Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Toksisitetsskjermer i humane retinale organoider for farmasøytisk oppdagelse

Published: March 4, 2021 doi: 10.3791/62269
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2, 1,2
1Lowy Medical Research Institute, 2The Scripps Research Institute

Summary

Her presenterer vi en trinnvis protokoll for å generere modne humane retinale organoider og bruke dem i en fotoreceptortoksisitetsanalyse for å identifisere farmasøytiske kandidater for den aldersrelaterte retinale degenerative sykdommen makulærtelangiektasi type 2 (MacTel).

Abstract

Organoider gir en lovende plattform for å studere sykdomsmekanisme og behandlinger, direkte i sammenheng med menneskelig vev med allsidighet og gjennomstrømning av cellekultur. Eldre humane retinale organoider brukes til å skjerme potensielle farmasøytiske behandlinger for den aldersrelaterte retinal degenerative sykdommen makulærtelangiektasi type 2 (MacTel).

Vi har nylig vist at MacTel kan skyldes forhøyede nivåer av en atypisk lipidart, deoksysfingolipider (deoksySLer). Disse lipidene er giftige for netthinnen og kan drive fotoreceptortapet som oppstår hos MacTel-pasienter. For å screene medisiner for deres evne til å forhindre deoksySL-fotoreceptortoksisitet, genererte vi humane retinale organoider fra en ikke-MacTel-indusert pluripotent stamcellelinje (iPSC) og modnet dem til en postmitotisk alder hvor de utvikler alle de neuronale avstamningsavledede cellene i netthinnen, inkludert funksjonelt modne fotoreceptorer. Netthinneorganoidene ble behandlet med en deoksySL-metabolitt og apoptose ble målt i fotoreseptorlaget ved hjelp av immunhistokjemi. Ved hjelp av denne toksisitetsmodellen ble farmakologiske forbindelser som forhindrer deoksySL-indusert fotoreseptordød screenet. Ved hjelp av en målrettet kandidattilnærming bestemte vi oss for at fenofibrat, et legemiddel som vanligvis foreskrives for behandling av høyt kolesterol og triglyserider, også kan forhindre deoksySL-toksisitet i cellene i netthinnen.

Toksisitetsskjermen identifiserte vellykket et FDA-godkjent legemiddel som kan forhindre fotoreceptordød. Dette er et direkte handlingsbart funn på grunn av den svært sykdomsrelevante modellen som er testet. Denne plattformen kan enkelt modifiseres for å teste et hvilket som helst antall metabolske stressorer og potensielle farmakologiske inngrep for fremtidig behandlingsoppdagelse i retinale sykdommer.

Introduction

Modellering av menneskelig sykdom i cellekultur og dyremodeller har gitt uvurderlige verktøy for oppdagelse, modifikasjon og validering av farmakologiske terapier, slik at de kan gå videre fra kandidatmedisin til godkjent terapi. Selv om en kombinasjon av in vitro og ikke-humane in vivo-modeller lenge har vært en kritisk komponent i legemiddelutviklingsrørledningen, klarer de ofte ikke å forutsi den kliniske ytelsen til nye legemiddelkandidater1. Det er et klart behov for utvikling av teknologier som bygger bro over gapet mellom forenklede humane cellulære monokulturer og kliniske studier. Nylige teknologiske fremskritt i selvorganiserte tredimensjonale vevskulturer, organoider, har forbedret deres troskap til vevene de modellerer, noe som gjør dem lovende verktøy i den prekliniske legemiddelutviklingsrørledningen2.

En stor fordel med menneskelig cellekultur over ikke-menneskelige in vivo-modeller er evnen til å replikere de spesifikke vanskelighetene med menneskelig metabolisme, som kan variere betydelig selv mellom høyere ordens vertebrater som mennesker og mus3. Imidlertid kan denne spesifisiteten overskygges av et tap i vevskompleksitet; Slik er tilfellet for retinalvev der flere celletyper er intrikat sammenvevd og har et unikt symbiotisk metabolsk samspill mellom cellulære subtyper som ikke kan replikeres i en monokultur4. Humane organoider, som gir en faksimile av komplekse menneskelige vev med tilgjengeligheten og skalerbarheten til cellekultur, har potensial til å overvinne manglene i disse sykdomsmodelleringsplattformene.

Retinale organoider avledet fra stamceller har vist seg å være spesielt trofaste i modellering av det komplekse vevet i den menneskelige nevrale netthinnen5. Dette har gjort retinal organoid modellen til en lovende teknologi for studier og behandling av retinal sykdom 6,7. Hittil har mye av sykdomsmodelleringen i retinale organoider fokusert på monogene retinale sykdommer der retinale organoider er avledet fra iPSC-linjer med sykdomsfremkallende genetiske varianter7. Dette er generelt svært penetrante mutasjoner som manifesterer seg som utviklingsfenotyper. Mindre arbeid har blitt effektivt gjort på aldrende sykdommer der genetiske mutasjoner og miljømessige stressorer påvirker vev som har utviklet seg normalt. Neurodegenerative sykdommer i aldring kan ha kompleks genetisk arv og bidrag fra miljøstressorer som iboende er vanskelige å modellere ved hjelp av kortsiktige cellekulturer. Imidlertid kan disse komplekse sykdommene i mange tilfeller samle seg på vanlige cellulære eller metabolske stressorer som, når de testes på et fullt utviklet menneskelig vev, kan gi kraftig innsikt i nevrodegenerative sykdommer i aldring8.

Den makulære degenerative sykdommen med sen oppstart, makulærtelangiektasi type II (MacTel), er et godt eksempel på en genetisk kompleks nevrodegenerativ sykdom som samler seg på en felles metabolsk defekt. MacTel er en uvanlig retinal degenerativ sykdom av aldring som resulterer i fotoreceptor og Müller glia tap i makulaen, noe som fører til et progressivt tap i sentralvisjon 9,10,11,12,13. I MacTel driver en ubestemt, muligens multifaktoriell, genetisk arv en vanlig reduksjon i sirkulerende serin hos pasienter, noe som resulterer i en økning i en nevrotoksisk lipidart kalt deoksysfingolipider (deoksySL)14,15. For å bevise at akkumulering av deoksySL er giftig for netthinnen og for å validere potensielle farmasøytiske terapier, utviklet vi denne protokollen for å analysere fotoreceptortoksisitet i humane retinale organoider14.

Her skisserer vi en spesifikk protokoll for å differensiere humane retinale organoider, etablere en toksisitets- og redningsanalyse ved bruk av organoider og kvantifisere utfall. Vi gir et vellykket eksempel der vi bestemmer vevsspesifikk toksisitet av et mistenkt sykdomsfremkallende middel, deoksySL, og validerer bruken av et trygt generisk legemiddel, fenofibrat, for potensiell behandling av deoksySL-indusert retinal toksisitet. Tidligere arbeid har vist at fenofibrat kan øke nedbrytningen av deoksySL og lavere sirkulerende deoksySL hos pasienter, men effekten i å redusere deoksySL-indusert retinal toksisitet er ikke testet16,17. Selv om vi presenterer et spesifikt eksempel, kan denne protokollen brukes til å evaluere effekten av et hvilket som helst antall metabolske / miljømessige stressorer og potensielle terapeutiske legemidler på retinalvev.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Tine, passere og utvide iPSC-er/ESC-er

MERK: For alle celledyrkingstrinn, bruk beste praksis for å opprettholde en steril cellekultur.

  1. Belegg en 6-brønns cellekulturplate med kjellermembranmatrisemedium.
    1. For å forberede 1x av dette mediet, følg produktspesifikasjonene eller fortynn 75 μL kaldmatriksmedium med 9 ml DMEM / F12. Tilsett 1,5 ml nylaget 1x medium per brønn i en 6-brønns plate. Inkuber ved 37 °C i 30 minutter.
    2. Aspirer av matriksmediet i kjellermembranen og skyll hver brønn med 3 ml DMEM/F12. Tilsett 2 ml DMEM/F12 og inkuber ved 37 °C inntil bruk. Bruk tallerkenen den dagen den tilberedes.
  2. Tilbered en 10 mM stamløsning av bergartsinhibitor (Y-27632 dihydroklorid) i PBS, og oppbevares ved -20 °C til bruk.
  3. Tine et hetteglass med iPSCs/ESC i DMEM/F12 medium og sentrifuge ved 400 x g i 5 minutter. Aspirer supernatanten og resuspender pelleten i mTeSR medium. Plate 1 hetteglass med celler på en belagt 6-brønn i mTeSR media med 10 μM bergartsinhibitor (Y-27632 dihydroklorid) og inkubere over natten i inkubatoren. Neste dag, aspirere av media og legge tilbake bare mTeSR.
    MERK: Bytt media hver dag til du passerer.
  4. Forbered 0,5 mM EDTA i PBS ved å fortynne 500 μL 0,5 M EDTA i 500 ml PBS.
  5. Passasjeceller når de når 80-90% konfluens. Del cellene 1:3 eller 1:6 per brønn, avhengig av celleveksten.
    1. For å fjerne klebende celler fra platen, aspirer av media og inkuber med 0,5 mM EDTA i PBS i 5 minutter ved romtemperatur. Etter inkubering, fjern EDTA-oppløsning og løft av celler ved å tvinge ut 1 ml mTeSR-medium på celler med en p1000-pipette.
    2. Fortsett å suge opp og kraftig løse ut mTeSR-medium og celler, opptil 5x, for å fjerne de festede gjenværende cellene. Plateceller på en fersk kjellermembranmatrisebelagt 6-brønnsplate, med mTeSR medium. Fortsett å bytte medier daglig til platene igjen når 80-100% sammenløp.
  6. Når cellene har utvidet seg til en full 6-brønnsplate og har nådd 80-100% sammenløp, sett til side en brønn for å utvide cellelinjen for påfølgende differensieringer eller for å fryse for kryopreservering. Bruk de resterende fem brønnene til å starte differensieringsprosessen ved å lage embryoidlegemer.

2. Å lage embryoide legemer (EB)

MERK: EB-dannelse og differensieringsmedieoppskrifter er avledet fra protokoller i Cowan et al.5, Ohlemacher et al.18 og Zhong et al.19.

  1. Forbered 1x Dispase oppløsning og Neural Induction Media (NIM) som beskrevet nedenfor.
    1. Tilbered 10 mg/ml 5x stamoppløsning av Dispase ved å løse opp pulveret i DMEM/F12. Sterilt filter ved hjelp av et 0,22 μm filter. Oppbevar 1 ml alikoter ved -20 °C til bruk.
    2. Bruk 5x Dispase-oppløsningen, klargjør 1 ml / brønn med 2 mg / ml Dispase i DMEM / F12. Varm oppløsningen ved 37 °C i 30 minutter.
    3. Forbered NIM ved å supplere DMEM/F12 med 1 % N2-tilskudd, 1 % MEM NEAA og 2 mg/ml heparin ved 180 U/mg. NIM kan oppbevares ved 4 °C i opptil én måned.
  2. Tilbered og varm 16 ml 3:1 blanding av mTeSR:NIM (12ml:4mL) løsning til romtemperatur.
  3. Fjern differensierte celler og tilsett varm Dispase-løsning.
    1. Fjern differensierende celler fra iPSCs/ESCs cellekultur. Under et disseksjonsskop, skrap av ugjennomsiktige hvite kolonier med en p10 pipettespiss. Aspirer av mTeSR medium fra kulturbrønnene. Dette vil fjerne de differensierte klumpene som bare ble skrapt av.
    2. Tilsett umiddelbart den forvarmede Dispase-løsningen og inkuber ved 37 °C til de fleste kantene på cellekoloniene begynner å krølle seg sammen under et mikroskop. Dette vil ta 4-8 min.
      MERK: Inkubasjonstiden for celler i Dispase må bestemmes for hvert laboratorium. Varigheten kan variere mellom cellelinjer og en lengre inkubasjon er nødvendig for celler som har blitt belagt i 3 dager eller mer. Saktevoksende iPSC / ESC som tar mer enn 3 dager å nå samløp vil begynne å feste seg med større styrke til platen, noe som gjør det vanskelig å løfte cellene av. For sakte voksende celler, prøv passaging celler på 1: 2 for utvidelse til en full 6-brønns plate for å redusere tiden fra plating til samløp.
  4. Aspirer oppløsningen og tilsett forsiktig minst 2 ml DMEM/F12 medium per brønn. Legg DMEM / F12 medium sakte til siden av brønnen, og pass på at du ikke løsner cellene.
    1. Aspirer DMEM / F12 medium deretter kraftig legge tilbake friske 1 ml DMEM / F12 direkte på cellene for å løfte cellekolonier fra platen. Med en p1000-pipette suger du gjentatte ganger opp og støter ut DMEM/F12 kraftig i brønnen, opptil 5x, for å løsne så mange cellekolonier som mulig.
      MERK: Differensierende/differensierte iPSC-er/ESC-er holder seg til platen mer enn udifferensierte iPSC-er/ESC-er. Celler som ikke kommer av med gjentatt pipettering, blir best igjen. Overflødig pipettering dreper celler og reduserer effektiviteten av EB-produksjonen. Celleklumper vil ha mellom 100-400 celler per klump.
  5. Overfør flytende kolonier til et 15 ml konisk rør og skyll brønner med ytterligere 1 ml DMEM/F12 medium per brønn for å samle opp eventuelle gjenværende flytende kolonier.
  6. La de flytende koloniene bosette seg ved tyngdekraften i ikke mer enn 5 minutter. Når det er avgjort, fjern alt unntatt 1-2 ml supernatant. Pass på at du ikke rører den myke pelleten i bunnen.
  7. Resuspender pelleten i forvarmet 3:1 mTeSR:NIM-medium og overfør til en T75-kolbe med ultralavt feste. Inkuber over natten for å la EB-er dannes. Dette vil bli vurdert dag 0 av differensiering.
  8. Gradvis bytte media til NIM for å begynne differensieringen av EB til nevrale forfedre.
    1. Neste dag, fjern media og erstatt med 10 ml 1:1 mTeSR:NIM medium. For å fjerne medier fra frittflytende EB-kultur, tipp kolben opp slik at EB-ene samler seg i nederste hjørne av kolben. Aspirer av supernatanten, pass på at du ikke aspirerer noen av EB-ene i pelleten nederst.
    2. Neste dag, bytt ut mediet med 10 ml 1:3 mTeSR:NIM medium.
    3. Neste dag bytter du ut mediet med fullt NIM-medium. Fortsett å skifte media hver 2. dag med NIM medium inntil 7 dager etter behandling med Dispase.

3. Plettering av EB og initiering av nevral retinal differensiering

  1. En uke etter Dispase behandling, plate frittflytende EBs på en 6-brønns plate belagt med vekstfaktor-redusert kjellermembranmatrise medium. For å belegge plate, se trinn 1.1.
    1. Aspirate brukte medier fra EBs og erstatt med 12 ml NIM.
    2. Sikre en jevn fordeling av EB i hver brønn ved å røre det EB-holdige mediet for å resuspendere EB-ene, fjern deretter raskt 1/6-del av mediet (2 ml) og dispenser i en brønn. Gjenta for de resterende brønnene.
    3. Før du ruger, rist platen forsiktig, frem og tilbake og deretter fra side til side, for å fordele EB-ene jevnt. Hvis EB-ene klumper seg i midten, vil de ikke differensiere ordentlig.
      MERK: Pletteringstetthet er avgjørende for differensiering. Sørg for å plate større enn 30 EBs per brønn. Hvis EBs produksjon ikke var effektiv, distribuer EB i færre brønner.
  2. Bytt media daglig med NIM medium. Hold medienivået i brønnene på ~3 ml. Når du skifter medium, fjern alle unntatt 1 ml medier for ikke å tørke ut de belagte EB-ene, og tilsett 2 ml medier forsiktig på siden av brønnen for ikke å løfte cellene av platen.
  3. Ni dager etter plating av EBs, begynne å endre media fra NIM til Retinal Differentiation Media (RDM) i løpet av to dager.
    1. Forbered RDM ved å blande følgende: 48% DMEM / F12 (1: 1) og 48% DMEM supplert med 2% B27 supplement uten vitamin A, 1% MEM NEAA og 1% Pen-Strep. Filtrer steriliser med 0,20 μm filter. RDM kan oppbevares ved 4 °C i opptil en måned.
    2. Den første dagen, bytt media til en 1: 1-blanding av NIM: RDM. På den andre dagen, bytt media til RDM. Alle påfølgende dager, mate celler RDM.
      MERK: I løpet av de neste ukene vil belagte EB-er danne nevrale retinale progenitorer som begynner å generere synlig pigmentert RPE.

4. Lage frittflytende organoider og opprettholde frittflytende organoidkulturer

  1. Fragmenter belagte EB-er 28 dager etter innledende dispasebehandling (21 dager etter EB-plating) ved hjelp av en steril skalpell for å kutte et 1-2 mm2-gitter i belagte EB-er. Dette vil skille retinal stamkoloniene i små biter, slik at de senere i utviklingen ikke blir for store og nekrose fra utilstrekkelig næringsutveksling i midten.
  2. Løsne belagte EB-er.
    1. For å gjøre det, legg først til ytterligere 2 ml RDM til hver brønn. Deretter aspirerer du ~1000 μL medier fra brønnene ved hjelp av en p1000-pipette. Ta nå mediet kraftig ut på belagte EB-er med spissen helt nedsenket.
    2. Gjenta dette til alle cellene er løftet fra platen. Hold spissen nedsenket under utstøting av medier, og ikke skyv pipettestempelet forbi første stopp for å unngå bobler.
  3. Resuspender nascently frittliggende EB-biter i en steril plast 125 ml Erlenmeyer-kolbe og fyll kolben med ~ 40 ml RDM-medier. Plasser kolben på en orbital shaker plassert i en standard inkubator. Sett risterhastigheten på 130-140 o / min (hastighetsinnstilling 3).
    MERK: Dyrking av organoider på en shaker hindrer dem i å holde seg sammen mens de dyrker ved en høyere konsentrasjon av organoider. Bioreaktorer oppnår også de samme endene, men en shaker er billigere.
  4. Fôr organoider med delvis medieendring, erstatter ca. 12 ml RDM 2-3 ganger per uke, avhengig av hvor gult mediet blir. Tidlige organoider vil ikke kreve mye fôring, men etter hvert som de vokser, vil de kreve hyppigere medieendringer med flere medier.
  5. Beskjær organoider annenhver uke for å fjerne ikke-retinale, overgrodde og døende organoider. Dette forhindrer sløsing med media og forbedrer helsen til de gjenværende retinale organoider.
    1. Overfør celler fra kolben til en 6-brønns plate eller 10 cm tallerken ved hjelp av en 5 ml pipette. Behold organoider som viser stratifisert nevroepitel (figur 1A, stjerne). Disse organoider er gjennomsiktige og hvite.
    2. Sorter ut og fjern dårlig dannede eller overgrodde retinale organoider og ikke-retinale organoider med en 5 ml pipette. Disse vil vanligvis være ugjennomsiktige og gulaktige (figur 1A). Fjern også alt som ikke ser ut som et stratifisert nevroepitel. De første beskjæringene vil være arbeidskrevende, men vil bli mye lettere hver gang etter hvert som organoidene blir større og mer homogene (figur 1B).

5. Opprettholde modne organoider og differensiere dem til et postmitotisk retinalvev

  1. Ved dag 56 (uke 8) etter den første dispasebehandlingen for EB-dannelse (28 dager etter dyrkning av løsrevne EB i en kolbe), bytter du organoid media til RDM+. Dette vil gi ekstra næringsstoffer til fullt modne organoider som retinalt vev.
    1. Tilbered 100 mM taurin i PBS. Oppbevar alikoter i -20 °C til bruk.
    2. Forbered RDM + ved å supplere RDM med 10% FBS, 100 μM taurin og 2 mM kommersielt glutamintilskudd. Filtrer steriliser med 0,20 μm filter.
    3. Fortsett å endre RDM+-medier 2-3 ganger i uken.
  2. I uke 17-18 (etter dispasebehandling) overføres organoider fra Erlenmeyerkolben til en 6-brønnsplate med ultralavt feste ved bruk av en 5 ml pipette. For den første uken fortsette å beskjære og skille organoider fra hverandre daglig til organoider ikke lenger holde sammen. Optimal tetthet er 10-15 organoider per brønn. Bytt media 2-3 ganger i uken.
    MERK: Reduser antall organoider per brønn hvis de organoider ofte fester seg til hverandre eller hvis mediet blir veldig gult mellom medieendringer.
  3. Forvent at organoider blir fullstendig postmitotiske innen uke 185 når nevrale retinale celler er tilstede overalt. Ved uke 24, sjekk for dannelsen av rudimentære ytre segmenter på utsiden av organoiden. Innen uke 26-28 må ytre segmenter være tykke på utsiden av organoidene (figur 1C). Utfør toksisitetsanalyser etter uke 26 når organoider har definert ytre segmenter som indikerer en moden differensieringstilstand.
    MERK: Bruk bare godt differensierte retinale organoider for toksisitetsanalyse. Utførelse av toksisitetsanalyse på organoider med veldefinerte ytre segmenter vil tillate identifikasjon.

6. Deoksysfinganin (deoksySA) og medikamentell behandling

MERK: Her presenteres en enkelt behandling av fenofibrat for å redde deoksySA-toksisitet over en periode på 4 dager (figur 2). Konsentrasjon av deoksySA tilsatt organoider, varighet av deoksySA-behandling på organoider og typen legemiddel som brukes til å redde toksisitet14 kan imidlertid modifiseres i henhold til eksperimentelle behov for å analysere toksisitet og toksisitetsredning.

  1. Forbered 1 mM stamløsning av deoksySA i etanol. Oppbevares ved -20 °C i 1 måned. Alternativt kan en stamløsning av deoksySA fremstilles i DMSO.
  2. Utfør en seriell fortynning av deoksySA for å bestemme en passende giftig konsentrasjon av deoksySA for narkotikaredning.
    MERK: Først bestemme en konsentrasjon av deoxySA som vil resultere i tilstrekkelig celledød for å måle en redningseffekt. Hvis konsentrasjonen er for høy, vil den toksiske responsen resultere i oppløsning av organoiden og ingen redning vil bli observert. Hvis den giftige responsen er for lav, vil det være vanskelig å observere en signifikant redningseffekt. DeoksySA toksisk respons kan variere fra lab-til-lab og batch-til-batch av deoxySA.
    1. Fortynn 1 mM deoksySA stamoppløsning til konsentrasjoner på 0,5 μM, 1 μM og 2 μM i 3 ml RDM+, hver. Tilsett 3 μL etanol til RDM + for å forberede en kontrollbehandling.
    2. Under et disseksjonsmikroskop, bruk en steril sonde for å velge 4 grupper organoider med minst 5 organoider per gruppe. Del gruppene i separate brønner med en 6-brønns plate med ultralavt vedlegg. Velg organoider som har omtrent samme størrelse og form.
    3. Aspirer av så mye RDM + fra organoider som mulig. Til hver brønn av organoider, legg til en konsentrasjon av deoxySA i RDM +. Legg kjøretøykontroll til den fjerde brønnen av organoider.
    4. Etter to dager med dyrkning i deoksySA eller kjøretøy, erstatt mediet med nytilberedte tilsvarende deoksySA-fortynninger i RDM+.
    5. På den fjerde behandlingsdagen, fortsett til trinn 7 for å behandle og analysere organoider for celledød. Når en deoksySA-konsentrasjon er valgt, fortsett til trinn 6.3 for å behandle med fenofibrat.
      MERK: Målcelledød i den valgte deoksySA-behandlingsgruppen er 5 - 20 TUNEL positive celler per 10.000 μm2. Organoidene skal ikke gå i oppløsning ved berøring av en sonde i løpet av behandlingen.
  3. Behandle organoider med den valgte toksiske dosen av deoksySA og fenofibrat.
    1. Klargjør en 40 mM stamløsning av fenofibrat i DMSO. Oppbevares ved -20 °C i opptil 1 år.
    2. Klargjør legemiddelbehandlingsmediet: I 3 ml RDM+ fortynnes 1 mM deoksySA stamløsning til 1 μM deoksySA og fortynner 40 mM fenofibrat stamløsning til 20 μM.
    3. Klargjør deoksySA-behandlingsmedier: I 3 ml RDM+ fortynnes 1 mM deoksySA stamløsning til 1 μM deoksySA og tilsett 1,5 μL DMSO.
    4. Forbered kontrollmediet: I 3 ml RDM +, tilsett 3 μL etanol og 1,5 μL DMSO.
    5. Under et disseksjonsmikroskop ved hjelp av en steril sonde velger du tre grupper organoider med minimum fem organoider per gruppe. Del gruppene i separate brønner med en 6-brønns plate med ultralavt vedlegg.
    6. Legg til de forberedte behandlingene (deoxySA, deoxySA + fenofibrat eller kontroll) til organoider. Etter to dager skiftes mediet i brønnene med nypreparert RDM+ supplert med tilsvarende deoksySA/fenofibrat/kontrollløsninger.
    7. På fjerde behandlingsdag går du videre til trinn 7 for å behandle og analysere organoider for celledød (figur 2).

7. Innebygging og kryoseksjonering av organoider

  1. Forbered fersk 4% PFA ved å tilsette 1 ml 16% PFA-ampulle til 3 ml PBS.
  2. Fjern RDM + -medier fra organoider og skyll en gang med PBS. Fjern så mye PBS som mulig fra organoider. Tilsett 2 ml nylaget 4% PFA (i PBS) til organoidene og inkuber i 15 minutter ved romtemperatur.
  3. Etter 15 min inkubasjon, skyll organoider to ganger med 2 ml PBS, vask deretter i PBS i 10 minutter.
    MERK: Utfør fiksering i en kjemisk avtrekkshette og kast PFA-oppløsningen og to påfølgende PBS-skyll i en passende merket PFA-avfallsbeholder som er lagret i avtrekkshetten.
  4. Aspirer alle PBS, og tilsett deretter 20% sukrose i PBS til de faste organoider. Forsikre deg om at organoidene blandes inn i sukroseoppløsningen og ikke forblir i en PBS-boble på toppen. Hold organoider i sukroseoppløsningen til de synker til bunnen av sukroseoppløsningen, dvs. ~ 1 time ved romtemperatur. Faste organoider kan oppbevares i sukroseoppløsning over natten ved 4 °C.
  5. Legg inn organoider i OCT-løsning i en kryoseksjonsform. Flere organoider per tilstand kan bygges inn i en form. Orienter organoidene slik at deres beste retinalregioner blir tverrsnittet på kryostaten, og midten av organoidene er omtrent i samme plan. Frys de innebygde organoidene ved -20 °C. Innebygde organoider kan lagres ved -80 °C i årevis.
    MERK: Organoider er vanskelige å se i frossen OCT; orienter RPE-klynger mot siden av formen som skal vende mot bladet for å lette organoididentifikasjon.
  6. Kryoseksjonsorganoider i 10-14 μm tykke seksjoner og fester seksjoner til poly-L-lysinbehandlede lysbilder. Under kryoseksjonering, kontroller lysbildene gjentatte ganger under et mikroskop for å identifisere seksjoner som inneholder midten av organoider. Samle bare de midterste skivene av organoidene der alle lagene er jevnt representert (figur 2A-C, figur 3). Når lysbildene er inndelt, kan de lagres i en lysbildeboks ved -80 °C i årevis.
    MERK: Skiver tatt på endene av organoiden vil overprøve ytterste fotoreseptorer og er ikke egnet for kvantifisering. Gjennomsnittlig størrelse organoider vil gi 10-15 skiver av midten av organoid som representerer et tverrsnitt av de stratifiserte retinale lagene.

8. TUNEL-farging for apoptotiske celler

  1. Tine frosne sklier i 30 minutter ved 37 °C. Umiddelbar plassering av lysbilder på 37 °C forhindrer kondens. Vevsprøver dynket i rent vann kan forvride vevet. En inkubasjon på 37 °C forbedrer også vedheft av vev til glassglasset.
  2. Lag en kontinuerlig kant på glasset rundt vevsseksjonene ved hjelp av en hydrofob penn. Dette vil gi en grense og sikre tilstrekkelig fiksering og antistoffinkubasjoner med lite volum av løsninger. Tilsett ca. 100-200 μL (volumet fyller den hydrofobe grensen uten å spyle over) av nytilberedt 4% PFA i 20 minutter. Utfør fiksering i en kjemisk avtrekkshette og kast PFA-oppløsningen i riktig merket PFA-avfallsbeholder som er lagret i avtrekksdekselet.
  3. Skyll lysbildene en gang i PBS og vask deretter i PBS i 25 min ved romtemperatur.
  4. Forbered TUNEL-blandingen. Tine både fiolette og blå hetteglass fra in situ celledødsdeteksjonssettet. Fjern 100 mikrol fiolett hetteglassoppløsning (kan brukes til negativ kontroll) og bland de resterende 450 mikrol oppløsning fra hetteglasset med 50 mikroliter oppløsning fra det blå hetteglasset. Bland godt og hold deg i mørket. Hvert sett med hetteglass (500 μL totalt) kan flekke 5-10 lysbilder.
  5. Permeabiliser vevskiver.
    1. Forbered permeabiliseringsløsning: PBS med 0,1% TritonX-100 og 0,1% natriumsitrat
    2. Fjern PBS fra eksempellysbilder og legg deretter til Permeabilization Solution i prøver. Inkuber i 2 minutter på isblokk eller ved 4 °C. Etter det, skyll en gang i PBS og vask deretter i PBS i 10 minutter.
  6. Fjern PBS og tørk bort så mye løsning som mulig ved hjelp av hjørnet av et brettet vev. Tilsett 50-100 μl fremstilt GUNEL-blanding til prøvene, avhengig av størrelsen på området som trekkes av den hydrofobe pennen. Dekk til med glassdeksel og rug ved 37 °C i 1 time i mørket.
    MERK: Alle inkubasjoner og vasker for følgende trinn skal gjøres i mørket for å forhindre bleking av fluoroforer. Bruk enten en mørk boks eller dekk lysbildene med aluminiumsfolie for å blokkere lys.
  7. Merk fotoreceptorene. Skyll en gang med PBS og vask deretter i 20 min i PBS. Fjern PBS og tilsett deretter primært Recoverin antistoff (kanin anti-Recoverin) fortynnet 1:500 i PBS med 0,1% Tween og 5% eselserum. Inkuber ved 4 °C over natten.
  8. Etter fjerning av primært antistoff, skyll en gang i PBS og vask deretter i PBS i 20 minutter. Tilsett sekundært antistoff, eselkanin med oransje eller rød fluorofor, fortynnet 1:1000 i PBS med 0,1 % Tween og 5 % eselserum og inkuber ved romtemperatur i 2 timer. Skyll en gang med PBS og vask deretter i 20 min i PBS. Legg til DAPI ved 1:1000 i PBS, rug ved romtemperatur i 10 minutter.
  9. Skyll en gang med PBS og vask deretter i 20 min i PBS. Fjern PBS og legg til monteringsmediet. Tilsett dekselslipp, forsegl med neglelakk, og la det tørke i mørket. Lysbilder kan oppbevares ved 4 °C i en mørk beholder i opptil 1 uke.
    MERK: For best bildekvalitet, ta bilder neste dag.

9. Avbildning av organoidskiver og kvantifisering av død.

MERK: Imaging krever et konfokalmikroskop med evne til å skille mellom tre fluoroforkanaler. Dette eksperimentet bruker grønne kanaler (Alexa Fluor 488), oransje kanaler (Alexa Fluor 555) og UV (DAPI). Enhver kombinasjon av fluoroforer kan brukes slik at utslippene ikke bløder inn i de andre kanalene.

  1. Finn retinale seksjoner for avbildning og kvantifisering. Under en lav forstørrelse av mikroskopet (5x eller 10x) bruk Recoverin-farging, som merker cytoplasmaet til fotoreceptorer, og DAPI-farging, som merker kjernene til alle celler, for å lokalisere en region av den skivede organoid som er intakt, velformet og i et plan som prøver et representativt tverrsnitt av organoiden (figur 2 og figur 3 ). Finn et snitt som har et distinkt ytre kjernefysisk lag av fotoreseptorer som er minst noen få celler tykt, og et separat og distinkt lag av kjerner som ikke har Recoverin-farging (figur 2 og figur 3).
  2. Ram inn bildet. Øk mikroskopets forstørrelse til et 20x-objektiv og ram inn lysbildet for å fylle bildet med så mye av fotoreseptorlaget som mulig (figur 3).
  3. Sett Z-planet. Hvis du bruker et mikroskop som avbilder Z-stabler, angir du øvre og nedre grense for Z-området for å avbilde hele dybden av stykket. Bruk samme Z-stacktykkelse for alle bilder i et eksperimentelt sett, slik at samme mengde vev analyseres i alle prøver. Hvis du ikke bruker et mikroskop som viser Z-stabler, fokuserer du bildet til midten av stykket.
  4. Se for deg alle tre kanalene med fluoroforer i et Z-stack-oppkjøp. Alle tre kanalene kreves for å identifisere en døende celle positivt. Se for deg ett område per organoid.
  5. Lagre bildesettet i et filformat som bevarer forholdet mellom areal per piksel.

10. Kvantifisering av døende celler

  1. Åpne bildestakker i FIJI (Image J)-programvare. I vinduet Bio-Formats Import Options , sørg for at ingen bokser under delen "delt inn i separate vinduer" er valgt. Rulling mellom justerte bildekanaler er avgjørende for å identifisere celler på riktig måte.
  2. Slå sammen Z-stack-bildesettet ved å klikke på Image > Stacks og velg deretter 'Z-prosjekt' fra rullegardinmenyen. Dette vil skape et nytt bilde for kvantifisering. Hvis organoidene ikke ble avbildet i Z-serien, hopper du over dette trinnet.
  3. Velg bildekanalen som viser Recoverin-farging (rød, i dette eksemplet). Klikk på polygonmarkeringsverktøyet i verktøylinjen og skisser et kontinuerlig område av fotoreseptorer i bildet (figur 3A). Klikk på Analyser > sett målinger. I popup-vinduet Angi målinger velger du boksen ved siden av Område, klikker på Analyser og velger Mål for å måle området (eller trykk "m" som en snarvei) av fotoreceptorer for å telle døende celler. Områdemålingen vises i et popup-målingsvindu.
  4. Tell de TUNEL-positive kjernene i fotoreseptorregionen som er valgt tidligere (figur 3B,C). Høyreklikk på punktverktøyet på verktøylinjen og velg flerpunktsverktøy. Bare i TANEL-kanalen klikker du på TUNEL positiv farging som overlapper med en DAPI positive kjerner og Recoverin-farging. Veksle mellom kanalene for å validere positive celler.
  5. Del antall TUNEL positive celler med området for å få en normalisert verdi for celledød i fotoreceptorer per organoid (figur 2D,E).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Retinale organoider ble generert fra en ikke-MacTel kontroll iPSC-linje. Etter at organoider nådde 26 uker i kultur, ble de valgt og delt inn i eksperimentelle grupper. Organoider ble behandlet med varierende konsentrasjoner av deoksySA for å avgjøre om deoksySA er giftig for fotoreseptorer. Fire konsentrasjoner av deoksySA ble testet, fra 0 til 1 μM (figur 2) og organoider ble behandlet i 8 dager, med medieforandringer annenhver dag. Celledød som respons på deoksySA er konsentrasjonsavhengig og påviselig i så lite som 50 nM deoksySA (figur 2D). Den høyeste konsentrasjonen som ble testet, 1 μM deoxySA, ga en robust effekt samtidig som retinalorganoidens integritet ble opprettholdt (figur 2B,D). En høyere konsentrasjon av 5 μM deoksySA forårsaket oppløsning av organoider i løpet av få dager (data ikke vist). Resultatene av deoksySA-doseresponsen bestemte den optimale konsentrasjonen av deoksySA for fremtidige toksisitetseksperimenter. DeoksySA-dosen på 1 μM resulterte i en betydelig celledød uten overmettende toksisitet, som ble observert ved 5 μM.

For å teste fenofibrat sin evne til å redde deoksySA-indusert celledød, ble retinale organoider behandlet med enten 1 μM deoksySA, 1 μM deoksySA pluss 20 μM fenofibrat, eller ingen kontroll av behandlingsvehabilitet (figur 2A-C,E). Fenofibrat på 20 μM forhindret deoksySA-indusert toksisitet i fotoreseptorene til retinale organoider, noe som signifikant reduserte celledød med ca. 80 % etter 4 dagers behandling (figur 2A-C,E)16. Ytterligere lipidendrende legemidler ble testet med samme protokoll, inkludert fumonosin-B1, som viste en fullstendig redning av deoksySA-toksisitet. Beslektede lipidarter ble også testet for å identifisere den spesifikke nedstrøms sfingolipidmetabolitten som fører til fotoreseptorcelledød14.

Figure 1
Figur 1: Representative lyse feltbilder av organoider under et invertert lysmikroskop . (A) 4 uker gamle organoider 2 dager etter løsrivelse viser passende retinal lagdeling (hvit *) eller ikke-retinal organoid utvikling. (B) Utvikling av organoider ved uke 13. (C) Netthinneorganoider ved uke 28 med klar retinal lagdeling og velformede ytre segmenter som projiserer fra det ytre fotoreseptorlaget (hvit søyle). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2 Representative konfokale bilder av celledød. Representative konfokale bilder av celledød (TUNEL, grønn) innenfor fotoreseptorlaget (Recoverin, rødt) av retinal organoid etter 4 dagers behandling med enten kontrollmedier (A), 1 μM deoksySA (B) eller 1 μM deoksySA med 20 μM fenofibrat (C). (D) Kvantifisering av celledød i humane fotoreseptorer etter behandling av retinalt organoidvev med varierende konsentrasjoner av deoksySA. (E) Kvantifisering av celledød i humane fotoreseptorer etter behandling av retinalt organoidvev med kontrollmedier (n = 6), 1 μM deoksySA (n = 22), 1 μM deoksySA + 20 μM fenofibrat (n = 21). *p<0.05, ***p<0.001 med enveis ANOVA og post hoc Tukey test. Data hentet fra New England Journal of Medicine, Gantner, M., Eade, K. og Wallace. M., et al. Serin- og lipidmetabolisme ved makulærsykdom og perifer nevropati, 381(15), 1422-1433, Copyright © (2019) Massachusetts Medical Society. Gjengitt med tillatelse. 14Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Skjermbilder som viser et konfokalt bilde av en seksjonert og farget organoid behandlet med 1 μM deoksySA vist med FIJI-programvare. Fluorescerende kanaler er delt inn i α-Recoverin (A, rød), TUNEL (B, grønn) og DAPI (C, blå). (A) Fotoreceptorområdet er skissert ved hjelp av polygonverktøyet som er valgt i verktøylinjen (øverst til venstre). (B,C) Celletelling ved hjelp av flerpunktsverktøyet, valgt på verktøylinjen, av TUNEL positive (B, grønne) og DAPI positive (C, blå) celler i fotoreceptorlaget. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Variasjoner i differensieringsprotokoll
Siden oppfinnelsen av selvformende optiske kopper av Yoshiki Sasais gruppe20, har mange laboratorier utviklet protokoller for å generere retinale organoider som kan variere i nesten hvert trinn 5,18,19,21. En uttømmende liste over protokoller finnes i Capowski et al.22. Differensieringsprotokollen vi gir her er en enkel, lavintervensjonsprotokoll som gir et godt utgangspunkt for ethvert laboratorium som forsøker å skille modne retinale organoider. Brukere oppfordres til å utforske og ta i bruk variasjoner av denne protokollen. Vanlige trinn for protokollvariasjon er produksjon og tidlig differensiering av EB, og bruk av differensieringsfaktorer som BMP4, DKK-1 eller retinsyre for å forbedre effektiviteten 5,19,23.

Dyrking av organoider på en shaker for mye av senfaseutviklingen har vært et effektivt skritt for å øke differensieringseffektiviteten og redusere tiden som brukes på å håndtere organoider. Bioreaktorer oppnår de samme endene24, men bruk av en shaker med engangs Erlenmyer-kolber er mer kostnadseffektivt og kan gjøres med vanlig laboratorieutstyr. Den største fordelen med å holde organoidene i mobilisert suspensjon er at det fjerner behovet for å skille organoider som holder seg sammen på platen mens de vokser. De suspenderte kulturene letter også større næringsutveksling, slik at organoider har en tendens til å vokse seg større enn de på en standard stillplate. Av denne grunn er det bra å starte med å fragmentere belagte EB-er så små som mulig i trinn 4.1.

Siden oppnåelse av modne retinale organoider krever differensiering av en enkelt kultur i nesten 6 måneder, kan det virke tidkrevende å utføre toksisitetsanalyser på retinale organoider sammenlignet med å bruke en 2-D monokultur. Imidlertid utføres toksisitetsanalyser på en enkelt kontrolllinje, og differensieringer kan settes opp rutinemessig. Etter en innledende 6-måneders investering vil en regelmessig tilførsel av organoider for å utføre ytterligere eksperimenter og protokollendringer være tilgjengelig uten forsinkelse. Å starte 2-3 runder med retinal organoid differensiering hver 1-2 måned gir rikelig vev for komplekse og grundige sett med eksperimenter.

Organoider gir en allsidig modell for målrettet narkotikatesting.
Denne protokollen beskriver en fotoreceptortoksisitetsanalyse for å teste effekten av lipidendrende legemidler for å redde deoksySL-indusert celledød. Selv om dette er en spesifikk applikasjon som viser en farmakologisk redning for et sykdomsfremkallende middel i MacTel, kan denne protokollen brukes til å teste et hvilket som helst antall fornærmelser (f.eks. Næringsmangel, hypoksiske tilstander, lystoksisitet) og farmakologiske redninger. Derfor kan den tilpasses for å modellere andre netthinnesykdommer. I vårt eget arbeid har vi vist at ved å bruke den samme protokollen og erstatte ulike relaterte sfingolipidarter og legemidler som direkte blokkerer sfingolipidmetabolismen, var vi også i stand til å gi innsikt i MacTels sykdomsmekanisme ved å bestemme den spesifikke toksiske nedstrøms sfingolipidmetabolitten som fører til fotoreceptorcelledød14 . I motsetning til modelleringssykdommer på nivå med genetiske mutasjoner, som krever etablering av variant iPSC-linjer, tillater bruk av organoider for å modellere giftige metabolske forhold og miljøstressorer bruk av en felles kontroll-iPSC-linje som en dynamisk modell med rikelig og lett tilgjengelig vevskilde.

De humane organoidmodellene er spesielt fordelaktige når man studerer metabolske sykdommer i netthinnen, hvor forskjellige celletyper har et unikt symbiotisk metabolsk samspill som ikke kan replikeres i en monokultur av fotoreseptorlignende celler4. Denne komplekse metabolske modellen har gjort det mulig for oss å oppdage effektiviteten av stoffet fenofibrat for å forhindre toksiske effekter av deoksySL direkte hos mennesker. I musemodeller av forhøyede deoksySLer14 (upubliserte data) og museembryonale fibroblastcellekulturmodeller av deoksySL-metabolisme viste fenofibrat seg å være ineffektive16. Testing av medisiner i sammenheng med komplekse menneskelige vevsmodeller vil tillate oss å identifisere effektive behandlinger og diskontere ineffektive behandlinger som ellers ville ha blitt savnet hvis vi bare hadde stolt på mus eller forenklede monokulturer.

Fremtidig utvikling for narkotikascreening
I denne protokollen kvantifiserer vi apoptose i fotoreseptorer, den mest tallrike celletypen. Men ved å bruke noen av de påviste antistoffene som spesifikt merker de andre retinale celletyper, er denne protokollen modifiserbar for å analysere celledød i en hvilken som helst retinal celletype eller celle subtype (f.eks. Kegle vs stang). Ulempen med å kvantifisere apoptose ved bruk av TUNEL-farging i vevsskiver er at det er en lav gjennomstrømningsteknikk for å kvantifisere celledød, noe som begrenser anvendelsen av denne analysen til screening av små lister over kandidatmedisiner. En større skjerm av ikke-målrettede narkotikabiblioteker ville ikke være mulig ved hjelp av en IHC-tilnærming. Fremtidig utvikling i denne protokollen for å legge til rette for større legemiddelscreeninger vil kreve integrering av en lettere kvantifiserbar celledødsmarkør. Selv om disse er tilgjengelige, gjør uregelmessigheten av retinale organoider i størrelse, tilstedeværelse eller fravær av ikke-retinale vevsvedheng og variabilitet i fotoreceptorlagkvalitet det vanskelig å normalisere resultater på tvers av organoider. Vi forventer at fremtidig utvikling for å øke gjennomstrømningen av humane organoide sykdomsmodeller for å skjerme store legemiddelbiblioteker, vil forbedre vår evne til å oppdage, modifisere og validere legemidler som vil gå videre fra prekliniske studier til godkjente terapier.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfattere har ingen interessekonflikter.

Acknowledgments

Støttet av Lowy Medical Research Institute. Vi vil gjerne takke Lowy-familien for deres støtte til MacTel-prosjektet. Vi takker Mari Gantner, Mike Dorrell og Lea Scheppke for intellektuelle innspill og hjelp til å forberede manuskriptet.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.5M EDTA Invitrogen 15575020
125mL Erlenmeyer Flasks VWR 89095-258
1-deoxysphinganine Avanti 860493
B27 Supplement, minus vitamin A Gibco 12587010
Beaver 6900 Mini-Blade Beaver-Visitec BEAVER6900
D-(+)-Sucrose VWR 97061-432
DAPI Thermo-fisher D1306
Dispase II, powder Gibco 17105041
DMEM, high glucose, pyruvate Gibco 11995073
DMEM/F12 Gibco 11330
Donkey anti-rabbit Ig-G, Alexa Fluor plus 555 Thermo-fisher A32794
donkey serum Sigma D9663-10ML
FBS, Heat Inactivated Corning 45001-108
Fenofibrate Sigma F6020
Glutamax Gibco 35050061
Heparin Stemcell Technologies 7980
In Situ Cell Death Detection Kit, Fluorescin Sigma 11684795910
Matrigel, growth factor reduced Corning 356230
MEM Non-Essential Amino Acids Solution Gibco 11140050
mTeSR 1 Stemcell Technologies 85850
N2 Supplement Gibco 17502048
Penicillin-Streptomycin Gibco 15140122
Pierce 16% Formaldehyde Thermo-fisher 28906
Rabbit anti-Recoverin antibody Millipore AB5585
Sodium Citrate Sigma W302600
Steriflip Sterile Disposable Vacuum Filter Units MilliporeSigma SE1M179M6
Taurine Sigma T0625
Tissue Plus- O.C.T. compound Fisher Scientific 23-730-571
Tissue-Tek Cryomold EMS 62534-10
Triton X-100 Sigma X100
Tween-20 Sigma P1379
Ultra-Low Attachment 6 well Plates Corning 29443-030
Ultra-Low Attachment 75cm2 U-Flask Corning 3814
Vacuum Filtration System VWR 10040-436
Vectashield-mounting medium vector Labs H-1000
wax pen-ImmEdge vector Labs H-4000
Y-27632 Dihydrochloride (Rock inhibitor) Sigma Y0503

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Waring, M. J., et al. An analysis of the attrition of drug candidates from four major pharmaceutical companies. Nature Review Drug Discovery. 14 (7), 475-486 (2015).
  2. Khalil, A. S., Jaenisch, R., Mooney, D. J. Engineered tissues and strategies to overcome challenges in drug development. Advances in Drug Delivery Reviews. 158, 116-139 (2020).
  3. Demetrius, L. Of mice and men. When it comes to studying ageing and the means to slow it down, mice are not just small humans. EMBO Reports. , 6 Spec No 39-44 (2005).
  4. Lindsay, K. J., et al. Pyruvate kinase and aspartate-glutamate carrier distributions reveal key metabolic links between neurons and glia in retina. Proceedings of the National Academy of Sciences U. S. A. 111 (43), 15579-15584 (2014).
  5. Cowan, C. S., et al. Cell types of the human retina and its organoids at single-cell resolution. Cell. 182 (6), 1623-1640 (2020).
  6. Kruczek, K., Swaroop, A. Pluripotent stem cell-derived retinal organoids for disease modeling and development of therapies. Stem Cells. 38 (10), 1206-1215 (2020).
  7. Sinha, D., Phillips, J., Phillips, M. J., Gamm, D. M. Mimicking retinal development and disease with human pluripotent stem cells. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 57 (5), 1-9 (2016).
  8. Gan, L., Cookson, M. R., Petrucelli, L., La Spada, A. R. Converging pathways in neurodegeneration, from genetics to mechanisms. Nature Neuroscience. 21 (10), 1300-1309 (2018).
  9. Aung, K. Z., Wickremasinghe, S. S., Makeyeva, G., Robman, L., Guymer, R. H. The prevalence estimates of macular telangiectasia type 2: the Melbourne collaborative cohort study. Retina. 30 (3), 473-478 (2010).
  10. Chew, E. Y., et al. Effect of ciliary neurotrophic factor on retinal neurodegeneration in patients with macular telangiectasia type 2: A randomized clinical trial. Ophthalmology. 126 (4), 540-549 (2019).
  11. Gass, J. D., Blodi, B. A. Idiopathic juxtafoveolar retinal telangiectasis. Update of classification and follow-up study. Ophthalmology. 100 (10), 1536-1546 (1993).
  12. Klein, R., et al. The prevalence of macular telangiectasia type 2 in the Beaver Dam eye study. American Journal of Ophthalmology. 150 (1), 55-62 (2010).
  13. Powner, M. B., et al. Loss of Muller's cells and photoreceptors in macular telangiectasia type 2. Ophthalmology. 120 (11), 2344-2352 (2013).
  14. Gantner, M. L., et al. Serine and lipid metabolism in macular disease and peripheral neuropathy. New England Journal of Medicine. 381 (15), 1422-1433 (2019).
  15. Scerri, T. S., et al. Genome-wide analyses identify common variants associated with macular telangiectasia type 2. Nature Genetics. 49 (4), 559-567 (2017).
  16. Alecu, I., et al. Cytotoxic 1-deoxysphingolipids are metabolized by a cytochrome P450-dependent pathway. Journal of Lipid Research. 58 (1), 60-71 (2017).
  17. Othman, A., et al. Fenofibrate lowers atypical sphingolipids in plasma of dyslipidemic patients: A novel approach for treating diabetic neuropathy. Journal of Clinical Lipidology. 9 (4), 568-575 (2015).
  18. Ohlemacher, S. K., Iglesias, C. L., Sridhar, A., Gamm, D. M., Meyer, J. S. Generation of highly enriched populations of optic vesicle-like retinal cells from human pluripotent stem cells. Curr Protoc Stem Cell Biol. 32, 1-20 (2015).
  19. Zhong, X., et al. Generation of three-dimensional retinal tissue with functional photoreceptors from human iPSCs. Nature Communication. 5, 4047 (2014).
  20. Eiraku, M., et al. Self-organizing optic-cup morphogenesis in three-dimensional culture. Nature. 472 (7341), 51-56 (2011).
  21. Wahlin, K. J., et al. Photoreceptor outer segment-like structures in long-term 3D retinas from human pluripotent stem cells. Science Reports. 7 (1), 766 (2017).
  22. Capowski, E. E., et al. Reproducibility and staging of 3D human retinal organoids across multiple pluripotent stem cell lines. Development. 146 (1), (2019).
  23. Luo, Z., et al. An optimized system for effective derivation of three-dimensional retinal tissue via Wnt signaling regulation. Stem Cells. 36 (11), 1709-1722 (2018).
  24. Ovando-Roche, P., et al. Use of bioreactors for culturing human retinal organoids improves photoreceptor yields. Stem Cell Research Therapy. 9 (1), 156 (2018).

Tags

Denne måneden i JoVE utgave 169 retinal organoid organoid retinal degenerasjon MacTel sfingolipid fotoreseptor fenofibrat TUNEL farging narkotika skjerm lipid toksisitet
Toksisitetsskjermer i humane retinale organoider for farmasøytisk oppdagelse
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Eade, K., Giles, S., Harkins-Perry,… More

Eade, K., Giles, S., Harkins-Perry, S., Friedlander, M. Toxicity Screens in Human Retinal Organoids for Pharmaceutical Discovery. J. Vis. Exp. (169), e62269, doi:10.3791/62269 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter