Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

شاشات السمية في عضويات شبكية العين البشرية لاكتشاف الأدوية

Published: March 4, 2021 doi: 10.3791/62269
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2, 1,2
1Lowy Medical Research Institute, 2The Scripps Research Institute

Summary

نقدم هنا بروتوكولا خطوة بخطوة لتوليد عضويات شبكية بشرية ناضجة واستخدامها في مقايسة سمية مستقبلات ضوئية لتحديد الأدوية المرشحة لمرض توسع الشعيرات البقعي المرتبط بالعمر من النوع 2 (MacTel).

Abstract

توفر المواد العضوية منصة واعدة لدراسة آلية المرض والعلاجات ، مباشرة في سياق الأنسجة البشرية مع براعة وإنتاجية زراعة الخلايا. تستخدم عضويات الشبكية البشرية الناضجة لفحص العلاجات الصيدلانية المحتملة لمرض توسع الشعيرات البقعي المرتبط بالعمر من النوع 2 (MacTel).

لقد أظهرنا مؤخرا أن MacTel يمكن أن يكون ناتجا عن مستويات مرتفعة من أنواع الدهون غير النمطية ، deoxysphingolipids (deoxySLs). هذه الدهون سامة لشبكية العين وقد تؤدي إلى فقدان مستقبلات الضوء التي تحدث في مرضى MacTel. لفحص الأدوية لقدرتها على منع سمية مستقبلات الضوء deoxySL ، قمنا بتوليد عضويات شبكية بشرية من خط الخلايا الجذعية متعددة القدرات (iPSC) غير المستحث من MacTel ونضجها إلى عصر ما بعد الانقسام حيث يطورون جميع الخلايا المشتقة من السلالة العصبية في شبكية العين ، بما في ذلك المستقبلات الضوئية الناضجة وظيفيا. تمت معالجة عضويات الشبكية بمستقلب deoxySL وتم قياس موت الخلايا المبرمج داخل طبقة المستقبلات الضوئية باستخدام الكيمياء الهيستولوجية المناعية. باستخدام نموذج السمية هذا ، تم فحص المركبات الدوائية التي تمنع موت المستقبلات الضوئية الناجم عن deoxySL. باستخدام نهج مرشح مستهدف ، قررنا أن فينوفايبرات ، وهو دواء يوصف عادة لعلاج ارتفاع الكوليسترول والدهون الثلاثية ، يمكن أن يمنع أيضا سمية deoxySL في خلايا شبكية العين.

نجح فحص السمية في تحديد دواء معتمد من إدارة الغذاء والدواء الأمريكية يمكنه منع موت المستقبلات الضوئية. هذه نتيجة قابلة للتنفيذ بشكل مباشر بسبب النموذج ذي الصلة بالمرض الذي تم اختباره. يمكن تعديل هذه المنصة بسهولة لاختبار أي عدد من الضغوطات الأيضية والتدخلات الدوائية المحتملة لاكتشاف العلاج في المستقبل في أمراض الشبكية.

Introduction

قدمت نمذجة الأمراض البشرية في زراعة الخلايا والنماذج الحيوانية أدوات لا تقدر بثمن لاكتشاف وتعديل والتحقق من صحة العلاجات الدوائية ، مما يسمح لها بالتقدم من دواء مرشح إلى علاج معتمد. على الرغم من أن الجمع بين النماذج في المختبر وغير البشرية في الجسم الحي كان منذ فترة طويلة مكونا حاسما في خط أنابيب تطوير الأدوية ، إلا أنها تفشل في كثير من الأحيان في التنبؤ بالأداء السريري للأدوية المرشحة الجديدة1. هناك حاجة واضحة لتطوير التقنيات التي تسد الفجوة بين الزراعات الأحادية الخلوية البشرية المبسطة والتجارب السريرية. أدت التطورات التكنولوجية الحديثة في مزارع الأنسجة ثلاثية الأبعاد ذاتية التنظيم ، العضوية ، إلى تحسين دقتها للأنسجة التي تضعها في نمذجتها مما يجعلها أدوات واعدة في خط أنابيب تطوير الأدوية قبل السريرية2.

الميزة الرئيسية لزراعة الخلايا البشرية على النماذج غير البشرية في الجسم الحي هي القدرة على تكرار التعقيدات المحددة لعملية التمثيل الغذائي البشري والتي يمكن أن تختلف اختلافا كبيرا حتى بين الفقاريات ذات الترتيب الأعلى مثل البشر والفئران3. ومع ذلك ، يمكن أن تطغى على هذه الخصوصية فقدان في تعقيد الأنسجة. هذا هو الحال بالنسبة لأنسجة الشبكية حيث تتشابك أنواع متعددة من الخلايا بشكل معقد ولها تفاعل استقلابي تكافلي فريد بين الأنواع الفرعية الخلوية التي لا يمكن تكرارها في الزراعة الأحادية4. الكائنات العضوية البشرية ، التي توفر نسخة طبق الأصل من الأنسجة البشرية المعقدة مع إمكانية الوصول إلى زراعة الخلايا وقابليتها للتوسع ، لديها القدرة على التغلب على أوجه القصور في منصات نمذجة الأمراض هذه.

أثبتت عضويات الشبكية المشتقة من الخلايا الجذعية أنها مخلصة بشكل خاص في نمذجة الأنسجة المعقدة للشبكية العصبية البشرية5. وقد جعل هذا النموذج العضوي للشبكية تقنية واعدة لدراسة وعلاج أمراض الشبكية 6,7. حتى الآن ، ركزت الكثير من نمذجة المرض في عضويات الشبكية على أمراض الشبكية أحادية المنشأ حيث يتم اشتقاق عضويات الشبكية من خطوط iPSC مع المتغيرات الجينية المسببة للأمراض7. هذه بشكل عام طفرات عالية الاختراق تظهر كأنماط ظاهرية تنموية. تم القيام بعمل أقل بشكل فعال على أمراض الشيخوخة حيث تؤثر الطفرات الجينية والضغوطات البيئية على الأنسجة التي تطورت بشكل طبيعي. يمكن أن يكون للأمراض التنكسية العصبية للشيخوخة وراثة جينية معقدة ومساهمات من الضغوطات البيئية التي يصعب بنمذجتها بطبيعتها باستخدام مزارع الخلايا قصيرة الأجل. ومع ذلك ، في كثير من الحالات ، يمكن أن تتجمع هذه الأمراض المعقدة على الضغوطات الخلوية أو الأيضية الشائعة التي ، عند اختبارها على أنسجة بشرية متطورة بالكامل ، يمكن أن توفر رؤى قوية للأمراض التنكسية العصبية للشيخوخة8.

يعد المرض التنكسي البقعي المتأخر ، توسع الشعيرات البقعي من النوع الثاني (MacTel) ، مثالا رائعا على مرض تنكسي عصبي معقد وراثيا يتجمع على عيب استقلابي شائع. MacTel هو مرض تنكسي غير شائع في شبكية العين يؤدي إلى فقدان مستقبلات الضوء ومولر الدبقية في البقعة ، مما يؤدي إلى فقدان تدريجي في الرؤية المركزية9،10،11،12،13. في MacTel ، يؤدي الوراثة الجينية غير المحددة ، وربما متعددة العوامل ، إلى انخفاض شائع في سيرين الدورة الدموية في المرضى ، مما يؤدي إلى زيادة في أنواع الدهون السمية العصبية تسمى deoxysphingolipids (deoxySL) 14,15. لإثبات أن تراكم deoxySL سام لشبكية العين وللتحقق من صحة العلاجات الصيدلانية المحتملة ، قمنا بتطوير هذا البروتوكول لفحص سمية المستقبلات الضوئية في عضويات شبكية العين البشرية14.

نحدد هنا بروتوكولا محددا للتمييز بين عضويات الشبكية البشرية ، وإنشاء مقايسة السمية والإنقاذ باستخدام المواد العضوية ، وتحديد النتائج. نحن نقدم مثالا ناجحا حيث نحدد السمية الخاصة بالأنسجة لعامل مسبب للمرض المشتبه به ، deoxySL ، ونتحقق من صحة استخدام دواء عام آمن ، fenofibrate ، للعلاج المحتمل لسمية الشبكية التي يسببها deoxySL. أظهرت الأعمال السابقة أن فينوفايبرات يمكن أن يزيد من تدهور deoxySL وانخفاض deoxySL المنتشر في المرضى ، ومع ذلك ، لم يتم اختبار فعاليته في الحد من سمية الشبكية التي يسببها deoxySL16,17. على الرغم من أننا نقدم مثالا محددا ، يمكن استخدام هذا البروتوكول لتقييم تأثير أي عدد من الضغوطات الأيضية / البيئية والأدوية العلاجية المحتملة على أنسجة الشبكية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. إذابة وتمرير وتوسيع iPSCs / ESCs

ملاحظة: بالنسبة لجميع خطوات زراعة الخلايا ، استخدم أفضل الممارسات للحفاظ على مزرعة الخلايا المعقمة.

  1. قم بتغطية لوحة استزراع الخلايا المكونة من 6 آبار بوسط مصفوفة غشاء القاعدة.
    1. لتحضير 1x من هذا الوسط ، اتبع مواصفات المنتج أو قم بتخفيف وسط المصفوفة الباردة 75 ميكرولتر مع 9 مل من DMEM / F12. أضف 1.5 مل من الوسط الطازج 1x لكل بئر في طبق مكون من 6 آبار. احتضان في 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
    2. نضح من وسط مصفوفة الغشاء القاعدي وشطف كل بئر ب 3 مل من DMEM / F12. أضف 2 مل من DMEM / F12 واحتضانها على حرارة 37 درجة مئوية حتى الاستخدام. استخدم الطبق في اليوم الذي يتم تحضيره.
  2. قم بإعداد محلول مخزون 10 مللي متر من مثبطات الصخور (Y-27632 ثنائي هيدروكلوريد) في PBS ، واحفظه في -20 درجة مئوية حتى الاستخدام.
  3. قم بإذابة قارورة من iPSCs / ESCs في وسط DMEM / F12 وأجهزة الطرد المركزي عند 400 × جم لمدة 5 دقائق. نضح المادة الطافية وأعد تعليق الحبيبات في وسط mTeSR. صفيحة 1 قارورة من الخلايا على بئر 6 بئر مغلفة في وسط mTeSR مع 10 ميكرومتر من مثبطات الصخور (Y-27632 ثنائي هيدروكلوريد) واحتضانها طوال الليل في الحاضنة. في اليوم التالي ، استنشق الوسائط وأضف mTeSR فقط.
    ملاحظة: قم بتغيير الوسائط كل يوم حتى المرور.
  4. تحضير 0.5 mM EDTA في PBS عن طريق تخفيف 500 ميكرولتر من 0.5 M EDTA في 500 مل من PBS.
  5. تمر الخلايا عندما تصل إلى التقاء 80-90 ٪. تقسيم الخلايا 1: 3 أو 1: 6 لكل بئر ، اعتمادا على معدل نمو الخلايا.
    1. لإزالة الخلايا الملتصقة من اللوحة ، قم بنضح الوسائط واحتضانها باستخدام 0.5 mM EDTA في PBS لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. بعد الحضانة ، قم بإزالة محلول EDTA وارفع الخلايا عن طريق إخراج 1 مل من وسط mTeSR بقوة إلى الخلايا ذات ماصة p1000.
    2. استمر في امتصاص وإخراج mTeSR المتوسط والخلايا بقوة ، حتى 5x ، لإزالة الخلايا المتبقية الملتصقة. خلايا الصفيحة على صفيحة 6 آبار مغلفة بمصفوفة غشاء قاعدي جديدة ، مع وسيط mTeSR. استمر في استبدال الوسائط يوميا حتى تصل اللوحات مرة أخرى إلى التقاء 80-100٪.
  6. بمجرد أن تتوسع الخلايا إلى صفيحة كاملة من 6 آبار وتصل إلى التقاء 80-100٪ ، خصص بئرا واحدا لتوسيع خط الخلية للتمايز اللاحق أو للتجميد للحفظ بالتبريد. استخدم الآبار الخمسة المتبقية لبدء عملية التمايز عن طريق صنع أجسام جنينية.

2. صنع الأجسام الجنينية (EBs)

ملاحظة: يتم اشتقاق وصفات وسائط تكوين وتمايز EB من البروتوكولات في Cowan et al.5 و Ohlemacher et al.18 و Zhong et al.19.

  1. قم بإعداد محلول 1x Dispase ووسائط الحث العصبي (NIM) كما هو موضح أدناه.
    1. تحضير 10 ملغ / مل من محلول مخزون 5x من Dispase عن طريق إذابة المسحوق في DMEM / F12. مرشح معقم باستخدام مرشح 0.22 ميكرومتر. قم بتخزين 1 مل من القسمة عند -20 درجة مئوية حتى الاستخدام.
    2. باستخدام محلول 5x Dispase ، قم بإعداد 1 مل / بئر من 2 مجم / مل Dispase في DMEM / F12. يسخن المحلول على حرارة 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
    3. تحضير NIM عن طريق استكمال DMEM / F12 مع 1٪ N2 الملحق ، 1٪ MEM NEAA ، و 2 ملغ / مل الهيبارين في 180 وحدة / ملغ. يمكن تخزين NIM في 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى شهر واحد.
  2. قم بإعداد وتسخين 16 مل من مزيج 3: 1 من محلول mTeSR: NIM (12 مل: 4 مل) في درجة حرارة الغرفة.
  3. إزالة الخلايا المتمايزة وإضافة محلول Dispase الدافئ.
    1. قم بإزالة الخلايا المميزة من ثقافة الخلايا iPSCs / ESCs. تحت نطاق التشريح ، اكشط المستعمرات البيضاء غير الشفافة بطرف ماصة p10. نضح من وسط mTeSR من آبار الاستزراع. سيؤدي ذلك إلى إزالة الكتل المتمايزة التي تم كشطها للتو.
    2. أضف على الفور محلول Dispase الذي تم تسخينه مسبقا واحتضانه عند 37 درجة مئوية حتى تبدأ معظم حواف مستعمرات الخلايا في الالتفاف تحت المجهر. سيستغرق هذا 4-8 دقائق.
      ملاحظة: يجب تحديد وقت حضانة الخلايا في Dispase لكل مختبر. يمكن أن تختلف المدة بين خطوط الخلايا ويلزم حضانة أطول للخلايا التي تم طلاؤها لمدة 3 أيام أو أكثر. ستبدأ iPSCs / ESCs بطيئة النمو التي تستغرق أكثر من 3 أيام للوصول إلى نقطة الالتقاء في الالتصاق بقوة أكبر باللوحة ، مما يجعل من الصعب رفع الخلايا. بالنسبة للخلايا بطيئة النمو ، حاول تمرير الخلايا عند 1: 2 للتوسع في لوحة كاملة من 6 آبار لتقليل الوقت من الطلاء إلى التقاء.
  4. نضح المحلول وأضف برفق ما لا يقل عن 2 مل من وسط DMEM / F12 لكل بئر. أضف وسيط DMEM / F12 ببطء إلى جانب البئر مع الحرص على عدم إزاحة الخلايا.
    1. نضح وسط DMEM / F12 ثم أضف بقوة 1 مل جديدة من DMEM / F12 مباشرة إلى الخلايا لرفع مستعمرات الخلايا من اللوحة. مع ماصة p1000 تمتص بشكل متكرر وإخراج DMEM / F12 بقوة في البئر ، حتى 5x ، لإزاحة أكبر عدد ممكن من مستعمرات الخلايا.
      ملاحظة: تلتصق iPSCs/ESCs المتميزة/المتمايزة باللوحة أكثر من iPSCs/ESCs غير المتمايزة. من الأفضل ترك الخلايا التي لا تؤتي ثمارها مع السحب المتكرر وراءها. السحب الزائد يقتل الخلايا ويقلل من كفاءة إنتاج EB. ستحتوي كتل الخلايا على ما بين 100-400 خلية لكل كتلة.
  5. انقل المستعمرات العائمة إلى أنبوب مخروطي سعة 15 مل واشطف الآبار بوسط إضافي 1 مل DMEM / F12 لكل بئر لجمع أي مستعمرات عائمة متبقية.
  6. اسمح للمستعمرات العائمة بالاستقرار عن طريق الجاذبية لمدة لا تزيد عن 5 دقائق. بمجرد تسويتها ، قم بإزالة جميع المواد الطافية باستثناء 1-2 مل. احرص على عدم تحريك الحبيبات الناعمة في الأسفل.
  7. أعد تعليق الحبيبات في وسط 3: 1 mTeSR: NIM المسخن مسبقا وانقله إلى دورق T75 منخفض الارتباط. احتضان بين عشية وضحاها للسماح EBs لتشكيل. سيتم اعتبار هذا اليوم 0 من التمايز.
  8. قم بتغيير الوسائط تدريجيا إلى NIM لبدء تمايز EBs إلى أسلاف عصبية.
    1. في اليوم التالي ، قم بإزالة الوسائط واستبدالها ب 10 مل من 1: 1 mTeSR: NIM المتوسط. لإزالة الوسائط من ثقافة EB العائمة الحرة، قم بإمالة القارورة لأعلى بحيث تتجمع EBs في الزاوية السفلية من القارورة. نضح من المادة الطافية ، مع التأكد من عدم استنشاق أي من EBs في الحبيبات في الأسفل.
    2. في اليوم التالي ، استبدل الوسائط ب 10 مل من 1: 3 mTeSR: NIM المتوسط.
    3. في اليوم التالي ، استبدل الوسائط بوسيط NIM كامل. استمر في تغيير الوسائط كل 2 أيام باستخدام NIM medium حتى 7 أيام بعد علاج Dispase.

3. تصفيح EBs وبدء تمايز الشبكية العصبية

  1. بعد أسبوع واحد من معالجة Dispase ، يتم وضع EBs حرة الطفو على لوحة ذات 6 آبار مطلية بوسط مصفوفة غشاء قاعدي منخفض عامل النمو. لطلاء الطبق، راجع الخطوة 1.1.
    1. نضح الوسائط المستهلكة من EBs واستبدلها ب 12 مل من NIM.
    2. ضمان التوزيع المتساوي للEBs في كل بئر عن طريق تحريك الوسائط المحتوية على EB لإعادة تعليق EBs ، ثم إزالة 1/6 من الوسائط بسرعة (2 مل) وتوزيعها في بئر واحدة. كرر للآبار المتبقية.
    3. قبل الاحتضان ، هز الطبق برفق ، ذهابا وإيابا ثم جنبا إلى جنب ، لتوزيع EBs بالتساوي. إذا تكتلت EBs في المنتصف ، فلن تتمايز بشكل صحيح.
      ملاحظة: كثافة الطلاء أمر بالغ الأهمية للتمايز. تأكد من لوحة أكبر من 30 EBs لكل بئر. إذا لم يكن إنتاج EBs فعالا ، فقم بتوزيع EBs في عدد أقل من الآبار.
  2. قم بتغيير الوسائط يوميا باستخدام وسيط NIM. حافظ على مستوى الوسائط في الآبار عند ~ 3 مل. عند تغيير الوسائط ، قم بإزالة جميع الوسائط باستثناء 1 مل حتى لا تجفف EBs المطلية ، وأضف 2 مل من الوسائط برفق إلى جانب البئر حتى لا ترفع الخلايا عن اللوحة.
  3. بعد تسعة أيام من طلاء EBs ، ابدأ في تغيير الوسائط من NIM إلى وسائط تمايز الشبكية (RDM) على مدار يومين.
    1. قم بإعداد RDM عن طريق خلط ما يلي: 48٪ DMEM / F12 (1: 1) و 48٪ DMEM مكمل بمكمل 27 بنسبة 2٪ بدون فيتامين أ ، 1٪ MEM NEAA و 1٪ قلم ستربك. تعقيم المرشح باستخدام مرشح 0.20 ميكرومتر. يمكن تخزين RDM في 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى شهر واحد.
    2. في اليوم الأول، قم بتبديل الوسائط إلى مزيج 1:1 من NIM:RDM. في اليوم الثاني ، قم بتغيير الوسائط إلى RDM. كل الأيام اللاحقة ، تغذية الخلايا RDM.
      ملاحظة: خلال الأسابيع القليلة المقبلة ، ستشكل EBs المطلية أسلاف شبكية عصبية تبدأ في توليد RPE مصطبغ بشكل واضح.

4. صنع المواد العضوية العائمة الحرة والحفاظ على الثقافات العضوية العائمة الحرة

  1. EBs مطلية بالشظايا في 28 يوما بعد معالجة Dispase الأولية (21 يوما بعد طلاء EB) باستخدام مشرط معقم لقطع شبكة 1-2 مم2 إلى EBs مطلية. سيؤدي ذلك إلى فصل المستعمرات السلفية للشبكية إلى قطع صغيرة بحيث لا تصبح في وقت لاحق من التطور كبيرة جدا ونخرية من عدم كفاية تبادل المغذيات في مركزها.
  2. افصل EBs المطلية.
    1. للقيام بذلك ، أضف أولا 2 مل إضافية من RDM إلى كل بئر. ثم نضح ~ 1000 ميكرولتر من الوسائط من الآبار باستخدام ماصة p1000. الآن قم بإخراج الوسائط بقوة مباشرة على EBs المطلية مع غمر الطرف بالكامل.
    2. كرر هذا حتى يتم رفع جميع الخلايا من اللوحة. احتفظ بالطرف مغمورا أثناء طرد الوسائط ولا تدفع مكبس الماصة إلى ما بعد المحطة الأولى لتجنب الفقاعات.
  3. أعد تعليق قطع EB المنفصلة الوليدة في دورق Erlenmeyer بلاستيكي معقم سعة 125 مل واملأ القارورة ب ~ 40 مل من وسائط RDM. ضع القارورة على شاكر مداري يوضع في حاضنة قياسية. اضبط سرعة الخفق على 130-140 دورة في الدقيقة (إعداد السرعة 3).
    ملاحظة: إن زراعة المواد العضوية على شاكر يمنعها من الالتصاق ببعضها البعض أثناء الاستزراع بتركيز أعلى من المواد العضوية. تحقق المفاعلات الحيوية أيضا نفس الغايات ، لكن شاكر أقل تكلفة.
  4. قم بتغذية المواد العضوية بتغيير جزئي للوسائط ، لتحل محل ما يقرب من 12 مل من RDM 2-3 مرات في الأسبوع ، اعتمادا على مدى اصفراد الوسائط. لن تتطلب المواد العضوية المبكرة الكثير من التغذية ولكن مع نموها ، ستتطلب تغييرات أكثر تكرارا في الوسائط مع المزيد من الوسائط.
  5. تقليم المواد العضوية كل أسبوعين لإزالة المواد العضوية غير الشبكية والمتضخمة والمحتضرة. هذا يمنع إهدار الوسائط ويحسن صحة عضويات الشبكية المتبقية.
    1. انقل الخلايا من قارورة إلى طبق 6 آبار أو طبق 10 سم باستخدام ماصة 5 مل. احتفظ بالمواد العضوية التي تعرض ظهارة عصبية طبقية (الشكل 1 أ ، علامة النجمة). هذه المواد العضوية شفافة وبيضاء.
    2. فرز وإزالة عضويات الشبكية سيئة التكوين أو المتضخمة ، والعضوية غير الشبكية مع ماصة 5 مل. ستكون هذه بشكل عام معتمة ومصفرة (الشكل 1 أ). قم أيضا بإزالة أي شيء لا يشبه ظهارة عصبية طبقية. ستكون عمليات التقليم القليلة الأولى كثيفة العمالة ولكنها ستصبح أسهل بكثير في كل مرة لاحقة حيث تصبح المواد العضوية أكبر وأكثر تجانسا (الشكل 1 ب).

5. الحفاظ على الكائنات العضوية الناضجة وتمييزها إلى أنسجة شبكية ما بعد الانقسام

  1. في اليوم 56 (الأسبوع 8) بعد المعالجة الأولية ل Dispase لتشكيل EB (28 يوما بعد زراعة EBs المخلوعة في قارورة) قم بتغيير الوسائط العضوية إلى RDM +. سيوفر هذا مغذيات إضافية للعضويات الناضجة تماما كأنسجة شبكية.
    1. إعداد 100 مللي متر توراين في برنامج تلفزيوني. قم بتخزين القسامات في -20 درجة مئوية حتى الاستخدام.
    2. قم بإعداد RDM + عن طريق استكمال RDM ب 10٪ FBS و 100 ميكرومتر توراين و 2 مللي متر مكمل جلوتامين تجاري. تعقيم المرشح باستخدام مرشح 0.20 ميكرومتر.
    3. استمر في تغيير وسائط RDM + 2-3 مرات في الأسبوع.
  2. في الأسبوع 17-18 (بعد العلاج ب Dispase) ، قم بنقل المواد العضوية من قارورة Erlenmeyer إلى لوحة ذات 6 آبار منخفضة للغاية باستخدام ماصة سعة 5 مل. في الأسبوع الأول ، استمر في تقليم الكائنات العضوية وفصلها عن بعضها البعض يوميا حتى لا تلتصق الكائنات العضوية ببعضها البعض. الكثافة المثلى هي 10-15 عضوي لكل بئر. تغيير الوسائط 2-3 مرات في الأسبوع.
    ملاحظة: قلل عدد المواد العضوية لكل بئر إذا كانت المواد العضوية تلتصق ببعضها البعض بشكل متكرر أو إذا كانت الوسائط تتحول إلى اللون الأصفر جدا بين تغييرات الوسائط.
  3. توقع أن تصبح الكائنات العضوية كاملة بعد الانقسام بحلول الأسبوع 185 عندما تكون خلايا الشبكية العصبية موجودة في جميع الأنحاء. بحلول الأسبوع 24 ، تحقق من تكوين شرائح خارجية بدائية على السطح الخارجي للعضوي. بحلول الأسبوع 26-28 ، تأكد من أن الأجزاء الخارجية سميكة على السطح الخارجي للعضويات (الشكل 1C). قم بإجراء فحوصات السمية بعد الأسبوع 26 عندما حددت الكائنات العضوية الأجزاء الخارجية التي تدل على حالة تمايز ناضجة.
    ملاحظة: استخدم فقط عضويات الشبكية المتمايزة جيدا لمقايسة السمية. سيسمح إجراء مقايسة السمية على المواد العضوية ذات الأجزاء الخارجية المحددة جيدا بتحديدها.

6. ديوكسي سفينجانين (deoxySA) والعلاج من تعاطي المخدرات

ملاحظة: يظهر هنا علاج واحد من فينوفايبرات لإنقاذ سمية deoxySA على مدى 4 أيام (الشكل 2). ومع ذلك ، يمكن تعديل تركيز deoxySA المضاف إلى المواد العضوية ، ومدة علاج deoxySA على المواد العضوية ونوع الدواء المستخدم لإنقاذ السمية14 وفقا للاحتياجات التجريبية لفحص السمية وإنقاذ السمية.

  1. تحضير محلول مخزون 1 mM من deoxySA في الإيثانول. يحفظ في درجة حرارة -20 درجة مئوية لمدة 1 شهر. بدلا من ذلك ، يمكن تحضير محلول مخزون deoxySA في DMSO.
  2. إجراء تخفيف تسلسلي من deoxySA لتحديد تركيز سام مناسب من deoxySA لإنقاذ المخدرات.
    ملاحظة: حدد أولا تركيز deoxySA الذي سيؤدي إلى موت الخلايا الكافي لقياس تأثير الإنقاذ. إذا كان التركيز مرتفعا جدا ، فإن الاستجابة السامة ستؤدي إلى تفكك العضو ولن يتم ملاحظة أي إنقاذ. إذا كانت الاستجابة السامة منخفضة للغاية ، فسيكون من الصعب ملاحظة تأثير إنقاذ كبير. يمكن أن تختلف الاستجابة السامة ل deoxySA من مختبر إلى مختبر ومن دفعة إلى أخرى من deoxySA.
    1. قم بتخفيف محلول مخزون deoxySA 1 mM إلى تركيزات 0.5 μM و 1 μM و 2 μM في 3 مل من RDM + ، لكل منها. أضف 3 ميكرولتر من الإيثانول إلى RDM + لإعداد علاج التحكم.
    2. تحت مجهر التشريح ، استخدم مسبارا معقما لتحديد 4 مجموعات من المواد العضوية بحد أدنى 5 عضويات لكل مجموعة. قسم المجموعات إلى آبار منفصلة من لوحة ذات 6 آبار منخفضة للغاية. حدد المواد العضوية التي لها نفس الحجم والشكل تقريبا.
    3. نضح أكبر قدر ممكن من RDM + من المواد العضوية. لكل بئر من المواد العضوية ، أضف تركيزا واحدا من deoxySA في RDM +. أضف التحكم في السيارة إلى البئر الرابع من المواد العضوية.
    4. بعد يومين من الاستزراع في deoxySA أو السيارة ، استبدل الوسائط بتخفيفات deoxySA المقابلة المحضرة حديثا في RDM +.
    5. في اليوم الرابع من العلاج ، انتقل إلى الخطوة 7 لمعالجة وفحص المواد العضوية لموت الخلايا. بمجرد اختيار تركيز deoxySA ، استمر في الخطوة 6.3 للعلاج باستخدام فينوفايبرات.
      ملاحظة: موت الخلايا المستهدف في مجموعة علاج deoxySA المختارة هو 5-20 خلية إيجابية TUNEL لكل 10000 ميكرومتر2. يجب ألا تتفكك المواد العضوية بلمسة مسبار على مدار العلاج.
  3. علاج المواد العضوية مع الجرعة السامة المختارة من deoxySA و fenofibrate.
    1. قم بإعداد محلول مخزون 40 مللي متر من فينوفايبرات في DMSO. يحفظ في درجة حرارة -20 درجة مئوية لمدة تصل إلى 1 سنة.
    2. تحضير وسائط العلاج بالعقاقير: في 3 مل RDM + ، قم بتخفيف محلول مخزون deoxySA 1 mM إلى 1 μM deoxySA وتخفيف محلول مخزون fenofibrate 40 mM إلى 20 μM.
    3. تحضير وسائط معالجة deoxySA: في 3 مل RDM + ، قم بتخفيف محلول مخزون deoxySA 1 mM إلى 1 μM deoxySA وأضف 1.5 ميكرولتر من DMSO.
    4. تحضير وسائط التحكم: في 3 مل RDM + ، أضف 3 ميكرولتر إيثانول و 1.5 ميكرولتر من DMSO.
    5. تحت مجهر التشريح باستخدام مسبار معقم ، حدد ثلاث مجموعات من المواد العضوية بحد أدنى خمسة عضويات لكل مجموعة. قسم المجموعات إلى آبار منفصلة من لوحة ذات 6 آبار منخفضة للغاية.
    6. أضف العلاجات المعدة (deoxySA ، deoxySA + fenofibrate ، أو التحكم) إلى المواد العضوية. بعد يومين ، قم بتغيير الوسائط في الآبار باستخدام RDM + المعد حديثا مع حلول deoxySA / fenofibrate / Control المقابلة.
    7. في اليوم الرابع من العلاج ، انتقل إلى الخطوة 7 لمعالجة وفحص المواد العضوية لموت الخلايا (الشكل 2).

7. التضمين والتقسيم بالتبريد للمواد العضوية

  1. تحضير 4٪ PFA طازجة بإضافة 1 مل من أمبولة PFA 16٪ إلى 3 مل من PBS.
  2. قم بإزالة وسائط RDM + من المواد العضوية واشطفها مرة واحدة باستخدام برنامج تلفزيوني. إزالة أكبر قدر ممكن من PBS من المواد العضوية. أضف 2 مل من 4٪ PFA المحضر حديثا (في PBS) إلى المواد العضوية واحتضانها لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
  3. بعد 15 دقيقة من الحضانة ، اشطف المواد العضوية مرتين باستخدام 2 مل من برنامج تلفزيوني ، ثم اغسلها في برنامج تلفزيوني لمدة 10 دقائق.
    ملاحظة: قم بإجراء التثبيت في غطاء دخان كيميائي وتخلص من محلول PFA وشطفان لاحقان ل PBS في حاوية نفايات PFA تحمل علامات مناسبة مخزنة في غطاء الدخان.
  4. نضح كل برنامج تلفزيوني ، ثم أضف 20٪ سكروز في برنامج تلفزيوني إلى المواد العضوية الثابتة. تأكد من خلط المواد العضوية في محلول السكروز وعدم البقاء في فقاعة PBS في الأعلى. احتفظ بالمواد العضوية في محلول السكروز حتى تغرق في قاع محلول السكروز ، أي ~ 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة. يمكن تخزين المواد العضوية الثابتة في محلول السكروز طوال الليل عند 4 درجات مئوية.
  5. قم بتضمين المواد العضوية في محلول OCT في قالب التبريد. يمكن تضمين العديد من المواد العضوية لكل حالة في قالب واحد. قم بتوجيه الكائنات العضوية للتأكد من أن أفضل مناطق الشبكية سيتم تقاطعها على cryostat ، ويكون منتصف الكائنات العضوية كلها تقريبا في نفس المستوى. قم بتجميد المواد العضوية المضمنة عند -20 درجة مئوية. يمكن تخزين المواد العضوية المضمنة عند -80 درجة مئوية لسنوات.
    ملاحظة: من الصعب رؤية المواد العضوية في OCT المجمدة. قم بتوجيه مجموعات RPE نحو جانب القالب الذي سيواجه الشفرة لتسهيل التعرف على المواد العضوية.
  6. تعمل عضويات الاستئصال بالتبريد إلى أقسام بسمك 10-14 ميكرومتر وتلتصق بأقسام معالجة بولي-L ليسين. أثناء التقسيم بالتبريد ، تحقق بشكل متكرر من الشرائح تحت المجهر لتحديد الأقسام التي تحتوي على منتصف المواد العضوية. اجمع فقط الشرائح الوسطى من المواد العضوية حيث يتم تمثيل جميع الطبقات بالتساوي (الشكل 2A-C ، الشكل 3). بمجرد تقسيمها ، يمكن تخزين الشرائح في صندوق شرائح عند -80 درجة مئوية لسنوات.
    ملاحظة: الشرائح المأخوذة على طرفي العضو سوف تفرط في أخذ عينات من المستقبلات الضوئية الخارجية وليست مناسبة للقياس الكمي. ستوفر الكائنات العضوية متوسطة الحجم 10-15 شريحة من منتصف العضو الذي يمثل مقطعا عرضيا لطبقات الشبكية الطبقية.

8. تلطيخ TUNEL للخلايا المبرمج

  1. قم بإذابة الشرائح المجمدة لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية. وضع الشرائح على الفور عند 37 درجة مئوية يمنع التكثيف. عينات الأنسجة المنقوعة في الماء النقي يمكن أن تشوه الأنسجة. تعمل الحضانة 37 درجة مئوية أيضا على تحسين التصاق الأنسجة بالشريحة الزجاجية.
  2. قم بإنشاء حد مستمر على الشريحة الزجاجية حول أقسام الأنسجة باستخدام قلم كاره للماء. سيوفر هذا حدودا ويضمن التثبيت الكافي وحضانة الأجسام المضادة مع حجم صغير من الحلول. أضف ما يقرب من 100-200 ميكرولتر (سيملأ الحجم المنطقة ذات الحدود الكارهة للماء دون انسكاب) من 4٪ PFA المحضرة حديثا لمدة 20 دقيقة. قم بإجراء التثبيت في غطاء دخان كيميائي وتخلص من محلول PFA في حاوية نفايات PFA ذات العلامات المناسبة المخزنة في غطاء الدخان.
  3. شطف الشرائح مرة واحدة في برنامج تلفزيوني ثم اغسلها في برنامج تلفزيوني لمدة 25 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
  4. تحضير خليط TUNEL. قم بإذابة كل من القوارير البنفسجية والزرقاء من مجموعة الكشف عن موت الخلايا في الموقع. قم بإزالة 100 ميكرولتر من محلول القارورة البنفسجية (يمكن استخدامها للتحكم السلبي) والجمع بين 450 ميكرولتر المتبقية من المحلول من القارورة البنفسجية مع 50 ميكرولتر من المحلول من القارورة الزرقاء. تخلط جيدا وتبقى في الظلام. كل مجموعة من القوارير (إجمالي 500 ميكرولتر) يمكن أن تلطخ 5-10 شرائح.
  5. تتخلل شرائح الأنسجة.
    1. تحضير محلول النفاذية: PBS مع 0.1٪ TritonX-100 و 0.1٪ سترات الصوديوم
    2. قم بإزالة PBS من شرائح العينة ثم أضف حل النفاذية إلى العينات. احتضان لمدة 2 دقيقة على كتلة الثلج أو على حرارة 4 درجة مئوية. بعد ذلك ، اشطفه مرة واحدة في برنامج تلفزيوني ثم اغسله في برنامج تلفزيوني لمدة 10 دقائق.
  6. قم بإزالة برنامج تلفزيوني وجفف أكبر قدر ممكن من المحلول باستخدام زاوية منديل مطوي. أضف 50-100 ميكرولتر من خليط TUNEL المحضر إلى العينات ، اعتمادا على حجم المنطقة التي يرسمها القلم الكارهة للماء. يغطى بغطاء زجاجي ويحتضن عند 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة في الظلام.
    ملاحظة: يجب إجراء جميع عمليات الحضانة والغسيل للخطوات التالية في الظلام لمنع تبييض الفلوروفور. استخدم إما صندوقا داكنا أو قم بتغطية الشرائح بورق الألمنيوم لحجب الضوء.
  7. قم بتسمية المستقبلات الضوئية. شطف مرة واحدة مع برنامج تلفزيوني ثم يغسل لمدة 20 دقيقة في برنامج تلفزيوني. قم بإزالة برنامج تلفزيوني ثم أضف الجسم المضاد الأولي Recoverin (أرنب مضاد Recoverin) مخفف 1: 500 في برنامج تلفزيوني مع 0.1٪ توين و 5٪ مصل الحمار. احتضان في 4 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
  8. بعد إزالة الجسم المضاد الأساسي ، اشطفه مرة واحدة في برنامج تلفزيوني ثم اغسله في برنامج تلفزيوني لمدة 20 دقيقة. أضف جسما مضادا ثانويا ، حمار مضاد للأرانب مع فلوروفور برتقالي أو أحمر ، مخفف 1: 1000 في برنامج تلفزيوني مع 0.1٪ توين و 5٪ مصل حمار واحتضانه في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعتين. شطف مرة واحدة مع برنامج تلفزيوني ثم يغسل لمدة 20 دقيقة في برنامج تلفزيوني. أضف DAPI في 1: 1000 في PBS ، واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق.
  9. شطف مرة واحدة مع برنامج تلفزيوني ثم يغسل لمدة 20 دقيقة في برنامج تلفزيوني. قم بإزالة PBS وإضافة وسيط التركيب. أضيفي غطاء الغطاء ، وأغلقيه بطلاء الأظافر ، واتركيه حتى يجف في الظلام. يمكن تخزين الشرائح في 4 °C في حاوية مظلمة لمدة تصل إلى 1 أسبوع.
    ملاحظة: للحصول على أفضل جودة للصورة، التقط الصور في اليوم التالي.

9. تصوير الشرائح العضوية وتحديد كمية الموت.

ملاحظة: يتطلب التصوير مجهرا متحد البؤر مع قدرات للتمييز بين ثلاث قنوات فلوروفور. تستخدم هذه التجربة القنوات الخضراء (Alexa Fluor 488) والبرتقالي (Alexa Fluor 555) والأشعة فوق البنفسجية (DAPI). يمكن استخدام أي مزيج من الفلوروفورات لضمان عدم نزيف الانبعاثات في القنوات الأخرى.

  1. تحديد موقع أقسام الشبكية للتصوير والقياس الكمي. تحت تكبير منخفض للمجهر (5x أو 10x) ، استخدم تلطيخ Recoverin ، الذي يسمي السيتوبلازم للمستقبلات الضوئية ، وتلطيخ DAPI ، الذي يسمي نوى جميع الخلايا ، لتحديد منطقة من العضو المقطوع سليمة وجيدة التكوين وفي مستوى يأخذ عينات من مقطع عرضي تمثيلي للعضو (الشكل 2 والشكل 3 ). ابحث عن مقطع يحتوي على طبقة نووية خارجية مميزة من المستقبلات الضوئية التي لا يقل سمكها عن بضع خلايا ، وطبقة منفصلة ومميزة من النوى التي لا تحتوي على تلطيخ Recoverin (الشكل 2 والشكل 3).
  2. ضع إطارا للصورة. قم بزيادة تكبير المجهر إلى هدف 20x وقم بتأطير الشريحة لملء الصورة بأكبر قدر ممكن من طبقة مستقبلات الضوء (الشكل 3).
  3. اضبط الطائرة Z. في حالة استخدام مجهر يقوم بتصوير مكدسات Z ، قم بتعيين الحدين العلوي والسفلي للنطاق Z لتصوير عمق الشريحة بالكامل. استخدم نفس سمك مكدس Z لجميع الصور في مجموعة تجريبية بحيث يتم فحص نفس الكمية من الأنسجة في جميع العينات. إذا لم تكن تستخدم مجهرا يقوم بتصوير مكدسات Z ، فقم بتركيز الصورة في منتصف الشريحة.
  4. قم بتصوير جميع القنوات الثلاث للفلوروفورات في عملية استحواذ على Z-stack. جميع القنوات الثلاث مطلوبة لتحديد الخلية المحتضرة بشكل إيجابي. صورة منطقة واحدة لكل عضوي.
  5. احفظ مجموعة الصور بتنسيق ملف يحافظ على نسبة المساحة لكل بكسل.

10. قياس الخلايا الميتة

  1. افتح مكدسات الصور في برنامج FIJI (Image J). في نافذة خيارات استيراد التنسيقات الحيوية ، تأكد من عدم تحديد أي مربعات ضمن قسم "التقسيم إلى نوافذ منفصلة". يعد التمرير بين قنوات الصورة المحاذية أمرا بالغ الأهمية لتعريف الخلايا بشكل مناسب.
  2. قم بتسطيح مجموعة صور Z-stack بالنقر فوق Image > Stacks ثم حدد "Z project" من القائمة المنسدلة. سيؤدي ذلك إلى إنشاء صورة جديدة للقياس الكمي. إذا لم يتم تصوير الكائنات العضوية في السلسلة Z ، فتخط هذه الخطوة.
  3. حدد قناة الصورة التي تعرض تلطيخ Recoverin (أحمر، في هذا المثال). انقر فوق أداة تحديد المضلع في شريط الأدوات وحدد منطقة متصلة من المستقبلات الضوئية في الصورة (الشكل 3 أ). انقر فوق تحليل > تعيين القياسات. في النافذة المنبثقة تعيين القياسات ، حدد المربع بجوار المنطقة ، وانقر فوق تحليل وحدد قياس لقياس المنطقة (أو اضغط على "m" كاختصار) للمستقبلات الضوئية لحساب الخلايا المحتضرة. سيظهر قياس المنطقة في نافذة قياسات منبثقة.
  4. عد نوى TUNEL الموجبة في منطقة المستقبلات الضوئية المحددة مسبقا (الشكل 3B ، C). انقر بزر الماوس الأيمن على أداة النقطة في شريط الأدوات وحدد أداة متعددة النقاط. في قناة TUNEL فقط ، انقر فوق تلطيخ TUNEL الإيجابي الذي يتداخل مع نوى DAPI الموجبة وتلطيخ Recoverin. التبديل بين القنوات للتحقق من صحة الخلايا الإيجابية.
  5. قسم عدد الخلايا الموجبة TUNEL على المنطقة للحصول على قيمة طبيعية لموت الخلية في المستقبلات الضوئية لكل عضو (الشكل 2D ، E).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

تم إنشاء عضويات الشبكية من خط iPSC غير تحكم MacTel. بعد أن وصلت المواد العضوية إلى 26 أسبوعا في الثقافة ، تم اختيارها وتقسيمها إلى مجموعات تجريبية. تمت معالجة المواد العضوية بتركيزات متفاوتة من deoxySA لتحديد ما إذا كان deoxySA ساما للمستقبلات الضوئية. تم اختبار أربعة تركيزات من deoxySA ، من 0 إلى 1 ميكرومتر (الشكل 2) وعولجت الكائنات العضوية لمدة 8 أيام ، مع تغييرات في الوسائط كل يوم. يعتمد موت الخلايا استجابة ل deoxySA على التركيز ويمكن اكتشافه في أقل من 50 نانومتر deoxySA (الشكل 2D). أعطى أعلى تركيز تم اختباره ، 1 ميكرومتر deoxySA ، تأثيرا قويا مع الحفاظ على سلامة العضو العضوي في شبكية العين (الشكل 2B ، D). تسبب تركيز أعلى من 5 ميكرومتر deoxySA في تفكك المواد العضوية في غضون أيام قليلة (البيانات غير معروضة). حددت نتائج استجابة جرعة deoxySA التركيز الأمثل ل deoxySA لتجارب السمية المستقبلية. أدت جرعة 1 ميكرومتر deoxySA إلى موت كبير للخلايا دون تشبع السمية ، كما لوحظ عند 5 ميكرومتر.

لاختبار قدرة فينوفايبرات على إنقاذ موت الخلايا الناجم عن deoxySA ، عولجت عضويات الشبكية إما ب 1 ميكرومتر deoxySA ، 1 ميكرومتر deoxySA بالإضافة إلى 20 ميكرومتر فينوفايبرات ، أو التحكم في مركبة العلاج (الشكل 2A-C ، E). منع علاج فينوفايبرات 20 ميكرومتر السمية التي يسببها deoxySA في المستقبلات الضوئية لعضويات الشبكية ، مما قلل بشكل كبير من موت الخلايا بنسبة 80٪ تقريبا بعد 4 أيام من العلاج (الشكل 2A-C ، E) 16. تم اختبار أدوية إضافية لتغيير الدهون باستخدام نفس البروتوكول ، بما في ذلك fumonosin-B1 ، والتي أظهرت إنقاذا كاملا لسمية deoxySA. كما تم اختبار أنواع الدهون ذات الصلة لتحديد مستقلب السفينغوليبيد المحدد في اتجاه مجرى النهر الذي يؤدي إلى موت الخلايا المستقبلة للضوء14.

Figure 1
الشكل 1: صور المجال الساطع التمثيلية للعضويات تحت مجهر ضوئي مقلوب. (أ) تظهر الكائنات العضوية البالغة من العمر 4 أسابيع في 2 أيام بعد الانفصال طبقات شبكية مناسبة (بيضاء *) أو تطور عضوي غير شبكي. ب: تطوير العضويات في الأسبوع 13. (ج) عضويات الشبكية في الأسبوع 28 مع طبقات شبكية واضحة وأجزاء خارجية جيدة التكوين تبرز من طبقة مستقبلات الضوء الخارجية (شريط أبيض). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: صور تمثيلية متحدة البؤر لموت الخلايا. صور تمثيلية متحدة البؤر لموت الخلايا (TUNEL ، أخضر) داخل طبقة المستقبلات الضوئية (Recoverin ، أحمر) من العضو العضوي في شبكية العين بعد 4 أيام من العلاج إما باستخدام وسائط التحكم (A) أو 1 μM deoxySA (B) أو 1 μM deoxySA مع 20 ميكرومتر فينوفايبرات (C). (د) القياس الكمي لموت الخلايا في المستقبلات الضوئية البشرية بعد معالجة الأنسجة العضوية الشبكية بتركيزات متفاوتة من الديوكسي SA. (ه) القياس الكمي لموت الخلايا في المستقبلات الضوئية البشرية بعد معالجة الأنسجة العضوية الشبكية بوسائط التحكم (ن = 6) ، 1 ميكرومتر ديوكسي إس إيه (ن = 22) ، 1 ميكرومتر ديوكسي إس إيه + 20 ميكرومتر فينوفايبرات (ن = 21). * p < 0.05 ، *** p < 0.001 مع اتجاه واحد ANOVA واختبار Tukey اللاحق. البيانات مستمدة من مجلة نيو إنجلاند الطبية ، جانتنر ، إم ، إيدي ، ك. ، ووالاس. م.، وآخرون. استقلاب سيرين والدهون في أمراض البقعة الصفراء والاعتلال العصبي المحيطي ، 381 (15) ، 1422-1433 ، حقوق الطبع والنشر © (2019) جمعية ماساتشوستس الطبية. أعيد طبعها بإذن. (14) يرجى النقر هنا للاطلاع على نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: لقطات شاشة تظهر صورة متحدة البؤر لعضو مقسم وملون معالج ب 1 ميكرومتر deoxySA تم عرضه باستخدام برنامج FIJI. تم تقسيم قنوات الفلورسنت إلى α-Recoverin (A ، أحمر) ، TUNEL (B ، أخضر) ، و DAPI (C ، أزرق). (أ) تم تحديد منطقة المستقبل الضوئي باستخدام أداة المضلع المحددة في شريط الأدوات (أعلى اليسار). (ب، ج) عدد الخلايا باستخدام الأداة متعددة النقاط ، المحددة في شريط الأدوات ، لخلايا TUNEL الموجبة (B ، الخضراء) و DAPI الإيجابية (C ، الزرقاء) داخل طبقة المستقبلات الضوئية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

اختلافات بروتوكول التمايز
منذ اختراع الأكواب البصرية ذاتية التكوين من قبل مجموعة YoshikiSasai 20 ، طورت العديد من المختبرات بروتوكولات لتوليد عضويات شبكية يمكن أن تختلف في كل خطوة تقريبا5،18،19،21. يمكن العثور على قائمة شاملة من البروتوكولات في Capowski et al.22. بروتوكول التمايز الذي نقدمه هنا هو بروتوكول بسيط منخفض التدخل يوفر نقطة انطلاق جيدة لأي مختبر يحاول التمييز بين عضويات الشبكية الناضجة. يتم تشجيع المستخدمين على استكشاف واعتماد الاختلافات في هذا البروتوكول. الخطوات الشائعة لاختلاف البروتوكول هي الإنتاج والتمايز المبكر ل EBs ، واستخدام عوامل التمايز مثل BMP4 أو DKK-1 أو حمض الريتينويك لتحسين الكفاءة5،19،23.

كان استزراع المواد العضوية على شاكر لكثير من مراحل التطوير المتأخرة خطوة فعالة لزيادة كفاءة التمايز وتقليل الوقت المستغرق في التعامل مع المواد العضوية. تحقق المفاعلات الحيوية نفس الغايات24 ، ومع ذلك ، فإن استخدام شاكر مع قوارير Erlenmyer التي تستخدم لمرة واحدة هو أكثر فعالية من حيث التكلفة ويمكن القيام به باستخدام معدات المختبر الشائعة. الميزة الرئيسية للحفاظ على المواد العضوية في تعليق معبأ هي أنه يزيل الحاجة إلى فصل المواد العضوية التي تلتصق ببعضها البعض على اللوحة أثناء نموها. تسهل الثقافات المعلقة أيضا تبادلا أكبر للمغذيات ، لذلك تميل الكائنات العضوية إلى النمو بشكل أكبر من تلك الموجودة على الصفيحة الثابتة القياسية. لهذا السبب ، من الجيد البدء بتجزئة EBs المطلية بأصغر حجم ممكن في الخطوة 4.1.

نظرا لأن الحصول على عضويات شبكية ناضجة يتطلب التمييز بين ثقافة واحدة لمدة 6 أشهر تقريبا ، فإن إجراء فحوصات السمية على عضويات الشبكية قد يبدو مستهلكا للوقت مقارنة باستخدام زراعة أحادية 2-D. ومع ذلك ، يتم إجراء فحوصات السمية على خط تحكم واحد ، ويمكن إعداد التمايز بشكل روتيني. بعد استثمار أولي لمدة 6 أشهر ، سيكون الإمداد المنتظم من المواد العضوية لإجراء تجارب إضافية وتعديلات البروتوكول في متناول اليد دون تأخير. إن بدء 2-3 جولات من التمايز العضوي في شبكية العين كل 1-2 أشهر يوفر أنسجة وافرة لمجموعات معقدة وشاملة من التجارب.

توفر المواد العضوية نموذجا متعدد الاستخدامات لاختبار الأدوية المستهدفة.
يصف هذا البروتوكول مقايسة سمية مستقبلات الضوء لاختبار فعالية الأدوية المعدلة للدهون لإنقاذ موت الخلايا الناجم عن deoxySL. على الرغم من أن هذا تطبيق محدد يظهر إنقاذا دوائيا لعامل مسبب للأمراض في MacTel ، إلا أنه يمكن استخدام هذا البروتوكول لاختبار أي عدد من الإهانات (على سبيل المثال ، نقص المغذيات ، وظروف نقص الأكسجين ، والسمية الخفيفة) وعمليات الإنقاذ الدوائية. لذلك ، يمكن تكييفه لنمذجة أمراض الشبكية الأخرى. لقد أظهرنا في عملنا الخاص أنه باستخدام هذا البروتوكول نفسه واستبدال أنواع وعقاقير السفينغوليبيد المختلفة ذات الصلة التي تمنع بشكل مباشر استقلاب السفينغوليبيد ، تمكنا أيضا من تقديم رؤى لآلية مرض MacTel من خلال تحديد مستقلب السفينغوليبيد السام المحدد الذي يؤدي إلى موت الخلايا المستقبلة للضوء14 . على عكس نمذجة الأمراض على مستوى الطفرات الجينية ، والتي تتطلب إنشاء خطوط iPSC متغيرة ، فإن استخدام المواد العضوية لنمذجة الظروف الأيضية السامة والضغوطات البيئية يسمح باستخدام خط iPSC للتحكم المشترك كنموذج ديناميكي مع مصدر أنسجة وفير ومتاح بسهولة.

تعتبر النماذج العضوية البشرية مفيدة بشكل خاص عند دراسة الأمراض الأيضية في شبكية العين ، حيث تتمتع أنواع الخلايا المختلفة بتفاعل استقلابي تكافلي فريد لا يمكن تكراره في زراعة أحادية للخلايا الشبيهة بالمستقبلات الضوئية4. سمح لنا هذا النموذج الأيضي المعقد باكتشاف فعالية عقار فينوفايبرات في منع التأثيرات السامة ل deoxySLs مباشرة في البشر. في نماذج الفئران من deoxySLs مرتفعة14 (بيانات غير منشورة) ونماذج زراعة الخلايا الليفية الجنينية للفأر من استقلاب deoxySL fenofibrate أثبتت أنها غير فعالة16. سيسمح لنا اختبار الأدوية في سياق نماذج الأنسجة البشرية المعقدة بتحديد العلاجات الفعالة واستبعاد العلاجات غير الفعالة التي كان من الممكن تفويتها لو اعتمدنا فقط على الفئران أو الزراعات الأحادية المبسطة.

التطوير المستقبلي لفحص المخدرات
في هذا البروتوكول ، نقوم بتحديد موت الخلايا المبرمج في المستقبلات الضوئية ، وهو أكثر أنواع الخلايا وفرة. ومع ذلك ، من خلال استخدام أي من الأجسام المضادة المثبتة التي تصنف على وجه التحديد أنواع خلايا الشبكية الأخرى ، فإن هذا البروتوكول قابل للتعديل لفحص موت الخلايا في أي نوع من خلايا الشبكية ، أو نوع فرعي للخلية (على سبيل المثال ، مخروط مقابل قضيب). عيب القياس الكمي لموت الخلايا المبرمج باستخدام تلطيخ TUNEL في شرائح الأنسجة هو أنها تقنية منخفضة الإنتاجية لقياس موت الخلايا ، مما يحد من تطبيق هذا الفحص لفحص قوائم صغيرة من الأدوية المرشحة. لن يكون من الممكن وجود شاشة أكبر لمكتبات الأدوية غير المستهدفة باستخدام نهج IHC. ستتطلب التطورات المستقبلية في هذا البروتوكول لتسهيل عمليات فحص المخدرات الأكبر حجما دمج علامة موت الخلايا القابلة للقياس الكمي بسهولة أكبر. في حين أن هذه متوفرة ، فإن عدم انتظام الكائنات العضوية في شبكية العين في الحجم ، ووجود أو عدم وجود زوائد الأنسجة غير الشبكية ، والتباين في جودة طبقة مستقبلات الضوء يجعل من الصعب تطبيع النتائج عبر المواد العضوية. نتوقع أن التطورات المستقبلية لزيادة إنتاجية نماذج الأمراض العضوية البشرية لفحص مكتبات الأدوية الكبيرة ستحسن بشكل كبير قدرتنا على اكتشاف وتعديل والتحقق من صحة الأدوية التي ستتقدم من التجارب قبل السريرية إلى العلاجات المعتمدة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

المؤلفون ليس لديهم تضارب في المصالح.

Acknowledgments

بدعم من معهد لوي للبحوث الطبية. نود أن نشكر عائلة لوي على دعمهم لمشروع MacTel. نود أن نشكر ماري جانتنر ومايك دوريل وليا شيبك على مساهمتهم الفكرية ومساعدتهم في إعداد المخطوطة.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.5M EDTA Invitrogen 15575020
125mL Erlenmeyer Flasks VWR 89095-258
1-deoxysphinganine Avanti 860493
B27 Supplement, minus vitamin A Gibco 12587010
Beaver 6900 Mini-Blade Beaver-Visitec BEAVER6900
D-(+)-Sucrose VWR 97061-432
DAPI Thermo-fisher D1306
Dispase II, powder Gibco 17105041
DMEM, high glucose, pyruvate Gibco 11995073
DMEM/F12 Gibco 11330
Donkey anti-rabbit Ig-G, Alexa Fluor plus 555 Thermo-fisher A32794
donkey serum Sigma D9663-10ML
FBS, Heat Inactivated Corning 45001-108
Fenofibrate Sigma F6020
Glutamax Gibco 35050061
Heparin Stemcell Technologies 7980
In Situ Cell Death Detection Kit, Fluorescin Sigma 11684795910
Matrigel, growth factor reduced Corning 356230
MEM Non-Essential Amino Acids Solution Gibco 11140050
mTeSR 1 Stemcell Technologies 85850
N2 Supplement Gibco 17502048
Penicillin-Streptomycin Gibco 15140122
Pierce 16% Formaldehyde Thermo-fisher 28906
Rabbit anti-Recoverin antibody Millipore AB5585
Sodium Citrate Sigma W302600
Steriflip Sterile Disposable Vacuum Filter Units MilliporeSigma SE1M179M6
Taurine Sigma T0625
Tissue Plus- O.C.T. compound Fisher Scientific 23-730-571
Tissue-Tek Cryomold EMS 62534-10
Triton X-100 Sigma X100
Tween-20 Sigma P1379
Ultra-Low Attachment 6 well Plates Corning 29443-030
Ultra-Low Attachment 75cm2 U-Flask Corning 3814
Vacuum Filtration System VWR 10040-436
Vectashield-mounting medium vector Labs H-1000
wax pen-ImmEdge vector Labs H-4000
Y-27632 Dihydrochloride (Rock inhibitor) Sigma Y0503

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Waring, M. J., et al. An analysis of the attrition of drug candidates from four major pharmaceutical companies. Nature Review Drug Discovery. 14 (7), 475-486 (2015).
  2. Khalil, A. S., Jaenisch, R., Mooney, D. J. Engineered tissues and strategies to overcome challenges in drug development. Advances in Drug Delivery Reviews. 158, 116-139 (2020).
  3. Demetrius, L. Of mice and men. When it comes to studying ageing and the means to slow it down, mice are not just small humans. EMBO Reports. , 6 Spec No 39-44 (2005).
  4. Lindsay, K. J., et al. Pyruvate kinase and aspartate-glutamate carrier distributions reveal key metabolic links between neurons and glia in retina. Proceedings of the National Academy of Sciences U. S. A. 111 (43), 15579-15584 (2014).
  5. Cowan, C. S., et al. Cell types of the human retina and its organoids at single-cell resolution. Cell. 182 (6), 1623-1640 (2020).
  6. Kruczek, K., Swaroop, A. Pluripotent stem cell-derived retinal organoids for disease modeling and development of therapies. Stem Cells. 38 (10), 1206-1215 (2020).
  7. Sinha, D., Phillips, J., Phillips, M. J., Gamm, D. M. Mimicking retinal development and disease with human pluripotent stem cells. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 57 (5), 1-9 (2016).
  8. Gan, L., Cookson, M. R., Petrucelli, L., La Spada, A. R. Converging pathways in neurodegeneration, from genetics to mechanisms. Nature Neuroscience. 21 (10), 1300-1309 (2018).
  9. Aung, K. Z., Wickremasinghe, S. S., Makeyeva, G., Robman, L., Guymer, R. H. The prevalence estimates of macular telangiectasia type 2: the Melbourne collaborative cohort study. Retina. 30 (3), 473-478 (2010).
  10. Chew, E. Y., et al. Effect of ciliary neurotrophic factor on retinal neurodegeneration in patients with macular telangiectasia type 2: A randomized clinical trial. Ophthalmology. 126 (4), 540-549 (2019).
  11. Gass, J. D., Blodi, B. A. Idiopathic juxtafoveolar retinal telangiectasis. Update of classification and follow-up study. Ophthalmology. 100 (10), 1536-1546 (1993).
  12. Klein, R., et al. The prevalence of macular telangiectasia type 2 in the Beaver Dam eye study. American Journal of Ophthalmology. 150 (1), 55-62 (2010).
  13. Powner, M. B., et al. Loss of Muller's cells and photoreceptors in macular telangiectasia type 2. Ophthalmology. 120 (11), 2344-2352 (2013).
  14. Gantner, M. L., et al. Serine and lipid metabolism in macular disease and peripheral neuropathy. New England Journal of Medicine. 381 (15), 1422-1433 (2019).
  15. Scerri, T. S., et al. Genome-wide analyses identify common variants associated with macular telangiectasia type 2. Nature Genetics. 49 (4), 559-567 (2017).
  16. Alecu, I., et al. Cytotoxic 1-deoxysphingolipids are metabolized by a cytochrome P450-dependent pathway. Journal of Lipid Research. 58 (1), 60-71 (2017).
  17. Othman, A., et al. Fenofibrate lowers atypical sphingolipids in plasma of dyslipidemic patients: A novel approach for treating diabetic neuropathy. Journal of Clinical Lipidology. 9 (4), 568-575 (2015).
  18. Ohlemacher, S. K., Iglesias, C. L., Sridhar, A., Gamm, D. M., Meyer, J. S. Generation of highly enriched populations of optic vesicle-like retinal cells from human pluripotent stem cells. Curr Protoc Stem Cell Biol. 32, 1-20 (2015).
  19. Zhong, X., et al. Generation of three-dimensional retinal tissue with functional photoreceptors from human iPSCs. Nature Communication. 5, 4047 (2014).
  20. Eiraku, M., et al. Self-organizing optic-cup morphogenesis in three-dimensional culture. Nature. 472 (7341), 51-56 (2011).
  21. Wahlin, K. J., et al. Photoreceptor outer segment-like structures in long-term 3D retinas from human pluripotent stem cells. Science Reports. 7 (1), 766 (2017).
  22. Capowski, E. E., et al. Reproducibility and staging of 3D human retinal organoids across multiple pluripotent stem cell lines. Development. 146 (1), (2019).
  23. Luo, Z., et al. An optimized system for effective derivation of three-dimensional retinal tissue via Wnt signaling regulation. Stem Cells. 36 (11), 1709-1722 (2018).
  24. Ovando-Roche, P., et al. Use of bioreactors for culturing human retinal organoids improves photoreceptor yields. Stem Cell Research Therapy. 9 (1), 156 (2018).

Tags

هذا الشهر في JoVE ، العدد 169 ، عضوي شبكي العين ، عضوي ، تنكس الشبكية ، MacTel ، سفينغوليبيد ، مستقبلات ضوئية ، فينوفايبرات ، تلطيخ TUNEL ، شاشة المخدرات ، سمية الدهون
شاشات السمية في عضويات شبكية العين البشرية لاكتشاف الأدوية
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Eade, K., Giles, S., Harkins-Perry,… More

Eade, K., Giles, S., Harkins-Perry, S., Friedlander, M. Toxicity Screens in Human Retinal Organoids for Pharmaceutical Discovery. J. Vis. Exp. (169), e62269, doi:10.3791/62269 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter