefacts de mouvement, même chez les animaux en mouvement actif sur un tapis roulant. La plaque de tête est petite et légère, causant un minimum d’inconfort aux animaux et reste stable pendant plusieurs mois après l’installation. L’implant d’imagerie est également compatible avec l’imagerie multiphotonique15,16,21 et peut être associé à des micro-endoscopes22,23. Un implant d’imagerie similaire a également été utilisé pour l’imagerie multiphotonique des structures plus profondes de l’hippocampe, y compris la couche rayonnée, la strate lacunose et le gyrus denté16,24,25,26,27. Cependant, le ciblage des structures plus profondes de l’hippocampe avec des AAV via une canule de perfusion peut nécessiter une optimisation supplémentaire du sérotype et du volume19de l’AAV.
Nous croyons que le protocole décrit facilitera des études qui visent à étudier l’activité neuronale avec la résolution spatio-temporelle élevée dans l’hippocampe des souris se comportant utilisant des configurations simples et abordables d’imagerie d’un-photon.
Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Nous tenons à remercier tous les membres du Groupe de bioingénierie moléculaire de l’Université Westlake pour toute l’aide et la discussion utile. Nous remercions également Jinze Li et Jie-Min Jia de l’Université Westlake pour l’aide qu’ils ont aidée à filmer l’intervention chirurgicale.
Ce travail a été soutenu par un financement de démarrage de la Fondation de l’Université Westlake, de la subvention BBRF 2020 pour les jeunes chercheurs et de la subvention de la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine 32050410298 tous à K.D.P.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cover glass | Deckgläser | 72296-03 | |
| Denture Base Resin | ShangHai New Centery Dentel Material | N/A | Type I, self-solidifying |
| Dummy Cannula | RWD Life Science Co.,LTD | 62102 | OD 0.30mm |
| Guide Cannula | RWD Life Science Co.,LTD | 62003 | 26G |
| Head Fork | N/A | N/A | Custom made |
| Head Plate | N/A | N/A | Custom made |
| Imaging Cannula | N/A | N/A | Custom Made; OD 3mm, ID 2.7mm, Height 1.8mm, #108 stainless steel |
| Internal Cannula | RWD Life Science Co.,LTD | 62203 | 0.30*0.14 (OD*ID, mm) |
| Kwik Sil | World Precision Instruments | KWIK-SIL | |
| SuperBond C&B | SUN MEDICAL | N/A | SuperBond C&B kit |
| Treadmill Kit | N/A | N/A | Custom made |
| UV-cured Adhesive | NORLAND PRODUCTS | NOA 60 |
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