Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Toksicitetsskærme i humane retinale organoider til farmaceutisk opdagelse

Published: March 4, 2021 doi: 10.3791/62269
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2, 1,2
1Lowy Medical Research Institute, 2The Scripps Research Institute

Summary

Her præsenterer vi en trinvis protokol til generering af modne humane retinale organoider og udnytter dem i et fotoreceptortoksicitetsassay for at identificere farmaceutiske kandidater til den aldersrelaterede retinale degenerative sygdom makulær telangiectasia type 2 (MacTel).

Abstract

Organoider giver en lovende platform til at studere sygdomsmekanismer og behandlinger direkte i forbindelse med humant væv med alsidighed og gennemstrømning af cellekultur. Modne humane retinale organoider bruges til at screene potentielle farmaceutiske behandlinger for den aldersrelaterede retinale degenerative sygdom makulær telangiectasia type 2 (MacTel).

Vi har for nylig vist, at MacTel kan være forårsaget af forhøjede niveauer af en atypisk lipidart, deoxysphingolipider (deoxySL'er). Disse lipider er giftige for nethinden og kan drive fotoreceptortabet, der opstår hos MacTel-patienter. For at screene lægemidler for deres evne til at forhindre deoxySL-fotoreceptortoksicitet genererede vi humane retinale organoider fra en ikke-MacTel-induceret pluripotent stamcellelinje (iPSC) og modnede dem til en postmitotisk alder, hvor de udvikler alle de neuronale afstamningsafledte celler i nethinden, herunder funktionelt modne fotoreceptorer. De retinale organoider blev behandlet med en deoxySL-metabolit, og apoptose blev målt inden for fotoreceptorlaget ved hjælp af immunhistokemi. Ved hjælp af denne toksicitetsmodel blev farmakologiske forbindelser, der forhindrer deoxySL-induceret fotoreceptordød, screenet. Ved hjælp af en målrettet kandidattilgang fastslog vi, at fenofibrat, et lægemiddel, der almindeligvis ordineres til behandling af højt kolesteroltal og triglycerider, også kan forhindre deoxySL-toksicitet i cellerne i nethinden.

Toksicitetsskærmen identificerede med succes et FDA-godkendt lægemiddel, der kan forhindre fotoreceptordød. Dette er et direkte handlingsmæssigt fund på grund af den meget sygdomsrelevante model, der testes. Denne platform kan let ændres til at teste et vilkårligt antal metaboliske stressorer og potentielle farmakologiske indgreb til fremtidig behandlingsopdagelse i nethindesygdomme.

Introduction

Modellering af menneskelig sygdom i cellekultur og dyremodeller har givet uvurderlige værktøjer til opdagelse, modifikation og validering af farmakologisk terapi, så de kan gå videre fra kandidatlægemiddel til godkendt behandling. Selv om en kombination af in vitro- og ikke-humane in vivo-modeller længe har været en kritisk komponent i lægemiddeludviklingspipelinen, undlader de ofte at forudsige den kliniske ydeevne af nye lægemiddelkandidater1. Der er et klart behov for udvikling af teknologier, der bygger bro mellem forenklede humane cellulære monokulturer og kliniske forsøg. Nylige teknologiske fremskridt inden for selvorganiserede tredimensionelle vævskulturer, organoider, har forbedret deres troskab til de væv, de modellerer, hvilket gør dem lovende værktøjer i den prækliniske lægemiddeludviklingspipeline2.

En stor fordel ved human cellekultur i forhold til ikke-menneskelige in vivo-modeller er evnen til at replikere de specifikke forviklinger i menneskelig metabolisme, som kan variere betydeligt selv mellem hvirveldyr af højere orden som mennesker og mus3. Denne specificitet kan imidlertid overskygges af et tab i vævskompleksitet; Dette er tilfældet for nethindevæv, hvor flere celletyper er indviklet sammenvævet og har et unikt symbiotisk metabolisk samspil mellem cellulære undertyper, der ikke kan replikeres i en monokultur4. Humane organoider, som giver en faksimile af komplekse humane væv med tilgængelighed og skalerbarhed af cellekultur, har potentialet til at overvinde manglerne ved disse sygdomsmodelleringsplatforme.

Retinale organoider afledt af stamceller har vist sig at være særligt trofaste i modellering af det komplekse væv i den menneskelige neurale nethinden5. Dette har gjort retinal organoidmodellen til en lovende teknologi til undersøgelse og behandling af retinal sygdom 6,7. Hidtil har meget af sygdomsmodelleringen i retinale organoider fokuseret på monogene nethindesygdomme, hvor retinale organoider stammer fra iPSC-linjer med sygdomsfremkaldende genetiske varianter7. Disse er generelt meget penetrerende mutationer, der manifesterer sig som udviklingsfænotyper. Mindre arbejde er blevet effektivt gjort på aldrende sygdomme, hvor genetiske mutationer og miljømæssige stressfaktorer påvirker væv, der har udviklet sig normalt. Neurodegenerative aldringssygdomme kan have kompleks genetisk arv og bidrag fra miljømæssige stressfaktorer, der i sagens natur er vanskelige at modellere ved hjælp af kortvarige cellekulturer. Imidlertid kan disse komplekse sygdomme i mange tilfælde samles på almindelige cellulære eller metaboliske stressfaktorer, der, når de testes på et fuldt udviklet humant væv, kan give kraftig indsigt i neurodegenerative aldringssygdomme8.

Den sent indsættende makuladegenerative sygdom, makula telangiectasia type II (MacTel), er et godt eksempel på en genetisk kompleks neurodegenerativ sygdom, der samler sig på en fælles metabolisk defekt. MacTel er en usædvanlig retinal degenerativ aldringssygdom, der resulterer i fotoreceptor og Müller glia tab i makulaen, hvilket fører til et progressivt tab i centralt syn 9,10,11,12,13. I MacTel driver en ubestemt, muligvis multifaktoriel, genetisk arv en almindelig reduktion i cirkulerende serin hos patienter, hvilket resulterer i en stigning i en neurotoksisk lipidart kaldet deoxysphingolipider (deoxySL)14,15. For at bevise, at akkumulering af deoxySL er giftigt for nethinden og for at validere potentielle farmaceutiske behandlinger, udviklede vi denne protokol til at analysere fotoreceptortoksicitet i humane retinale organoider14.

Her skitserer vi en specifik protokol til differentiering af humane retinale organoider, etablering af et toksicitets- og redningsassay ved hjælp af organoider og kvantificering af resultater. Vi giver et vellykket eksempel, hvor vi bestemmer den vævsspecifikke toksicitet af et mistænkt sygdomsfremkaldende middel, deoxySL, og validerer brugen af et sikkert generisk lægemiddel, fenofibrat, til potentiel behandling af deoxySL-induceret retinal toksicitet. Tidligere arbejde har vist, at fenofibrat kan øge nedbrydningen af deoxySL og lavere cirkulerende deoxySL hos patienter, men dets effektivitet til reduktion af deoxySL-induceret retinal toksicitet er ikke blevet testet16,17. Selvom vi præsenterer et specifikt eksempel, kan denne protokol bruges til at evaluere effekten af et vilkårligt antal metaboliske / miljømæssige stressorer og potentielle terapeutiske lægemidler på nethindevæv.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Optøning, gennemtøning og udvidelse af iPSC'er/ESC'er

BEMÆRK: For alle celledyrkningstrin skal du bruge bedste praksis til at opretholde en steril cellekultur.

  1. Overtræk en 6-brønds cellekulturplade med kældermembranmatrixmedium.
    1. For at klargøre 1x af dette medium skal du følge produktspecifikationerne eller fortynde 75 μL koldmatrixsubstrat med 9 ml DMEM/F12. Tilsæt 1,5 ml frisklavet 1x medium pr. brønd i en plade med 6 huller. Der inkuberes ved 37 °C i 30 minutter.
    2. Opsug kældermembranmatrixmediet af, og skyl hvert hul med 3 ml DMEM/F12. Der tilsættes 2 ml DMEM/F12 og inkuberes ved 37 °C indtil brug. Brug pladen den dag, den er tilberedt.
  2. Der fremstilles en 10 mM stamopløsning af bjerghæmmeren (Y-27632-dihydrochlorid) i PBS, og den opbevares ved -20 °C indtil brug.
  3. Optø et hætteglas med iPSC'er/ESC i DMEM/F12-mediet og centrifuger ved 400 x g i 5 minutter. Supernatanten suges til syn, og pelletpen opslæmmes igen i mTeSR-medium. Plade 1 hætteglas med celler på en belagt 6-brønd i mTeSR-medier med 10 μM stenhæmmer (Y-27632 dihydrochlorid) og inkuberes natten over i inkubatoren. Den næste dag skal du aspirere af medier og tilføje bare mTeSR igen.
    BEMÆRK: Skift medie hver dag indtil forbipasserende.
  4. Der fremstilles 0,5 mM EDTA i PBS ved at fortynde 500 μL 0,5 M EDTA i 500 ml PBS.
  5. Passage celler, når de når 80-90% sammenløb. Opdel cellerne 1:3 eller 1:6 pr. brønd, afhængigt af cellernes væksthastighed.
    1. For at fjerne klæbende celler fra pladen, aspireres mediet og inkuberes med 0,5 mM EDTA i PBS i 5 minutter ved stuetemperatur. Efter inkubation fjernes EDTA-opløsningen, og cellerne løftes af ved kraftigt at skubbe 1 ml mTeSR-medium ud på cellerne med en p1000-pipette.
    2. Fortsæt med at suge op og kraftigt skubbe mTeSR-medium og celler ud op til 5x for at fjerne de klæbende resterende celler. Pladeceller på en frisk kældermembranmatrixbelagt 6-brønds plade med mTeSR-medium. Fortsæt med at udskifte medier dagligt, indtil pladerne igen når 80-100% sammenløb.
  6. Når cellerne har udvidet sig til en fuld 6-brønds plade og har nået 80-100% sammenløb, skal du afsætte en brønd for at udvide cellelinjen til efterfølgende differentieringer eller fryse til kryopræservering. Brug de resterende fem brønde til at starte differentieringsprocessen ved at lave embryoide kroppe.

2. Fremstilling af embryoide kroppe (EB'er)

BEMÆRK: EB-dannelses- og differentieringsmedieopskrifter er afledt af protokoller i Cowan et al.5, Ohlemacher et al.18 og Zhong et al.19.

  1. Forbered 1x Dispase-opløsning og neurale induktionsmedier (NIM) som beskrevet nedenfor.
    1. Forbered 10 mg/ml 5x stamopløsning af Dispase ved at opløse pulveret i DMEM/F12. Sterilt filter ved hjælp af et 0,22 μm filter. Opbevar 1 ml alikvoter ved -20 °C indtil brug.
    2. Brug 5x Dispase-opløsningen til at forberede 1 ml/hul 2 mg/ml Dispase i DMEM/F12. Opløsningen opvarmes ved 37 °C i 30 min.
    3. Forbered NIM ved at supplere DMEM / F12 med 1% N2 supplement, 1% MEM NEAA og 2 mg / ml heparin ved 180 E / mg. NIM kan opbevares ved 4 ° C i op til en måned.
  2. Forbered og varm 16 ml 3: 1 blanding af mTeSR: NIM (12 ml: 4 ml) opløsning til stuetemperatur.
  3. Fjern differentierede celler og tilsæt varm Dispase-opløsning.
    1. Fjern differentierende celler fra iPSC'erne/ESC'ernes cellekultur. Under et dissektionsomfang skrabes uigennemsigtige hvide kolonier af med en p10-pipettespids. Opsug mTeSR-mediet fra kulturbrøndene. Dette vil fjerne de differentierede klumper, der lige blev skrabet af.
    2. Den forvarmede Dispase-opløsning tilsættes straks og inkuberes ved 37 °C, indtil de fleste kanter af cellekolonierne begynder at krølle sig sammen under et mikroskop. Dette vil tage 4-8 min.
      BEMÆRK: Inkubationstiden for celler i Dispase skal bestemmes for hvert laboratorium. Varigheden kan variere mellem cellelinjer, og der kræves en længere inkubation for celler, der er blevet belagt i 3 dage eller mere. Langsomt voksende iPSC'er / ESC'er, der tager mere end 3 dage at nå sammenløb, begynder at klæbe med større styrke til pladen, hvilket gør det vanskeligt at løfte cellerne af. For langsomt voksende celler, prøv at passere celler ved 1: 2 for udvidelse til en fuld 6-brøndplade for at reducere tiden fra plettering til sammenløb.
  4. Opsug opløsningen, og tilsæt forsigtigt mindst 2 ml DMEM/F12-medium pr. hul. Tilsæt DMEM / F12 medium langsomt til siden af brønden, pas på ikke at løsne cellerne.
    1. Aspirer DMEM / F12-medium og tilsæt derefter kraftigt frisk 1 ml DMEM / F12 direkte på cellerne for at løfte cellekolonier fra pladen. Med en p1000-pipette suges DMEM/F12 gentagne gange op og skubbes kraftigt ud i brønden, op til 5x, for at løsne så mange cellekolonier som muligt.
      BEMÆRK: Differentierende/differentierede iPSC'er/ESC'er klæber mere til pladen end udifferentierede iPSC'er/ESC'er. Celler, der ikke kommer ud med gentagen pipettering, efterlades bedst. Overskydende pipettering dræber celler og reducerer effektiviteten af EB-produktionen. Celleklumper vil have mellem 100-400 celler pr. Klump.
  5. Overfør flydende kolonier til et 15 ml konisk rør og skyl brønde med yderligere 1 ml DMEM / F12 medium pr. Brønd for at opsamle eventuelle resterende flydende kolonier.
  6. Lad de flydende kolonier sætte sig ved tyngdekraften i højst 5 min. Når supernatanten er bundfældet, fjernes alle supernatanter undtagen 1-2 ml. Pas på ikke at røre den bløde pellet i bunden.
  7. Resuspender pellet i forvarmet 3: 1 mTeSR: NIM-medium og overfør til en T75-kolbe med ultralav fastgørelse. Inkuber natten over for at tillade EB'er at dannes. Dette vil blive betragtet som dag 0 af differentiering.
  8. Skift gradvist medier til NIM for at begynde differentieringen af EB'er i neurale forfædre.
    1. Den følgende dag fjernes mediet, og det erstattes med 10 ml 1:1 mTeSR:NIM-medie. For at fjerne medier fra fritflydende EB-kultur vippes kolben op, så EB'erne samles i kolbens nederste hjørne. Opsug supernatanten af, og sørg for ikke at opsuge nogen af EB'erne i pelleten i bunden.
    2. Den følgende dag udskiftes mediet med 10 ml 1:3 mTeSR:NIM-medium.
    3. Den næste dag skal du udskifte medierne med fuld NIM-medium. Fortsæt med at skifte medie hver 2. dag med NIM-medium indtil 7 dage efter behandling med Dispase.

3. Plating EB'er og initiering af neural retinal differentiering

  1. En uge efter Dispase-behandling, pladefritflydende EB'er på en 6-brønds plade belagt med vækstfaktorreduceret kældermembranmatrixmedium. For at belægge pladen, se trin 1.1.
    1. Aspirere brugte medier fra EB'er og erstatte med 12 ml NIM.
    2. Sørg for en jævn fordeling af EB'er i hver brønd ved at omrøre de EB-holdige medier for at resuspendere EB'erne, fjern derefter hurtigt 1/6 af mediet (2 ml) og dispenser i en brønd. Gentag for de resterende brønde.
    3. Før du inkuberer, skal du forsigtigt ryste pladen frem og tilbage og derefter side til side for at fordele EB'erne jævnt. Hvis EB'erne klumper sig sammen i midten, vil de ikke skelne ordentligt.
      BEMÆRK: Plating densitet er afgørende for differentiering. Sørg for at plade større end 30 EB'er pr. Brønd. Hvis EBs produktion ikke var effektiv, distribuere EB'er i færre brønde.
  2. Skift mediet dagligt med NIM-medium. Hold medieniveauet i brøndene ved ~ 3 ml. Når du skifter medie, skal du fjerne alle medier undtagen 1 ml for ikke at tørre de belagte EB'er ud, og tilsæt forsigtigt 2 ml medier til siden af brønden for ikke at løfte cellerne af pladen.
  3. Ni dage efter plettering af EB'er skal du begynde at ændre mediet fra NIM til Retinal Differentiation Media (RDM) i løbet af to dage.
    1. Forbered RDM ved at blande følgende: 48% DMEM/F12 (1:1) og 48% DMEM suppleret med 2% B27 tilskud uden vitamin A, 1% MEM NEAA og 1% Pen-Strep. Filtersteriliser ved hjælp af 0,20 μm filter. RDM kan opbevares ved 4 °C i op til en måned.
    2. Den første dag skal du skifte medie til en 1:1 blanding af NIM:RDM. På den anden dag skal du ændre medierne til RDM. Alle efterfølgende dage, foderceller RDM.
      BEMÆRK: I løbet af de næste par uger vil belagte EB'er danne neurale retinale forfædre, der begynder at generere synligt pigmenteret RPE.

4. Fremstilling af fritflydende organoider og opretholdelse af fritflydende organoidkulturer

  1. Fragmentbelagte EB'er 28 dage efter indledende Dispase-behandling (21 dage efter EB-plettering) ved hjælp af en steril skalpel til at skære et 1-2 mm2 gitter i belagte EB'er. Dette vil adskille retinale stamfaderkolonier i små bidder, så de senere i udviklingen ikke bliver for store og nekrose fra utilstrækkelig næringsstofudveksling i deres centrum.
  2. Afmonterede EB'er.
    1. For at gøre det skal du først tilføje yderligere 2 ml RDM til hver brønd. Derefter aspireres ~ 1000 μL medier fra brøndene ved hjælp af en p1000 pipette. Skub nu mediet kraftigt ud direkte på belagte EB'er med spidsen helt nedsænket.
    2. Gentag dette, indtil alle cellerne er løftet fra pladen. Hold spidsen nedsænket under udslyngning af mediet, og skub ikke pipettestemplet forbi det første stop for at undgå bobler.
  3. Resuspender nascently løsrevne EB-bidder i en steril plast 125 ml Erlenmeyerkolbe og fyld kolben med ~40 ml RDM medier. Placer kolben på en orbital shaker anbragt i en standard inkubator. Indstil rystehastigheden til 130-140 RPM (hastighedsindstilling 3).
    BEMÆRK: Dyrkning af organoider på en ryster forhindrer dem i at klæbe sammen, mens de dyrkes i en højere koncentration af organoider. Bioreaktorer opnår også de samme ender, men en ryster er billigere.
  4. Foder organoider med en delvis medieændring, der erstatter ca. 12 ml RDM 2-3 gange om ugen, afhængigt af hvor gul mediet bliver. Tidlige organoider kræver ikke meget fodring, men når de vokser, vil de kræve hyppigere medieændringer med flere medier.
  5. Beskær organoider hver anden uge for at fjerne ikke-retinale, overgroede og døende organoider. Dette forhindrer spild af medier og forbedrer sundheden for de resterende retinale organoider.
    1. Overfør celler fra deres kolbe til en 6-brønds plade eller 10 cm skål ved hjælp af en 5 ml pipette. Hold organoider, der viser stratificeret neuroepitel (figur 1A, stjerne). Disse organoider er gennemsigtige og hvide.
    2. Sorter og fjern dårligt formede eller overgroede retinale organoider og ikke-retinale organoider med en 5 ml pipette. Disse vil generelt være uigennemsigtige og gullige (figur 1A). Fjern også alt, der ikke ligner et stratificeret neuroepitel. De første par beskæringer vil være arbejdskrævende, men vil blive meget lettere hver efterfølgende gang, da organoider bliver større og mere homogene (figur 1B).

5. Vedligeholdelse af modne organoider og differentiering af dem til et postmitotisk nethindevæv

  1. På dag 56 (uge 8) efter den indledende Dispase-behandling for EB-dannelse (28 dage efter dyrkning af løsrevne EB'er i en kolbe) skiftes organoidmedier til RDM+. Dette vil give ekstra næringsstoffer til fuldt modne organoider som retinal væv.
    1. Forbered 100 mM taurin i PBS. Alikvoter opbevares ved -20 °C indtil brug.
    2. Forbered RDM + ved at supplere RDM med 10% FBS, 100 μM Taurin og 2 mM kommercielt glutamintilskud. Filtersteriliser ved hjælp af 0,20 μm filter.
    3. Fortsæt med at ændre RDM + medier 2-3 gange om ugen.
  2. I uge 17-18 (efter Dispase-behandling) overføres organoider fra Erlenmeyerkolben til en 6-brønds plade med ultralav fastgørelse ved hjælp af en 5 ml pipette. I den første uge fortsætter du med at beskære og adskille organoider fra hinanden dagligt, indtil organoider ikke længere holder sammen. Optimal tæthed er 10-15 organoider pr. Brønd. Skift medie 2-3 gange om ugen.
    BEMÆRK: Reducer antallet af organoider pr. brønd, hvis de organoider ofte klæber til hinanden, eller hvis medierne bliver meget gule mellem medieændringer.
  3. Forvent, at organoider bliver fuldt postmitotiske i uge 185 , når neurale retinale celler er til stede hele vejen igennem. I uge 24 skal du kontrollere dannelsen af rudimentære ydre segmenter på ydersiden af organoiden. I uge 26-28 skal du sikre, at de ydre segmenter er tykke på ydersiden af organoiderne (figur 1C). Udfør toksicitetsanalyser efter uge 26, når organoider har definerede ydre segmenter, der angiver en moden differentieringstilstand.
    BEMÆRK: Brug kun veldifferentierede retinale organoider til toksicitetsanalyse. Udførelse af toksicitetsanalyse på organoider med veldefinerede ydre segmenter vil muliggøre deres identifikation.

6. Deoxysphinganin (deoxySA) og lægemiddelbehandling

BEMÆRK: Her præsenteres en enkelt behandling af fenofibrat for at redde deoxySA-toksicitet over en periode på 4 dage (figur 2). Koncentration af deoxySA tilsat organoider, varighed af deoxySA-behandling på organoider og den type lægemiddel, der anvendes til at redde toksicitet14 , kan dog ændres i henhold til de eksperimentelle behov for at analysere toksicitet og toksicitetsredning.

  1. Forbered 1 mM stamopløsning af deoxySA i ethanol. Opbevares ved -20 °C i 1 måned. Alternativt kan der fremstilles en stamopløsning af deoxySA i DMSO.
  2. Udfør en seriel fortynding af deoxySA for at bestemme en passende toksisk koncentration af deoxySA til lægemiddelredning.
    BEMÆRK: Først bestemme en koncentration af deoxySA, der vil resultere i tilstrækkelig celledød til at måle en redningseffekt. Hvis koncentrationen er for høj, vil det toksiske respons resultere i opløsning af organoiden, og der vil ikke blive observeret nogen redning. Hvis det toksiske respons er for lavt, vil det være svært at observere en signifikant redningseffekt. Det deoxySA toksiske respons kan variere fra lab-til-lab og batch-til-batch af deoxySA.
    1. 1 mM deoxySA stamopløsning fortyndes til koncentrationer på 0,5 μM, 1 μM og 2 μM i 3 ml RDM+ hver. Tilsæt 3 μL ethanol til RDM+ for at forberede en kontrolbehandling.
    2. Under et dissektionsmikroskop skal du bruge en steril sonde til at vælge 4 grupper af organoider med mindst 5 organoider pr. Gruppe. Opdel grupperne i separate brønde med en 6-brøndsplade med ultralav fastgørelse. Vælg organoider, der har omtrent samme størrelse og form.
    3. Opsug så meget RDM + fra organoiderne som muligt. Til hver brønd af organoider tilsættes en koncentration af deoxySA i RDM +. Tilføj køretøjskontrol til den fjerde brønd af organoider.
    4. Efter to dages dyrkning i deoxySA eller vehikel udskiftes mediet med frisklavede tilsvarende deoxySA-fortyndinger i RDM+.
    5. På den fjerde behandlingsdag skal du fortsætte til trin 7 for at behandle og analysere organoider til celledød. Når en deoxySA-koncentration er valgt, fortsættes til trin 6.3 for at behandle med fenofibrat.
      BEMÆRK: Målcelledød i den valgte deoxySA-behandlingsgruppe er 5 - 20 TUNEL positive celler pr. 10.000 μm2. Organoiderne bør ikke opløses ved berøring af en sonde i løbet af behandlingen.
  3. Behandl organoider med den valgte toksiske dosis deoxySA og fenofibrat.
    1. Forbered en 40 mM stamopløsning af fenofibrat i DMSO. Opbevares ved -20 °C i op til 1 år.
    2. Forbered lægemiddelbehandlingsmediet: I 3 ml RDM+ fortyndes 1 mM deoxySA stamopløsning til 1 μM deoxySA og fortyndes 40 mM fenofibrat stamopløsning til 20 μM.
    3. Forbered deoxySA-behandlingsmedier: I 3 ml RDM+ fortyndes 1 mM deoxySA-stamopløsning til 1 μM deoxySA, og der tilsættes 1,5 μL DMSO.
    4. Forbered kontrolmediet: I 3 ml RDM+ tilsættes 3 μL ethanol og 1,5 μL DMSO.
    5. Under et dissektionsmikroskop ved hjælp af en steril sonde vælges tre grupper af organoider med mindst fem organoider pr. Gruppe. Opdel grupperne i separate brønde med en 6-brøndsplade med ultralav fastgørelse.
    6. Tilsæt de tilberedte behandlinger (deoxySA, deoxySA + fenofibrat eller kontrol) til organoiderne. Efter to dage ændres mediet i brøndene med frisklavet RDM + suppleret med tilsvarende deoxySA / fenofibrat / kontrolopløsninger.
    7. På den fjerde behandlingsdag fortsæt til trin 7 for at behandle og analysere organoider til celledød (figur 2).

7. Indlejring og kryosektion af organoider

  1. Forbered frisk 4% PFA ved at tilsætte 1 ml 16% PFA-ampul til 3 ml PBS.
  2. Fjern RDM + medier fra organoider og skyl en gang med PBS. Fjern så meget PBS som muligt fra organoider. Tilsæt 2 ml frisklavet 4% PFA (i PBS) til organoiderne og inkuber i 15 minutter ved stuetemperatur.
  3. Efter 15 minutters inkubation skylles organoider to gange med 2 ml PBS, vaskes derefter i PBS i 10 minutter.
    BEMÆRK: Udfør fiksering i en kemisk stinkhætte og kassér PFA-opløsning og to efterfølgende PBS-skylninger i en korrekt mærket PFA-affaldsbeholder, der opbevares i stinkdækslet.
  4. Opsug alle PBS, og tilsæt derefter 20% saccharose i PBS til de faste organoider. Sørg for, at organoiderne blandes i saccharoseopløsningen og ikke forbliver i en PBS-boble ovenpå. Opbevar organoiderne i saccharoseopløsningen, indtil de synker til bunden af saccharoseopløsningen, dvs. ~ 1 time ved stuetemperatur. Faste organoider kan opbevares i saccharoseopløsning natten over ved 4 °C.
  5. Integrer organoiderne i OCT-opløsning i en kryosektionsform. Flere organoider pr. Tilstand kan indlejres i en form. Orienter organoiderne og sørg for, at deres bedste retinale regioner vil blive tværsnittet på kryostaten, og midten af organoiderne er alle omtrent i samme plan. De indlejrede organoider fryses ved -20 °C. Indlejrede organoider kan opbevares ved -80 °C i årevis.
    BEMÆRK: Organoider er vanskelige at se i frosne OCT; orienter RPE-klynger mod siden af formen, der vender mod bladet for at lette organoididentifikation.
  6. Kryosektionsorganoider i 10-14 μm tykke sektioner og klæber sektioner til poly-L lysinbehandlede dias. Under kryosektionering skal du gentagne gange kontrollere diasene under et mikroskop for at identificere sektioner, der indeholder midten af organoiderne. Saml kun de midterste skiver af organoiderne, hvor alle lagene er jævnt repræsenteret (figur 2A-C, figur 3). Når diasene er sektioneret, kan de opbevares i en diasboks ved -80 °C i årevis.
    BEMÆRK: Skiver taget på enderne af organoid vil overprøve yderste fotoreceptorer og er ikke egnede til kvantificering. Organoider i gennemsnitlig størrelse vil give 10-15 skiver af midten af organoiden, som repræsenterer et tværsnit af de stratificerede retinale lag.

8. TUNEL-farvning til apoptotiske celler

  1. Optø frosne rutsjebaner i 30 minutter ved 37 °C. Øjeblikkelig placering af objektglas ved 37 °C forhindrer kondens. Vævsprøver gennemblødt i rent vand kan forvrænge vævet. En inkubation på 37 °C forbedrer også vævets vedhæftning til glasglasset.
  2. Opret en kontinuerlig kant på glasgliden omkring vævssektionerne ved hjælp af en hydrofob pen. Dette vil give en grænse og sikre tilstrækkelig fiksering og antistofinkubationer med lille volumen opløsninger. Tilsæt ca. 100-200 μL (volumenet fylder det hydrofobe grænseområde uden at spilde over) frisklavet 4% PFA i 20 minutter. Udfør fiksering i en kemisk stinkhætte og kassér PFA-opløsning i korrekt mærket PFA-affaldsbeholder, der opbevares i stinkdækslet.
  3. Skyl rutsjebanerne én gang i PBS, og vask derefter i PBS i 25 minutter ved stuetemperatur.
  4. Forbered TUNEL-blandingen. Optø både violette og blå hætteglas fra in situ-celledødsdetekteringssættet. Fjern 100 μL violet hætteglasopløsning (kan bruges til negativ kontrol) og kombiner de resterende 450 μL opløsning fra det violette hætteglas med 50 μL opløsning fra det blå hætteglas. Bland godt og hold i mørket. Hvert sæt hætteglas (500 μL i alt) kan plette 5-10 dias.
  5. Permeabiliser vævsskiver.
    1. Forbered permeabiliseringsopløsning: PBS med 0,1% TritonX-100 og 0,1% natriumcitrat
    2. Fjern PBS fra eksempeldias, og føj derefter Permeabilization Solution til prøver. Inkuber i 2 minutter på isblok eller ved 4 °C. Derefter skylles en gang i PBS og vaskes derefter i PBS i 10 min.
  6. Fjern PBS og tør så meget opløsning som muligt væk ved hjælp af hjørnet af et foldet væv. Der tilsættes 50-100 μL tilberedt TUNEL-blanding til prøverne, afhængigt af størrelsen af det område, der trækkes af den hydrofobe pen. Dækket med glasdæksel, slip og inkuber ved 37 °C i 1 time i mørke.
    BEMÆRK: Alle inkubationer og vaske til følgende trin skal udføres i mørke for at forhindre blegning af fluoroforer. Brug enten en mørk kasse eller dæk diasene med aluminiumsfolie for at blokere lyset.
  7. Mærk fotoreceptorerne. Skyl én gang med PBS og vask derefter i 20 minutter i PBS. Fjern PBS, tilsæt derefter primært Recoverin-antistof (kaninanti-Recoverin) fortyndet 1:500 i PBS med 0,1% Tween og 5% æselserum. Der inkuberes ved 4 °C natten over.
  8. Efter fjernelse af primært antistof skylles en gang i PBS og vaskes derefter i PBS i 20 minutter. Tilsæt sekundært antistof, æselantikanin med en orange eller rød fluorofor, fortyndet 1:1.000 i PBS med 0,1% Tween og 5% æselserum og inkuber ved stuetemperatur i 2 timer. Skyl én gang med PBS og vask derefter i 20 minutter i PBS. Tilsæt DAPI ved 1:1000 i PBS, inkuber ved stuetemperatur i 10 min.
  9. Skyl én gang med PBS og vask derefter i 20 minutter i PBS. Fjern PBS, og tilsæt monteringsmediet. Tilsæt dækslip, forsegl med neglelak og lad det tørre i mørke. Slides kan opbevares ved 4 °C i en mørk beholder i op til 1 uge.
    BEMÆRK: For at få den bedste billedkvalitet skal du tage billeder næste dag.

9. Billeddannelse af organoidskiver og kvantificering af døden.

BEMÆRK: Billeddannelse kræver et konfokalmikroskop med evner til at skelne mellem tre fluoroforkanaler. Dette eksperiment bruger grønne (Alexa Fluor 488), orange (Alexa Fluor 555) og UV (DAPI) kanaler. Enhver kombination af fluoroforer kan anvendes, hvilket sikrer, at emissionerne ikke bløder ind i de andre kanaler.

  1. Find retinale sektioner til billeddannelse og kvantificering. Under en lav forstørrelse af mikroskopet (5x eller 10x) skal du bruge Recoverin-farvning, som mærker cytoplasmaet af fotoreceptorer og DAPI-farvning, der mærker kernerne i alle celler, for at lokalisere et område af den skivede organoid, der er intakt, velformet og i et plan, der prøver et repræsentativt tværsnit af organoiden (figur 2 og figur 3 ). Find et afsnit, der har et særskilt ydre nukleart lag af fotoreceptorer, der er mindst et par celler tykt, og et separat og tydeligt lag af kerner, der ikke har Recoverin-farvning (figur 2 og figur 3).
  2. Indram billedet. Forøg mikroskopets forstørrelse til et 20x mål, og indram diaset for at fylde billedet med så meget af fotoreceptorlaget som muligt (figur 3).
  3. Indstil Z-planet. Hvis du bruger et mikroskop, der afbilder Z-stakke, skal du indstille de øvre og nedre grænser for Z-området for at afbilde hele dybden af udsnittet. Brug den samme Z-staktykkelse til alle billeder i et eksperimentelt sæt, så den samme mængde væv analyseres i alle prøver. Hvis du ikke bruger et mikroskop, der afbilder Z-stakke, skal du fokusere billedet til midten af skiven.
  4. Billede alle tre kanaler af fluoroforer i en Z-stack erhvervelse. Alle tre kanaler er nødvendige for positivt at identificere en døende celle. Billede et område pr. Organoid.
  5. Gem billedsættet i et filformat, der bevarer forholdet mellem areal pr. pixel.

10. Kvantificering af døende celler

  1. Åbn billedstakke i FIJI (Image J) software. I vinduet Indstillinger for import af bioformater skal du sikre dig, at der ikke er markeret nogen felter under afsnittet "opdelt i separate vinduer". Rulning mellem justerede billedkanaler er afgørende for korrekt identifikation af celler.
  2. Samkopier Z-stack-billedsættet ved at klikke på Image > Stacks , og vælg derefter 'Z-projekt' i rullemenuen. Dette vil skabe et nyt billede til kvantificering. Hvis organoiderne ikke blev afbildet i Z-serien, skal du springe dette trin over.
  3. Vælg den billedkanal, der viser Recoverin-farvning (rød i dette eksempel). Klik på polygonvalgsværktøjet i værktøjslinjen og skitser et kontinuerligt område af fotoreceptorer i billedet (figur 3A). Klik på Analyser > indstil målinger. I pop op-vinduet Indstil målinger skal du markere feltet ud for Område, klikke på Analyser og vælge Mål for at måle området (eller trykke på "m" som en genvej) af fotoreceptorer for at tælle døende celler. Arealmålingen vises i et pop op-opmålingsvindue.
  4. Tæl de TUNEL-positive kerner i det tidligere valgte fotoreceptorområde (figur 3B,C). Højreklik på punktværktøjet i værktøjslinjen, og vælg flerpunktsværktøj. Kun i TUNEL-kanalen skal du klikke på TUNEL-positiv farvning, der overlapper med en DAPI-positiv kerne og Recoverin-farvning. Skift mellem kanalerne for at validere positive celler.
  5. Opdel antallet af TUNEL-positive celler med området for at få en normaliseret værdi for celledød i fotoreceptorer pr. Organoid (figur 2D, E).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Retinale organoider blev genereret fra en ikke-MacTel kontrol iPSC-linje. Efter organoider nåede 26 uger i kultur, blev de udvalgt og opdelt i eksperimentelle grupper. Organoider blev behandlet med varierende koncentrationer af deoxySA for at afgøre, om deoxySA er toksisk for fotoreceptorer. Fire koncentrationer af deoxySA blev testet, fra 0 til 1 μM (figur 2), og organoider blev behandlet i 8 dage med medieskift hver anden dag. Celledød som reaktion på deoxySA er koncentrationsafhængig og påviselig i så lidt som 50 nM deoxySA (figur 2D). Den højeste testede koncentration, 1 μM deoxySA, gav en robust effekt, samtidig med at retinalorganoidens integritet blev opretholdt (figur 2B, D). En højere koncentration på 5 μM deoxySA forårsagede opløsning af organoider inden for få dage (data ikke vist). Resultaterne af deoxySA-dosisresponsen bestemte den optimale koncentration af deoxySA til fremtidige toksicitetsforsøg. Dosis på 1 μM deoxySA resulterede i en betydelig celledød uden overmættende toksicitet, som blev observeret ved 5 μM.

For at teste fenofibrat evne til at redde deoxySA-induceret celledød blev retinale organoider behandlet med enten 1 μM deoxySA, 1 μM deoxySA plus 20 μM fenofibrat eller en ingen behandling køretøjskontrol (figur 2A-C, E). 20 μM fenofibrat behandlingen forhindrede deoxySA-induceret toksicitet i fotoreceptorerne af retinale organoider, hvilket signifikant reducerede celledød med ca. 80% efter 4 dages behandling (figur 2A-C, E)16. Yderligere lipidændrende lægemidler blev testet ved hjælp af den samme protokol, herunder fumonosin-B1, som viste en fuldstændig redning af deoxySA-toksicitet. Beslægtede lipidarter blev også testet for at identificere den specifikke nedstrøms sphingolipidmetabolit, der fører til fotoreceptorcelledød14.

Figure 1
Figur 1: Repræsentative lyse feltbilleder af organoider under et omvendt lysmikroskop . (A) 4 uger gamle organoider 2 dage efter løsrivelse viser passende retinal lagdeling (hvid *) eller ikke-retinal organoid udvikling. (B) Udvikling af organoider i uge 13. (C) Retinale organoider i uge 28 med klar retinal lagdeling og velformede ydre segmenter, der rager ud fra det ydre fotoreceptorlag (hvid bjælke). Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 2
Figur 2: Repræsentative konfokale billeder af celledød. Repræsentative konfokale billeder af celledød (TUNEL, grøn) i fotoreceptorlaget (Recoverin, rød) af retinalorganoiden efter 4 dages behandling med enten kontrolmedier (A), 1 μM deoxySA (B) eller 1 μM deoxySA med 20 μM fenofibrat (C). D) Kvantificering af celledød i humane fotoreceptorer efter behandling af retinal organoidvæv med varierende koncentrationer af deoxySA. E) Kvantificering af celledød i humane fotoreceptorer efter behandling af retinal organoidvæv med kontrolmedier (n=6), 1 μM deoxySA (n=22), 1 μM deoxySA + 20 μM fenofibrat (n=21). *p<0.05, ***p<0.001 med envejs ANOVA og post hoc Tukey test. Data stammer fra New England Journal of Medicine, Gantner, M., Eade, K. og Wallace. M., et al. Serin- og lipidmetabolisme i makulær sygdom og perifer neuropati, 381 (15), 1422-1433, Copyright © (2019) Massachusetts Medical Society. Genoptrykt med tilladelse. 14Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: Skærmbilleder, der viser et konfokalbillede af en snittet og farvet organoid behandlet med 1 μM deoxySA set ved hjælp af FIJI-software. Fluorescerende kanaler er blevet opdelt i α-Recoverin (A, rød), TUNEL (B, grøn) og DAPI (C, blå). (A) Fotoreceptorområdet er blevet skitseret ved hjælp af polygonværktøjet valgt i værktøjslinjen (øverst til venstre). (B,C) Celletællinger ved hjælp af flerpunktsværktøjet, der er valgt på værktøjslinjen, af TUNEL-positive (B, grønne) og DAPI-positive (C, blå) celler i fotoreceptorlaget. Klik her for at se en større version af denne figur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Variationer i differentieringsprotokol
Siden opfindelsen af selvdannende optiske kopper af Yoshiki Sasais gruppe20 har mange laboratorier udviklet protokoller til generering af retinale organoider, der kan variere ved næsten hvert trin 5,18,19,21. En udtømmende liste over protokoller findes i Capowski et al.22. Den differentieringsprotokol, vi leverer her, er en simpel protokol med lav intervention, der giver et godt udgangspunkt for ethvert laboratorium, der forsøger at differentiere modne retinale organoider. Brugere opfordres til at udforske og vedtage variationer af denne protokol. Almindelige trin for protokolvariation er produktion og tidlig differentiering af EB'er og brugen af differentieringsfaktorer som BMP4, DKK-1 eller retinsyre for at forbedre effektiviteten 5,19,23.

Dyrkning af organoider på en ryster i meget af den sene fase udvikling har været et effektivt skridt til at øge differentieringseffektiviteten og reducere den tid, der bruges på håndtering af organoider. Bioreaktorer opnår de samme ender24, men det er mere omkostningseffektivt at bruge en ryster med engangsflasker til Erlenmyer og kan gøres med almindeligt laboratorieudstyr. Den største fordel ved at holde organoiderne i mobiliseret suspension er, at det fjerner behovet for at adskille organoider, der klæber sammen på pladen, mens de vokser. De suspenderede kulturer letter også større næringsstofudveksling, så organoider har en tendens til at vokse sig større end dem på en standard stille plade. Af denne grund er det godt at starte med at fragmentere belagte EB'er så små som muligt i trin 4.1.

Da opnåelse af modne retinale organoider kræver differentiering af en enkelt kultur i næsten 6 måneder, kan udførelse af toksicitetsanalyser på retinale organoider virke tidskrævende sammenlignet med at bruge en 2-D monokultur. Imidlertid udføres toksicitetsanalyser på en enkelt kontrollinje, og differentieringer kan opstilles rutinemæssigt. Efter en indledende 6-måneders investering vil en regelmæssig forsyning af organoider til at udføre yderligere eksperimenter og protokolændringer straks være til rådighed. Initiering af 2-3 runder af retinal organoid differentiering hver 1-2 måned giver rigeligt væv til komplekse og grundige sæt eksperimenter.

Organoider giver en alsidig model til målrettet lægemiddeltestning.
Denne protokol beskriver et fotoreceptortoksicitetsassay for at teste effekten af lipidændrende lægemidler til redning af deoxySL-induceret celledød. Selvom dette er en specifik applikation, der viser en farmakologisk redning for et sygdomsfremkaldende middel i MacTel, kan denne protokol bruges til at teste et vilkårligt antal fornærmelser (f.eks. Næringsstofmangel, hypoxiske tilstande, lystoksicitet) og farmakologiske redninger. Derfor kan den tilpasses til at modellere andre retinale sygdomme. I vores eget arbejde har vi vist, at ved at bruge den samme protokol og erstatte forskellige beslægtede sphingolipidarter og lægemidler, der direkte blokerer sphingolipidmetabolisme, var vi også i stand til at give indsigt i MacTel-sygdomsmekanismen ved at bestemme den specifikke toksiske nedstrøms sfingolipidmetabolit, der fører til fotoreceptorcelledød14 . I modsætning til modellering af sygdomme på niveau med genetiske mutationer, som kræver etablering af variante iPSC-linjer, giver brug af organoider til modellering af toksiske metaboliske tilstande og miljømæssige stressfaktorer mulighed for anvendelse af en fælles kontrol-iPSC-linje som en dynamisk model med rigelig og let tilgængelig vævskilde.

De humane organoidmodeller er særligt fordelagtige, når man studerer metaboliske sygdomme i nethinden, hvor forskellige celletyper har et unikt symbiotisk metabolisk samspil, der ikke kan replikeres i en monokultur af fotoreceptorlignende celler4. Denne komplekse metaboliske model har gjort det muligt for os at opdage effektiviteten af lægemidlet fenofibrat til forebyggelse af de toksiske virkninger af deoxySL'er direkte hos mennesker. I musemodeller af forhøjede deoxySL'er14 (upublicerede data) og museembryonale fibroblastcellekulturmodeller af deoxySL-metabolisme viste fenofibrat sig at være ineffektive16. Test af lægemidler i forbindelse med komplekse humane vævsmodeller vil give os mulighed for at identificere effektive behandlinger og se bort fra ineffektive behandlinger, der ellers ville være gået glip af, hvis vi kun havde stolet på mus eller forenklede monokulturer.

Fremtidig udvikling inden for lægemiddelscreening
I denne protokol kvantificerer vi apoptose i fotoreceptorer, den mest rigelige celletype. Men ved at bruge et af de dokumenterede antistoffer, der specifikt mærker de andre retinale celletyper, kan denne protokol ændres til at analysere celledød i enhver retinal celletype eller celleundertype (f.eks. Kegle vs stang). Ulempen ved at kvantificere apoptose ved hjælp af TUNEL-farvning i vævsskiver er, at det er en teknik med lav gennemstrømning til at kvantificere celledød, hvilket begrænser anvendelsen af dette assay til screening af små lister over kandidatlægemidler. En større skærm af ikke-målrettede lægemiddelbiblioteker ville ikke være mulig ved hjælp af en IHC-tilgang. Den fremtidige udvikling i denne protokol med henblik på at lette større lægemiddelscreeninger vil kræve integration af en lettere kvantificerbar celledødsmarkør. Mens disse er tilgængelige, uregelmæssigheden af retinale organoider i størrelse, tilstedeværelse eller fravær af ikke-retinale vævsvedhæng og variabilitet i fotoreceptorlagkvalitet gør det vanskeligt at normalisere resultater på tværs af organoider. Vi forventer, at fremtidige udviklinger for at øge gennemstrømningen af humane organoidsygdomsmodeller til screening af store lægemiddelbiblioteker i høj grad vil forbedre vores evne til at opdage, ændre og validere lægemidler, der vil gå videre fra prækliniske forsøg til godkendte behandlinger.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfattere har ingen interessekonflikter.

Acknowledgments

Støttet af Lowy Medical Research Institute. Vi vil gerne takke Lowy-familien for deres støtte til MacTel-projektet. Vi vil gerne takke Mari Gantner, Mike Dorrell og Lea Scheppke for deres intellektuelle input og hjælp til at udarbejde manuskriptet.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.5M EDTA Invitrogen 15575020
125mL Erlenmeyer Flasks VWR 89095-258
1-deoxysphinganine Avanti 860493
B27 Supplement, minus vitamin A Gibco 12587010
Beaver 6900 Mini-Blade Beaver-Visitec BEAVER6900
D-(+)-Sucrose VWR 97061-432
DAPI Thermo-fisher D1306
Dispase II, powder Gibco 17105041
DMEM, high glucose, pyruvate Gibco 11995073
DMEM/F12 Gibco 11330
Donkey anti-rabbit Ig-G, Alexa Fluor plus 555 Thermo-fisher A32794
donkey serum Sigma D9663-10ML
FBS, Heat Inactivated Corning 45001-108
Fenofibrate Sigma F6020
Glutamax Gibco 35050061
Heparin Stemcell Technologies 7980
In Situ Cell Death Detection Kit, Fluorescin Sigma 11684795910
Matrigel, growth factor reduced Corning 356230
MEM Non-Essential Amino Acids Solution Gibco 11140050
mTeSR 1 Stemcell Technologies 85850
N2 Supplement Gibco 17502048
Penicillin-Streptomycin Gibco 15140122
Pierce 16% Formaldehyde Thermo-fisher 28906
Rabbit anti-Recoverin antibody Millipore AB5585
Sodium Citrate Sigma W302600
Steriflip Sterile Disposable Vacuum Filter Units MilliporeSigma SE1M179M6
Taurine Sigma T0625
Tissue Plus- O.C.T. compound Fisher Scientific 23-730-571
Tissue-Tek Cryomold EMS 62534-10
Triton X-100 Sigma X100
Tween-20 Sigma P1379
Ultra-Low Attachment 6 well Plates Corning 29443-030
Ultra-Low Attachment 75cm2 U-Flask Corning 3814
Vacuum Filtration System VWR 10040-436
Vectashield-mounting medium vector Labs H-1000
wax pen-ImmEdge vector Labs H-4000
Y-27632 Dihydrochloride (Rock inhibitor) Sigma Y0503

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Waring, M. J., et al. An analysis of the attrition of drug candidates from four major pharmaceutical companies. Nature Review Drug Discovery. 14 (7), 475-486 (2015).
  2. Khalil, A. S., Jaenisch, R., Mooney, D. J. Engineered tissues and strategies to overcome challenges in drug development. Advances in Drug Delivery Reviews. 158, 116-139 (2020).
  3. Demetrius, L. Of mice and men. When it comes to studying ageing and the means to slow it down, mice are not just small humans. EMBO Reports. , 6 Spec No 39-44 (2005).
  4. Lindsay, K. J., et al. Pyruvate kinase and aspartate-glutamate carrier distributions reveal key metabolic links between neurons and glia in retina. Proceedings of the National Academy of Sciences U. S. A. 111 (43), 15579-15584 (2014).
  5. Cowan, C. S., et al. Cell types of the human retina and its organoids at single-cell resolution. Cell. 182 (6), 1623-1640 (2020).
  6. Kruczek, K., Swaroop, A. Pluripotent stem cell-derived retinal organoids for disease modeling and development of therapies. Stem Cells. 38 (10), 1206-1215 (2020).
  7. Sinha, D., Phillips, J., Phillips, M. J., Gamm, D. M. Mimicking retinal development and disease with human pluripotent stem cells. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 57 (5), 1-9 (2016).
  8. Gan, L., Cookson, M. R., Petrucelli, L., La Spada, A. R. Converging pathways in neurodegeneration, from genetics to mechanisms. Nature Neuroscience. 21 (10), 1300-1309 (2018).
  9. Aung, K. Z., Wickremasinghe, S. S., Makeyeva, G., Robman, L., Guymer, R. H. The prevalence estimates of macular telangiectasia type 2: the Melbourne collaborative cohort study. Retina. 30 (3), 473-478 (2010).
  10. Chew, E. Y., et al. Effect of ciliary neurotrophic factor on retinal neurodegeneration in patients with macular telangiectasia type 2: A randomized clinical trial. Ophthalmology. 126 (4), 540-549 (2019).
  11. Gass, J. D., Blodi, B. A. Idiopathic juxtafoveolar retinal telangiectasis. Update of classification and follow-up study. Ophthalmology. 100 (10), 1536-1546 (1993).
  12. Klein, R., et al. The prevalence of macular telangiectasia type 2 in the Beaver Dam eye study. American Journal of Ophthalmology. 150 (1), 55-62 (2010).
  13. Powner, M. B., et al. Loss of Muller's cells and photoreceptors in macular telangiectasia type 2. Ophthalmology. 120 (11), 2344-2352 (2013).
  14. Gantner, M. L., et al. Serine and lipid metabolism in macular disease and peripheral neuropathy. New England Journal of Medicine. 381 (15), 1422-1433 (2019).
  15. Scerri, T. S., et al. Genome-wide analyses identify common variants associated with macular telangiectasia type 2. Nature Genetics. 49 (4), 559-567 (2017).
  16. Alecu, I., et al. Cytotoxic 1-deoxysphingolipids are metabolized by a cytochrome P450-dependent pathway. Journal of Lipid Research. 58 (1), 60-71 (2017).
  17. Othman, A., et al. Fenofibrate lowers atypical sphingolipids in plasma of dyslipidemic patients: A novel approach for treating diabetic neuropathy. Journal of Clinical Lipidology. 9 (4), 568-575 (2015).
  18. Ohlemacher, S. K., Iglesias, C. L., Sridhar, A., Gamm, D. M., Meyer, J. S. Generation of highly enriched populations of optic vesicle-like retinal cells from human pluripotent stem cells. Curr Protoc Stem Cell Biol. 32, 1-20 (2015).
  19. Zhong, X., et al. Generation of three-dimensional retinal tissue with functional photoreceptors from human iPSCs. Nature Communication. 5, 4047 (2014).
  20. Eiraku, M., et al. Self-organizing optic-cup morphogenesis in three-dimensional culture. Nature. 472 (7341), 51-56 (2011).
  21. Wahlin, K. J., et al. Photoreceptor outer segment-like structures in long-term 3D retinas from human pluripotent stem cells. Science Reports. 7 (1), 766 (2017).
  22. Capowski, E. E., et al. Reproducibility and staging of 3D human retinal organoids across multiple pluripotent stem cell lines. Development. 146 (1), (2019).
  23. Luo, Z., et al. An optimized system for effective derivation of three-dimensional retinal tissue via Wnt signaling regulation. Stem Cells. 36 (11), 1709-1722 (2018).
  24. Ovando-Roche, P., et al. Use of bioreactors for culturing human retinal organoids improves photoreceptor yields. Stem Cell Research Therapy. 9 (1), 156 (2018).

Tags

Denne måned i JoVE udgave 169 retinal organoid organoid retinal degeneration MacTel sphingolipid fotoreceptor fenofibrat TUNEL farvning lægemiddel skærm lipid toksicitet
Toksicitetsskærme i humane retinale organoider til farmaceutisk opdagelse
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Eade, K., Giles, S., Harkins-Perry,… More

Eade, K., Giles, S., Harkins-Perry, S., Friedlander, M. Toxicity Screens in Human Retinal Organoids for Pharmaceutical Discovery. J. Vis. Exp. (169), e62269, doi:10.3791/62269 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter