Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

מסכי רעילות באורגנואידים ברשתית אנושית לגילוי תרופות

Published: March 4, 2021 doi: 10.3791/62269
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2, 1,2
1Lowy Medical Research Institute, 2The Scripps Research Institute

Summary

כאן אנו מציגים פרוטוקול שלב אחר שלב ליצירת אורגנואידים רשתית אנושיים בוגרים ומשתמשים בהם בבדיקת רעילות קולטני אור כדי לזהות מועמדים תרופתיים למחלת רשתית ניוונית הקשורה לגיל טלנגיאקטזיה מקולרית מסוג 2 (MacTel).

Abstract

אורגנואידים מספקים פלטפורמה מבטיחה לחקר מנגנונים וטיפולים במחלות, ישירות בהקשר של רקמה אנושית עם הרבגוניות והתפוקה של תרבית תאים. אורגנואידים רשתית אנושיים בוגרים משמשים לסינון טיפולים תרופתיים פוטנציאליים למחלת רשתית ניוונית הקשורה לגיל טלנגיאקטזיה מקולרית מסוג 2 (MacTel).

לאחרונה הראינו כי MacTel יכול להיגרם על ידי רמות גבוהות של מין שומנים לא טיפוסי, deoxysphingolipids (deoxySLs). שומנים אלה רעילים לרשתית ועלולים לגרום לאובדן קולטני האור המתרחש בחולי מקטל. כדי לסנן תרופות על יכולתן למנוע רעילות של קולטני אור deoxySL, יצרנו אורגנואידים של רשתית אנושית מקו תאי גזע פלוריפוטנטיים שאינם מושרים על ידי מקטל (iPSC) והבשלנו אותם לגיל פוסט-מיטוטי שבו הם מפתחים את כל התאים שמקורם בשושלת העצבית של הרשתית, כולל פוטורצפטורים בוגרים מבחינה תפקודית. אורגנואידי הרשתית טופלו במטבוליט deoxySL ואפופטוזיס נמדד בתוך שכבת הפוטורצפטור באמצעות אימונוהיסטוכימיה. באמצעות מודל רעילות זה, נבדקו תרכובות פרמקולוגיות המונעות מוות של קולטני אור הנגרמים על ידי deoxySL. באמצעות גישה מועמדת ממוקדת, קבענו כי פנופיברט, תרופה הנרשמת בדרך כלל לטיפול בכולסטרול גבוה וטריגליצרידים, יכולה גם למנוע רעילות deoxySL בתאי הרשתית.

מסך הרעילות זיהה בהצלחה תרופה שאושרה על ידי ה-FDA ויכולה למנוע מוות של קולטני אור. זהו ממצא מעשי ישירות בשל המודל הרלוונטי מאוד למחלה שנבדק. ניתן לשנות פלטפורמה זו בקלות כדי לבדוק כל מספר של גורמי לחץ מטבוליים והתערבויות פרמקולוגיות פוטנציאליות לגילוי טיפול עתידי במחלות רשתית.

Introduction

מידול מחלות אנושיות בתרביות תאים ובמודלים של בעלי חיים סיפק כלים שלא יסולא בפז לגילוי, שינוי ותיקוף של טיפולים פרמקולוגיים, ואפשר להם להתקדם מתרופה מועמדת לטיפול מאושר. למרות ששילוב של מודלים במבחנה ומודלים לא אנושיים in vivo הוא כבר זמן רב מרכיב קריטי בצנרת פיתוח התרופות, הם לעתים קרובות נכשלים בחיזוי הביצועים הקליניים של תרופות מועמדות חדשות1. יש צורך ברור בפיתוח טכנולוגיות שיגשרו על הפער בין מונוקולטורה תאית אנושית פשטנית לבין ניסויים קליניים. ההתקדמות הטכנולוגית האחרונה בתרביות רקמה תלת-ממדיות המאורגנות באופן עצמי, אורגנואידים, שיפרה את נאמנותן לרקמות שהן מדגימות והפכה אותן לכלים מבטיחים בצנרת פיתוח התרופות הפרה-קליניות2.

יתרון מרכזי של תרבית תאים אנושית על פני מודלים שאינם אנושיים in vivo הוא היכולת לשכפל את המורכבויות הספציפיות של חילוף החומרים האנושי, אשר יכול להשתנות במידה ניכרת אפילו בין חולייתנים מסדר גבוה יותר, כגון בני אדם ועכברים3. עם זאת, ספציפיות זו יכולה להיות מאפילה על ידי אובדן מורכבות רקמות; כזה הוא המקרה של רקמת רשתית שבה סוגי תאים מרובים שזורים זה בזה באופן מורכב ויש להם יחסי גומלין מטבוליים סימביוטיים ייחודיים בין תת-סוגים תאיים שלא ניתן לשכפל במונוקולטורה4. לאורגנואידים אנושיים, המספקים פקסימיליה של רקמות אנושיות מורכבות עם נגישות ומדרגיות של תרביות תאים, יש פוטנציאל להתגבר על הליקויים של פלטפורמות מידול מחלות אלה.

אורגנואידים ברשתית שמקורם בתאי גזע הוכיחו את עצמם כנאמנים במיוחד במידול הרקמה המורכבת של הרשתית העצבית האנושית5. זה הפך את מודל אורגנואיד הרשתית לטכנולוגיה מבטיחה לחקר וטיפול במחלות רשתית 6,7. עד כה, רוב מידול המחלה באורגנואידים ברשתית התמקד במחלות רשתית מונוגניות, שבהן אורגנואידים ברשתית נגזרים מקווי iPSC עם וריאנטים גנטיים גורמי מחלה7. בדרך כלל מדובר במוטציות חודרניות מאוד המתבטאות בפנוטיפים התפתחותיים. פחות עבודה נעשתה ביעילות על מחלות הזדקנות שבהן מוטציות גנטיות וגורמי עקה סביבתיים משפיעים על רקמות שהתפתחו באופן תקין. מחלות נוירודגנרטיביות של הזדקנות יכולות להיות בעלות תורשה גנטית מורכבת ותרומות מגורמי עקה סביבתיים שמטבעם קשה למדל באמצעות תרביות תאים לטווח קצר. עם זאת, במקרים רבים מחלות מורכבות אלה יכולות להתגבש על גורמי עקה תאיים או מטבוליים נפוצים, אשר, כאשר נבדקים על רקמה אנושית מפותחת, יכולים לספק תובנות רבות עוצמה על מחלות נוירודגנרטיביות של הזדקנות8.

המחלה הניוונית המקולרית המאוחרת, טלנגיאקטזיה מקולרית מסוג II (MacTel), היא דוגמה מצוינת למחלה נוירודגנרטיבית מורכבת גנטית המתלכדת על פגם מטבולי נפוץ. מקטל היא מחלה ניוונית נדירה ברשתית של הזדקנות הגורמת לאובדן קולטני אור וגליה Müller במקולה, מה שמוביל לאובדן פרוגרסיבי בראייה המרכזית 9,10,11,12,13. ב- MacTel, תורשה גנטית לא מוגדרת, אולי רב-גורמית, מניעה ירידה נפוצה בסרין במחזור הדם בחולים, וכתוצאה מכך עלייה במין שומנים נוירוטוקסיים הנקראים deoxysphingolipids (deoxySL)14,15. כדי להוכיח שהצטברות של deoxySL רעילה לרשתית ולאמת טיפולים תרופתיים פוטנציאליים, פיתחנו פרוטוקול זה כדי להעריך רעילות של קולטני אור באורגנואידים ברשתית אנושית14.

כאן אנו מתארים פרוטוקול ספציפי להבחנה בין אורגנואידים ברשתית אנושית, ביסוס בדיקת רעילות והצלה באמצעות אורגנואידים, וכימות תוצאות. אנו מספקים דוגמה מוצלחת שבה אנו קובעים את הרעילות הספציפית לרקמות של גורם חשוד כגורם מחלה, deoxySL, ומאמתים את השימוש בתרופה גנרית בטוחה, פנופיברט, לטיפול פוטנציאלי ברעילות רשתית הנגרמת על ידי deoxySL. עבודות קודמות הראו כי פנופיברט יכול להגביר את השפלה של deoxySL ולהוריד את deoxySL במחזור הדם בחולים, עם זאת, יעילותו בהפחתת רעילות הרשתית הנגרמת על ידי deoxySL לא נבדקה16,17. למרות שאנו מציגים דוגמה ספציפית, פרוטוקול זה יכול לשמש להערכת ההשפעה של כל מספר של גורמי עקה מטבוליים/סביבתיים ותרופות טיפוליות פוטנציאליות על רקמת הרשתית.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. הפשרה, העברה והרחבה של iPSCs/ESCs

הערה: עבור כל שלבי תרבית התא, השתמש בשיטות עבודה מומלצות כדי לשמור על תרבית תאים סטרילית.

  1. מצפים צלחת תרבית תאים בת 6 בארות בתווך מטריצת קרום מרתף.
    1. כדי להכין 1x של מדיום זה, עקוב אחר מפרטי המוצר או דלל מדיום מטריצה קרה 75 μL עם 9 מ"ל של DMEM/F12. מוסיפים 1.5 מ"ל של 1x בינוני טרי מוכן לכל באר בצלחת 6 באר. יש לדגור בטמפרטורה של 37°C למשך 30 דקות.
    2. יש לשאוף את מדיום ממברנת המרתף ולשטוף כל באר עם 3 מ"ל DMEM/F12. יש להוסיף 2 מ"ל DMEM/F12 ולדגור ב-37°C עד לשימוש. השתמשו בצלחת ביום הכנתה.
  2. הכינו תמיסת מלאי של 10 מילימטר של מעכב סלעים (Y-27632 דיהידרוכלוריד) ב-PBS, ואחסנו בטמפרטורה של -20°C עד לשימוש.
  3. הפשירו בקבוקון של iPSCs/ESCs לתוך DMEM/F12 בינוני וצנטריפוגה במהירות של 400 x גרם למשך 5 דקות. שאפו את הסופרנאטנט ותלו מחדש את הגלולה בתווך mTeSR. לוחית 1 של תאים על באר מצופה 6 בארות במדיה mTeSR עם 10 מיקרומטר של מעכב סלע (Y-27632 dihydrochloride) ולדגור לילה באינקובטור. למחרת, שאפו מהמדיה והוסיפו בחזרה רק mTeSR.
    הערה: החלף מדיה מדי יום עד שתעבור.
  4. הכן 0.5 mM EDTA ב- PBS על ידי דילול 500 μL של 0.5 M EDTA ב- 500 מ"ל PBS.
  5. תאי מעבר כאשר הם מגיעים למפגש של 80-90%. פיצול תאים 1:3 או 1:6 לכל באר, בהתאם לקצב הצמיחה של התאים.
    1. כדי להסיר תאים דבוקים מהצלחת, יש לשאוף מהמדיה ולדגור עם 0.5 mM EDTA ב-PBS למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר הדגירה, הסר תמיסת EDTA והרם תאים על ידי פליטה בכוח של 1 מ"ל של מדיום mTeSR על תאים עם פיפטה p1000.
    2. המשך למצוץ ולפלוט בכוח מדיום mTeSR ותאים, עד פי 5, כדי להסיר את התאים הנותרים שדבקו. תאי צלחת על צלחת ממברנת מרתף טרייה מצופה 6 בארות, עם מדיום mTeSR. המשיכו להחליף מדיה מדי יום עד שהפלטות יגיעו שוב למפגש של 80-100%.
  6. לאחר שהתאים התרחבו לצלחת מלאה של 6 בארות והגיעו למפגש של 80-100%, הקדישו באר אחת להרחבת קו התאים להתמיינות הבאה או להקפאה לצורך שימור בהקפאה. השתמש בחמש הבארות הנותרות כדי להתחיל את תהליך ההתמיינות על ידי יצירת גופים עובריים.

2. יצירת גופים עובריים (EBs)

הערה: מתכוני מדיה של היווצרות EB ובידול נגזרים מפרוטוקולים ב- Cowan et al.5, Ohlemacher et al.18 ו- Zhong et al.19.

  1. הכינו תמיסת דיספז 1x ומדיה אינדוקציה עצבית (NIM) כמתואר להלן.
    1. הכינו 10 מ"ג/מ"ל של תמיסת מלאי 5x של Dispase על ידי המסת האבקה ב-DMEM/F12. מסנן סטרילי באמצעות מסנן 0.22 מיקרומטר. יש לאחסן 1 מ"ל aliquots ב -20 °C עד לשימוש.
    2. באמצעות תמיסת 5x Dispase, להכין 1 מ"ל / באר של 2 מ"ג / מ"ל Dispase ב DMEM / F12. חממו את התמיסה ב-37°C למשך 30 דקות.
    3. הכינו NIM על ידי תוספת DMEM/F12 עם תוספת N2 1%, 1% MEM NEAA, ו-2 מ"ג/מ"ל הפרין ב-180 U/mg. ניתן לאחסן NIM ב-4°C למשך עד חודש.
  2. הכינו וחממו 16 מ"ל תערובת של תמיסה mTeSR:NIM (12 מ"ל: 4 מ"ל) לטמפרטורת החדר.
  3. הסר תאים ממוינים והוסף תמיסת דיספז חמה.
    1. הסר תאים מתבירות תאי iPSCs/ESCs. תחת טווח דיסקציה, מגרדים מושבות לבנות אטומות עם קצה פיפטה p10. שאפו את מדיום mTeSR מבארות התרבית. פעולה זו תסיר את הגושים המובחנים שזה עתה נשרטו.
    2. מיד להוסיף את תמיסת Dispase שחומם מראש לדגור ב 37 ° C עד שרוב הקצוות של מושבות התא מתחילים להתכרבל תחת מיקרוסקופ. זה ייקח 4-8 דקות.
      הערה: זמן הדגירה של תאים בדיספאזה יצטרך להיקבע עבור כל מעבדה. משך הזמן יכול להיות שונה בין שורות התאים ונדרשת דגירה ארוכה יותר עבור תאים שהיו מצופים במשך 3 ימים או יותר. תאי גזע פלוריפוטנטיים (iPSCs/ESCs) שגדלים לאט ולוקח להם יותר מ-3 ימים להגיע למפגש יתחילו להיצמד בחוזק רב יותר לצלחת, מה שיקשה על הרמת התאים. עבור תאים הגדלים לאט, נסו להעביר תאים ביחס של 1:2 לצורך התרחבות לצלחת מלאה בת 6 בארות כדי לקצר את הזמן מציפוי למפגש.
  4. שאפו את התמיסה והוסיפו בעדינות לפחות 2 מ"ל של מדיום DMEM/F12 לכל באר. מוסיפים את מדיום DMEM/F12 באיטיות לצד הבאר, תוך הקפדה שלא לעקור את התאים.
    1. שאפו את מדיום DMEM/F12 ואז הוסיפו בכוח 1 מ"ל טרי של DMEM/F12 ישירות לתאים כדי להרים מושבות תאים מהצלחת. עם פיפטה p1000 לשאוב שוב ושוב ולפלוט בכוח DMEM/F12 בבאר, עד פי 5, כדי לעקור מושבות תאים רבות ככל האפשר.
      הערה: iPSCs/ESCs מובחנים/מובחנים נדבקים לצלחת יותר מאשר iPSCs/ESC לא מובחנים. תאים שאינם יוצאים עם פיפטינג חוזר עדיף להשאיר מאחור. עודף צנרת הורג תאים ומפחית את יעילות ייצור EB. גושי תאים יהיו בין 100-400 תאים לכל גוש.
  5. העבירו מושבות צפות לצינור חרוטי בנפח 15 מ"ל ושטפו בארות בתווך DMEM/F12 נוסף של 1 מ"ל לכל באר כדי לאסוף מושבות צפות שנותרו.
  6. אפשרו למושבות הצפות להתיישב בכוח הכבידה למשך לא יותר מ-5 דקות. לאחר ההתיישבות, להסיר את כל supernatant מלבד 1-2 מ"ל. היזהר לא להתסיס את הגלולה הרכה בתחתית.
  7. יש להשהות מחדש את הגלולה במצב מחומם מראש ביחס של 3:1 mTeSR:NIM בינוני ולהעביר לצלוחית T75 בעלת חיבור נמוך במיוחד. יש לדגור במשך הלילה כדי לאפשר ל-EBs להיווצר. זה ייחשב יום 0 של בידול.
  8. שנה בהדרגה את המדיה ל- NIM כדי להתחיל את ההתמיינות של EBs לאבות עצביים.
    1. למחרת, הסר את המדיה והחלף ב- 10 מ"ל של 1:1 mTeSR:NIM בינוני. כדי להסיר מדיה מתרבית EB צפה, הטה את הבקבוק כלפי מעלה כך שה- EBs ייאספו בפינה התחתונה של הצלוחית. שאפו מהסופרנטנט, הקפידו לא לשאוף אף אחד מה-EBs בגלולה שבתחתית.
    2. למחרת, החלף את המדיה עם 10 מ"ל של 1:3 mTeSR:NIM בינוני.
    3. למחרת, החלף את המדיה במדיום NIM מלא. יש להמשיך להחליף מדיה כל יומיים עם NIM medium עד 7 ימים לאחר הטיפול בדיספאז.

3. ציפוי EBs וייזום התמיינות רשתית עצבית

  1. שבוע לאחר הטיפול בדיספאז, פלטות צפות בחופשיות על צלחת בעלת 6 בארות המצופה בתווך מטריצת קרום מרתף מופחת גורם גדילה. כדי לצפות לוחית, עיין בשלב 1.1.
    1. לשאוף מדיה בילה מ EBs ולהחליף עם 12 מ"ל של NIM.
    2. ודא חלוקה שווה של EBs לכל באר על ידי התסיסה של המדיה המכילה EB כדי להשעות מחדש את EBs, ולאחר מכן להסיר במהירות 1/6 מהמדיה (2 מ"ל) ולחלק לבאר אחת. חזור על הפעולה עבור הבארות הנותרות.
    3. לפני הדגירה, נערו בעדינות את הצלחת, קדימה ואחורה ואז מצד לצד, כדי לפזר את ה-EBs באופן שווה. אם ה- EBs מתגבשים באמצע הם לא יבדילו כראוי.
      הערה: צפיפות הציפוי היא קריטית לבידול. הקפד צלחת יותר מ 30 EBs לכל באר. אם ייצור EBs לא היה יעיל, להפיץ EBs לתוך פחות בארות.
  2. שנה את המדיה מדי יום עם מדיום NAM. שמור על רמת המדיה בבארות ב ~ 3 מ"ל. בעת החלפת מדיה, הסר את כל המדיה מלבד 1 מ"ל כדי לא לייבש את ה- EBs המצופים, והוסף 2 מ"ל של מדיה בעדינות לצד הבאר כדי לא להרים את התאים מהצלחת.
  3. תשעה ימים לאחר ציפוי EBs, התחל לשנות את המדיה מ- NIM ל- Retinal Differentiation Media (RDM) במהלך יומיים.
    1. הכינו RDM על ידי ערבוב הדברים הבאים: 48% DMEM/F12 (1:1) ו-48% DMEM בתוספת תוסף B27 2% ללא ויטמין A, 1% MEM NEAA ו-1% Pen-Strep. יש לעקר את המסנן באמצעות מסנן 0.20 מיקרומטר. RDM ניתן לאחסן ב 4 ° C עד חודש אחד.
    2. ביום הראשון, העבר את המדיה לשילוב של 1:1 של NIM:RDM. ביום השני, שנה את המדיה ל- RDM. כל הימים שלאחר מכן, להזין תאים RDM.
      הערה: במהלך השבועות הקרובים, EBs מצופים ייצרו אבות רשתית עצביים שמתחילים לייצר RPE פיגמנטי גלוי.

4. יצירת אורגנואידים צפים בחופשיות ושמירה על תרביות אורגנואידים צפות בחופשיות

  1. EBs מצופים פרגמנט ב 28 ימים לאחר הטיפול הראשוני Dispase (21 ימים לאחר ציפוי EB) באמצעות אזמל סטרילי לחתוך רשת 1-2 מ"מ2 לתוך EBs מצופה. זה יפריד את מושבות האב ברשתית לגושים קטנים, כך שבהמשך ההתפתחות הם לא יהיו גדולים מדי ונמק מחילופי חומרים מזינים לא מספיקים במרכזם.
  2. EBs מצופים ניתוק.
    1. לשם כך, תחילה הוסף 2 מ"ל נוספים של RDM לכל באר. לאחר מכן שאפו ~ 1000 μL של מדיה מהבארות באמצעות פיפטה p1000. כעת הוציאו בכוח את המדיה ישירות אל EBs מצופים כשהקצה שקוע במלואו.
    2. חזור על פעולה זו עד שכל התאים הורמו מהצלחת. שמור את הקצה שקוע במהלך פליטת המדיה ואל תדחוף את בוכנה פיפטה מעבר לתחנה הראשונה כדי למנוע בועות.
  3. השהה מחדש גושי EB מנותקים מתהווים לתוך בקבוק פלסטיק סטרילי 125 מ"ל Erlenmeyer ומלא את הבקבוק עם ~ 40 מ"ל של מדיה RDM. הניחו את הבקבוק על שייקר מסלולי, שהונח באינקובטור סטנדרטי. הגדר את מהירות השייקר ל- 130-140 סל"ד (הגדרת מהירות 3).
    הערה: גידול אורגנואידים על שייקר מונע מהם להידבק זה לזה בזמן גידול בריכוז גבוה יותר של אורגנואידים. גם ביוריאקטורים משיגים את אותן מטרות, אבל שייקר הוא פחות יקר.
  4. הזנה אורגנואידים עם שינוי מדיה חלקי, החלפת כ 12 מ"ל של RDM 2-3 פעמים בשבוע, תלוי כמה צהוב המדיה מקבלת. אורגנואידים מוקדמים לא ידרשו הזנה רבה, אך ככל שהם גדלים, הם ידרשו שינויי מדיה תכופים יותר עם יותר מדיה.
  5. גזום אורגנואידים כל שבועיים כדי להסיר אורגנואידים שאינם רשתית, מגודלים יתר על המידה וגוססים. פעולה זו מונעת בזבוז מדיה ומשפרת את בריאותם של אורגנואידי הרשתית הנותרים.
    1. מעבירים תאים מהבקבוק שלהם לצלחת 6 בארות או צלחת 10 ס"מ באמצעות פיפטה 5 מ"ל. שמרו על אורגנואידים שמציגים נוירואפיתל מרובד (איור 1A, כוכבית). אורגנואידים אלה שקופים ולבנים.
    2. מיין והסר אורגנואידים רשתית לא מעוצבים או מגודלים, ואורגנואידים שאינם רשתית עם פיפטה 5 מ"ל. אלה בדרך כלל יהיו אטומים וצהבהבים (איור 1A). גם להסיר כל דבר שלא נראה כמו neuroepithelium מרובד. הגיזום הראשון יהיה עתיר עבודה, אולם יהיה הרבה יותר קל בכל פעם שלאחר מכן כשהאורגנואידים יהיו גדולים והומוגניים יותר (איור 1B).

5. שמירה על אורגנואידים בוגרים והבדילתם לרקמת רשתית פוסט-מיטוטית

  1. ביום ה-56 (שבוע 8) לאחר הטיפול הראשוני ב-Dispase להיווצרות EB (28 ימים לאחר תרבית EBs שנעקרו ממקומם בצלוחית) יש לשנות את המדיה האורגנואידית ל-RDM+. זה יספק חומרים מזינים נוספים לאורגנואידים בוגרים לחלוטין כרקמת רשתית.
    1. הכן 100 mM טאורין ב PBS. יש לאחסן aliquots ב -20 °C עד לשימוש.
    2. הכינו RDM+ על ידי תוספת RDM עם 10% FBS, 100 מיקרומטר טאורין ותוסף גלוטמין מסחרי של 2 mM. יש לעקר את המסנן באמצעות מסנן 0.20 מיקרומטר.
    3. המשך להחליף מדיה RDM+ 2-3 פעמים בשבוע.
  2. בשבוע 17-18 (לאחר טיפול בדיספאזה) מעבירים אורגנואידים מבקבוק ארלנמאייר לצלחת חיבור 6 בארות נמוכה במיוחד באמצעות פיפטה 5 מ"ל. במשך השבוע הראשון, המשיכו לגזום ולהפריד אורגנואידים זה מזה מדי יום, עד שהאורגנואידים כבר לא נדבקים זה לזה. צפיפות אופטימלית היא 10-15 אורגנואידים לכל באר. החליפו מדיה 2-3 פעמים בשבוע.
    הערה: הפחיתו את מספר האורגנואידים לבאר אם הם נצמדים זה לזה לעתים קרובות או אם המדיה הופכת צהובה מאוד בין שינויי מדיה.
  3. צפו שהאורגנואידים יהפכו לפוסט-מיטוטיים לחלוטין בשבוע 185 , כאשר תאי רשתית עצביים נמצאים לאורך כל הדרך. בשבוע 24, בדוק היווצרות של מקטעים חיצוניים בסיסיים בצד החיצוני של האורגנואיד. בשבוע 26-28 ודאו שהחלקים החיצוניים עבים בחלק החיצוני של האורגנואידים (איור 1C). בצע בדיקות רעילות לאחר שבוע 26 כאשר אורגנואידים הגדירו מקטעים חיצוניים המסמנים מצב התמיינות בוגר.
    הערה: יש להשתמש רק באורגנואידים מובחנים היטב ברשתית לבדיקת רעילות. ביצוע בדיקת רעילות על אורגנואידים עם מקטעים חיצוניים מוגדרים היטב יאפשר את זיהויים.

6. Deoxysphinganine (deoxySA) וטיפול תרופתי

הערה: מוצג כאן טיפול יחיד בפנופיברט להצלת רעילות deoxySA במשך 4 ימים (איור 2). עם זאת, ניתן לשנות את ריכוז ה-deoxySA שנוסף לאורגנואידים, משך הטיפול ב-deoxySA באורגנואידים ואת סוג התרופה המשמשת להצלת רעילות14 בהתאם לצרכים הניסיוניים להערכת רעילות והצלת רעילות.

  1. הכן 1 mM תמיסת מלאי של deoxySA באתנול. יש לאחסן בטמפרטורה של -20°C למשך חודש אחד. לחלופין, ניתן להכין פתרון מלאי של deoxySA ב- DMSO.
  2. בצע דילול סדרתי של deoxySA כדי לקבוע ריכוז רעיל מתאים של deoxySA להצלת סמים.
    הערה: ראשית לקבוע ריכוז של deoxySA שיגרום למוות תאי מספיק כדי למדוד אפקט הצלה. אם הריכוז גבוה מדי, התגובה הרעילה תגרום להתפוררות האורגנואיד ולא תיצפה הצלה. אם התגובה הרעילה נמוכה מדי, יהיה קשה להבחין באפקט הצלה משמעותי. התגובה הרעילה של deoxySA יכולה להשתנות ממעבדה למעבדה ומאצווה לאצווה של deoxySA.
    1. יש לדלל תמיסת מלאי deoxySA של 1 mM לריכוזים של 0.5 μM, 1 μM ו-2 μM ב-3 מ"ל RDM+, כל אחד. הוסף 3 μL אתנול ל- RDM+ כדי להכין טיפול בקרה.
    2. תחת מיקרוסקופ דיסקציה, השתמש בבדיקה סטרילית כדי לבחור 4 קבוצות של אורגנואידים עם מינימום של 5 אורגנואידים לכל קבוצה. לפצל את הקבוצות לבארות נפרדות של צלחת חיבור נמוכה במיוחד 6 בארות. בחר אורגנואידים בעלי גודל וצורה זהים בערך.
    3. שאפו להוריד כמה שיותר RDM+ מהאורגנואידים. לכל באר של אורגנואידים, הוסף ריכוז אחד של deoxySA ב- RDM+. הוסף בקרת רכב לבאר הרביעית של אורגנואידים.
    4. לאחר יומיים של תרבית ב-deoxySA או ברכב, החלף את המדיה בדילולים מתאימים של deoxySA טריים שהוכנו ב-RDM+.
    5. ביום הרביעי של הטיפול, המשך לשלב 7 כדי לעבד ולהעריך אורגנואידים למוות תאי. לאחר שנבחר ריכוז deoxySA, המשך לשלב 6.3 לטיפול בפנופיברט.
      הערה: מוות תאי מטרה בקבוצת הטיפול שנבחרה ב- deoxySA הוא 5 - 20 תאים חיוביים ל- 10,000 מיקרומטר2. האורגנואידים לא צריכים להתפרק על ידי מגע של בדיקה במהלך הטיפול.
  3. טפל אורגנואידים עם המינון הרעיל שנבחר של deoxySA ו fenofibrate.
    1. הכן תמיסת מלאי של 40 mM של fenofibrate ב- DMSO. יש לאחסן בטמפרטורה של -20°C למשך עד שנה.
    2. הכן את מדיית הטיפול התרופתי: ב- 3 מ"ל RDM+ יש לדלל תמיסת מלאי deoxySA של 1 מיקרומטר ל- 1 מיקרומטר deoxySA ולדלל תמיסת מלאי פנופיברט של 40 מ"מ ל- 20 מיקרומטר.
    3. הכן מדיית טיפול deoxySA: ב 3 מ"ל RDM+, לדלל 1 mM deoxySA תמיסת מלאי ל 1 מיקרומטר deoxySA ולהוסיף 1.5 μL של DMSO.
    4. הכן את מדיית הבקרה: ב 3 מ"ל RDM+, להוסיף 3 μL אתנול ו 1.5 μL של DMSO.
    5. תחת מיקרוסקופ דיסקציה באמצעות בדיקה סטרילית לבחור שלוש קבוצות של אורגנואידים עם מינימום של חמישה אורגנואידים לכל קבוצה. לפצל את הקבוצות לבארות נפרדות של צלחת חיבור נמוכה במיוחד 6 בארות.
    6. הוסף את הטיפולים המוכנים (deoxySA, deoxySA + fenofibrate, או בקרה) לאורגנואידים. לאחר יומיים, לשנות את התקשורת בבארות עם RDM מוכן טרי + בתוספת deoxySA / fenofibrate / פתרונות בקרה.
    7. ביום הרביעי של הטיפול, המשיכו לשלב 7 כדי לעבד ולהעריך אורגנואידים למוות תאי (איור 2).

7. הטבעה והקפאה של אורגנואידים

  1. הכינו 4% PFA טריים על ידי הוספת 1 מ"ל של 16% אמפולה PFA ל-3 מ"ל PBS.
  2. יש להסיר חומרי הדפסה מסוג RDM+ מאורגנואידים ולשטוף פעם אחת עם PBS. הסר PBS ככל האפשר מאורגנואידים. הוסיפו 2 מ"ל של 4% PFA טרי (ב-PBS) לאורגנואידים ודגרו במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר.
  3. לאחר דגירה של 15 דקות, שטפו אורגנואידים פעמיים עם 2 מ"ל של PBS, ולאחר מכן שטפו ב-PBS במשך 10 דקות.
    הערה: בצע קיבוע במכסה אדים כימי והשלך תמיסת PFA ושתי שטיפות PBS עוקבות לתוך מיכל פסולת PFA מסומן כראוי המאוחסן במכסה האדים.
  4. שאפו את כל PBS, ואז הוסיפו 20% סוכרוז ב-PBS לאורגנואידים הקבועים. ודא שהאורגנואידים מעורבבים בתמיסת הסוכרוז ואינם נשארים בבועת PBS למעלה. שמור את האורגנואידים בתמיסת הסוכרוז עד שהם שוקעים לתחתית תמיסת הסוכרוז, כלומר, ~ 1 שעות בטמפרטורת החדר. אורגנואידים קבועים ניתן לאחסן בתמיסת סוכרוז לילה ב 4 °C.
  5. הטמע את האורגנואידים בתמיסת OCT בתבנית קריוזקציה. ניתן להטמיע אורגנואידים מרובים לכל מצב בתבנית אחת. כיוון האורגנואידים מבטיח שאזורי הרשתית הטובים ביותר שלהם יהיו חתך על הקריוסטט, ואמצע האורגנואידים נמצאים כולם בערך באותו מישור. הקפיאו את האורגנואידים המשובצים בטמפרטורה של -20°C. ניתן לאחסן אורגנואידים משובצים בטמפרטורה של -80°C למשך שנים.
    הערה: קשה לראות אורגנואידים באוקטובר קפוא; לכוון אשכולות RPE לכיוון הצד של התבנית כי יהיה מול הלהב כדי להקל על זיהוי אורגנואידים.
  6. קריוסקציה אורגנואידים למקטעים בעובי 10-14 מיקרומטר ומדביקים קטעים לשקופיות המטופלות בליזין פולי-L. בזמן ההקפאה, בדוק שוב ושוב את השקופיות תחת מיקרוסקופ כדי לזהות חלקים המכילים את אמצע האורגנואידים. אספו רק את הפרוסות האמצעיות של האורגנואידים שבהן כל השכבות מיוצגות באופן שווה (איור 2A-C, איור 3). לאחר החתך, ניתן לאחסן שקופיות בתיבת שקופיות ב -80 ° C במשך שנים.
    הערה: פרוסות שצולמו בקצות האורגנואיד ידגמו יתר על המידה את הפוטורצפטורים החיצוניים ביותר ואינן מתאימות לכימות. אורגנואידים בגודל ממוצע יספקו 10-15 פרוסות מאמצע האורגנואיד המייצג חתך רוחב של שכבות הרשתית המרובדות.

8. צביעת טונל לתאים אפופטוטיים

  1. הפשירו מגלשות קפואות למשך 30 דקות ב-37°C. הצבת שקופיות באופן מיידי בטמפרטורה של 37°C מונעת עיבוי. דגימות רקמה ספוגות במים טהורים יכולות לעוות את הרקמה. דגירה של 37 מעלות צלזיוס משפרת גם את היצמדות הרקמה למגלשת הזכוכית.
  2. צור גבול רציף על שקופית הזכוכית סביב חלקי הרקמה באמצעות עט הידרופובי. זה יספק גבול ויבטיח קיבוע נאות דגירות נוגדנים עם נפח קטן של תמיסות. הוסיפו כ-100-200 μL (הנפח ימלא את האזור ההידרופובי מבלי להישפך) של 4% PFA טרי מוכן למשך 20 דקות. בצע קיבוע במכסה אדים כימי והשלך תמיסת PFA למיכל פסולת PFA מסומן כראוי המאוחסן במכסה האדים.
  3. יש לשטוף את המגלשות פעם אחת ב-PBS ולאחר מכן לשטוף ב-PBS במשך 25 דקות בטמפרטורת החדר.
  4. מכינים את תערובת טונל. הפשירו בקבוקונים סגולים וכחולים מערכת זיהוי מוות של תאים באתרם. הסר 100 μL של תמיסת בקבוקון סגול (יכול להשתמש עבור שליטה שלילית) ולשלב את 450 μL הנותרים של פתרון מן הבקבוקון סגול עם 50 μL של פתרון מן הבקבוקון הכחול. מערבבים היטב ושומרים בחושך. כל סט בקבוקונים (500 מיקרוליטר בסך הכל) יכול להכתים 5-10 שקופיות.
  5. לחדור פרוסות רקמות.
    1. הכינו תמיסת חדירות: PBS עם 0.1% TritonX-100 ו-0.1% נתרן ציטראט
    2. הסר PBS משקופיות לדוגמה ולאחר מכן הוסף פתרון חדירות לדוגמאות. יש לדגור במשך 2 דקות על גוש קרח או בטמפרטורה של 4°C. לאחר מכן, יש לשטוף פעם אחת ב-PBS ולאחר מכן לשטוף ב-PBS למשך 10 דקות.
  6. מוציאים PBS ומייבשים כמה שיותר תמיסה באמצעות פינה של רקמה מקופלת. הוסיפו 50-100 מיקרוליטר של תערובת טונל מוכנה לדגימות, בהתאם לגודל השטח שצייר העט ההידרופובי. יש לכסות בזכוכית, להחליק ולדגור בטמפרטורה של 37°C למשך שעה אחת בחושך.
    הערה: כל הדגירות והשטיפות לשלבים הבאים יבוצעו בחושך כדי למנוע הלבנה של פלואורופורים. השתמש בקופסה כהה או כסה את המגלשות ברדיד אלומיניום כדי לחסום את האור.
  7. תייגו את הפוטורצפטורים. יש לשטוף פעם אחת עם PBS ולאחר מכן לשטוף במשך 20 דקות ב-PBS. הסר PBS ולאחר מכן הוסף נוגדן Recoverin ראשוני (ארנב נגד Recoverin) מדולל 1:500 ב PBS עם 0.1% Tween ו 5% חמור בסרום. יש לדגור על 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
  8. לאחר הסרת הנוגדן הראשוני, יש לשטוף פעם אחת ב-PBS ולאחר מכן לשטוף ב-PBS במשך 20 דקות. מוסיפים נוגדן משני, חמור נגד ארנב עם פלואורופור כתום או אדום, מדולל 1:1,000 ב-PBS עם 0.1% טווין ו-5% נסיוב חמורים ודגרים בטמפרטורת החדר למשך שעתיים. יש לשטוף פעם אחת עם PBS ולאחר מכן לשטוף במשך 20 דקות ב-PBS. מוסיפים DAPI בשעה 1:1000 ב-PBS, דוגרים בטמפ' החדר למשך 10 דקות.
  9. יש לשטוף פעם אחת עם PBS ולאחר מכן לשטוף במשך 20 דקות ב-PBS. הסר PBS והוסף את אמצעי ההרכבה. יש להוסיף את החלקת הכיסוי, לאטום בלק ולהשאיר לייבוש בחושך. ניתן לאחסן שקופיות בטמפרטורה של 4°C במיכל כהה למשך עד שבוע.
    הערה: לקבלת איכות התמונה הטובה ביותר, צלם תמונות למחרת.

9. הדמיה של פרוסות אורגנואידים וכימות מוות.

הערה: הדמיה דורשת מיקרוסקופ קונפוקלי עם יכולות להבחין בין שלוש תעלות פלואורופור. ניסוי זה משתמש בתעלות ירוקות (Alexa Fluor 488), כתומות (Alexa Fluor 555) ו-UV (DAPI). ניתן להשתמש בכל שילוב של פלואורופורים כדי להבטיח שהפליטות לא ידממו לערוצים האחרים.

  1. איתור מקטעי רשתית לצורך הדמיה וכימות. תחת הגדלה נמוכה של המיקרוסקופ (5x או 10x) השתמשו בצביעת Recoverin, אשר מסמנת את הציטופלסמה של פוטורצפפטורים, ובצביעת DAPI, אשר מסמנת את גרעיני כל התאים, כדי לאתר אזור של האורגנואיד החתוך שהוא שלם, בנוי היטב, ובמישור הדוגם חתך מייצג של האורגנואיד (איור 2 ואיור 3 ). מצאו מקטע שיש לו שכבה גרעינית חיצונית ברורה של פוטורצפטורים בעובי של לפחות כמה תאים, ושכבה נפרדת ומובחנת של גרעינים שאין להם צביעת Recoverin (איור 2 ואיור 3).
  2. מסגר את התמונה. הגדילו את ההגדלה של המיקרוסקופ למטרה של פי 20 ומסגרו את השקופית כך שתמלא את התמונה בכמה שיותר משכבת קולטני האור (איור 3).
  3. הגדר את מישור Z. אם משתמשים במיקרוסקופ שמצלם ערימות Z, קבעו את הגבול העליון והתחתון של טווח Z כדי לצלם את כל עומק הפרוסה. השתמש באותו עובי Z-stack עבור כל התמונות בערכת ניסוי, כך שאותה כמות של רקמה נבדקת בכל הדגימות. אם אינכם משתמשים במיקרוסקופ שמצלם ערימות Z, מקמו את התמונה למרכז הפרוסה.
  4. דמיינו את כל שלושת ערוצי הפלואורופורים ברכישת Z-stack. כל שלושת הערוצים נדרשים לזהות באופן חיובי תא גוסס. תמונה אזור אחד לכל אורגנואיד.
  5. שמרו את ערכת התמונה בתבנית קובץ השומרת על יחס השטח לפיקסל.

10. כימות תאים גוססים

  1. פתח ערימות תמונות בתוכנת FIJI (Image J). בחלון אפשרויות ייבוא של תבניות ביולוגיות , ודא שלא נבחרו תיבות תחת המקטע "פיצול לחלונות נפרדים". גלילה בין ערוצי תמונה מיושרים היא קריטית לזיהוי מתאים של תאים.
  2. שטחו את ערכת התמונות Z-stack על ידי לחיצה על Image > Stacks ולאחר מכן בחרו 'Z project' מהתפריט הנפתח. זה ייצור תמונה חדשה לכימות. אם האורגנואידים לא צולמו בסדרה Z, דלג על שלב זה.
  3. בחרו בערוץ התמונה שמציג צביעה של Recoverin (אדום, בדוגמה זו). לחצו על הכלי לבחירת מצולע בסרגל הכלים ושרטטו אזור רציף של פוטורצפטורים בתמונה (איור 3A). לחץ על נתח > הגדר מדידות. בחלון המוקפץ Set Measurements בחר את התיבה לצד Area, לחץ על Analyze ובחר Measure כדי למדוד את השטח (או לחץ על "m" כקיצור דרך) של פוטורצפטורים כדי לספור תאים גוססים. מדידת השטח תופיע בחלון מידות נפתח.
  4. ספרו את הגרעינים החיוביים ל-TUNEL באזור קולטני האור שנבחרו קודם לכן (איור 3B,C). לחץ לחיצה ימנית על הכלי נקודה בסרגל הכלים ובחר כלי מרובה נקודות. בערוץ TUNEL בלבד, לחץ על צביעה חיובית של TUNEL החופפת לגרעינים חיוביים של DAPI וצביעה של Recoverin. עבור בין הערוצים כדי לאמת תאים חיוביים.
  5. חלקו את מספר התאים החיוביים של טונל באזור כדי לקבל ערך מנורמל למוות התא בפוטורצפטורים לכל אורגנואיד (איור 2D,E).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

אורגנואידים ברשתית נוצרו מקו iPSC שאינו בקרת MacTel. לאחר שהאורגנואידים הגיעו ל-26 שבועות בתרבית, הם נבחרו וחולקו לקבוצות ניסוי. אורגנואידים טופלו בריכוזים משתנים של deoxySA כדי לקבוע אם deoxySA רעיל לקולטני אור. נבדקו ארבעה ריכוזים של deoxySA, מ-0 עד 1 מיקרומטר (איור 2), ואורגנואידים טופלו במשך 8 ימים, עם שינויי מדיה כל יומיים. מוות תאי בתגובה ל-deoxySA תלוי ריכוז וניתן לגילוי ב-deoxySA של 50 ננומטר בלבד (איור 2D). הריכוז הגבוה ביותר שנבדק, 1 מיקרומטר deoxySA, נתן השפעה חזקה תוך שמירה על שלמות אורגנואיד הרשתית (איור 2B,D). ריכוז גבוה יותר של 5 מיקרומטר deoxySA גרם להתפוררות של אורגנואידים בתוך כמה ימים (הנתונים לא מוצגים). תוצאות תגובת המינון של deoxySA קבעו את הריכוז האופטימלי של deoxySA לניסויי רעילות עתידיים. מינון 1 μM deoxySA הביא למוות תאי משמעותי ללא רעילות יתר רוויה, כפי שנצפה ב 5 מיקרומטר.

כדי לבחון את יכולתו של פנופיברט להציל מוות תאי הנגרם על-ידי deoxySA, אורגנואידים ברשתית טופלו ב-1 μM deoxySA, 1 μM deoxySA בתוספת 20 μM fenofibrate, או בבקרת רכב ללא טיפול (איור 2A-C,E). הטיפול בפנופיברט במינון 20 מיקרומטר מנע רעילות הנגרמת על ידי deoxySA בפוטורצפטורים של אורגנואידים ברשתית, והפחית באופן משמעותי את מוות התאים בכ-80% לאחר 4 ימי טיפול (איור 2A-C,E)16. תרופות נוספות לשינוי שומנים נבדקו באמצעות אותו פרוטוקול, כולל fumonosin-B1, אשר הראה הצלה מלאה של רעילות deoxySA. מיני שומנים קשורים נבדקו גם כדי לזהות את המטבוליט הספציפי במורד הזרם של ספינגולפידים המוביל למוות של תאים קולטי אור14.

Figure 1
איור 1: תמונות שדה בהיר מייצגות של אורגנואידים תחת מיקרוסקופ אור הפוך . (A) אורגנואידים בני 4 שבועות יומיים לאחר הניתוק מראים שכבות רשתית מתאימות (לבן *) או התפתחות אורגנואידים שאינם רשתית. (B) פיתוח אורגנואידים בשבוע 13. (C) אורגנואידים ברשתית בשבוע 28 עם שכבות רשתית שקופות ומקטעים חיצוניים בנויים היטב המקרינים משכבת הפוטורצפטור החיצונית (פס לבן). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: תמונות קונפוקליות מייצגות של מוות תאי. תמונות קונפוקליות מייצגות של מוות תאי (TUNEL, ירוק) בתוך שכבת הפוטורצפטור (Recoverin, אדום) של אורגנואיד הרשתית לאחר 4 ימי טיפול עם אמצעי בקרה (A), 1 μM deoxySA (B), או 1 μM deoxySA עם 20 μM fenofibrate (C). (D) כימות מוות תאי בפוטורצפטורים אנושיים בעקבות טיפול ברקמת אורגנואיד רשתית עם ריכוזים משתנים של deoxySA. (E) כימות מוות תאי בפוטורצפטורים אנושיים בעקבות טיפול ברקמת אורגנואיד ברשתית עם אמצעי בקרה (n=6), 1 μM deoxySA (n=22), 1 μM deoxySA + 20 μM fenofibrate (n=21). *p<0.05, ***p<0.001 עם ANOVA בכיוון אחד ומבחן טוקי פוסט הוק. הנתונים נלקחו מ- New England Journal of Medicine, Gantner, M., Eade, K. ו- Wallace. M., et al. מטבוליזם סרין ושומנים במחלות מקולריות ונוירופתיה היקפית, 381 (15), 1422-1433, זכויות יוצרים © (2019) החברה הרפואית של מסצ'וסטס. הודפס מחדש באישור. 14לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: צילומי מסך המציגים תמונה קונפוקלית של אורגנואיד חתך ומוכתם שטופל ב-1 μM deoxySA שנצפה באמצעות תוכנת FIJI. תעלות פלואורסצנטיות פוצלו ל-α-Recoverin (A, אדום), TUNEL (B, ירוק) ו-DAPI (C, כחול). (A) אזור קולטני האור שורטט בעזרת הכלי מצולע שנבחר בסרגל הכלים (למעלה משמאל). (ב,ג) ספירת תאים באמצעות הכלי הרב-נקודתי, שנבחר בסרגל הכלים, של תאים TUNEL חיוביים (B, ירוק) וחיוביים DAPI (C, כחול) בתוך שכבת קולטני האור. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

וריאציות של פרוטוקול בידול
מאז המצאת הכוסות האופטיות היוצרות את עצמן על ידי קבוצת20 של יושיקי סאסאי, מעבדות רבות פיתחו פרוטוקולים ליצירת אורגנואידים ברשתית שיכולים להשתנות כמעט בכל שלב 5,18,19,21. רשימה ממצה של פרוטוקולים ניתן למצוא ב Capowski et al.22. פרוטוקול ההתמיינות שאנו מספקים כאן הוא פרוטוקול פשוט, בהתערבות נמוכה המספק נקודת התחלה טובה לכל מעבדה המנסה להבדיל בין אורגנואידים רשתית בוגרים. אנו מעודדים את המשתמשים לחקור ולאמץ וריאציות על פרוטוקול זה. השלבים הנפוצים לשינוי פרוטוקולים הם ייצור והתמיינות מוקדמת של EBs, ושימוש בגורמי התמיינות כגון BMP4, DKK-1 או חומצה רטינואית לשיפור היעילות 5,19,23.

גידול אורגנואידים על שייקר במשך רוב שלבי הפיתוח המאוחרים היה צעד יעיל להגברת יעילות הבידול ולהפחתת הזמן המושקע בטיפול באורנואידים. ביוריאקטורים משיגים את אותן מטרות24, עם זאת, שימוש בשייקר עם צלוחיות ארלנמאייר חד פעמיות הוא חסכוני יותר וניתן לעשות זאת עם ציוד מעבדה נפוץ. היתרון העיקרי של שמירה על האורגנואידים בתרחיף מגויס הוא שהוא מבטל את הצורך להפריד אורגנואידים שנדבקים זה לזה על הצלחת בזמן שהם גדלים. התרביות המרחפות גם מאפשרות חילופי חומרים מזינים גדולים יותר, כך שלאורגנואידים יש נטייה לגדול יותר מאלה שעל צלחת דוממת סטנדרטית. מסיבה זו, זה טוב להתחיל על ידי פיצול EBs מצופים קטן ככל האפשר בשלב 4.1.

מכיוון שהשגת אורגנואידים בוגרים ברשתית דורשת הבחנה של תרבית אחת במשך כמעט 6 חודשים, ביצוע בדיקות רעילות על אורגנואידים ברשתית יכול להיראות גוזל זמן בהשוואה לשימוש במונוקולטורה דו-ממדית. עם זאת, בדיקות רעילות מבוצעות על קו בקרה יחיד, וניתן להגדיר הבדלים באופן שגרתי. לאחר השקעה ראשונית של 6 חודשים, אספקה סדירה של אורגנואידים לביצוע ניסויים נוספים ושינויי פרוטוקול תהיה בהישג יד ללא דיחוי. התחלת 2-3 סבבים של התמיינות אורגנואידים ברשתית כל 1-2 חודשים מספקת רקמה מספקת לסדרות מורכבות ויסודיות של ניסויים.

אורגנואידים מספקים מודל רב-תכליתי לבדיקות סמים ממוקדות.
פרוטוקול זה מתאר בדיקת רעילות פוטורצפטור כדי לבדוק את יעילותן של תרופות משנות שומנים להצלת מוות תאי הנגרם על ידי deoxySL. למרות שמדובר ביישום ספציפי המציג הצלה פרמקולוגית לגורם מחלה ב- MacTel, פרוטוקול זה יכול לשמש לבדיקת כל מספר של עלבונות (למשל, מחסור בחומרים מזינים, מצבים היפוקסיים ורעילות אור) והצלות פרמקולוגיות. לכן, ניתן להתאים אותו למודל של מחלות רשתית אחרות. בעבודתנו הראינו כי על ידי שימוש באותו פרוטוקול והחלפת מינים ותרופות ספינגולפידים קשורים שונים החוסמים ישירות את חילוף החומרים של ספינגולפידים, הצלחנו גם לספק תובנות למנגנון מחלת מקטל על ידי קביעת המטבוליט הרעיל הספציפי במורד הזרם של ספינגולפידים המוביל למוות תאי קולטני אור14 . בניגוד למידול מחלות ברמה של מוטציות גנטיות, הדורשות קביעת קווי iPSC שונים, שימוש באורגנואידים כדי למדל תנאים מטבוליים רעילים וגורמי עקה סביבתיים מאפשר שימוש בקו iPSC בקרה משותף כמודל דינמי עם מקור רקמה שופע וזמין.

המודלים האורגנואידים האנושיים מועילים במיוחד כאשר חוקרים מחלות מטבוליות ברשתית, שם לסוגי תאים שונים יש יחסי גומלין מטבוליים סימביוטיים ייחודיים שלא ניתן לשכפל במונוקולטורה של תאים דמויי קולטני אור4. מודל מטבולי מורכב זה אפשר לנו לגלות את היעילות של התרופה fenofibrate במניעת ההשפעות הרעילות של deoxySLs ישירות בבני אדם. במודלים עכבריים של deoxySLsמוגבהים 14 (נתונים שלא פורסמו) ומודלים של תרבית תאי פיברובלסט עובריים של עכבר של מטבוליזם deoxySL, fenofibrate הוכח כלא יעיל16. בדיקת תרופות בהקשר של מודלים מורכבים של רקמות אנושיות תאפשר לנו לזהות טיפולים יעילים ולשלול טיפולים לא יעילים שאחרת היו מתפספסים אילו היינו מסתמכים רק על עכברים או מונוקולטורה פשטנית.

פיתוח עתידי לבדיקת תרופות
בפרוטוקול זה אנו מכמתים אפופטוזיס בפוטורצפטורים, סוג התא הנפוץ ביותר. עם זאת, על ידי שימוש בכל אחד מהנוגדנים המוכחים המסמנים באופן ספציפי את סוגי תאי הרשתית האחרים, פרוטוקול זה ניתן לשינוי כדי להעריך מוות תאי בכל סוג תא רשתית, או תת-סוג תא (למשל, חרוט לעומת מוט). החיסרון של כימות אפופטוזיס באמצעות צביעת טונל בפרוסות רקמה הוא שזוהי טכניקת תפוקה נמוכה לכימות מוות תאי, המגבילה את היישום של בדיקה זו לסינון רשימות קטנות של תרופות מועמדות. מסך גדול יותר של ספריות סמים לא ממוקדות לא יהיה אפשרי באמצעות גישת IHC. פיתוחים עתידיים בפרוטוקול זה כדי להקל על מסכי תרופות גדולים יותר ידרשו שילוב של סמן מוות תאי קל יותר לכימות קל. בעוד אלה זמינים, אי הסדירות של אורגנואידים ברשתית בגודל, נוכחות או היעדר נספחים של רקמה שאינה רשתית, ושונות באיכות שכבת קולט האור מקשים על נרמול התוצאות בין אורגנואידים. אנו צופים כי פיתוחים עתידיים להגדלת התפוקה של מודלים של מחלות אורגנואידים אנושיים לסינון ספריות תרופות גדולות ישפרו במידה ניכרת את יכולתנו לגלות, לשנות ולאמת תרופות שיתקדמו מניסויים פרה-קליניים לטיפולים מאושרים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

למחברים אין ניגודי אינטרסים.

Acknowledgments

נתמך על ידי מכון המחקר הרפואי לואי. ברצוננו להודות למשפחת לואי על תמיכתה בפרויקט מקטל. ברצוננו להודות למרי גאנטנר, מייק דורל ולאה שפקה על תרומתם האינטלקטואלית ועזרתם בהכנת כתב היד.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.5M EDTA Invitrogen 15575020
125mL Erlenmeyer Flasks VWR 89095-258
1-deoxysphinganine Avanti 860493
B27 Supplement, minus vitamin A Gibco 12587010
Beaver 6900 Mini-Blade Beaver-Visitec BEAVER6900
D-(+)-Sucrose VWR 97061-432
DAPI Thermo-fisher D1306
Dispase II, powder Gibco 17105041
DMEM, high glucose, pyruvate Gibco 11995073
DMEM/F12 Gibco 11330
Donkey anti-rabbit Ig-G, Alexa Fluor plus 555 Thermo-fisher A32794
donkey serum Sigma D9663-10ML
FBS, Heat Inactivated Corning 45001-108
Fenofibrate Sigma F6020
Glutamax Gibco 35050061
Heparin Stemcell Technologies 7980
In Situ Cell Death Detection Kit, Fluorescin Sigma 11684795910
Matrigel, growth factor reduced Corning 356230
MEM Non-Essential Amino Acids Solution Gibco 11140050
mTeSR 1 Stemcell Technologies 85850
N2 Supplement Gibco 17502048
Penicillin-Streptomycin Gibco 15140122
Pierce 16% Formaldehyde Thermo-fisher 28906
Rabbit anti-Recoverin antibody Millipore AB5585
Sodium Citrate Sigma W302600
Steriflip Sterile Disposable Vacuum Filter Units MilliporeSigma SE1M179M6
Taurine Sigma T0625
Tissue Plus- O.C.T. compound Fisher Scientific 23-730-571
Tissue-Tek Cryomold EMS 62534-10
Triton X-100 Sigma X100
Tween-20 Sigma P1379
Ultra-Low Attachment 6 well Plates Corning 29443-030
Ultra-Low Attachment 75cm2 U-Flask Corning 3814
Vacuum Filtration System VWR 10040-436
Vectashield-mounting medium vector Labs H-1000
wax pen-ImmEdge vector Labs H-4000
Y-27632 Dihydrochloride (Rock inhibitor) Sigma Y0503

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Waring, M. J., et al. An analysis of the attrition of drug candidates from four major pharmaceutical companies. Nature Review Drug Discovery. 14 (7), 475-486 (2015).
  2. Khalil, A. S., Jaenisch, R., Mooney, D. J. Engineered tissues and strategies to overcome challenges in drug development. Advances in Drug Delivery Reviews. 158, 116-139 (2020).
  3. Demetrius, L. Of mice and men. When it comes to studying ageing and the means to slow it down, mice are not just small humans. EMBO Reports. , 6 Spec No 39-44 (2005).
  4. Lindsay, K. J., et al. Pyruvate kinase and aspartate-glutamate carrier distributions reveal key metabolic links between neurons and glia in retina. Proceedings of the National Academy of Sciences U. S. A. 111 (43), 15579-15584 (2014).
  5. Cowan, C. S., et al. Cell types of the human retina and its organoids at single-cell resolution. Cell. 182 (6), 1623-1640 (2020).
  6. Kruczek, K., Swaroop, A. Pluripotent stem cell-derived retinal organoids for disease modeling and development of therapies. Stem Cells. 38 (10), 1206-1215 (2020).
  7. Sinha, D., Phillips, J., Phillips, M. J., Gamm, D. M. Mimicking retinal development and disease with human pluripotent stem cells. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 57 (5), 1-9 (2016).
  8. Gan, L., Cookson, M. R., Petrucelli, L., La Spada, A. R. Converging pathways in neurodegeneration, from genetics to mechanisms. Nature Neuroscience. 21 (10), 1300-1309 (2018).
  9. Aung, K. Z., Wickremasinghe, S. S., Makeyeva, G., Robman, L., Guymer, R. H. The prevalence estimates of macular telangiectasia type 2: the Melbourne collaborative cohort study. Retina. 30 (3), 473-478 (2010).
  10. Chew, E. Y., et al. Effect of ciliary neurotrophic factor on retinal neurodegeneration in patients with macular telangiectasia type 2: A randomized clinical trial. Ophthalmology. 126 (4), 540-549 (2019).
  11. Gass, J. D., Blodi, B. A. Idiopathic juxtafoveolar retinal telangiectasis. Update of classification and follow-up study. Ophthalmology. 100 (10), 1536-1546 (1993).
  12. Klein, R., et al. The prevalence of macular telangiectasia type 2 in the Beaver Dam eye study. American Journal of Ophthalmology. 150 (1), 55-62 (2010).
  13. Powner, M. B., et al. Loss of Muller's cells and photoreceptors in macular telangiectasia type 2. Ophthalmology. 120 (11), 2344-2352 (2013).
  14. Gantner, M. L., et al. Serine and lipid metabolism in macular disease and peripheral neuropathy. New England Journal of Medicine. 381 (15), 1422-1433 (2019).
  15. Scerri, T. S., et al. Genome-wide analyses identify common variants associated with macular telangiectasia type 2. Nature Genetics. 49 (4), 559-567 (2017).
  16. Alecu, I., et al. Cytotoxic 1-deoxysphingolipids are metabolized by a cytochrome P450-dependent pathway. Journal of Lipid Research. 58 (1), 60-71 (2017).
  17. Othman, A., et al. Fenofibrate lowers atypical sphingolipids in plasma of dyslipidemic patients: A novel approach for treating diabetic neuropathy. Journal of Clinical Lipidology. 9 (4), 568-575 (2015).
  18. Ohlemacher, S. K., Iglesias, C. L., Sridhar, A., Gamm, D. M., Meyer, J. S. Generation of highly enriched populations of optic vesicle-like retinal cells from human pluripotent stem cells. Curr Protoc Stem Cell Biol. 32, 1-20 (2015).
  19. Zhong, X., et al. Generation of three-dimensional retinal tissue with functional photoreceptors from human iPSCs. Nature Communication. 5, 4047 (2014).
  20. Eiraku, M., et al. Self-organizing optic-cup morphogenesis in three-dimensional culture. Nature. 472 (7341), 51-56 (2011).
  21. Wahlin, K. J., et al. Photoreceptor outer segment-like structures in long-term 3D retinas from human pluripotent stem cells. Science Reports. 7 (1), 766 (2017).
  22. Capowski, E. E., et al. Reproducibility and staging of 3D human retinal organoids across multiple pluripotent stem cell lines. Development. 146 (1), (2019).
  23. Luo, Z., et al. An optimized system for effective derivation of three-dimensional retinal tissue via Wnt signaling regulation. Stem Cells. 36 (11), 1709-1722 (2018).
  24. Ovando-Roche, P., et al. Use of bioreactors for culturing human retinal organoids improves photoreceptor yields. Stem Cell Research Therapy. 9 (1), 156 (2018).

Tags

החודש ב- JoVE גיליון 169 אורגנואיד רשתית אורגנואיד ניוון רשתית MacTel ספינגולפיד קולט אור פנופיברט צביעת טונל מסך תרופות הרעלת שומנים
מסכי רעילות באורגנואידים ברשתית אנושית לגילוי תרופות
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Eade, K., Giles, S., Harkins-Perry,… More

Eade, K., Giles, S., Harkins-Perry, S., Friedlander, M. Toxicity Screens in Human Retinal Organoids for Pharmaceutical Discovery. J. Vis. Exp. (169), e62269, doi:10.3791/62269 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter