Qui presentiamo un protocollo passo-passo per generare organoidi retinici umani maturi e utilizzarli in un test di tossicità dei fotorecettori per identificare i candidati farmaceutici per la malattia degenerativa retinica legata all'età telangiectasia maculare di tipo 2 (MacTel).
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Articolo metodologico
Screening di tossicità negli organoidi retinici umani per la scoperta farmaceutica
In questo articolo
Sommario
Abstract
Gli organoidi forniscono una piattaforma promettente per studiare il meccanismo e i trattamenti della malattia, direttamente nel contesto del tessuto umano con la versatilità e la produttività della coltura cellulare. Gli organoidi retinici umani maturi sono utilizzati per lo screening di potenziali trattamenti farmaceutici per la telangiectasia maculare legata all'età della malattia degenerativa della retina di tipo 2 (MacTel).
Abbiamo recentemente dimostrato che MacTel può essere causato da livelli elevati di una specie lipidica atipica, i desossisfingolipidi (deossiSL). Questi lipidi sono tossici per la retina e possono guidare la perdita di fotorecettori che si verifica nei pazienti MacTel. Per esaminare i farmaci per la loro capacità di prevenire la tossicità dei fotorecettori deossiSL, abbiamo generato organoidi retinici umani da una linea di cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC) non MacTel e li abbiamo maturati fino a un'età post-mitotica in cui sviluppano tutte le cellule derivate dalla linea neuronale della retina, compresi i fotorecettori funzionalmente maturi. Gli organoidi retinici sono stati trattati con un metabolita deossiSL e l'apoptosi è stata misurata all'interno dello strato fotorecettore utilizzando l'immunoistochimica. Utilizzando questo modello di tossicità, sono stati sottoposti a screening i composti farmacologici che prevengono la morte dei fotorecettori indotta da deossiSL. Utilizzando un approccio candidato mirato, abbiamo determinato che il fenofibrato, un farmaco comunemente prescritto per il trattamento del colesterolo alto e dei trigliceridi, può anche prevenire la tossicità del deossiSL nelle cellule della retina.
Lo schermo di tossicità ha identificato con successo un farmaco approvato dalla FDA che può prevenire la morte dei fotorecettori. Questo è un risultato direttamente attuabile grazie al modello altamente rilevante per la malattia testato. Questa piattaforma può essere facilmente modificata per testare qualsiasi numero di fattori di stress metabolici e potenziali interventi farmacologici per la futura scoperta del trattamento nelle malattie retiniche.
Introduzione
La modellazione delle malattie umane in colture cellulari e modelli animali ha fornito strumenti inestimabili per la scoperta, la modifica e la convalida di terapie farmacologiche, consentendo loro di passare dal farmaco candidato alla terapia approvata. Sebbene una combinazione di modelli in vitro e non umani in vivo sia stata a lungo una componente critica della pipeline di sviluppo di farmaci, spesso non riescono a prevedere le prestazioni cliniche di nuovi farmaci candidati1. Vi è una chiara necessità di sviluppare tecnologie che colmino il divario tra monocolture cellulari umane semplicistiche e sperimentazioni cliniche. I recenti progress....
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Protocollo
1. Scongelamento, passaggio ed espansione delle iPSC/ESC
NOTA: Per tutte le fasi di coltura cellulare, utilizzare le migliori pratiche per mantenere una coltura cellulare sterile.
- Rivestire una piastra di coltura cellulare a 6 pozzetti con mezzo a matrice di membrana basale.
- Per preparare 1x di questo mezzo, seguire le specifiche del prodotto o diluire il mezzo a matrice fredda da 75 μL con 9 ml di DMEM/F12. Aggiungere 1,5 ml di 1x mezzo per pozzetto appena preparato in una piastra a 6 pozzetti. Incubare a 37 °C per 30 min.
- Aspirare il mezzo della matrice della membrana basale e risciacquare ogni pozzetto con 3 m....
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Risultati
Gli organoidi retinici sono stati generati da una linea iPSC di controllo non MacTel. Dopo che gli organoidi hanno raggiunto le 26 settimane di coltura, sono stati selezionati e divisi in gruppi sperimentali. Gli organoidi sono stati trattati con concentrazioni variabili di deossiSA per determinare se il deossiSA è tossico per i fotorecettori. Sono state testate quattro concentrazioni di deossiSA, da 0 a 1 μM (Figura 2) e gli organoidi sono stati trattati per 8 giorni, con cambiamenti dei te.......
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Discussione
Variazioni del protocollo di differenziazione
Dall'invenzione delle coppe ottiche autoformanti da parte del gruppo20 di Yoshiki Sasai, molti laboratori hanno sviluppato protocolli per generare organoidi retinici che possono variare in quasi ogni fase 5,18,19,21. Un elenco esaustivo di protocolli può essere trovato in Capowski et al.2.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno conflitti di interesse.
Ringraziamenti
Supportato dal Lowy Medical Research Institute. Vorremmo ringraziare la famiglia Lowy per il loro sostegno al progetto MacTel. Vorremmo ringraziare Mari Gantner, Mike Dorrell e Lea Scheppke per il loro contributo intellettuale e l'assistenza nella preparazione del manoscritto.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| 0.5M EDTA | Invitrogen | 15575020 | |
| 125mL Erlenmeyer Flaconi | VWR | 89095-258 | |
| 1-deossisfinganina | Avanti | 860493 | |
| B27 Supplemento, meno vitamina A | Gibco | 12587010 | |
| Beaver 6900 Mini-Blade | Beaver-Visitec | BEAVER6900 | |
| D-(+)-Saccarosio | VWR | 97061-432 | |
| DAPI | Thermo-fisher | D1306 | |
| Dispase II, polvere | Gibco | 17105041 | |
| DMEM, glucosio alto, piruvato | Gibco | 11995073 | |
| DMEM/F12 | Gibco | 11330 | |
| Asino anti-coniglio Ig-G, Alexa Fluor plus 555 | Thermo-fisher | A32794 | |
| siero | d'asinoSigma | D9663-10ML | |
| FBS, Inattivato a Caldo | Corning | 45001-108 | |
| Fenofibrato | Sigma | F6020 | |
| Glutamax | Gibco | 35050061 | |
| Eparina | Stemcell Technologies | 7980 | |
| Kit di Rilevamento della Morte Cellulare In Situ, Fluorescin | Sigma | 11684795910 | |
| Matrigel, fattore di crescita ridotto | Corning | 356230 | |
| MEM Soluzione di aminoacidi non essenziali | Gibco | 11140050 | |
| mTeSR 1 | Stemcell Technologies | 85850 | |
| N2 Integratore | Gibco | 17502048 | |
| Penicillina-Streptomicina | Gibco | 15140122 | |
| Pierce 16% Formaldeide | Thermo-fisher | 28906 | |
| Anticorpo anti-Recoverina di coniglio | Millipore | AB5585 | |
| Citrato di sodio | Sigma | W302600 | |
| Steriflip Unità filtranti sottovuoto monouso sterili | MilliporeSigma | SE1M179M6 | |
| Taurina | Sigma | T0625 | |
| Tessuto Plus- Composto OCT | Fisher Scientific | 23-730-571 | |
| Tissue-Tek Cryomold | EMS | 62534-10 | |
| Triton X-100 | Sigma | X100 | |
| Tween-20 | Sigma | P1379 | |
| Attacco ultra-basso Piastre a 6 pozzetti | Corning | 29443-030 | |
| Attacco ultra-basso 75cm2 U-Flask | Corning | 3814 | |
| Sistema di filtrazione sottovuoto | VWR | 10040-436 | |
| Vectashield-montaggio vettore medio | Labs | H-1000 | |
| penna per cera-ImmEdge | vettore Labs | H-4000 | |
| Y-27632 Dicloridrato (Inibitore della roccia) | Sigma | Y0503 |
Riferimenti
- Waring, M. J., et al. An analysis of the attrition of drug candidates from four major pharmaceutical companies. Nature Review Drug Discovery. 14 (7), 475-486 (2015).
- Khalil, A. S., Jaenisch, R., Mooney, D. J.
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Ristampe e permessi
