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Bioengineering

फार्मास्युटिकल डिस्कवरी के लिए मानव रेटिना ऑर्गेनोइड्स में विषाक्तता स्क्रीन

Published: March 4, 2021 doi: 10.3791/62269
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2, 1,2
1Lowy Medical Research Institute, 2The Scripps Research Institute

Summary

यहां हम परिपक्व मानव रेटिना ऑर्गेनोइड्स उत्पन्न करने के लिए एक चरण-दर-चरण प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं और उम्र से संबंधित रेटिना अपक्षयी रोग मैकुलर टेलेंजिक्टेसिया टाइप 2 (मैकटेल) के लिए दवा उम्मीदवारों की पहचान करने के लिए फोटोरिसेप्टर विषाक्तता परख में उनका उपयोग करते हैं।

Abstract

ऑर्गेनोइड्स रोग तंत्र और उपचार का अध्ययन करने के लिए एक आशाजनक मंच प्रदान करते हैं, सीधे सेल संस्कृति की बहुमुखी प्रतिभा और थ्रूपुट के साथ मानव ऊतक के संदर्भ में। परिपक्व मानव रेटिना ऑर्गेनोइड्स का उपयोग उम्र से संबंधित रेटिना अपक्षयी रोग मैकुलर टेलेंजिक्टेसिया टाइप 2 (मैकटेल) के लिए संभावित दवा उपचार को स्क्रीन करने के लिए किया जाता है।

हमने हाल ही में दिखाया है कि मैकटेल एक एटिपिकल लिपिड प्रजातियों, डीऑक्सीस्फिंगोलिपिड्स (डीऑक्सीएसएल) के ऊंचे स्तर के कारण हो सकता है। ये लिपिड रेटिना के लिए विषाक्त हैं और मैकटेल रोगियों में होने वाले फोटोरिसेप्टर हानि को चला सकते हैं। डीऑक्सीएसएल फोटोरिसेप्टर विषाक्तता को रोकने की उनकी क्षमता के लिए दवाओं की जांच करने के लिए, हमने एक गैर-मैकटेल प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल (आईपीएससी) लाइन से मानव रेटिना ऑर्गेनोइड उत्पन्न किए और उन्हें पोस्ट-माइटोटिक उम्र में परिपक्व किया, जहां वे कार्यात्मक रूप से परिपक्व फोटोरिसेप्टर सहित रेटिना के सभी न्यूरोनल वंश-व्युत्पन्न कोशिकाओं को विकसित करते हैं। रेटिना ऑर्गेनोइड्स को एक डीऑक्सीएसएल मेटाबोलाइट के साथ इलाज किया गया था और एपोप्टोसिस को इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री का उपयोग करके फोटोरिसेप्टर परत के भीतर मापा गया था। इस विषाक्तता मॉडल का उपयोग करते हुए, औषधीय यौगिक जो डीऑक्सीएसएल-प्रेरित फोटोरिसेप्टर मृत्यु को रोकते हैं, की जांच की गई थी। एक लक्षित उम्मीदवार दृष्टिकोण का उपयोग करते हुए, हमने निर्धारित किया कि फेनोफाइब्रेट, आमतौर पर उच्च कोलेस्ट्रॉल और ट्राइग्लिसराइड्स के उपचार के लिए निर्धारित दवा, रेटिना की कोशिकाओं में डीऑक्सीएसएल विषाक्तता को भी रोक सकती है।

विषाक्तता स्क्रीन ने सफलतापूर्वक एफडीए-अनुमोदित दवा की पहचान की जो फोटोरिसेप्टर मृत्यु को रोक सकती है। यह परीक्षण किए गए अत्यधिक रोग-प्रासंगिक मॉडल के कारण एक प्रत्यक्ष कार्रवाई योग्य खोज है। रेटिना रोगों में भविष्य के उपचार की खोज के लिए किसी भी संख्या में चयापचय तनाव और संभावित औषधीय हस्तक्षेप का परीक्षण करने के लिए इस मंच को आसानी से संशोधित किया जा सकता है।

Introduction

सेल संस्कृति और पशु मॉडल में मानव रोग मॉडलिंग ने फार्माकोलॉजिकल चिकित्सीय की खोज, संशोधन और सत्यापन के लिए अमूल्य उपकरण प्रदान किए हैं, जिससे उन्हें उम्मीदवार दवा से अनुमोदित चिकित्सा में आगे बढ़ने की अनुमति मिलती है। यद्यपि विवो मॉडल में इन विट्रो और गैर-मानव का संयोजन लंबे समय से दवा विकास पाइपलाइन का एक महत्वपूर्ण घटक रहा है, वे अक्सर नई दवा उम्मीदवारों के नैदानिक प्रदर्शन की भविष्यवाणी करने में विफलरहते हैं। प्रौद्योगिकियों के विकास की स्पष्ट आवश्यकता है जो सरलीकृत मानव सेलुलर मोनोकल्चर और नैदानिक परीक्षणों के बीच की खाई को पाटते हैं। स्व-संगठित त्रि-आयामी ऊतक संस्कृतियों, ऑर्गेनोइड्स में हालिया तकनीकी प्रगति ने उन ऊतकों के प्रति उनकी निष्ठा में सुधार किया है जो वे उन्हें प्रीक्लिनिकल दवा विकास पाइपलाइन2 में आशाजनक उपकरण बनाते हैं।

विवो मॉडल में गैर-मानव पर मानव कोशिका संस्कृति का एक प्रमुख लाभ मानव चयापचय की विशिष्ट पेचीदगियों को दोहराने की क्षमता है जो मनुष्यों और चूहों जैसे उच्च क्रम कशेरुकियों के बीच भी काफी भिन्न होसकता है। हालांकि, इस विशिष्टता को ऊतक जटिलता में नुकसान से कम किया जा सकता है; रेटिना ऊतक के लिए ऐसा मामला है जहां कई सेल प्रकार जटिल रूप से परस्पर जुड़े हुए हैं और सेलुलर उपप्रकारों के बीच एक अद्वितीय सहजीवी चयापचय परस्पर क्रिया है जिसे मोनोकल्चर4 में दोहराया नहीं जा सकता है। मानव ऑर्गेनोइड्स, जो सेल संस्कृति की पहुंच और स्केलेबिलिटी के साथ जटिल मानव ऊतकों का एक फेसिमाइल प्रदान करते हैं, इन रोग मॉडलिंग प्लेटफार्मों की कमियों को दूर करने की क्षमता रखते हैं।

स्टेम कोशिकाओं से प्राप्त रेटिना ऑर्गेनोइड्स मानव तंत्रिका रेटिना 5 के जटिल ऊतक को मॉडलिंग में विशेष रूप से वफादार साबित हुएहैं। इसने रेटिना ऑर्गेनॉइड मॉडल को रेटिना रोग 6,7 के अध्ययन और उपचार के लिए एक आशाजनक तकनीक बना दिया है। आज तक रेटिना ऑर्गेनोइड्स में अधिकांश रोग मॉडलिंग ने मोनोजेनिक रेटिना रोगों पर ध्यान केंद्रित किया है जहां रेटिना ऑर्गेनोइड्स रोग पैदा करने वाले आनुवंशिक वेरिएंट 7 के साथ आईपीएससी लाइनों से प्राप्तहोते हैं। ये आम तौर पर अत्यधिक पेनेट्रेंट उत्परिवर्तन होते हैं जो विकासात्मक फेनोटाइप के रूप में प्रकट होते हैं। उम्र बढ़ने की बीमारियों पर कम काम प्रभावी ढंग से किया गया है जहां आनुवंशिक उत्परिवर्तन और पर्यावरणीय तनाव सामान्य रूप से विकसित ऊतक को प्रभावित करते हैं। उम्र बढ़ने के न्यूरोडीजेनेरेटिव रोगों में जटिल आनुवंशिक विरासत और पर्यावरणीय तनावों से योगदान हो सकता है जो अल्पकालिक सेल संस्कृतियों का उपयोग करके मॉडल करना स्वाभाविक रूप से मुश्किल है। हालांकि, कई मामलों में ये जटिल रोग सामान्य सेलुलर या चयापचय तनावों पर एकजुट हो सकते हैं, जो पूरी तरह से विकसित मानव ऊतक पर परीक्षण किए जाने पर, उम्र बढ़ने के न्यूरोडीजेनेरेटिव रोगों में शक्तिशाली अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकतेहैं।

देर से शुरू होने वाली मैकुलर डीजेनेरेटिव बीमारी, मैकुलर टेलेंजीक्टेसिया टाइप II (मैकटेल), आनुवंशिक रूप से जटिल न्यूरोडीजेनेरेटिव बीमारी का एक बड़ा उदाहरण है जो एक सामान्य चयापचय दोष पर निर्भर करता है। मैकटेल उम्र बढ़ने की एक असामान्य रेटिना अपक्षयी बीमारी है जिसके परिणामस्वरूप मैक्युला में फोटोरिसेप्टर और मुलर ग्लिया हानि होती है, जिससे केंद्रीय दृष्टि 9,10,11,12,13 में प्रगतिशील नुकसान होता है। मैकटेल में, एक अनिर्धारित, संभवतः बहुक्रियात्मक, आनुवंशिक विरासत रोगियों में परिसंचारी सेरीन में एक आम कमी लाती है, जिसके परिणामस्वरूप एक न्यूरोटॉक्सिक लिपिड प्रजातियों में वृद्धि होती है जिसे डीऑक्सीस्फिंगोलिपिड्स (डीऑक्सीएसएल) 14,15 कहा जाता है। यह साबित करने के लिए कि डीऑक्सीएसएल का संचय रेटिना के लिए विषाक्त है और संभावित दवा चिकित्सीय को मान्य करने के लिए, हमने मानव रेटिना ऑर्गेनोइड्स14 में फोटोरिसेप्टर विषाक्तता की परख के लिए इस प्रोटोकॉल को विकसित किया है।

यहां हम मानव रेटिना ऑर्गेनोइड्स को अलग करने, ऑर्गेनोइड्स का उपयोग करके विषाक्तता और बचाव परख स्थापित करने और परिणामों को निर्धारित करने के लिए एक विशिष्ट प्रोटोकॉल की रूपरेखा तैयार करते हैं। हम एक सफल उदाहरण प्रदान करते हैं जहां हम एक संदिग्ध बीमारी पैदा करने वाले एजेंट, डीऑक्सीएसएल की ऊतक-विशिष्ट विषाक्तता का निर्धारण करते हैं, और डीऑक्सीएसएल-प्रेरित रेटिना विषाक्तता के संभावित उपचार के लिए एक सुरक्षित जेनेरिक दवा, फेनोफिब्रेट के उपयोग को मान्य करते हैं। पिछले काम से पता चला है कि फेनोफिब्रेट डीऑक्सीएसएल के क्षरण को बढ़ा सकता है और रोगियों में डीऑक्सीएसएल को कम कर सकता है, हालांकि, डीऑक्सीएसएल-प्रेरित रेटिना विषाक्तता को कम करने में इसकी प्रभावकारिताका परीक्षण नहीं किया गया है। यद्यपि हम एक विशिष्ट उदाहरण प्रस्तुत करते हैं, इस प्रोटोकॉल का उपयोग रेटिना ऊतक पर किसी भी चयापचय / पर्यावरणीय तनाव और संभावित चिकित्सीय दवाओं के प्रभाव का मूल्यांकन करने के लिए किया जा सकता है।

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Protocol

1. आईपीएससी/ईएससी को पिघलाना, पास करना और विस्तार करना

नोट: सभी सेल संवर्धन चरणों के लिए, बाँझ सेल संस्कृति को बनाए रखने के लिए सर्वोत्तम प्रथाओं का उपयोग करें।

  1. तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स माध्यम के साथ एक 6-वेल सेल कल्चर प्लेट कोट करें।
    1. इस माध्यम के 1x को तैयार करने के लिए, उत्पाद विनिर्देशों का पालन करें या 9 एमएल डीएमईएम / एफ 12 के साथ 75 μL कोल्ड मैट्रिक्स माध्यम को पतला करें। 6-वेल प्लेट में 1.5 एमएल ताजा तैयार 1x मीडियम प्रति वेल जोड़ें। 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
    2. बेसमेंट मेम्ब्रेन मैट्रिक्स माध्यम से एस्पिरेट करें और डीएमईएम / एफ 12 के 3 एमएल के साथ प्रत्येक अच्छी तरह से कुल्ला करें। 2 एमएल डीएमईएम / एफ 12 जोड़ें और उपयोग होने तक 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें। जिस दिन प्लेट तैयार की जाती है, उस दिन इसका उपयोग करें।
  2. पीबीएस में रॉक अवरोधक (वाई -27632 डाइहाइड्रोक्लोराइड) का 10 एमएम स्टॉक समाधान तैयार करें, और उपयोग होने तक -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  3. आईपीएससी/ईएससी की शीशी को डीएमईएम/एफ12 मीडियम में पिघलाएं और सेंट्रीफ्यूज को 5 मिनट के लिए 400 x g पर रखें। सतह पर तैरने वाले को एस्पिरेट करें और एमटीईएसआर माध्यम में गोली को फिर से निलंबित करें। प्लेट 1 शीशी एमटीईएसआर मीडिया में एक लेपित 6-वेल पर 10 μM रॉक इनहिबिटर (Y-27632 डाइहाइड्रोक्लोराइड) के साथ होती है और इनक्यूबेटर में रात भर इनक्यूबेट होती है। अगले दिन, मीडिया से दूर रहें और सिर्फ एमटीईएसआर जोड़ें।
    नोट: पासिंग तक हर दिन मीडिया बदलें।
  4. पीबीएस के 500 एमएल में 0.5 एम ईडीटीए के 500 μL को पतला करके पीबीएस में 0.5 mM EDTA तैयार करें।
  5. मार्ग कोशिकाएं जब वे 80-90% सामंजस्य तक पहुंचती हैं। कोशिकाओं की वृद्धि दर के आधार पर कोशिकाओं को 1: 3 या 1: 6 प्रति अच्छी तरह से विभाजित करें।
    1. प्लेट से पालन की गई कोशिकाओं को हटाने के लिए, मीडिया को बंद करें और कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए पीबीएस में 0.5 एमएम ईडीटीए के साथ इनक्यूबेट करें। इनक्यूबेशन बाद, ईडीटीए समाधान को हटा दें और पी 1000 पिपेट के साथ कोशिकाओं पर 1 एमएल एमटीईएसआर माध्यम को बलपूर्वक बाहर निकालकर कोशिकाओं को उठाएं।
    2. शेष कोशिकाओं को हटाने के लिए, 5x तक mTeSR माध्यम और कोशिकाओं को चूसना और बलपूर्वक बाहर निकालना जारी रखें। एमटीईएसआर माध्यम के साथ एक ताजा तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स-लेपित 6-वेल प्लेट पर प्लेट कोशिकाएं। रोजाना मीडिया को बदलना जारी रखें जब तक कि प्लेटें फिर से 80-100% कॉन्फ्लुएंसी तक न पहुंच जाएं।
  6. एक बार जब कोशिकाएं एक पूर्ण 6-वेल प्लेट में विस्तारित हो जाती हैं और 80-100% कंफ्लुएंसी तक पहुंच जाती हैं, तो बाद के भेदभाव के लिए सेल लाइन का विस्तार करने या क्रायोप्रिजर्वेशन के लिए फ्रीज करने के लिए एक कुआं अलग रखें। भ्रूण यी निकाय बनाकर विभेदन प्रक्रिया शुरू करने के लिए शेष पांच कुओं का उपयोग करें।

2. भ्रूण निकाय (ईबी) बनाना

नोट: ईबी गठन और विभेदन मीडिया व्यंजनों को कोवान एट अल.5, ओहलेमाकर एट अल.18 और झोंग एट अल.19 में प्रोटोकॉल से प्राप्त किया गया है।

  1. नीचे वर्णित 1x Dispase समाधान और तंत्रिका प्रेरण मीडिया (NIM) तैयार करें।
    1. डीएमईएम /एफ 12 में पाउडर को घोलकर डिस्पेज़ के 5x स्टॉक समाधान का 10 मिलीग्राम / एमएल तैयार करें। 0.22 μm फ़िल्टर का उपयोग कर बाँझ फ़िल्टर करें. उपयोग होने तक -20 डिग्री सेल्सियस पर 1 एमएल एलिकोट स्टोर करें।
    2. 5x Dispase समाधान का उपयोग करके, DMEM/F12 में 2 mg/mL Dispase का 1 mL/well तैयार करें। 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर घोल गर्म करें।
    3. 1% N2 पूरक, 1% MEM NEAA, और 180 U/mg पर 2 mg/mL हेपरिन के साथ DMEM/F12 को पूरक करके NIM तैयार करें।
  2. कमरे के तापमान के लिए mTeSR: NIM (12mL: 4mL) समाधान के 3: 1 मिश्रण के 16 एमएल तैयार करें और गर्म करें।
  3. विभेदित कोशिकाओं को हटा दें और गर्म डिस्पेज़ समाधान जोड़ें।
    1. आईपीएससी / ईएससी सेल कल्चर से विभेदक कोशिकाओं को हटा दें। एक विच्छेदन दायरे के तहत, पी 10 पिपेट टिप के साथ अपारदर्शी सफेद कॉलोनियों को स्क्रैप करें। संस्कृति कुओं से एमटीएसईआर माध्यम से एस्पिरेट करें। यह उन विभेदित झुरमुटों को हटा देगा जिन्हें अभी-अभी काट दिया गया था।
    2. तुरंत पूर्व-गर्म डिस्पेस समाधान जोड़ें और 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें जब तक कि सेल कॉलोनियों के अधिकांश किनारे माइक्रोस्कोप के नीचे घुंघराले होने न लगें। इसमें 4-8 मिनट का समय लगेगा।
      नोट: डिस्पेज़ में कोशिकाओं के लिए इनक्यूबेशन समय प्रत्येक प्रयोगशाला के लिए निर्धारित करना होगा। अवधि सेल लाइनों के बीच भिन्न हो सकती है और 3 दिनों या उससे अधिक समय तक चढ़ाई गई कोशिकाओं के लिए एक लंबा इनक्यूबेशन आवश्यक है। धीमी गति से बढ़ने वाले आईपीएससी / ईएससी जिन्हें कॉन्फ्लुएंसी तक पहुंचने में 3 दिन से अधिक समय लगता है, प्लेट में अधिक ताकत के साथ पालन करना शुरू कर देंगे, जिससे कोशिकाओं को उठाना मुश्किल हो जाएगा। धीमी गति से बढ़ने वाली कोशिकाओं के लिए, एक पूर्ण 6-वेल प्लेट में विस्तार के लिए 1: 2 पर पासिंग कोशिकाओं का प्रयास करें ताकि प्लेटिंग से कंफ्लुएंसी तक का समय कम हो सके।
  4. घोल को एस्पिरेट करें और धीरे से प्रति अच्छी तरह से कम से कम 2 एमएल डीएमईएम / एफ 12 माध्यम जोड़ें। डीएमईएम / एफ 12 माध्यम को धीरे-धीरे कुएं के किनारे जोड़ें ताकि कोशिकाओं को हटा न दिया जाए।
    1. एफ 12 माध्यम फिर प्लेट से सेल कॉलोनियों को उठाने के लिए सीधे कोशिकाओं पर डीएमईएम / एफ 12 के ताजा 1 एमएल को वापस जोड़ें। पी 1000 पिपेट के साथ बार-बार चूसने और डीएमईएम / एफ 12 को 5 गुना तक कुएं में निकालने के लिए, जितना संभव हो उतने सेल कॉलोनियों को हटाने के लिए।
      नोट: विभेदित/विभेदित आईपीएससी/ईएससी प्लेट से अपरिभाषित आईपीएससी/ईएससी की तुलना में अधिक चिपके रहते हैं। कोशिकाएं जो बार-बार पाइपिंग के साथ बाहर नहीं आती हैं, वे पीछे रह जाती हैं। अतिरिक्त पाइपिंग कोशिकाओं को मारता है और ईबी उत्पादन की दक्षता को कम करता है। सेल क्लंप में प्रति झुरमुट 100-400 कोशिकाएं होंगी।
  5. फ्लोटिंग कॉलोनियों को 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में स्थानांतरित करें और किसी भी शेष फ्लोटिंग कॉलोनियों को इकट्ठा करने के लिए प्रति कुएं अतिरिक्त 1 एमएल डीएमईएम / एफ 12 माध्यम के साथ कुल्ला करें।
  6. फ्लोटिंग कॉलोनियों को 5 मिनट से अधिक समय तक गुरुत्वाकर्षण द्वारा व्यवस्थित करने की अनुमति न दें। एक बार तय होने के बाद, 1-2 एमएल सुपरनैटेंट को छोड़कर सभी को हटा दें। ध्यान रखें कि नीचे नरम गोली को उत्तेजित न करें।
  7. गोली को पूर्व-गर्म 3: 1 mTeSR: NIM माध्यम में पुन: निलंबित करें और अल्ट्रा-लो-अटैचमेंट T75 फ्लास्क में स्थानांतरित करें। ईबी को बनाने की अनुमति देने के लिए रात भर इनक्यूबेट करें। इसे भेदभाव का दिन 0 माना जाएगा।
  8. तंत्रिका पूर्वजों में ईबी के भेदभाव को शुरू करने के लिए धीरे-धीरे मीडिया को एनआईएम में बदलें।
    1. अगले दिन, मीडिया को हटा दें और 1: 1 mTeSR: NIM माध्यम के 10 mL के साथ बदलें। फ्री-फ्लोटिंग ईबी संस्कृति से मीडिया को हटाने के लिए, फ्लास्क को ऊपर टिप करें ताकि ईबी फ्लास्क के निचले कोने में एकत्र हों। सतह पर तैरने वाले को दूर करें, यह सुनिश्चित करें कि नीचे की ओर गोली में किसी भी ईबी को एस्पिरेटेड न करें।
    2. अगले दिन, मीडिया को 1: 3 mTeSR: NIM माध्यम के 10 mL के साथ बदलें।
    3. अगले दिन, मीडिया को पूर्ण एनआईएम माध्यम से बदलें। डिस्पेस उपचार के बाद 7 दिनों तक एनआईएम माध्यम के साथ हर 2 दिनों में मीडिया बदलना जारी रखें।

3. ईबी चढ़ाना और तंत्रिका रेटिना भेदभाव शुरू करना

  1. डिस्पेस उपचार के एक सप्ताह बाद, 6-वेल प्लेट पर प्लेट फ्री-फ्लोटिंग ईबी को विकास कारक-कम बेसमेंट झिल्ली मैट्रिक्स माध्यम के साथ लेपित किया गया। प्लेट को कोट करने के लिए, चरण 1.1 देखें।
    1. एस्पिरेटेड ने ईबी से मीडिया खर्च किया और 12 एमएल एनआईएम के साथ बदल दिया।
    2. ईबी युक्त मीडिया को ईबी को फिर से निलंबित करने के लिए आंदोलन करके प्रत्येक कुएं में ईबी का समान वितरण सुनिश्चित करें, फिर मीडिया के 1/6 वें हिस्से (2 एमएल) को जल्दी से हटा दें और एक कुएं में वितरित करें। शेष कुओं के लिए दोहराएं।
    3. इनक्यूबेट करने से पहले, धीरे से प्लेट को हिलाएं, फिर आगे और पीछे, ईबी को समान रूप से वितरित करने के लिए। यदि ईबी बीच में झुरमुट करते हैं तो वे ठीक से अंतर नहीं करेंगे।
      नोट: प्लेटिंग घनत्व भेदभाव के लिए महत्वपूर्ण है। प्रति अच्छी तरह से 30 ईबी से अधिक प्लेट करना सुनिश्चित करें। यदि ईबी उत्पादन कुशल नहीं था, तो ईबी को कम कुओं में वितरित करें।
  2. NIM माध्यम के साथ दैनिक मीडिया बदलें। कुओं में मीडिया का स्तर ~ 3 एमएल रखें। मीडिया बदलते समय, प्लेटेड ईबी को सूखने से रोकने के लिए 1 एमएल मीडिया को छोड़कर सभी को हटा दें, और प्लेट से कोशिकाओं को न उठाने के लिए कुएं के किनारे धीरे से 2 एमएल मीडिया जोड़ें।
  3. ईबी चढ़ाना के नौ दिन बाद, दो दिनों के दौरान एनआईएम से रेटिना भेदभाव मीडिया (आरडीएम) में मीडिया को बदलना शुरू करें।
    1. निम्नलिखित को मिलाकर आरडीएम तैयार करें: 48% डीएमईएम / एफ 12 (1: 1) और 48% डीएमईएम विटामिन ए के बिना 2% बी 27 पूरक, 1% एमईएम एनईएए और 1% पेन-स्ट्रेप के साथ पूरक है। 0.20 μm फ़िल्टर का उपयोग करके फ़िल्टर निष्फल करें। आरडीएम को एक महीने तक 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।
    2. पहले दिन, मीडिया को एनआईएम: आरडीएम के 1: 1 मिश्रण पर स्विच करें। दूसरे दिन, मीडिया को आरडीएम में बदलें। बाद के सभी दिनों में, फ़ीड कोशिकाएं आरडीएम।
      नोट: अगले कुछ हफ्तों में, प्लेटेड ईबी तंत्रिका रेटिना पूर्वजों का निर्माण करेंगे जो स्पष्ट रूप से रंजित आरपीई उत्पन्न करना शुरू करते हैं।

4. फ्री-फ्लोटिंग ऑर्गेनोइड बनाना और फ्री-फ्लोटिंग ऑर्गेनॉइड संस्कृतियों को बनाए रखना

  1. प्रारंभिक डिस्पेस उपचार (ईबी प्लेटिंग के 21 दिन बाद) के बाद 28 दिनों में 1-2 मिमी 2 ग्रिड को प्लेटेड ईबी में काटने के लिए बाँझ स्केलपेल का उपयोग करकेईबी को 28 दिनों में चढ़ाया गया। यह रेटिना पूर्वज कॉलोनियों को छोटे टुकड़ों में अलग करेगा ताकि बाद में विकास में वे अपने केंद्र में अपर्याप्त पोषक तत्व विनिमय से बहुत बड़े और नेक्रोस न हों।
  2. प्लेटेड ईबी को अलग करें।
    1. ऐसा करने के लिए, पहले प्रत्येक कुएं में आरडीएम का एक अतिरिक्त 2 एमएल जोड़ें। फिर पी 1000 पिपेट का उपयोग करके कुओं से ~ 1000 μL मीडिया को एस्पिरेट करें। अब मीडिया को सीधे प्लेटेड ईबी पर निकाल दें, जिसमें नोक पूरी तरह से जलमग्न हो गई है।
    2. इसे तब तक दोहराएं जब तक कि सभी कोशिकाओं को प्लेट से उठा न दिया जाए। मीडिया के इजेक्शन के दौरान नोक को जलमग्न रखें और बुलबुले से बचने के लिए पिपेट प्लंजर को पहले स्टॉप से आगे न धकेलें।
  3. नवजात रूप से अलग किए गए ईबी चंक्स को एक बाँझ प्लास्टिक 125 एमएल एर्लेनमेयर फ्लास्क में फिर से चार्ज करें और फ्लास्क को ~ 40 एमएल आरडीएम मीडिया से भरें। फ्लास्क को एक मानक इनक्यूबेटर में रखे गए कक्षीय शेकर पर रखें। शेकर की गति 130-140 आरपीएम (गति सेटिंग 3) पर सेट करें।
    नोट: एक शेकर पर ऑर्गेनोइड्स की खेती उन्हें ऑर्गेनोइड्स की उच्च सांद्रता पर खेती करते समय एक साथ चिपकने से रोकती है। बायोरिएक्टर भी समान छोर प्राप्त करते हैं, लेकिन एक शेकर कम महंगा होता है।
  4. आंशिक मीडिया परिवर्तन के साथ ऑर्गेनोइड्स को खिलाएं, प्रति सप्ताह लगभग 12 एमएल आरडीएम को 2-3 बार प्रतिस्थापित करें, यह इस बात पर निर्भर करता है कि मीडिया कितना पीला हो जाता है। प्रारंभिक ऑर्गेनोइड्स को ज्यादा भोजन की आवश्यकता नहीं होगी, लेकिन जैसे-जैसे वे बढ़ते हैं, उन्हें अधिक मीडिया के साथ अधिक लगातार मीडिया परिवर्तन की आवश्यकता होगी।
  5. गैर-रेटिना, ओवरग्रोन और मरने वाले ऑर्गेनोइड्स को हटाने के लिए हर दो सप्ताह में ऑर्गेनोइड्स की छंटाई करें। यह मीडिया को बर्बाद करने से रोकता है और शेष रेटिना ऑर्गेनोइड्स के स्वास्थ्य में सुधार करता है।
    1. 5 एमएल पिपेट का उपयोग करके 6-वेल प्लेट या 10 सेमी डिश पर अपने फ्लास्क से कोशिकाओं को स्थानांतरित करें। ऑर्गेनोइड्स रखें जो स्तरीकृत न्यूरोएपिथेलियम प्रदर्शित करते हैं (चित्रा 1 ए, तारांकन)। ये ऑर्गेनोइड पारदर्शी और सफेद होते हैं।
    2. 5 एमएल पिपेट के साथ खराब-निर्मित या अतिरंजित रेटिना ऑर्गेनोइड्स, और गैर-रेटिना ऑर्गेनोइड्स को छांटना और हटाना। ये आम तौर पर अपारदर्शी और पीले रंग के होंगे (चित्रा 1 ए)। इसके अलावा कुछ भी हटा दें जो एक स्तरीकृत न्यूरोएपिथेलियम की तरह नहीं दिखता है। पहले कुछ छंटाई श्रम गहन होंगे, लेकिन हर बाद में बहुत आसान हो जाएंगे क्योंकि ऑर्गेनोइड बड़े और अधिक समरूप हो जाते हैं (चित्रा 1 बी)।

5. परिपक्व ऑर्गेनोइड्स को बनाए रखना और उन्हें पोस्ट-माइटोटिक रेटिना ऊतक में अलग करना

  1. ईबी गठन के लिए प्रारंभिक डिस्पेस उपचार के बाद 56 वें दिन (सप्ताह 8) (फ्लास्क में हटाए गए ईबी को विकसित करने के 28 दिन बाद) ऑर्गेनॉइड मीडिया को आरडीएम + में बदलें। यह रेटिना ऊतक के रूप में पूरी तरह से परिपक्व ऑर्गेनोइड्स को अतिरिक्त पोषक तत्व प्रदान करेगा।
    1. पीबीएस में 100 एमएम टॉरिन तैयार करें। उपयोग होने तक -20 डिग्री सेल्सियस में एलिकोट स्टोर करें।
    2. 10% एफबीएस, 100 एसएम टॉरिन और 2 एमएम वाणिज्यिक ग्लूटामाइन पूरक के साथ आरडीएम को पूरक करके आरडीएम + तैयार करें। 0.20 μm फ़िल्टर का उपयोग करके फ़िल्टर निष्फल करें।
    3. सप्ताह में 2-3 बार RDM+ मीडिया बदलना जारी रखें।
  2. सप्ताह 17-18 (पोस्ट-डिस्पेस उपचार) में ऑर्गेनोइड्स को एर्लेनमेयर फ्लास्क से 5 एमएल पिपेट का उपयोग करके अल्ट्रा-लो अटैचमेंट 6-वेल प्लेट में स्थानांतरित करें। पहले सप्ताह के लिए रोजाना ऑर्गेनोइड्स को एक-दूसरे से काटना और अलग करना जारी रखें जब तक कि ऑर्गेनोइड्स अब एक साथ नहीं चिपकते हैं। इष्टतम घनत्व प्रति अच्छी तरह से 10-15 ऑर्गेनोइड है। सप्ताह में 2-3 बार मीडिया बदलें।
    नोट: ऑर्गेनोइड्स की संख्या को कम करें यदि वे ऑर्गेनोइड अक्सर एक-दूसरे का पालन करते हैं या यदि मीडिया परिवर्तनों के बीच मीडिया बहुत पीला हो रहा है।
  3. सप्ताह 185 तक ऑर्गेनोइड्स पूरी तरह से पोस्ट-माइटोटिक हो जाने की उम्मीद करें जब तंत्रिका रेटिना कोशिकाएं मौजूद होती हैं। सप्ताह 24 तक, ऑर्गेनॉइड के बाहर अल्पविकसित बाहरी खंडों के गठन की जांच करें। सप्ताह 26-28 तक यह सुनिश्चित करें कि बाहरी खंड ऑर्गेनोइड्स के बाहर मोटे हैं (चित्रा 1 सी)। सप्ताह 26 के बाद विषाक्तता परीक्षण करें जब ऑर्गेनोइड्स ने बाहरी खंडों को परिभाषित किया है जो एक परिपक्व भेदभाव स्थिति को दर्शाता है।
    नोट: विषाक्तता परख के लिए केवल अच्छी तरह से विभेदित रेटिना ऑर्गेनोइड का उपयोग करें। अच्छी तरह से परिभाषित बाहरी खंडों के साथ ऑर्गेनोइड्स पर विषाक्तता परख करने से उनकी पहचान की अनुमति मिलेगी।

6. डीऑक्सीस्फिंगानिन (डीऑक्सीएसए) और दवा उपचार

नोट: यहां प्रस्तुत 4 दिनों की अवधि में डीऑक्सीएसए विषाक्तता को बचाने के लिए फेनोफाइब्रेट का एक एकल उपचार है (चित्रा 2)। ऑर्गेनोइड्स में जोड़े गए डीऑक्सीएसए की एकाग्रता, ऑर्गेनोइड्स पर डीऑक्सीएसए उपचार की अवधिऔर विषाक्तता को बचाने के लिए उपयोग की जाने वाली दवा का प्रकार, हालांकि, विषाक्तता और विषाक्तता बचाव की परख के लिए प्रयोगात्मक आवश्यकताओं के अनुसार संशोधित किया जा सकता है।

  1. इथेनॉल में डीऑक्सीएसए का 1 एमएम स्टॉक समाधान तैयार करें। 1 महीने के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। वैकल्पिक रूप से, डीएमएसओ में डीऑक्सीएसए का एक स्टॉक समाधान तैयार किया जा सकता है।
  2. दवा बचाव के लिए डीऑक्सीएसए की उचित विषाक्त एकाग्रता निर्धारित करने के लिए डीऑक्सीएसए का एक सीरियल कमजोर पड़ने का प्रदर्शन करें।
    नोट: पहले डीऑक्सीएसए की एकाग्रता निर्धारित करें जिसके परिणामस्वरूप बचाव प्रभाव को मापने के लिए पर्याप्त कोशिका मृत्यु होगी। यदि एकाग्रता बहुत अधिक है, तो विषाक्त प्रतिक्रिया के परिणामस्वरूप ऑर्गेनोइड का विघटन होगा और कोई बचाव नहीं देखा जाएगा। यदि विषाक्त प्रतिक्रिया बहुत कम है, तो एक महत्वपूर्ण बचाव प्रभाव का निरीक्षण करना मुश्किल होगा। डीऑक्सीएसए विषाक्त प्रतिक्रिया लैब-टू-लैब और डीऑक्सीएसए के बैच-टू-बैच से भिन्न हो सकती है।
    1. 1 mM deoxySA स्टॉक समाधान को 3 mL RDM+ में 0.5 μM, 1 μM और 2 μM की सांद्रता में पतला करें। नियंत्रण उपचार तैयार करने के लिए आरडीएम + में 3 μL इथेनॉल जोड़ें।
    2. एक विच्छेदन माइक्रोस्कोप के तहत, प्रति समूह न्यूनतम 5 ऑर्गेनोइड के साथ ऑर्गेनोइड के 4 समूहों का चयन करने के लिए एक बाँझ जांच का उपयोग करें। समूहों को अल्ट्रा-लो अटैचमेंट 6-वेल प्लेट के अलग-अलग कुओं में विभाजित करें। ऑर्गेनोइड्स का चयन करें जिनके पास लगभग समान आकार और आकार है।
    3. ऑर्गेनोइड्स से जितना संभव हो उतना आरडीएम + को एस्पिरेट करें। ऑर्गेनोइड्स के प्रत्येक कुएं में, आरडीएम + में डीऑक्सीएसए की एक एकाग्रता जोड़ें। ऑर्गेनोइड्स के चौथे कुएं में वाहन नियंत्रण जोड़ें।
    4. डीऑक्सीएसए या वाहन में दो दिनों की संस्कृति के बाद, मीडिया को आरडीएम + में ताजा तैयार संबंधित डीऑक्सीएसए कमजोर पड़ने के साथ बदलें।
    5. उपचार के चौथे दिन, कोशिका मृत्यु के लिए ऑर्गेनोइड्स को संसाधित करने और परख करने के लिए चरण 7 पर आगे बढ़ें। एक बार जब डीऑक्सीएसए एकाग्रता का चयन किया जाता है, तो फेनोफाइब्रेट के साथ इलाज करने के लिए चरण 6.3 जारी रखें।
      नोट: चयनित डीऑक्सीएसए उपचार समूह में लक्ष्य कोशिका मृत्यु प्रति 10,000 μm 2 पर 5 -20 ट्यूनल पॉजिटिव कोशिकाएं हैं। उपचार के दौरान एक जांच के स्पर्श से ऑर्गेनोइड्स विघटित नहीं होना चाहिए।
  3. डीऑक्सीएसए और फेनोफाइब्रेट की चयनित विषाक्त खुराक के साथ ऑर्गेनोइड्स का इलाज करें।
    1. डीएमएसओ में फेनोफाइब्रेट का 40 एमएम स्टॉक समाधान तैयार करें। 1 वर्ष तक -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
    2. दवा उपचार मीडिया तैयार करें: 3 एमएल आरडीएम + में, 1 एमएम डीऑक्सीएसए स्टॉक समाधान को 1 एसएम डीऑक्सीएसए में पतला करें और 40 एमएम फेनोफाइब्रेट स्टॉक समाधान को 20 μM तक पतला करें।
    3. डीऑक्सीएसए उपचार मीडिया तैयार करें: 3 एमएल आरडीएम + में, 1 एमएम डीऑक्सीएसए स्टॉक समाधान को 1 μM deoxySA में पतला करें और DMSO के 1.5 μL जोड़ें।
    4. नियंत्रण मीडिया तैयार करें: 3 एमएल आरडीएम + में, 3 μL इथेनॉल और 1.5 μL DMSO जोड़ें।
    5. एक बाँझ जांच का उपयोग करके एक विच्छेदन माइक्रोस्कोप के तहत प्रति समूह न्यूनतम पांच ऑर्गेनोइड के साथ ऑर्गेनोइड के तीन समूहों का चयन करें। समूहों को अल्ट्रा-लो अटैचमेंट 6-वेल प्लेट के अलग-अलग कुओं में विभाजित करें।
    6. ऑर्गेनोइड्स में तैयार उपचार (डीऑक्सीएसए, डीऑक्सीएसए + फेनोफाइब्रेट, या नियंत्रण) जोड़ें। दो दिनों के बाद, ताजा तैयार आरडीएम + के साथ कुओं में मीडिया को बदलें, जिसमें संबंधित डीऑक्सीएसए / फेनोफाइब्रेट / नियंत्रण समाधान शामिल हैं।
    7. उपचार के चौथे दिन कोशिका मृत्यु के लिए ऑर्गेनोइड्स को संसाधित करने और परख करने के लिए चरण 7 पर आगे बढ़ें (चित्रा 2)।

7. ऑर्गेनोइड्स का एम्बेडिंग और क्रायोसेक्शनिंग

  1. पीबीएस के 3 एमएल में 16% पीएफए एम्पोल के 1 एमएल जोड़कर ताजा 4% पीएफए तैयार करें।
  2. ऑर्गेनोइड्स से आरडीएम + मीडिया को हटा दें और पीबीएस के साथ एक बार कुल्ला करें। ऑर्गेनोइड्स से जितना संभव हो उतना पीबीएस हटा दें। ऑर्गेनोइड्स में ताजा तैयार 4% पीएफए (पीबीएस में) के 2 एमएल जोड़ें और कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
  3. 15 मिनट इनक्यूबेशन बाद, ऑर्गेनोइड्स को 2 एमएल पीबीएस के साथ दो बार कुल्ला करें, फिर 10 मिनट के लिए पीबीएस में धो लें।
    नोट: एक रासायनिक फ्यूम हुड में निर्धारण करें और पीएफए समाधान और बाद में दो पीबीएस कुल्ला को फ्यूम हुड में संग्रहीत उचित रूप से लेबल किए गए पीएफए अपशिष्ट कंटेनर में छोड़ दें।
  4. सभी पीबीएस को एस्पिरेट करें, फिर पीबीएस में 20% सुक्रोज को निश्चित ऑर्गेनोइड्स में जोड़ें। सुनिश्चित करें कि ऑर्गेनोइड्स सुक्रोज समाधान में मिश्रित हैं और शीर्ष पर पीबीएस बुलबुले में नहीं रहते हैं। सुक्रोज समाधान में ऑर्गेनोइड्स को तब तक रखें जब तक कि वे सुक्रोज समाधान के तल तक नहीं डूब जाते, यानी कमरे के तापमान पर ~ 1 घंटे। फिक्स्ड ऑर्गेनोइड्स को 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर सुक्रोज समाधान में संग्रहीत किया जा सकता है।
  5. एक क्रायोसेक्शन मोल्ड में ओसीटी समाधान में ऑर्गेनोइड्स को एम्बेड करें। प्रति स्थिति कई ऑर्गेनोइड्स को एक मोल्ड में एम्बेडेड किया जा सकता है। ऑर्गेनोइड्स को यह सुनिश्चित करने के लिए उन्मुख करें कि उनके सबसे अच्छे रेटिना क्षेत्र क्रायोस्टैट पर क्रॉससेक्शन किए जाएंगे, और ऑर्गेनोइड्स के मध्य सभी मोटे तौर पर एक ही विमान में हैं। एम्बेडेड ऑर्गेनोइड्स को -20 डिग्री सेल्सियस पर फ्रीज करें। एम्बेडेड ऑर्गेनोइड्स को वर्षों तक -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।
    नोट: जमे हुए ओसीटी में ऑर्गेनोइड्स देखना मुश्किल है; आरपीई समूहों को मोल्ड के किनारे की ओर उन्मुख करें जो ऑर्गेनोइड पहचान की सुविधा के लिए ब्लेड का सामना करेंगे।
  6. क्रायोसेक्शन ऑर्गेनोइड्स को 10-14 μm मोटी खंडों में विभाजित करें और पॉली-एल लाइसिन उपचारित स्लाइडों का पालन करें। क्रायोसेक्शनिंग करते समय, बार-बार माइक्रोस्कोप के तहत स्लाइड्स की जांच करें ताकि उन वर्गों की पहचान की जा सके जिनमें ऑर्गेनोइड्स का मध्य होता है। केवल ऑर्गेनोइड्स के मध्य स्लाइस एकत्र करें जहां सभी परतों को समान रूप से दर्शाया जाता है (चित्रा 2 ए-सी, चित्रा 3)। एक बार अनुभागित होने के बाद, स्लाइड्स को वर्षों तक -80 डिग्री सेल्सियस पर स्लाइड बॉक्स में संग्रहीत किया जा सकता है।
    नोट: ऑर्गेनॉइड के सिरों पर लिए गए स्लाइस सबसे बाहरी फोटोरिसेप्टर का अधिक नमूना लेंगे और परिमाणीकरण के लिए उपयुक्त नहीं हैं। औसत आकार के ऑर्गेनोइड ऑर्गेनोइड के मध्य के 10-15 स्लाइस प्रदान करेंगे जो स्तरीकृत रेटिना परतों के क्रॉस सेक्शन का प्रतिनिधित्व करता है।

8. एपोप्टोटिक कोशिकाओं के लिए ट्यूनल धुंधला होना

  1. 37 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए जमे हुए स्लाइड को पिघलाएं। तुरंत स्लाइड को 37 डिग्री सेल्सियस पर रखने से संघनन को रोका जा सकता है। शुद्ध पानी में भिगोए गए ऊतक के नमूने ऊतक को विकृत कर सकते हैं। एक 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेशन ग्लास स्लाइड में ऊतक के आसंजन में भी सुधार करता है।
  2. हाइड्रोफोबिक पेन का उपयोग करके ऊतक वर्गों के चारों ओर ग्लास स्लाइड पर एक निरंतर सीमा बनाएं। यह एक सीमा प्रदान करेगा और समाधान की छोटी मात्रा के साथ पर्याप्त निर्धारण और एंटीबॉडी ऊष्मायन सुनिश्चित करेगा। 20 मिनट के लिए ताजा तैयार 4% पीएफए के लगभग 100-200 μL जोड़ें (मात्रा हाइड्रोफोबिक-सीमा वाले क्षेत्र को बिना फैले भर देगी)। एक रासायनिक फ्यूम हुड में निर्धारण करें और पीएफए समाधान को फ्यूम हुड में संग्रहीत उचित रूप से लेबल किए गए पीएफए अपशिष्ट कंटेनर में छोड़ दें।
  3. पीबीएस में एक बार स्लाइड को धो लें फिर कमरे के तापमान पर 25 मिनट के लिए पीबीएस में धो लें।
  4. TUNEL मिश्रण तैयार करें। सीटू सेल डेथ डिटेक्शन किट से बैंगनी और नीली शीशियों दोनों को पिघलाएं। बैंगनी शीशी के घोल के 100 μL को निकालें (एक नकारात्मक नियंत्रण के लिए उपयोग कर सकते हैं) और बैंगनी शीशी से शेष 450 μL घोल को नीली शीशी से 50 μL घोल के साथ मिलाएं। अच्छी तरह मिलाएं और अंधेरे में रखें। शीशियों का प्रत्येक सेट (500 μL कुल) 5-10 स्लाइड दाग सकता है।
  5. ऊतक स्लाइस को स्थिर करें।
    1. परमेबिलाइजेशन समाधान तैयार करें: 0.1% ट्राइटनएक्स -100 और 0.1% सोडियम साइट्रेट के साथ पीबीएस
    2. नमूना स्लाइड से PBS निकालें फिर नमूने में Permeabilization Solution जोड़ें। बर्फ के ब्लॉक पर या 4 डिग्री सेल्सियस पर 2 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें। उसके बाद, पीबीएस में एक बार कुल्ला करें और फिर पीबीएस में 10 मिनट के लिए धो लें।
  6. पीबीएस को हटा दें और मुड़े हुए ऊतक के कोने का उपयोग करके जितना संभव हो उतना घोल सुखा लें। हाइड्रोफोबिक पेन द्वारा खींचे गए क्षेत्र के आकार के आधार पर नमूनों में तैयार ट्यूनल मिश्रण का 50-100 μL जोड़ें। ग्लास कवर स्लिप के साथ कवर करें और अंधेरे में 1 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
    नोट: फ्लोरोफोरे के विरंजन को रोकने के लिए निम्नलिखित चरणों के लिए सभी ऊष्मायन और धुलाई अंधेरे में की जानी चाहिए। प्रकाश को अवरुद्ध करने के लिए या तो एक अंधेरे बॉक्स का उपयोग करें या एल्यूमीनियम पन्नी के साथ स्लाइड को कवर करें।
  7. फोटोरिसेप्टर को लेबल करें। पीबीएस के साथ एक बार कुल्ला करें फिर पीबीएस में 20 मिनट के लिए धो लें। पीबीएस को हटा दें फिर प्राथमिक रिकवरिन एंटीबॉडी (खरगोश एंटी-रिकवरिन) को पीबीएस में 0.1% ट्वीन और 5% गधे सीरम के साथ 1:500 पतला जोड़ें। रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
  8. प्राथमिक एंटीबॉडी को हटाने के बाद, पीबीएस में एक बार कुल्ला करें फिर पीबीएस में 20 मिनट के लिए धो लें। द्वितीयक एंटीबॉडी, गधे विरोधी खरगोश को नारंगी या लाल फ्लोरोफोरे के साथ जोड़ें, पीबीएस में 0.1% ट्वीन और 5% गधे सीरम के साथ 1: 1,000 पतला करें और 2 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट करें। पीबीएस के साथ एक बार कुल्ला करें फिर पीबीएस में 20 मिनट के लिए धो लें। पीबीएस में 1: 1000 पर DAPI जोड़ें, 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट करें।
  9. पीबीएस के साथ एक बार कुल्ला करें फिर पीबीएस में 20 मिनट के लिए धो लें। पीबीएस निकालें और माउंटिंग माध्यम जोड़ें। कवर स्लिप जोड़ें, नेल पॉलिश के साथ सील करें, और अंधेरे में सूखने के लिए छोड़ दें। स्लाइड्स को 1 सप्ताह तक एक अंधेरे कंटेनर में 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।
    नोट: सबसे अच्छी छवि गुणवत्ता के लिए अगले दिन छवियां लें।

9. इमेजिंग ऑर्गेनॉइड स्लाइस और मृत्यु की मात्रा।

नोट: इमेजिंग को तीन फ्लोरोफोरे चैनलों के बीच अंतर करने की क्षमताओं के साथ एक कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप की आवश्यकता होती है। यह प्रयोग हरे (एलेक्सा फ्लूर 488), नारंगी (एलेक्सा फ्लूर 555), और यूवी (डीएपीआई) चैनलों का उपयोग करता है। फ्लोरोफोरे के किसी भी संयोजन का उपयोग यह सुनिश्चित करने के लिए किया जा सकता है कि उत्सर्जन अन्य चैनलों में खून न बहाए।

  1. इमेजिंग और परिमाणीकरण के लिए रेटिना अनुभागों का पता लगाएं। माइक्रोस्कोप (5x या 10x) के कम आवर्धन के तहत, पुनर्प्राप्ति धुंधलापन का उपयोग करें, जो फोटोरिसेप्टर के साइटोप्लाज्म को लेबल करता है, और DAPI धुंधलापन, जो सभी कोशिकाओं के नाभिक को लेबल करता है, कटा हुआ ऑर्गेनोइड के एक क्षेत्र का पता लगाने के लिए जो बरकरार, अच्छी तरह से गठित है, और एक विमान में जो ऑर्गेनोइड के प्रतिनिधि क्रॉस-सेक्शन का नमूना लेता है (चित्रा 2 और चित्रा 3)। ). एक खंड का पता लगाएं जिसमें फोटोरिसेप्टर की एक अलग बाहरी परमाणु परत है जो कम से कम कुछ कोशिकाएं मोटी हैं, और नाभिक की एक अलग और विशिष्ट परत है जिसमें रिकवरिन धुंधला नहीं है (चित्रा 2 और चित्रा 3)।
  2. छवि को फ्रेम करें। माइक्रोस्कोप के आवर्धन को 20x उद्देश्य तक बढ़ाएं और छवि को यथासंभव फोटोरिसेप्टर परत से भरने के लिए स्लाइड को फ्रेम करें (चित्रा 3)।
  3. Z-विमान सेट करें। यदि माइक्रोस्कोप का उपयोग करके जेड-स्टैक्स की छवियां स्लाइस की पूरी गहराई को चित्रित करने के लिए जेड-रेंज की ऊपरी और निचली सीमा निर्धारित करती हैं। एक प्रयोगात्मक सेट में सभी छवियों के लिए एक ही जेड-स्टैक मोटाई का उपयोग करें ताकि सभी नमूनों में ऊतक की समान मात्रा की परख की जा सके। यदि जेड-स्टैक्स की छवियों को चित्रित करने वाले माइक्रोस्कोप का उपयोग नहीं किया जाता है, तो छवि को स्लाइस के बीच में केंद्रित करें।
  4. जेड-स्टैक अधिग्रहण में फ्लोरोफोरेस के सभी तीन चैनलों को चित्रित करें। सभी तीन चैनलों को एक मरने वाली कोशिका की सकारात्मक पहचान करने की आवश्यकता होती है। प्रति ऑर्गनॉइड एक क्षेत्र की छवि।
  5. छवि सेट को फ़ाइल स्वरूप में सहेजें जो प्रति पिक्सेल क्षेत्र के अनुपात को संरक्षित करता है.

10. मरने वाली कोशिकाओं की मात्रा

  1. FIJI (छवि J) सॉफ्टवेयर में छवि ढेर खोलें। जैव-स्वरूप आयात विकल्प विंडो में, सुनिश्चित करें कि "अलग-अलग विंडो में विभाजित" अनुभाग के तहत कोई बॉक्स चयनित नहीं है। संरेखित छवि चैनलों के बीच स्क्रॉलिंग कोशिकाओं को उचित रूप से पहचानने के लिए महत्वपूर्ण है।
  2. इमेज > स्टैक्स पर क्लिक करके जेड-स्टैक छवि सेट को समतल करें और फिर ड्रॉपडाउन मेनू से 'जेड प्रोजेक्ट' का चयन करें। यह परिमाणीकरण के लिए एक नई छवि बनाएगा। यदि ऑर्गेनोइड्स को जेड-सीरीज़ में चित्रित नहीं किया गया था, तो इस चरण को छोड़ दें।
  3. उस छवि चैनल का चयन करें जो पुनर्प्राप्ति धुंधला दिखाता है (लाल, इस उदाहरण में)। टूलबार में बहुभुज चयन उपकरण पर क्लिक करें और छवि में फोटोरिसेप्टर के एक निरंतर क्षेत्र को रेखांकित करें (चित्रा 3 ए)। विश्लेषण > सेट माप पर क्लिक करें। सेट माप पॉप-अप विंडो में क्षेत्र के बगल में बॉक्स का चयन करें, विश्लेषण पर क्लिक करें और मरने वाली कोशिकाओं की गणना करने के लिए फोटोरिसेप्टर के क्षेत्र (या शॉर्ट-कट के रूप में "एम" दबाएं) को मापने के लिए माप का चयन करें। क्षेत्र माप एक पॉप-अप माप विंडो में दिखाई देगा।
  4. पहले से चयनित फोटोरिसेप्टर क्षेत्र में ट्यूनल-पॉजिटिव नाभिक की गणना करें (चित्रा 3 बी, सी)। टूल बार में पॉइंट टूल पर राइट क्लिक करें और मल्टी-पॉइंट टूल का चयन करें। केवल ट्यूनल चैनल में, ट्यूनल पॉजिटिव स्टेनिंग पर क्लिक करें जो एक डीएपीआई पॉजिटिव नाभिक और रिकवरिन स्टेनिंग के साथ ओवरलैप होता है। सकारात्मक कोशिकाओं को मान्य करने के लिए चैनलों के बीच टॉगल करें।
  5. प्रति ऑर्गेनोइड फोटोरिसेप्टर में कोशिका मृत्यु के लिए सामान्यीकृत मूल्य प्राप्त करने के लिए क्षेत्र द्वारा ट्यूनल पॉजिटिव कोशिकाओं की संख्या को विभाजित करें (चित्रा 2 डी, ई)।

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Representative Results

रेटिना ऑर्गेनोइड्स एक गैर-मैकटेल नियंत्रण आईपीएससी लाइन से उत्पन्न हुए थे। ऑर्गेनोइड्स संस्कृति में 26 सप्ताह तक पहुंचने के बाद उन्हें चुना गया और प्रयोगात्मक समूहों में विभाजित किया गया। ऑर्गेनोइड्स को डीऑक्सीएसए की अलग-अलग सांद्रता के साथ इलाज किया गया था ताकि यह निर्धारित किया जा सके कि डीऑक्सीएसए फोटोरिसेप्टर के लिए विषाक्त है या नहीं। डीऑक्सीएसए की चार सांद्रता का परीक्षण किया गया था, 0 से 1 μM (चित्रा 2) और ऑर्गेनोइड्स का इलाज 8 दिनों के लिए किया गया था, जिसमें हर दूसरे दिन मीडिया परिवर्तन होते थे। डीऑक्सीएसए के जवाब में कोशिका मृत्यु एकाग्रता-निर्भर है और 50 एनएम डीऑक्सीएसए (चित्रा 2 डी) से कम में पता लगाने योग्य है। परीक्षण किए गए उच्चतम एकाग्रता, 1 μM deoxySA, ने रेटिना ऑर्गेनॉइड (चित्रा 2 बी, डी) की अखंडता को बनाए रखते हुए एक मजबूत प्रभाव दिया। 5 μM deoxySA की उच्च सांद्रता ने कुछ दिनों के भीतर ऑर्गेनोइड्स के विघटन का कारण बना (डेटा नहीं दिखाया गया)। डीऑक्सीएसए खुराक प्रतिक्रिया के परिणामों ने भविष्य के विषाक्तता प्रयोगों के लिए डीऑक्सीएसए की इष्टतम एकाग्रता निर्धारित की। 1 μM deoxySA खुराक के परिणामस्वरूप विषाक्तता को ओवरसैचुर किए बिना पर्याप्त कोशिका मृत्यु हुई, जैसा कि 5 μM पर देखा गया था।

डीऑक्सीएसए-प्रेरित कोशिका मृत्यु को बचाने के लिए फेनोफाइब्रेट की क्षमता का परीक्षण करने के लिए, रेटिना ऑर्गेनोइड्स को या तो 1 μM deoxySA, 1 μM deoxySA प्लस 20 μM फेनोफाइब्रेट, या कोई उपचार वाहन नियंत्रण नहीं (चित्रा 2A-C, E) के साथ इलाज किया गया था। 20 μM फेनोफाइब्रेट उपचार ने रेटिना ऑर्गेनोइड्स के फोटोरिसेप्टर में डीऑक्सीएसए-प्रेरित विषाक्तता को रोका, 4 दिनों के उपचार के बाद कोशिका मृत्यु को लगभग 80% तक कम कर दिया (चित्रा 2 ए-सी, ई)16। अतिरिक्त लिपिड-बदलने वाली दवाओं का परीक्षण उसी प्रोटोकॉल का उपयोग करके किया गया था, जिसमें फ्यूमोनोसिन-बी 1 भी शामिल था, जिसने डीऑक्सीएसए विषाक्तता का पूरा बचाव दिखाया। संबंधित लिपिड प्रजातियों का भी परीक्षण विशिष्ट डाउनस्ट्रीम स्फिंगोलिपिड मेटाबोलाइट की पहचान करने के लिए किया गया था जो फोटोरिसेप्टर सेल मृत्यु की ओर जाताहै।

Figure 1
चित्र 1: एक उल्टे प्रकाश माइक्रोस्कोप के तहत ऑर्गेनोइड्स की प्रतिनिधि उज्ज्वल क्षेत्र छवियां। (ए) अलगाव के बाद 2 दिनों में 4 सप्ताह पुराने ऑर्गेनोइड उचित रेटिना लेयरिंग (सफेद *) या गैर-रेटिना ऑर्गेनोइड विकास दिखाते हैं। (बी) सप्ताह 13 में ऑर्गेनोइड ्स विकसित करना। (सी) सप्ताह 28 में रेटिना ऑर्गेनोइड्स स्पष्ट रेटिना लेयरिंग और बाहरी फोटोरिसेप्टर परत (सफेद पट्टी) से प्रोजेक्ट करने वाले अच्छी तरह से गठित बाहरी खंडों के साथ। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्रा 2: कोशिका मृत्यु की प्रतिनिधि कॉन्फोकल छवियां। 4 दिनों के उपचार के बाद रेटिना ऑर्गेनॉइड की फोटोरिसेप्टर परत (रिकवरिन, लाल) के भीतर कोशिका मृत्यु (ट्यूनल, हरे) की प्रतिनिधि कॉन्फोकल छवियां या तो नियंत्रण मीडिया (ए), 1 μM deoxySA (B), या 20 μM फेनोफिब्रेट (C) के साथ 1 μM deoxySA के साथ। (डी) डीऑक्सीएसए की अलग-अलग सांद्रता के साथ रेटिना ऑर्गेनॉइड ऊतक के उपचार के बाद मानव फोटोरिसेप्टर में कोशिका मृत्यु का परिमाणीकरण। (ई) नियंत्रण मीडिया (एन = 6), 1 μM deoxySA (n = 22), 1 μM deoxySA + 20 μM फेनोफाइब्रेट (n = 21) के साथ रेटिना ऑर्गेनोइड ऊतक के उपचार के बाद मानव फोटोरिसेप्टर में कोशिका मृत्यु का परिमाणीकरण। *p<0.05, ***p<0.001 एक तरफा ANOVA और पोस्ट हॉक Tukey परीक्षण के साथ। डेटा न्यू इंग्लैंड जर्नल ऑफ मेडिसिन, गैंटनर, एम, ईड, के और वालेस से प्राप्त हुआ है। एम, एट अल। मैकुलर रोग और परिधीय न्यूरोपैथी में सेरीन और लिपिड चयापचय, 381 (15), 1422-1433, कॉपीराइट © (2019) मैसाचुसेट्स मेडिकल सोसाइटी। अनुमति के साथ पुनर्मुद्रित. 14कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्रा 3: स्क्रीन शॉट्स एक वर्गीकृत और दाग वाले ऑर्गेनोइड की एक कॉन्फोकल छवि दिखाते हैं, जिसे फिजी सॉफ्टवेयर का उपयोग करके 1 μM deoxySA के साथ इलाज किया जाता है। फ्लोरोसेंट चैनलों को α-रिकवरिन (ए, लाल), ट्यूनल (बी, हरा), और डीएपीआई (सी, ब्लू) में विभाजित किया गया है। (ए) फोटोरिसेप्टर क्षेत्र को टूलबार (ऊपर बाएं) में चुने गए बहुभुज उपकरण का उपयोग करके रेखांकित किया गया है। (बी, सी) फोटोरिसेप्टर परत के भीतर ट्यूनल पॉजिटिव (बी, ग्रीन) और डीएपीआई पॉजिटिव (सी, ब्लू) कोशिकाओं के टूल बार में चुने गए मल्टी-पॉइंट टूल का उपयोग करके सेल गिनती करता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

विभेदन प्रोटोकॉल भिन्नताएं
योशिकी सासाई के समूह20 द्वारा स्व-निर्माण ऑप्टिक कप के आविष्कार के बाद से, कई प्रयोगशालाओं ने रेटिना ऑर्गेनोइड उत्पन्न करने के लिए प्रोटोकॉल विकसित किए हैं जो लगभग हर चरण 5,18,19,21 पर भिन्न हो सकते हैं। प्रोटोकॉल की एक विस्तृत सूची कैपोव्स्की एट अल .22 में पाई जा सकती है। यहां हम जो भेदभाव प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं वह एक सरल, कम हस्तक्षेप प्रोटोकॉल है जो परिपक्व रेटिना ऑर्गेनोइड्स को अलग करने का प्रयास करने वाली किसी भी प्रयोगशाला के लिए एक अच्छा प्रारंभिक बिंदु प्रदान करता है। उपयोगकर्ताओं को इस प्रोटोकॉल पर विविधताओं का पता लगाने और अपनाने के लिए प्रोत्साहित किया जाता है। प्रोटोकॉल भिन्नता के लिए सामान्य कदम ईबी का उत्पादन और प्रारंभिक भेदभाव हैं, और दक्षता 5,19,23 में सुधार के लिए बीएमपी 4, डीकेके -1, या रेटिनोइक एसिड जैसे भेदभावकारकों का उपयोग है।

देर से चरण के विकास के लिए एक शेकर पर ऑर्गेनोइड्स की खेती भेदभाव दक्षता बढ़ाने और ऑर्गेनोइड्स को संभालने में बिताए गए समय को कम करने के लिए एक प्रभावी कदम रहा है। बायोरिएक्टरसमान छोर 24 प्राप्त करते हैं, हालांकि, डिस्पोजेबल एर्लेनमायर फ्लास्क के साथ एक शेकर का उपयोग करना अधिक लागत प्रभावी है और इसे सामान्य प्रयोगशाला उपकरणों के साथ किया जा सकता है। ऑर्गेनोइड्स को संगठित निलंबन में रखने का मुख्य लाभ यह है कि यह ऑर्गेनोइड्स को अलग करने की आवश्यकता को दूर करता है जो बढ़ते समय प्लेट पर एक साथ चिपके रहते हैं। निलंबित संस्कृतियां भी अधिक पोषक तत्वों के आदान-प्रदान की सुविधा प्रदान करती हैं, इसलिए ऑर्गेनोइड्स में मानक स्टिल प्लेट पर उन लोगों की तुलना में बड़े होने की प्रवृत्ति होती है। इस कारण से, चरण 4.1 में जितना संभव हो उतना छोटा प्लेटेड ईबी को विभाजित करके शुरू करना अच्छा है।

चूंकि परिपक्व रेटिना ऑर्गेनोइड्स प्राप्त करने के लिए लगभग 6 महीने के लिए एक एकल संस्कृति को अलग करने की आवश्यकता होती है, इसलिए रेटिना ऑर्गेनोइड्स पर विषाक्तता परख करना 2-डी मोनोकल्चर का उपयोग करने की तुलना में समय लेने वाला लग सकता है। हालांकि, विषाक्तता परख एक ही नियंत्रण रेखा पर की जाती है, और भेदभाव नियमित रूप से स्थापित किए जा सकते हैं। प्रारंभिक 6 महीने के निवेश के बाद, अतिरिक्त प्रयोगों और प्रोटोकॉल संशोधनों को करने के लिए ऑर्गेनोइड्स की नियमित आपूर्ति बिना देरी के हाथ में होगी। हर 1-2 महीने में रेटिना ऑर्गेनॉइड भेदभाव के 2-3 राउंड शुरू करना प्रयोगों के जटिल और संपूर्ण सेट के लिए पर्याप्त ऊतक प्रदान करता है।

ऑर्गेनोइड्स लक्षित दवा परीक्षण के लिए एक बहुमुखी मॉडल प्रदान करते हैं।
यह प्रोटोकॉल डीऑक्सीएसएल-प्रेरित कोशिका मृत्यु को बचाने के लिए लिपिड-बदलने वाली दवाओं की प्रभावकारिता का परीक्षण करने के लिए एक फोटोरिसेप्टर विषाक्तता परख का वर्णन करता है। यद्यपि यह मैकटेल में रोग पैदा करने वाले एजेंट के लिए औषधीय बचाव दिखाने वाला एक विशिष्ट अनुप्रयोग है, इस प्रोटोकॉल का उपयोग किसी भी संख्या में अपमान (जैसे, पोषक तत्वों की कमी, हाइपोक्सिक स्थितियों, प्रकाश विषाक्तता) और औषधीय बचाव का परीक्षण करने के लिए किया जा सकता है। इसलिए, इसे अन्य रेटिना रोगों के मॉडल के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। अपने स्वयं के काम में हमने दिखाया है कि इसी प्रोटोकॉल का उपयोग करके और विभिन्न संबंधित स्फिंगोलिपिड प्रजातियों और दवाओं को प्रतिस्थापित करके जो सीधे स्फिंगोलिपिड चयापचय को अवरुद्ध करते हैं, हम विशिष्ट विषाक्त डाउनस्ट्रीम स्फिंगोलिपिड मेटाबोलाइट का निर्धारण करके मैकटेल रोग तंत्र को अंतर्दृष्टि प्रदान करने में सक्षम थे जो फोटोरिसेप्टर सेल मृत्यु की ओर जाता है। . आनुवंशिक उत्परिवर्तन के स्तर पर मॉडलिंग रोगों के विपरीत, जिन्हें वेरिएंट आईपीएससी लाइनों को स्थापित करने की आवश्यकता होती है, विषाक्त चयापचय स्थितियों और पर्यावरणीय तनावों को मॉडल करने के लिए ऑर्गेनोइड्स का उपयोग करने से प्रचुर मात्रा में और आसानी से उपलब्ध ऊतक स्रोत के साथ एक गतिशील मॉडल के रूप में एक सामान्य नियंत्रण आईपीएससी लाइन का उपयोग करने की अनुमति मिलती है।

रेटिना में चयापचय रोगों का अध्ययन करते समय मानव ऑर्गेनॉइड मॉडल विशेष रूप से फायदेमंद होते हैं, जहां विभिन्न सेल प्रकारों में एक अद्वितीय सहजीवी चयापचय परस्पर क्रिया होती है जिसे फोटोरिसेप्टर जैसी कोशिकाओं के मोनोकल्चर में दोहराया नहीं जा सकताहै। इस जटिल चयापचय मॉडल ने हमें मनुष्यों में सीधे डीऑक्सीएसएल के विषाक्त प्रभावों को रोकने में दवा फेनोफाइब्रेट की प्रभावशीलता की खोज करने की अनुमति दी है। ऊंचा डीऑक्सीएसएल14 (अप्रकाशित डेटा) और माउस भ्रूण फाइब्रोब्लास्ट सेल कल्चर मॉडल के माउस मॉडल में डीऑक्सीएसएल चयापचय फेनोफाइब्रेट अप्रभावी साबितहुए। जटिल मानव ऊतक मॉडल के संदर्भ में दवाओं का परीक्षण हमें प्रभावी उपचार की पहचान करने और अप्रभावी उपचारों को छूट देने की अनुमति देगा जो अन्यथा चूक गए होते यदि हम केवल चूहों या सरलीकृत मोनोकल्चर पर भरोसा करते।

दवा स्क्रीनिंग के लिए भविष्य का विकास
इस प्रोटोकॉल में हम फोटोरिसेप्टर में एपोप्टोसिस की मात्रा निर्धारित करते हैं, जो सबसे प्रचुर मात्रा में सेल प्रकार है। हालांकि, किसी भी सिद्ध एंटीबॉडी का उपयोग करके जो विशेष रूप से अन्य रेटिना सेल प्रकारों को लेबल करते हैं, यह प्रोटोकॉल किसी भी रेटिना सेल प्रकार, या सेल उपप्रकार (जैसे, शंकु बनाम रॉड) में कोशिका मृत्यु को परख करने के लिए संशोधित है। ऊतक स्लाइस में ट्यूनल धुंधलापन का उपयोग करके एपोप्टोसिस को निर्धारित करने का नुकसान यह है कि यह कोशिका मृत्यु को निर्धारित करने के लिए एक कम थ्रूपुट तकनीक है, जो उम्मीदवार दवाओं की छोटी सूचियों की स्क्रीनिंग के लिए इस परख के आवेदन को सीमित करता है। आईएचसी दृष्टिकोण का उपयोग करके अलक्षित दवा पुस्तकालयों की एक बड़ी स्क्रीन संभव नहीं होगी। बड़ी दवा स्क्रीन की सुविधा के लिए इस प्रोटोकॉल में भविष्य के विकास के लिए अधिक आसानी से मात्रात्मक सेल डेथ मार्कर के एकीकरण की आवश्यकता होगी। हालांकि ये उपलब्ध हैं, आकार में रेटिना ऑर्गेनोइड्स की अनियमितता, गैर-रेटिना ऊतक उपांगों की उपस्थिति या अनुपस्थिति, और फोटोरिसेप्टर परत की गुणवत्ता में परिवर्तनशीलता ऑर्गेनोइड्स में परिणामों को सामान्य करना मुश्किल बनाती है। हम उम्मीद करते हैं कि बड़े दवा पुस्तकालयों की स्क्रीनिंग के लिए मानव ऑर्गेनॉइड रोग मॉडल के थ्रूपुट को बढ़ाने के लिए भविष्य के विकास से दवाओं की खोज, संशोधन और मान्य करने की हमारी क्षमता में काफी सुधार होगा जो प्रीक्लिनिकल परीक्षणों से अनुमोदित चिकित्सीय तक आगे बढ़ेंगे।

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Disclosures

लेखकों के हितों का कोई टकराव नहीं है।

Acknowledgments

लोवी मेडिकल रिसर्च इंस्टीट्यूट द्वारा समर्थित। हम मैकटेल परियोजना के समर्थन के लिए लोवी परिवार को धन्यवाद देना चाहते हैं। हम पांडुलिपि तैयार करने में उनके बौद्धिक इनपुट और सहायता के लिए मारी गैंटनर, माइक डोरेल और ली शेपके को धन्यवाद देना चाहते हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.5M EDTA Invitrogen 15575020
125mL Erlenmeyer Flasks VWR 89095-258
1-deoxysphinganine Avanti 860493
B27 Supplement, minus vitamin A Gibco 12587010
Beaver 6900 Mini-Blade Beaver-Visitec BEAVER6900
D-(+)-Sucrose VWR 97061-432
DAPI Thermo-fisher D1306
Dispase II, powder Gibco 17105041
DMEM, high glucose, pyruvate Gibco 11995073
DMEM/F12 Gibco 11330
Donkey anti-rabbit Ig-G, Alexa Fluor plus 555 Thermo-fisher A32794
donkey serum Sigma D9663-10ML
FBS, Heat Inactivated Corning 45001-108
Fenofibrate Sigma F6020
Glutamax Gibco 35050061
Heparin Stemcell Technologies 7980
In Situ Cell Death Detection Kit, Fluorescin Sigma 11684795910
Matrigel, growth factor reduced Corning 356230
MEM Non-Essential Amino Acids Solution Gibco 11140050
mTeSR 1 Stemcell Technologies 85850
N2 Supplement Gibco 17502048
Penicillin-Streptomycin Gibco 15140122
Pierce 16% Formaldehyde Thermo-fisher 28906
Rabbit anti-Recoverin antibody Millipore AB5585
Sodium Citrate Sigma W302600
Steriflip Sterile Disposable Vacuum Filter Units MilliporeSigma SE1M179M6
Taurine Sigma T0625
Tissue Plus- O.C.T. compound Fisher Scientific 23-730-571
Tissue-Tek Cryomold EMS 62534-10
Triton X-100 Sigma X100
Tween-20 Sigma P1379
Ultra-Low Attachment 6 well Plates Corning 29443-030
Ultra-Low Attachment 75cm2 U-Flask Corning 3814
Vacuum Filtration System VWR 10040-436
Vectashield-mounting medium vector Labs H-1000
wax pen-ImmEdge vector Labs H-4000
Y-27632 Dihydrochloride (Rock inhibitor) Sigma Y0503

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References

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Eade, K., Giles, S., Harkins-Perry, S., Friedlander, M. Toxicity Screens in Human Retinal Organoids for Pharmaceutical Discovery. J. Vis. Exp. (169), e62269, doi:10.3791/62269 (2021).

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