Summary
여기에서 우리는 성숙한 인간 망막 오가노이드를 생성하고 이를 광수용체 독성 분석에 활용하여 연령 관련 망막 퇴행성 질환 황반 모세혈관확장증 2형(MacTel)에 대한 제약 후보를 식별하는 단계별 프로토콜을 제시합니다.
Abstract
오가노이드는 세포 배양의 다양성과 처리량을 통해 인간 조직의 맥락에서 직접 질병 메커니즘 및 치료법을 연구할 수 있는 유망한 플랫폼을 제공합니다. 성숙한 인간 망막 오가노이드는 노화 관련 망막 퇴행성 질환 황반 모세혈관확장증 2형(MacTel)에 대한 잠재적인 약물 치료법을 스크리닝하는 데 사용됩니다.
우리는 최근에 MacTel이 비정형 지질 종인 deoxysphingolipids (deoxySLs)의 상승 된 수준으로 인해 발생할 수 있음을 보여주었습니다. 이러한 지질은 망막에 독성이 있으며 MacTel 환자에서 발생하는 광수용체 손실을 유발할 수 있습니다. deoxySL 광수용체 독성을 예방하는 능력에 대해 약물을 스크리닝하기 위해 비-MacTel 유도 만능 줄기 세포(iPSC) 계통에서 인간 망막 오가노이드를 생성하고 기능적으로 성숙한 광수용체를 포함하여 망막의 모든 신경 계통 유래 세포를 발달시키는 유사분열 후 연령으로 성숙시켰습니다. 망막 오가노이드를 deoxySL 대사산물로 처리하고 면역조직화학을 사용하여 광수용체층 내에서 세포자멸사를 측정했습니다. 이 독성 모델을 사용하여 deoxySL 유도 광수용체 사멸을 방지하는 약리학적 화합물을 스크리닝했습니다. 표적 후보 접근법을 사용하여 고콜레스테롤 및 중성지방 치료를 위해 일반적으로 처방되는 약물인 페노피브레이트가 망막 세포에서 deoxySL 독성을 예방할 수 있음을 확인했습니다.
독성 스크리닝은 광수용체 사멸을 예방할 수 있는 FDA 승인 약물을 성공적으로 식별했습니다. 이것은 테스트된 질병 관련성이 높은 모델로 인해 직접 실행 가능한 결과입니다. 이 플랫폼은 망막 질환의 향후 치료 발견을 위해 여러 대사 스트레스 요인과 잠재적인 약리학적 개입을 테스트하도록 쉽게 수정할 수 있습니다.
Introduction
세포 배양 및 동물 모델에서 인간 질병을 모델링하는 것은 약리학적 치료제의 발견, 변형 및 검증을 위한 귀중한 도구를 제공하여 후보 약물에서 승인된 치료법으로 발전할 수 있도록 합니다. in vitro 및 non-human in vivo 모델의 조합은 오랫동안 약물 개발 파이프라인의 중요한 구성 요소였지만 신약 후보의 임상 성능을 예측하지 못하는 경우가 많습니다1. 단순한 인간 세포 단일 배양과 임상 시험 사이의 격차를 해소하는 기술 개발이 분명히 필요합니다. 자가 조직화된 3차원 조직 배양인 오가노이드의 최근 기술 발전으로 모델링한 조직에 대한 충실도가 향상되어 전임상 약물 개발 파이프라인에서 유망한 도구가 되었습니다2.
비인간 생체 모델에 비해 인간 세포 배양의 주요 이점은 인간 대사의 특정 복잡성을 복제할 수 있다는 것인데, 이는 인간과 생쥐와 같은 고차원 척추동물 사이에서도 상당히 다를 수 있다3. 그러나 이러한 특이성은 조직 복잡성의 손실로 인해 가려질 수 있습니다. 망막 조직의 경우 여러 세포 유형이 복잡하게 얽혀 있고 단일 배양에서 복제할 수 없는 세포 아형 간에 독특한 공생 대사 상호작용이 있습니다4. 세포 배양의 접근성과 확장성을 갖춘 복잡한 인간 조직의 복제물을 제공하는 인간 오가노이드는 이러한 질병 모델링 플랫폼의 결함을 극복할 수 있는 잠재력을 가지고 있습니다.
줄기세포에서 유래한 망막 오가노이드는 인간 신경 망막의 복잡한 조직을 모델링하는 데 특히 충실한 것으로 입증되었다5. 이로 인해 망막 오가노이드 모델은 망막 질환의 연구 및 치료를 위한 유망한 기술이 되었습니다 6,7. 지금까지 망막 오가노이드의 질병 모델링의 대부분은 망막 오가노이드가 질병을 유발하는 유전적 변이를 가진 iPSC 계통에서 파생되는 단일 유전자 망막 질환에 초점을 맞추었습니다7. 이들은 일반적으로 발달 표현형으로 나타나는 침투성이 높은 돌연변이입니다. 유전적 돌연변이와 환경적 스트레스 요인이 정상적으로 발달한 조직에 영향을 미치는 노화 질환에 대한 효과적인 연구는 거의 이루어지지 않았습니다. 노화의 신경퇴행성 질환은 복잡한 유전적 유전과 단기 세포 배양을 사용하여 모델링하기 본질적으로 어려운 환경적 스트레스 요인의 기여를 가질 수 있습니다. 그러나 많은 경우 이러한 복잡한 질병이 일반적인 세포 또는 대사 스트레스 요인에 영향을 미칠 수 있으며, 완전히 발달된 인체 조직에서 검사할 경우 노화로 인한 신경퇴행성 질환에 대한 강력한 통찰력을 제공할 수 있다8.
후기 발병 황반 퇴행성 질환인 황반 모세혈관확장증 II형(MacTel)은 일반적인 대사 결함에 합쳐지는 유전적으로 복잡한 신경퇴행성 질환의 좋은 예입니다. MacTel은 황반의 광수용체 및 뮐러 신경교 손실을 초래하여 중심 시력의 점진적인 상실을 초래하는 흔하지 않은 노화의 망막 퇴행성 질환입니다 9,10,11,12,13. MacTel에서 미확인, 아마도 다인성 유전은 환자의 순환 세린의 일반적인 감소를 유도하여 deoxysphingolipids(deoxySL)14,15라고 하는 신경독성 지질 종의 증가를 초래합니다. deoxySL의 축적이 망막에 독성이 있음을 증명하고 잠재적인 제약 치료제를 검증하기 위해, 본 발명자들은 인간 망막 오가노이드의 광수용체 독성을 분석하기 위해 이 프로토콜을 개발했다14.
여기에서는 인간 망막 오가노이드를 구별하고, 오가노이드를 사용하여 독성 및 구조 분석을 설정하고, 결과를 정량화하기 위한 특정 프로토콜을 간략하게 설명합니다. 우리는 의심되는 질병 유발 물질인 deoxySL의 조직 특이적 독성을 결정하고 deoxySL 유발 망막 독성의 잠재적 치료를 위해 안전한 제네릭 약물인 페노피브레이트의 사용을 검증하는 성공적인 예를 제공합니다. 이전 연구에서는 페노피브레이트가 환자에서 deoxySL의 분해를 증가시키고 순환 deoxySL을 낮출 수 있음을 보여주었지만, deoxySL 유도 망막 독성을 감소시키는 효능은 테스트되지 않았습니다16,17. 구체적인 예를 제시하지만 이 프로토콜은 망막 조직에 대한 여러 대사/환경 스트레스 요인 및 잠재적인 치료 약물의 효과를 평가하는 데 사용할 수 있습니다.
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Protocol
1. iPSC/ESC의 해동, 패시징 및 확장
참고: 모든 세포 배양 단계에서 모범 사례를 사용하여 멸균 세포 배양을 유지하십시오.
- 6웰 세포 배양 플레이트를 기저막 매트릭스 배지로 코팅합니다.
- 이 배지의 1x를 준비하려면 제품 사양을 따르거나 75μL 저온 매트릭스 배지를 9mL의 DMEM/F12로 희석하십시오. 6웰 플레이트에 웰당 1.5mL의 새로 준비한 1x 배지를 추가합니다. 37°C에서 30분 동안 배양합니다.
- 기저막 매트릭스 배지를 흡인하고 각 웰을 3mL의 DMEM/F12로 헹굽니다. DMEM/F12 2mL를 넣고 사용할 때까지 37°C에서 배양합니다. 접시가 준비된 날에 사용하십시오.
- PBS 중의 10 mM 락 억제제 (Y-27632 dihydrochloride) 원액을 준비하고, 사용 전까지 -20 °C에서 보관한다.
- iPSC/ESC 바이알을 DMEM/F12 배지에 해동하고 400 x g 에서 5분 동안 원심분리합니다. 상청액을 흡인하고 펠릿을 mTeSR 배지에 재현탁합니다. 플레이트 1 바이알을 10 μM의 암석 억제제 (Y-27632 디히드로클로라이드)와 함께 mTeSR 배지 중의 코팅된 6-웰 웰 상에 올리고, 인큐베이터에서 밤새 인큐베이션한다. 다음날 미디어를 흡인하고 mTeSR만 다시 추가합니다.
알림: 통과할 때까지 매일 미디어를 교체하십시오. - 500mL의 PBS에 0.5M EDTA 500μL를 희석하여 PBS 중 0.5mM EDTA를 준비합니다.
- 계대 세포가 80-90 % 밀도에 도달 할 때. 세포의 성장 속도에 따라 웰당 세포를 1:3 또는 1:6으로 분할합니다.
- 플레이트에서 부착된 세포를 제거하기 위해 배지를 흡인하고 실온에서 5분 동안 PBS에서 0.5mM EDTA와 함께 배양합니다. 배양 후 EDTA 용액을 제거하고 p1000 피펫으로 세포에 mTeSR 배지 1mL를 강제로 분사하여 세포를 들어 올립니다.
- mTeSR 배지와 셀을 최대 5배까지 계속 빨아들이고 강제로 배출하여 부착된 나머지 셀을 제거합니다. mTeSR 배지를 사용하여 신선한 기저막 매트릭스 코팅된 6웰 플레이트에 세포를 플레이트합니다. 플레이트가 다시 80-100% 밀도에 도달할 때까지 매일 미디어를 계속 교체하십시오.
- 세포가 전체 6웰 플레이트로 확장되고 80-100% 밀도에 도달하면 후속 분화를 위해 세포주를 확장하거나 냉동 보존을 위해 동결하기 위해 하나의 웰을 따로 보관하십시오. 나머지 5개의 웰을 사용하여 배아체를 만들어 분화 과정을 시작합니다.
2. 배아체(EB) 만들기
참고: EB 형성 및 분화 배지 레시피는 Cowan et al.5, Ohlemacher et al.18 및 Zhong et al.19의 프로토콜에서 파생됩니다.
- 아래에 설명된 대로 1x Dispase 용액과 NIM(Neural Induction Media)을 준비합니다.
- 분말을 DMEM/F12에 용해시켜 Dispase의 5x 원액 10mg/mL를 준비합니다. 0.22 μm 필터를 이용한 멸균 필터. 사용할 때까지 1mL 분취량을 -20°C에서 보관하십시오.
- 5x Dispase 용액을 사용하여 DMEM/F12에서 2mg/mL Dispase의 1mL/웰을 준비합니다. 용액을 37°C에서 30분 동안 예열합니다.
- DMEM/F12에 1% N2 보충제, 1% MEM NEAA 및 2mg/mL 헤파린(180U/mg)을 보충하여 NIM을 준비합니다. NIM은 4°C에서 최대 1개월 동안 보관할 수 있습니다.
- mTeSR:NIM(12mL:4mL) 용액의 3:1 혼합 용액 16mL를 준비하고 실온으로 데웁니다.
- 분화 된 세포를 제거하고 따뜻한 Dispase 용액을 첨가하십시오.
- iPSCs/ESCs 세포 배양물에서 분화 세포를 제거합니다. 해부 범위 아래에서 p10 피펫 팁으로 불투명한 흰색 집락을 긁어냅니다. 배양 웰에서 mTeSR 배지를 흡인합니다. 이렇게 하면 방금 긁어낸 차별화된 덩어리가 제거됩니다.
- 미리 데워진 Dispase 용액을 즉시 추가하고 세포 콜로니의 가장자리 대부분이 현미경으로 말리기 시작할 때까지 37°C에서 배양합니다. 4-8분 정도 소요됩니다.
참고: Dispase의 세포 배양 시간은 각 실험실에 대해 결정되어야 합니다. 기간은 세포주마다 다를 수 있으며 3일 이상 도말한 세포의 경우 더 긴 배양이 필요합니다. 합류도에 도달하는 데 3일 이상 걸리는 느리게 성장하는 iPSC/ESC는 플레이트에 더 큰 강도로 부착되기 시작하여 세포를 들어 올리기 어렵게 만듭니다. 느리게 성장하는 세포의 경우, 세포를 1:2로 계대배양하여 전체 6웰 플레이트로 확장하여 도금에서 합류까지의 시간을 단축할 수 있습니다.
- 용액을 흡인하고 웰당 최소 2mL의 DMEM/F12 배지를 부드럽게 다시 추가합니다. DMEM/F12 배지를 웰 측면에 천천히 추가하고 세포가 빠지지 않도록 주의합니다.
- DMEM/F12 배지를 흡인한 다음 신선한 DMEM/F12 1mL를 세포에 직접 다시 추가하여 플레이트에서 세포 콜로니를 들어 올립니다. p1000 피펫을 사용하여 웰에서 DMEM/F12를 최대 5배까지 반복적으로 흡입하고 강제로 배출하여 가능한 한 많은 세포 콜로니를 제거합니다.
알림: 차별화/차별화된 iPSC/ESC는 미분화된 iPSC/ESC보다 플레이트에 더 많이 달라붙습니다. 반복적인 피펫팅으로 벗겨지지 않는 세포는 남겨두는 것이 가장 좋습니다. 과도한 피펫팅은 세포를 죽이고 EB 생산의 효율성을 감소시킵니다. 세포 덩어리는 덩어리당 100-400개의 세포를 갖습니다.
- DMEM/F12 배지를 흡인한 다음 신선한 DMEM/F12 1mL를 세포에 직접 다시 추가하여 플레이트에서 세포 콜로니를 들어 올립니다. p1000 피펫을 사용하여 웰에서 DMEM/F12를 최대 5배까지 반복적으로 흡입하고 강제로 배출하여 가능한 한 많은 세포 콜로니를 제거합니다.
- 부유 콜로니를 15mL 코니컬 튜브로 옮기고 웰당 추가 1mL DMEM/F12 배지로 웰을 헹구어 남아 있는 부유 콜로니를 수집합니다.
- 떠 다니는 식민지가 중력에 의해 5 분 이상 정착하지 않도록하십시오. 침전되면 1-2mL 상층액을 제외한 모든 상청액을 제거합니다. 바닥의 부드러운 펠릿이 흔들리지 않도록 주의하십시오.
- 예열된 3:1 mTeSR:NIM 배지에 펠릿을 재현탁하고 초저부착 T75 플라스크로 옮깁니다. EB가 형성될 수 있도록 하룻밤 동안 배양합니다. 이것은 차별화의 0일차로 간주됩니다.
- 점차적으로 미디어를 NIM으로 변경하여 EB를 신경 전구체로 분화하기 시작합니다.
- 다음 날 배지를 제거하고 10mL의 1:1 mTeSR:NIM 배지로 교체합니다. 자유 부동 EB 배양에서 미디어를 제거하려면 EB가 플라스크의 하단 모서리에 모이도록 플라스크를 위로 기울입니다. 상층액을 흡인하고 바닥에 있는 펠릿의 EB를 흡인하지 않도록 합니다.
- 다음 날 배지를 10mL의 1:3 mTeSR:NIM 배지로 교체합니다.
- 다음 날, 매체를 전체 NIM 매체로 교체하십시오. Dispase 치료 후 7일까지 NIM 배지로 2일마다 배지를 계속 교체합니다.
3. EB 도금 및 신경 망막 분화 시작
- Dispase 처리 1주일 후, 성장 인자 감소 기저막 매트릭스 배지로 코팅된 6웰 플레이트에 자유 부동 EB를 플레이트했습니다. 플레이트를 코팅하려면 1.1단계를 참조하십시오.
- EB에서 사용한 배지를 흡인하고 12mL의 NIM으로 교체합니다.
- EB 함유 배지를 교반하여 EB를 재현탁하여 각 웰에 EB가 고르게 분포되도록 한 다음 배지의 1/6(2mL)을 신속하게 제거하고 하나의 웰에 분주합니다. 나머지 우물에 대해 반복하십시오.
- 배양하기 전에 플레이트를 앞뒤로 부드럽게 흔들어 EB가 고르게 분포되도록 합니다. EB가 중간에 뭉치면 제대로 구별되지 않습니다.
참고: 도금 밀도는 차별화에 매우 중요합니다. 웰당 30EB 이상을 플레이트해야 합니다. EB 생산이 효율적이지 않은 경우 EB를 더 적은 수의 유정에 분배하십시오.
- NIM 매체를 사용하여 매일 매체를 변경하십시오. 웰의 배지 수준을 ~3mL로 유지합니다. 배지를 교체할 때 도금된 EB가 건조되지 않도록 1mL를 제외한 모든 배지를 제거하고 플레이트에서 세포가 들어 올려지지 않도록 웰 측면에 2mL의 배지를 부드럽게 추가합니다.
- EB 도금 후 9일 후에 이틀에 걸쳐 배지를 NIM에서 망막 분화 배지(RDM)로 변경하기 시작합니다.
- 다음을 혼합하여 RDM을 준비합니다: 48% DMEM/F12(1:1) 및 48% DMEM에 비타민 A 없이 2% B27 보충제가 보충됨, 1% MEM NEAA 및 1% Pen-Strep. 0.20μm 필터를 사용하여 필터를 멸균합니다. RDM은 4°C에서 최대 1개월 동안 보관할 수 있습니다.
- 첫날에는 미디어를 NIM:RDM의 1:1 혼합으로 전환합니다. 둘째 날에는 미디어를 RDM으로 변경합니다. 그 이후의 모든 날, 피드 셀 RDM.
참고: 앞으로 몇 주 동안 도금된 EB는 눈에 띄게 착색된 RPE를 생성하기 시작하는 신경 망막 전구체를 형성할 것입니다.
4. 자유 부동 오가노이드 만들기 및 자유 부동 오가노이드 배양 유지
- 초기 Dispase 처리 후 28일(EB 도금 후 21일)에 단편 도금된 EB를 멸균 메스를 사용하여 1-2mm2 그리드를 도금된 EB로 절단합니다. 이것은 망막 전구 콜로니를 작은 덩어리로 분리하여 나중에 발달 과정에서 중심의 불충분 한 영양소 교환으로 인해 너무 커지고 괴사되지 않도록합니다.
- 도금된 EB를 분리합니다.
- 이렇게 하려면 먼저 각 웰에 2mL의 RDM을 추가합니다. 그런 다음 p1000 피펫을 사용하여 웰에서 ~1000μL의 배지를 흡인합니다. 이제 팁이 완전히 잠긴 상태에서 도금된 EB에 직접 미디어를 강제로 꺼냅니다.
- 모든 세포가 플레이트에서 들어 올려질 때까지 이 작업을 반복합니다. 매체를 배출하는 동안 팁을 물에 잠긴 상태로 유지하고 기포를 피하기 위해 피펫 플런저를 첫 번째 스톱 지점으로 밀지 마십시오.
- 처음 분리된 EB 덩어리를 멸균 플라스틱 125mL 삼각 플라스크에 재현탁하고 플라스크에 ~40mL의 RDM 배지를 채웁니다. 표준 인큐베이터에 놓인 궤도 셰이커에 플라스크를 놓습니다. 셰이커 속도를 130-140RPM으로 설정합니다(속도 설정 3).
참고: 셰이커에서 오가노이드를 배양하면 더 높은 농도의 오가노이드에서 배양하는 동안 서로 달라붙는 것을 방지할 수 있습니다. 생물 반응기도 동일한 목적을 달성하지만 셰이커는 더 저렴합니다. - 배지가 얼마나 노랗게 변하는지에 따라 주당 2-3회 약 12mL의 RDM을 대체하여 오가노이드를 부분적으로 배지 교체합니다. 초기 오가노이드는 많은 먹이를 필요로 하지 않지만 성장함에 따라 더 많은 배지로 더 자주 배지를 교체해야 합니다.
- 2주마다 오가노이드를 가지치기하여 망막이 아닌 오가노이드, 무성하고 죽어가는 오가노이드를 제거합니다. 이것은 매체 낭비를 방지하고 나머지 망막 오가노이드의 건강을 개선합니다.
- 5mL 피펫을 사용하여 플라스크에서 6웰 플레이트 또는 10cm 접시로 세포를 옮깁니다. 층화된 신경상피를 표시하는 오가노이드를 보관하십시오(그림 1A, 별표). 이 오가노이드는 투명하고 흰색입니다.
- 5mL 피펫으로 잘못 형성되거나 과도하게 자란 망막 오가노이드와 비망막 오가노이드를 분류하고 제거합니다. 이들은 일반적으로 불투명하고 황색을 띠고 있습니다(그림 1A). 또한 층화 된 신경 상피처럼 보이지 않는 것을 제거하십시오. 처음 몇 번의 가지치기는 노동 집약적이지만 오가노이드가 더 커지고 균질해짐에 따라 이후에는 훨씬 쉬워질 것입니다(그림 1B).
5. 성숙한 오가노이드를 유지하고 유사분열 후 망막 조직으로 분화
- EB 형성을 위한 초기 Dispase 처리 후 56일(8주)에(플라스크에서 제거된 EB를 배양한 후 28일) 오가노이드 배지를 RDM+로 변경합니다. 이것은 망막 조직으로서 완전히 성숙한 오가노이드에 추가 영양소를 제공합니다.
- PBS에서 100mM 타우린을 준비합니다. 사용할 때까지 분취량을 -20°C에 보관하십시오.
- RDM에 10% FBS, 100μM 타우린 및 2mM 상업용 글루타민 보충제를 보충하여 RDM+를 준비합니다. 0.20μm 필터를 사용하여 필터를 멸균합니다.
- RDM+ 미디어를 일주일에 2-3번 계속 교체하십시오.
- 17-18주차(Dispase 처리 후)에 5mL 피펫을 사용하여 삼각 플라스크에서 초저 부착 6웰 플레이트로 오가노이드를 옮깁니다. 첫 주 동안은 오가노이드가 더 이상 서로 달라붙지 않을 때까지 매일 오가노이드를 가지치기하고 분리합니다. 최적 밀도는 웰 당 10-15 오가노이드입니다. 일주일에 2-3 번 미디어를 변경하십시오.
참고: 오가노이드가 서로 자주 부착되거나 배지 교체 사이에 배지가 매우 노랗게 변하는 경우 웰당 오가노이드 수를 줄이십시오. - 오가노이드는 신경 망막 세포가 전체에 존재하는 18주,5 주까지 완전히 유사분열 후 상태가 될 것으로 예상합니다. 24주까지 오가노이드 외부에 기본적인 외부 세그먼트가 형성되는지 확인합니다. 26-28주차까지 오가노이드 바깥쪽의 바깥쪽 부분이 두꺼워지는지 확인합니다(그림 1C). 오가노이드가 성숙한 분화 상태를 나타내는 외부 세그먼트를 정의한 26주 후에 독성 분석을 수행합니다.
참고: 독성 분석을 위해 잘 분화된 망막 오가노이드만 사용하십시오. 잘 정의된 외부 세그먼트가 있는 오가노이드에 대한 독성 분석을 수행하면 식별이 가능합니다.
6. Deoxysphinganine (deoxySA) 및 약물 치료
참고: 여기에 제시된 것은 4일 동안 deoxySA 독성을 구출하기 위한 페노피브레이트의 단일 처리입니다(그림 2). 그러나 오가노이드에 첨가된 deoxySA의 농도, 오가노이드에 대한 deoxySA 처리 기간 및 독성을 구출하는 데 사용되는 약물의 유형14 그러나 독성 및 독성 구조를 분석하기 위한 실험 요구에 따라 수정할 수 있습니다.
- 에탄올에 deoxySA의 1 mM 저장 용액을 준비합니다. -20 °C에서 1개월 동안 보관하세요. 대안적으로, deoxySA의 원액은 DMSO에서 제조될 수 있다.
- 약물 구조를 위한 deoxySA의 적절한 독성 농도를 결정하기 위해 deoxySA의 연속 희석을 수행합니다.
참고: 먼저 구조 효과를 측정하기에 충분한 세포 사멸을 초래할 수 있는 deoxySA의 농도를 결정합니다. 농도가 너무 높으면 독성 반응으로 인해 오가노이드가 분해되고 구조가 관찰되지 않습니다. 독성 반응이 너무 낮 으면 중요한 구조 효과를 관찰하기가 어려울 것입니다. deoxySA 독성 반응은 deoxySA의 실험실 간 및 배치에서 배치로 다를 수 있습니다.- 1mM deoxySA 원액을 각각 3mL의 RDM+에 0.5μM, 1μM 및 2μM의 농도로 희석합니다. 3 μL의 에탄올을 RDM+에 첨가하여 대조군 처리를 준비한다.
- 해부 현미경에서 멸균 프로브를 사용하여 그룹당 최소 5개의 오가노이드가 있는 4개의 오가노이드 그룹을 선택합니다. 그룹을 초저 부착 6-웰 플레이트의 개별 웰로 분할합니다. 크기와 모양이 거의 같은 오가노이드를 선택하십시오.
- 오가노이드에서 가능한 한 많은 RDM+를 흡인합니다. 오가노이드의 각 웰에 RDM+에 한 가지 농도의 deoxySA를 추가합니다. 오가노이드의 네 번째 웰에 비히클 제어를 추가합니다.
- deoxySA 또는 vehicle에서 이틀 동안 배양한 후 배지를 RDM+에서 새로 준비된 해당 deoxySA 희석액으로 교체합니다.
- 치료 4일째에 7단계로 진행하여 오가노이드를 처리하고 세포 사멸을 분석합니다. deoxySA 농도가 선택되면 6.3단계를 계속하여 페노피브레이트로 치료합니다.
참고: 선택된 deoxySA 처리군에서 표적 세포 사멸은 10,000μm2당 5 - 20 TUNEL 양성 세포입니다. 오가노이드는 치료 과정에서 프로브를 만져도 분해되지 않아야 합니다.
- 오가노이드를 선택된 독성 용량의 deoxySA 및 fenofibrate로 치료합니다.
- DMSO 중의 페노피브레이트의 40 mM 원액을 제조한다. -20 °C에서 최대 1년 동안 보관하십시오.
- 약물 처리 배지 준비: 3mL RDM+에서 1mM deoxySA 원액을 1μM deoxySA로 희석하고 40mM 페노피브레이트 원액을 20μM로 희석합니다.
- deoxySA 처리 배지 준비: 3mL RDM+에서 1mM deoxySA 원액을 1μM deoxySA로 희석하고 DMSO 1.5μL를 추가합니다.
- 대조군 배지 준비: 3mL RDM+에 에탄올 3μL와 DMSO 1.5μL를 추가합니다.
- 멸균 프로브를 사용하는 해부 현미경에서 그룹당 최소 5개의 오가노이드가 있는 3개의 오가노이드 그룹을 선택합니다. 그룹을 초저 부착 6-웰 플레이트의 개별 웰로 분할합니다.
- 준비된 치료제(deoxySA, deoxySA + fenofibrate 또는 대조군)를 오가노이드에 추가합니다. 이틀 후, 해당 deoxySA/페노피브레이트/대조 용액으로 보충된 새로 준비된 RDM+로 웰의 배지를 교체합니다.
- 처리 4일째에 7단계로 진행하여 오가노이드를 처리하고 세포 사멸을 분석합니다(그림 2).
7. 오가노이드의 임베딩 및 냉동 절개
- PBS 3mL에 16% PFA 앰플 1mL를 첨가하여 신선한 4% PFA를 준비합니다.
- 오가노이드에서 RDM+ 배지를 제거하고 PBS로 한 번 헹굽니다. 오가노이드에서 가능한 한 많은 PBS를 제거합니다. 갓 준비한 4% PFA(PBS) 2mL를 오가노이드에 넣고 실온에서 15분 동안 배양합니다.
- 15분 배양 후 오가노이드를 PBS 2mL로 두 번 헹군 다음 PBS에서 10분 동안 세척합니다.
알림: 화학 흄 후드에 고정을 수행하고 PFA 용액을 버리고 흄 후드에 보관된 적절하게 라벨이 붙은 PFA 폐기물 용기에 두 번의 후속 PBS 헹굼을 버립니다. - 모든 PBS를 흡인한 다음 PBS에 20% 자당을 고정 오가노이드에 추가합니다. 오가노이드가 자당 용액에 혼합되고 상단의 PBS 기포에 남아 있지 않은지 확인합니다. 오가노이드가 자당 용액의 바닥으로 가라앉을 때까지, 즉 실온에서 ~1시간 동안 자당 용액에 보관합니다. 고정 오가노이드는 4°C에서 밤새 수크로오스 용액에 보관할 수 있습니다.
- OCT 용액에 오가노이드를 극저온 절편 금형에 삽입합니다. 조건당 여러 오가노이드를 하나의 금형에 내장할 수 있습니다. 오가노이드의 방향을 정하여 최상의 망막 영역이 저온 유지 장치에서 단면화되고 오가노이드의 중간이 모두 거의 같은 평면에 있도록 합니다. 내장된 오가노이드를 -20°C에서 동결합니다. 내장된 오가노이드는 -80°C에서 수년간 보관할 수 있습니다.
참고: 오가노이드는 냉동 OCT에서 보기 어렵습니다. 오가노이드 식별을 용이하게 하기 위해 블레이드를 향할 금형 측면으로 RPE 클러스터를 향하게 합니다. - 오가노이드를 10-14μm 두께의 절편으로 극저온 절편하고 절편을 폴리-L 라이신 처리된 슬라이드에 부착합니다. 냉동 절편하는 동안 현미경으로 슬라이드를 반복적으로 확인하여 오가노이드의 중간이 포함된 섹션을 식별합니다. 모든 층이 고르게 표현되는 오가노이드의 중간 조각만 수집합니다(그림 2A-C, 그림 3). 일단 절단되면 슬라이드는 -80°C의 슬라이드 박스에 수년 동안 보관할 수 있습니다.
참고: 오가노이드의 끝에서 채취한 슬라이스는 가장 바깥쪽 광수용체를 과도하게 샘플링하며 정량화에 적합하지 않습니다. 평균 크기의 오가노이드는 층화된 망막층의 단면을 나타내는 오가노이드 중간의 10-15개 슬라이스를 제공합니다.
8. 세포사멸세포에 대한 TUNEL 염색
- 냉동 슬라이드를 37°C에서 30분 동안 해동합니다. 슬라이드를 즉시 37°C에 두면 결로를 방지할 수 있습니다. 순수한 물에 담근 조직 샘플은 조직을 왜곡시킬 수 있습니다. 37°C 인큐베이션은 또한 유리 슬라이드에 대한 조직의 접착력을 향상시킨다.
- 소수성 펜을 사용하여 조직 섹션 주위의 유리 슬라이드에 연속적인 테두리를 만듭니다. 이것은 경계를 제공하고 소량의 용액으로 적절한 고정 및 항체 배양을 보장합니다. 약 100-200 μL(부피가 쏟아지지 않고 소수성 경계 영역을 채울 것임)의 갓 준비한 4% PFA를 20분 동안 추가합니다. 화학 흄 후드에 고정하고 PFA 용액을 흄 후드에 보관된 적절하게 라벨이 붙은 PFA 폐기물 용기에 버립니다.
- 슬라이드를 PBS에서 한 번 헹구고 PBS에서 실온에서 25분 동안 세척합니다.
- TUNEL 혼합물을 준비하십시오. In situ 세포 사멸 검출 키트에서 보라색과 파란색 바이알을 모두 해동합니다. 100 μL의 보라색 바이알 용액(음성 대조군에 사용 가능)을 제거하고 보라색 바이알의 나머지 450 μL 용액을 파란색 바이알의 용액 50 μL와 결합합니다. 잘 섞고 어둠 속에 보관하십시오. 각 바이알 세트(총 500μL)는 5-10개의 슬라이드를 염색할 수 있습니다.
- 조직 조각을 투과시킵니다.
- 투과화 용액 준비: 0.1% TritonX-100 및 0.1% 시트르산나트륨이 함유된 PBS
- 샘플 슬라이드에서 PBS를 제거한 다음 샘플에 투과화 용액을 추가합니다. 얼음 블록 또는 4°C에서 2분 동안 배양합니다. 그런 다음 PBS에서 한 번 헹구고 PBS에서 10분 동안 세척합니다.
- PBS를 제거하고 접힌 티슈의 모서리를 사용하여 가능한 한 많은 용액을 건조시킵니다. 소수성 펜으로 그린 영역의 크기에 따라 준비된 TUNEL 혼합물 50-100 μL을 샘플에 추가합니다. 유리 커버 슬립으로 덮고 37°C에서 어두운 곳에서 1시간 동안 배양합니다.
알림: 다음 단계에 대한 모든 배양 및 세척은 형광단의 표백을 방지하기 위해 어두운 곳에서 수행해야 합니다. 어두운 상자를 사용하거나 슬라이드를 알루미늄 호일로 덮어 빛을 차단하십시오. - 광수용체에 라벨을 붙입니다. PBS로 한 번 헹군 다음 PBS에서 20분 동안 씻습니다. PBS를 제거한 다음 PBS에서 1:500으로 희석한 1차 Recoverin 항체(토끼 항-Recoverin)를 0.1% 트윈 및 5% 당나귀 혈청으로 추가합니다. 4°C에서 하룻밤 동안 배양합니다.
- 1차 항체를 제거한 후 PBS에서 한 번 헹군 다음 PBS에서 20분 동안 세척합니다. 2차 항체인 주황색 또는 빨간색 형광단이 있는 당나귀 항토끼를 PBS에 1:1,000으로 0.1% 트윈 및 5% 당나귀 혈청으로 희석하고 실온에서 2시간 동안 배양합니다. PBS로 한 번 헹군 다음 PBS에서 20분 동안 씻습니다. PBS에서 1:1000에 DAPI를 추가하고 실온에서 10분 동안 배양합니다.
- PBS로 한 번 헹군 다음 PBS에서 20분 동안 씻습니다. PBS를 제거하고 장착 매체를 추가합니다. 커버 슬립을 추가하고 매니큐어로 밀봉한 다음 어두운 곳에서 말리십시오. 슬라이드는 어두운 용기에 4°C에서 최대 1주일 동안 보관할 수 있습니다.
참고: 최상의 이미지 품질을 위해 다음날 이미지를 촬영하십시오.
9. 오가노이드 슬라이스 이미징 및 사망 정량화.
참고: 이미징에는 3개의 형광단 채널을 구별할 수 있는 기능이 있는 컨포칼 현미경이 필요합니다. 이 실험에서는 녹색(Alexa Fluor 488), 주황색(Alexa Fluor 555) 및 UV(DAPI) 채널을 사용합니다. 형광단의 모든 조합을 사용하여 방출이 다른 채널로 흘러 들어가지 않도록 할 수 있습니다.
- 이미징 및 정량화를 위해 망막 섹션을 찾습니다. 현미경의 저배율(5x 또는 10x)에서 광수용체의 세포질을 표지하는 Recoverin 염색과 모든 세포의 핵을 표지하는 DAPI 염색을 사용하여 오가노이드의 대표적인 단면을 샘플링하는 평면에서 손상되지 않고 잘 형성된 슬라이스된 오가노이드의 영역을 찾습니다(그림 2 및 그림 3 ). 적어도 몇 개의 세포 두께를 가진 광수용체의 뚜렷한 외부 핵층과 Recoverin 염색이 없는 별도의 뚜렷한 핵층이 있는 섹션을 찾습니다(그림 2 및 그림 3).
- 이미지의 구도를 잡습니다. 현미경의 배율을 20x 대물렌즈로 늘리고 슬라이드의 구도를 잡아 이미지를 가능한 한 많은 광수용체층으로 채웁니다(그림 3).
- Z 평면을 설정합니다. Z 스택을 이미지화하는 현미경을 사용하는 경우 Z 범위의 상한 및 하한을 설정하여 슬라이스의 전체 깊이를 이미지화합니다. 실험 세트의 모든 이미지에 동일한 Z-스택 두께를 사용하여 모든 샘플에서 동일한 양의 조직을 분석합니다. Z 스택을 이미지화하는 현미경을 사용하지 않는 경우 슬라이스 중앙에 이미지의 초점을 맞춥니다.
- Z-스택 획득에서 형광단의 3개 채널을 모두 이미지화합니다. 세 가지 채널 모두 죽어가는 세포를 긍정적으로 식별하는 데 필요합니다. 오가노이드당 한 영역을 이미지화합니다.
- 픽셀당 면적 비율을 유지하는 파일 형식으로 이미지 세트를 저장합니다.
10. 죽어가는 세포 정량화
- FIJI(이미지 J) 소프트웨어에서 이미지 스택을 엽니다. Bio-Formats 가져오기 옵션 창에서 "별도의 창으로 분할" 섹션 아래의 상자가 선택되어 있지 않은지 확인합니다. 정렬된 이미지 채널 사이를 스크롤하는 것은 셀을 적절하게 식별하는 데 중요합니다.
- Image > Stacks를 클릭하여 Z 스택 이미지 세트를 병합한 다음 드롭다운 메뉴에서 'Z 프로젝트'를 선택합니다. 이렇게 하면 정량화를 위한 새 이미지가 생성됩니다. 오가노이드가 Z 시리즈에서 이미지화되지 않은 경우 이 단계를 건너뜁니다.
- Recoverin 염색을 표시하는 이미지 채널(이 예에서는 빨간색)을 선택합니다. 도구 모음에서 다각형 선택 도구를 클릭하고 이미지에서 광수용체의 연속 영역을 윤곽을 그립니다(그림 3A). Analyze( 분석)> Set Measurements(측정값 설정)를 클릭합니다. Set Measurements (측정 설정) 팝업 창에서 Area(영역) 옆의 상자를 선택하고 Analyze(분석 )를 클릭한 다음 Measure(측정)를 선택하여 광수용체의 면적을 측정 (또는 바로 가기로 "m"을 누름)하여 죽어가는 세포 수를 계산합니다. 면적 측정이 팝업 측정 창에 나타납니다.
- 이전에 선택한 광수용체 영역의 TUNEL 양성 핵을 계산합니다(그림 3B, C). 도구 모음에서 포인트 도구를 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 다중 포인트 도구를 선택합니다. TUNEL 채널에서만 DAPI 양성 핵 및 Recoverin 염색과 겹치는 TUNEL 양성 염색을 클릭합니다. 채널 사이를 전환하여 양성 셀을 검증합니다.
- TUNEL 양성 세포의 수를 면적으로 나누어 오가노이드당 광수용체의 세포 사멸에 대한 정규화된 값을 얻습니다(그림 2D,E).
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Representative Results
망막 오가노이드는 비-MacTel 대조군 iPSC 라인으로부터 생성되었다. 오가노이드가 배양 26주에 도달한 후 선별되어 실험군으로 나뉩니다. 오가노이드는 다양한 농도의 deoxySA로 처리하여 deoxySA가 광수용체에 독성이 있는지 확인했습니다. 0에서 1 μM까지 4가지 농도의 deoxySA를 테스트하고(그림 2) 오가노이드를 8일 동안 처리했으며 격일로 배지를 교체했습니다. deoxySA에 대한 반응으로 세포 사멸은 농도에 따라 달라지며 50nM deoxySA에서만 검출할 수 있습니다(그림 2D). 테스트된 최고 농도인 1μM deoxySA는 망막 오가노이드의 무결성을 유지하면서 강력한 효과를 제공했습니다(그림 2B,D). 5μM deoxySA의 더 높은 농도는 며칠 내에 오가노이드의 붕괴를 일으켰습니다(데이터는 표시되지 않음). deoxySA 용량 반응의 결과는 향후 독성 실험을 위한 deoxySA의 최적 농도를 결정했습니다. 1 μM deoxySA 용량은 5 μM에서 관찰된 바와 같이 과포화 독성 없이 상당한 세포 사멸을 초래했습니다.
deoxySA 유도 세포 사멸을 구출하는 페노피브레이트의 능력을 테스트하기 위해 레티날 오가노이드를 1μM deoxySA, 1μM deoxySA 및 20μM 페노피브레이트 또는 무처리 비히클 대조군으로 처리했습니다(그림 2A-C,E). 20μM 페노피브레이트 처리는 망막 오가노이드의 광수용체에서 deoxySA 유발 독성을 방지하여 처리 4일 후 세포 사멸을 약 80% 감소시켰습니다(그림 2A-C,E)16. 푸모노신-B1을 포함한 추가 지질 변경 약물을 동일한 프로토콜을 사용하여 테스트했으며, 이는 deoxySA 독성의 완전한 구조를 보여주었습니다. 관련 지질 종은 또한 광수용체 세포 사멸을 유도하는 특정 다운스트림 스핑고지질 대사산물을 확인하기 위해 테스트되었습니다14.
그림 1: 도립 광학 현미경으로 사용한 오가노이드의 대표적인 명시야 이미지 . (A) 박리 후 2일째 4주령의 오가노이드는 적절한 망막 층상(흰색 *) 또는 비망막 오가노이드 발달을 보입니다. (B) 13주차에 오가노이드 개발. (C) 28주차의 망막 오가노이드, 투명한 망막 층과 외부 광수용체층에서 돌출된 잘 형성된 외부 세그먼트(흰색 막대). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 세포 사멸의 대표적인 컨포칼 이미지. 대조군 배지(A), 1μM deoxySA(B) 또는 20μM fenofibrate(C)가 포함된 1μM deoxySA(C)로 4일 동안 처리한 후 망막 오가노이드의 광수용체층(Recoverin, 빨간색) 내 세포 사멸(TUNEL, 녹색)의 대표적인 공초점 이미지. (D) 다양한 농도의 deoxySA로 망막 오가노이드 조직을 처리한 후 인간 광수용체의 세포 사멸 정량화. (E) 대조군 배지(n=6), 1μM deoxySA(n=22), 1μM deoxySA + 20μM 페노피브레이트(n=21)로 망막 오가노이드 조직을 처리한 후 인간 광수용체의 세포 사멸 정량화. *p<0.05, ***p<0.001(단방향 ANOVA) 및 사후 Tukey 테스트. New England Journal of Medicine, Gantner, M., Eade, K. 및 Wallace에서 파생된 데이터입니다. M., 외. 황반 질환 및 말초 신경 병증의 세린 및 지질 대사, 381(15), 1422-1433, Copyright © (2019) Massachusetts Medical Society. 허가를 받아 재인쇄했습니다. 14이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: FIJI 소프트웨어를 사용하여 본 1μM deoxySA로 처리된 절편 및 염색된 오가노이드의 컨포칼 이미지를 보여주는 스크린샷. 형광 채널은 α-Recoverin(A, 빨간색), TUNEL(B, 녹색) 및 DAPI(C, 파란색)로 분할되었습니다. (A) 광수용체 영역은 도구 모음(왼쪽 상단)에서 선택한 다각형 도구를 사용하여 윤곽이 그려져 있습니다. (나,씨) 도구 모음에서 선택한 다지점 도구를 사용하여 광수용체층 내의 TUNEL 양성(B, 녹색) 및 DAPI 양성(C, 파란색) 세포의 세포 수. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
차별화 프로토콜 변형
요시키 사사이(Yoshiki Sasai)의 그룹20에 의한 자가 형성 광학 컵의 발명 이후, 많은 실험실들은 거의 모든 단계 5,18,19,21에서 변할 수 있는 망막 오가노이드를 생성하기 위한 프로토콜을 개발했다. 프로토콜의 전체 목록은 Capowski et al.22에서 찾을 수 있습니다. 여기에서 제공하는 분화 프로토콜은 성숙한 망막 오가노이드를 감화하려는 모든 실험실에 좋은 출발점을 제공하는 간단하고 개입이 적은 프로토콜입니다. 사용자는 이 프로토콜의 변형을 탐색하고 채택하는 것이 좋습니다. 프로토콜 변형을 위한 일반적인 단계는 EB의 생산 및 조기 분화, 효율성 향상을 위한 BMP4, DKK-1 또는 레티노산과 같은 분화 인자의 사용입니다 5,19,23.
후기 단계 개발의 대부분을 위해 셰이커에서 오가노이드를 배양하는 것은 분화 효율을 높이고 오가노이드 취급에 소요되는 시간을 줄이는 효과적인 단계였습니다. 바이오리액터는 동일한 목적을 달성하지만(24), 일회용 삼각 플라스크와 함께 쉐이커를 사용하는 것이 더 비용 효율적이며 일반적인 실험실 장비로 수행할 수 있다. 오가노이드를 동원 현탁액에 보관하는 주요 이점은 성장하는 동안 플레이트에 서로 달라붙는 오가노이드를 분리할 필요가 없다는 것입니다. 부유 배양은 또한 더 큰 영양소 교환을 촉진하므로 오가노이드는 표준 스틸 플레이트의 오가노이드보다 더 크게 자라는 경향이 있습니다. 이러한 이유로 4.1단계에서 도금된 EB를 가능한 한 작게 조각화하는 것으로 시작하는 것이 좋습니다.
성숙한 망막 오가노이드를 얻으려면 거의 6개월 동안 단일 배양을 분화해야 하기 때문에 망막 오가노이드에 대한 독성 분석을 수행하는 것은 2D 단일 배양을 사용하는 것에 비해 시간이 많이 소요될 수 있습니다. 그러나 독성 분석은 단일 제어 라인에서 수행되며 분화는 일상적으로 설정할 수 있습니다. 초기 6개월의 투자 후, 추가 실험 및 프로토콜 수정을 수행하기 위한 오가노이드의 정기적인 공급이 지체 없이 이루어질 것입니다. 1-2개월마다 2-3회의 망막 오가노이드 분화를 시작하면 복잡하고 철저한 실험을 위한 충분한 조직을 얻을 수 있습니다.
오가노이드는 표적 약물 검사를 위한 다목적 모델을 제공합니다.
이 프로토콜은 deoxySL 유도 세포 사멸을 구하기 위한 지질 변경 약물의 효능을 테스트하기 위한 광수용체 독성 분석을 설명합니다. 이것은 MacTel에서 질병 유발 물질에 대한 약리학적 구조를 나타내는 특정 응용 프로그램이지만 이 프로토콜은 여러 가지 모욕(예: 영양 결핍, 저산소 상태, 광 독성) 및 약리학적 구조를 테스트하는 데 사용할 수 있습니다. 따라서 다른 망막 질환을 모델링하는 데 적용할 수 있습니다. 우리 자신의 연구에서 우리는 이와 동일한 프로토콜을 사용하고 스핑고지질 대사를 직접 차단하는 다양한 관련 스핑고지질 종 및 약물을 대체함으로써 광수용체 세포 사멸을 유발하는 특정 독성 다운스트림 스핑고지질 대사 산물을 결정함으로써 MacTel 질병 메커니즘에 대한 통찰력을 제공할 수 있음을 보여주었습니다14 . 변이체 iPSC 라인을 설정해야 하는 유전적 돌연변이 수준에서 질병을 모델링하는 것과 달리, 오가노이드를 사용하여 독성 대사 조건 및 환경적 스트레스 요인을 모델링하면 풍부하고 쉽게 사용할 수 있는 조직 소스를 가진 동적 모델로 공통 제어 iPSC 라인을 사용할 수 있습니다.
인간 오가노이드 모델은 망막의 대사 질환을 연구할 때 특히 유리한데, 망막에서는 서로 다른 세포 유형이 광수용체 유사 세포의 단일 배양에서 복제할 수 없는 독특한 공생 대사 상호작용을 가지고 있습니다4. 이 복잡한 대사 모델을 통해 우리는 인간에게 직접 deoxySL의 독성 영향을 예방하는 약물 페노피브레이트의 효과를 발견할 수 있었습니다. 상승된 deoxySLs14 의 마우스 모델(미공개 데이터)과 deoxySL 대사의 마우스 배아 섬유아세포 배양 모델에서 페노피브레이트는 효과가 없는 것으로 판명되었습니다16. 복잡한 인체 조직 모델의 맥락에서 약물을 테스트하면 효과적인 치료법을 식별하고 생쥐 또는 단순한 단일 배양에만 의존했다면 놓쳤을 비효율적 인 치료법을 할인 할 수 있습니다.
약물 스크리닝을 위한 향후 개발
이 프로토콜에서 우리는 가장 풍부한 세포 유형인 광수용체의 세포자멸사를 정량화합니다. 그러나, 다른 망막 세포 유형을 특이적으로 표지하는 입증된 항체 중 임의의 것을 이용함으로써, 이 프로토콜은 임의의 망막 세포 유형, 또는 세포 아형(예를 들어, 원뿔 대 간상체)에서 세포 사멸을 분석하도록 수정될 수 있다. 조직 절편에서 TUNEL 염색을 사용하여 세포자멸사를 정량화할 때의 단점은 세포 사멸을 정량화하는 것이 처리량이 낮은 기술이기 때문에 이 분석의 적용을 후보 약물의 작은 목록을 스크리닝하는 것으로 제한한다는 것입니다. IHC 접근법을 사용하여 비표적 약물 라이브러리의 더 큰 스크린은 실현 가능하지 않습니다. 더 큰 약물 스크리닝을 용이하게 하기 위한 이 프로토콜의 향후 개발은 보다 쉽게 정량화할 수 있는 세포 사멸 마커의 통합을 필요로 할 것입니다. 이러한 기능을 사용할 수 있지만 망막 오가노이드의 불규칙성, 비망막 조직 부속물의 존재 또는 부재, 광수용체층 품질의 가변성으로 인해 오가노이드 전반에 걸쳐 결과를 정규화하기가 어렵습니다. 우리는 대규모 약물 라이브러리를 스크리닝하기 위해 인간 오가노이드 질병 모델의 처리량을 증가시키기 위한 향후 개발이 전임상 시험에서 승인된 치료제로 발전할 약물을 발견, 수정 및 검증하는 능력을 크게 향상시킬 것으로 기대합니다.
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Disclosures
저자는 이해 상충이 없습니다.
Acknowledgments
Lowy Medical Research Institute에서 지원합니다. MacTel 프로젝트를 지원해 주신 Lowy 가족에게 감사드립니다. 원고 준비에 도움을 주신 Mari Gantner, Mike Dorrell, Lea Scheppke에게 감사드립니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5M EDTA | Invitrogen | 15575020 | |
| 125mL Erlenmeyer Flasks | VWR | 89095-258 | |
| 1-deoxysphinganine | Avanti | 860493 | |
| B27 Supplement, minus vitamin A | Gibco | 12587010 | |
| Beaver 6900 Mini-Blade | Beaver-Visitec | BEAVER6900 | |
| D-(+)-Sucrose | VWR | 97061-432 | |
| DAPI | Thermo-fisher | D1306 | |
| Dispase II, powder | Gibco | 17105041 | |
| DMEM, high glucose, pyruvate | Gibco | 11995073 | |
| DMEM/F12 | Gibco | 11330 | |
| Donkey anti-rabbit Ig-G, Alexa Fluor plus 555 | Thermo-fisher | A32794 | |
| donkey serum | Sigma | D9663-10ML | |
| FBS, Heat Inactivated | Corning | 45001-108 | |
| Fenofibrate | Sigma | F6020 | |
| Glutamax | Gibco | 35050061 | |
| Heparin | Stemcell Technologies | 7980 | |
| In Situ Cell Death Detection Kit, Fluorescin | Sigma | 11684795910 | |
| Matrigel, growth factor reduced | Corning | 356230 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution | Gibco | 11140050 | |
| mTeSR 1 | Stemcell Technologies | 85850 | |
| N2 Supplement | Gibco | 17502048 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| Pierce 16% Formaldehyde | Thermo-fisher | 28906 | |
| Rabbit anti-Recoverin antibody | Millipore | AB5585 | |
| Sodium Citrate | Sigma | W302600 | |
| Steriflip Sterile Disposable Vacuum Filter Units | MilliporeSigma | SE1M179M6 | |
| Taurine | Sigma | T0625 | |
| Tissue Plus- O.C.T. compound | Fisher Scientific | 23-730-571 | |
| Tissue-Tek Cryomold | EMS | 62534-10 | |
| Triton X-100 | Sigma | X100 | |
| Tween-20 | Sigma | P1379 | |
| Ultra-Low Attachment 6 well Plates | Corning | 29443-030 | |
| Ultra-Low Attachment 75cm2 U-Flask | Corning | 3814 | |
| Vacuum Filtration System | VWR | 10040-436 | |
| Vectashield-mounting medium | vector Labs | H-1000 | |
| wax pen-ImmEdge | vector Labs | H-4000 | |
| Y-27632 Dihydrochloride (Rock inhibitor) | Sigma | Y0503 |
References
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